Средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении и способ стимуляции регенерации ткани печени на его основе

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении в организм, характеризующееся тем, что оно содержит жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида, а также способ стимуляции регенерации ткани печени, включающий парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта, отличающийся тем, что в качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии, а введение указанного средства осуществляют инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве не более 250 мкл на 1 кг живой массы тела. Изобретение обеспечивает повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечения гепатита, цирроза печени, острой печеночной недостаточности, хронической недостаточности печени за счет повышения накопления пробиотика Bacillus subtilis в печени. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 пр., 16 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к лекарственным средствам и способам стимулирования регенерации ткани печени и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

В настоящее время известны препараты, улучшающие метаболические процессы в печени, к которым относятся природные антиоксиданты, в частности витамины группы В (В₁, В₆, В₁₂), аскорбиновая кислота, витамин Е, витамин А; препараты из лекарственных растений - Лив-52 (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2, 2002, с. 435). Известны средства, улучшающие обмен веществ в клетках печени, среди которых следует отметить силибинин (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2, 2002, с. 719); сирепар (Большая Российская энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2 2002, с. 722); эссенциале (патент РФ №2462251, опубл. 27.09.2012 г.); а также синтетические пептидные препараты (патент РФ №2166957, опубл. 2000 г.).

Указанные выше известные средства обладают только однонаправленным действием, а именно - улучшают метаболические процессы в печени и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.

Известно клинико-экспериментальное обоснование перорального применения пробиотика споробактерина (на основе бактерии Bac. subtillis 534) в комплексной терапии при механической желтухе (А.А. Третьяков, А.А. Стадников, А.В. Валышев Кафедры хирургии ФППС, гистологии Оренбургской государственной медицинской академии. Журнал "Анналы травматологии и ортопедии", №2, 2001 г. ). Учитывая полученные авторами экспериментальные данные о механизмах транслокации Bac. subtillis 534 в условиях механической желтухи, путях ее миграции из желудочно-кишечного тракта в билиарную систему, противомикробных и стимулирующих регенераторные процессы в печени свойствах сенной палочки, наблюдалась эффективность действия препарата споробактерина, созданного на основе этого микроорганизма в комплексном лечении хронического и острого холангита.

Известно средство Эссенциале, обладающее гепатопротекторным действием (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд. - М.: Новая Волна, 2005. - С.526-528). Создан он на основе эссенциальных фосфолипидов, а говоря точнее - высокоочищенной фракции фосфатидилхоллина, имеющей название дилинолеоилфосфатидилхоллин. Фирма-производитель: A.NATTERMANN and Cie. GmbH (Германия). Эссенциале препарат предназначен как для перорального приема (выпускается в форме капсул), так и для парентерального (в форме ампул для инъекций). Препарат вводится внутривенно по (5-10) мл в сутки, а в сложных случаях доза может быть увеличена до 20 мл. Кроме того, существуют особые условия введения Эссенциале: лекарственное средство разводят кровью больного или раствором глюкозы [(5-10) %] в пропорции один к одному и уже после этого вливают внутривенно. Внутримышечное введение препарата категорически запрещено по причине возникновения местного раздражения. Курс лечения с помощью инъекций обычно составляет 10 дней и дополняется приемом капсул. Общая продолжительность лечения Эссенциале довольно длительная - до полугода. Гепатопротектор Эссенциале не представлен в фармакопеях стран Северной Америки, Европы, Австралии и Новой Зеландии и не включен в Клинические Рекомендации - практические руководства для врачей и хирургов, которыми они пользуются для принятия решений по диагностике и лечению заболеваний, как не подтвердившие своей практической значимости.

Недостатком данного препарата и схемы его применения является то, что он не позволяет полностью купировать синдромы воспаления, холестаза и печеночно-клеточной недостаточности.

Известен способ коррекции гиперхолестеринемии пробиотиком, при этом в качестве пробиотика больному перорально дают по 1 мл 2 раза в сутки споробактерин жидкий в течение 30 дней (патент РФ №2388479, МПК A61K 35/74, A61P 3/06, опубл. 10.05.2010 г.).

Недостатком данного способа является невысокая эффективность коррекции гиперхолестеринемии пробиотиком.

Известно лечебное средство для восстановления функции печени при хроническом гепатите С, содержащее гепатопротектор (Эссенциале, Фосфоглив, Урсосан) и бактериальный препарат споробактерин в жидкой форме, представляющий собой жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtillis ВКМ 1666 D в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида (Князькина О.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. «Микробиоценоз кишечника у больных хроническим гепатитом С и его коррекция», Москва 2013 г., стр. 7).

Известен способ восстановления функции печени при хроническом гепатите С, включающий прием препаратов-гепатопротекторов (Эссенциале, Фосфоглив, Урсосан) по 2 капсулы 3 раза в сутки во время еды курсом до 3-х месяцев и бактериальный препарат споробактерин в жидкой форме, представляющий собой жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtillis ВКМ 1666 D в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл перорально по 1 мл, два раза в день за 30 минут до приема пищи, разводя назначенную дозу в 15 мл остуженной кипяченой воды, в течение 3 месяцев. (Князькина О.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. «Микробиоценоз кишечника у больных хроническим гепатитом С и его коррекция», Москва 2013 г., стр. 7).

В группе больных, принимавших споробактерин и гепатопротекторы, уменьшились проявления дисбактериоза толстого кишечника, улучшились клиническая картина, некоторые биохимические показатели (АлАТ, АсАТ, ЩФ, билирубин), показатели гуморального и клеточного иммунитета, а также снизилась вирусная нагрузка, в отличие от группы пациентов, не принимавших пробиотик споробактерин, у которых значимых изменений не выявлено.

Однако указанное лечебное средство и способ его применения для восстановления функции печени при хроническом гепатите С имеют недостаточный лечебный эффект, связанный с восстановлением клеток печени.

Ниже приведен ряд лечебных средств на основе пробиотиков и способы их парентерального применения (внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное и подкожное) для лечения некоторых инфекционных и соматических заболеваний организма.

Известен способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий липопептидополисахаридной природы для профилактики и лечения туберкулеза (патент РФ №2468816, МПК A61K 39/05, C12N 1/20, опубл. 10.12.2012 г.). Для этого наращивают биомассу пробиотического симбионтного штамма Corynebacterium diphtheriae tox- №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича в жидкой питательной среде, содержащей гидролизат казеина, осаждают полученные микробные клетки центрифугированием, промывают осадок целых клеток при центрифугировании, далее клетки суспендируют в растворе хлорида натрия, дезинтегрируют при температуре (25-30)°C в течение 15 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, повторно центрифугируют при 5000 g и удаляют оставшиеся целые клетки, полученный надосадок центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин и получают осадок, содержащий корпускулярные антигены клеточных стенок коринебактерий, осадок ресуспендируют в растворе стабилизатора и подвергают дезинтеграции при температуре (25-30)°C в течение 5 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, полученный дезинтеграт клеточных стенок разводят до концентрации (225-275) мкг/мл, стерилизуют и высушивают целевой продукт методом лиофилизации. Указанный пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза, содержащий корпускулярные антигены коринебактерий липопептидополисахаридной природы вводят подкожно мышам для проверки его профилатического действия против туберкулеза.

Известен способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных, предусматривающий выращивание споровой культуры Bacillus subtillis 3 на питательной среде, содержащей плацентарно-эмбрионально-маточный гидролизат тканей и органов животных, содержащий 90 мг % аминного азота, полученный из плаценты, эмбрионов и матки убойных животных, получение культуральной жидкости Bacillus subtillis 3, добавление суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции цеолита и гидролизата лактоальбумина, смешивание в соотношениях 1:1:0,5 соответственно, стерилизацию и розлив во флаконы (патент РФ №2366448, МПК A61K 38/01, A61K 35/50, опубл. 16.09.2009 г.). Используют цеолит, предварительно подвергнутый обработке соляной кислотой с последующим удалением дистиллированной водой растворимых солей и кварца, причем из оставшихся частиц цеолита отмучены частицы монтмориллонита величиной (0,0006-0,0009) мм, с последующим высушиванием полученной фракции. Известен также способ лечения радиационных поражений организма животных путем однократного подкожного введения в организм препарата, полученного по указанному выше способу, в дозах (7-10) см³ (мелким) и (15-20) см³ (и крупным) из расчета (6,5-7,5) мг сухого вещества на 1 кг живой массы в первые (1-10) суток после облучения (патент РФ №2366448, МПК A61K 38/01, A61K 35/50, опубл. 16.09.2009 г.).

Известен способ лечения телят, больных неспецифической катаральной бронхопневмонией, включающий использование антибактериального средства, отхаркивающих и противовоспалительных фитопрепаратов (патент РФ №2321393, МПК A61K 31/00, опубл. 10.04.2008 г.). В качестве антибактериального средства применяют биопрепарат Зимун 4.24 внутримышечно, в дозе (0,07-0,14) мл/кг живой массы один раз в сутки в течение (5-6) сут, в качестве отхаркивающего и противовоспалительного средства мукалтин внутрь, в дозе (100-150) мг на голову 2 раза в сут, в качестве витаминов аскорбиновую кислоту внутрь по (5-6) г на голову 2 раза в сут., тривит внутримышечно в дозе (2-2,5) мл на голову однократно в первые сутки терапии, в качестве аналептика сульфокамфокаин 10%-ный в дозе (2-4) мл 2 раза в сут.

Экономическая эффективность данного способа лечения на один рубль затрат составляет 5,71 руб. Зимун 4.24 - препарат, разработанный учеными ООО НПФ «Исследовательский центр - 1», содержит споровую биомассу бактерий Bacillus subtillis штамм 7048 и наполнитель. Представляет собой прозрачную мутноватую жидкость, при хранении допускается образование осадка желтовато-белого цвета на дне флакона, который при встряхивании легко разбивается на равномерную взвесь. Препарат обладает высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. На непатогенные штаммы Е. Coli антагонистическим действием не обладает. Помимо этого препарат стимулирует регенерационные процессы в организме, активизирует обменные процессы и биосинтез белка, нормализует окислительно-восстановительные процессы, повышает интенсивность роста молодняка и сохранность животных. Согласно исследованиям авторов препарат Зимун 4.24 не обладает острой и хронической токсичностью, кумулятивным эффектом, не вызывает анафилактического шока, развития септических процессов и воспалительных реакций. Его длительное парентеральное применение в высоких дозах не оказывает повреждающего воздействия на внутренние органы и картину крови белых мышей, он не обладает негативным влиянием на репродуктивную функцию и не вызывает мутаций половых клеток.

Однако в вышеприведенных аналогах отсутствуют сведения о стимулировании регенерации ткани печени при различных заболеваниях.

Известен способ стимуляции регенерации печеночной ткани (Патент РФ №2134582, МПК A61K 35/55, A61K 31/56, опубл. 20.08.1999 г.), при котором регенерационная терапия печени осуществляется путем подкожного введения экспериментальным животным вытяжки коры свиных или фетальных (человеческих) надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций. Способ повышает эффективность регенерации печеночной ткани и восстановление паренхимы патологически измененной печени с одновременным снижением побочных эффектов от применяемого синтетического лекарственного средства.

Недостатком выше условного аналога является сложность и затратность воспроизведения предложенной технологии ввиду сложности получения вытяжки фетальных надпочечников, свободной от вирусов и чужеродных белков.

Известен способ стимуляции регенерации печени с применением стимуляторов физической природы (патент РФ №2198621, МПК A61B 18/12, A61B 17/00, опубл. 20.02.2003 г.), в котором проводят прижигание капсулы печени в шахматном порядке силой тока 8 мА с шириной шага 2 см до снижения величины тканевого давления на (5-10) % от исходного, при этом стимуляция вызывает ответную реакцию структурных элементов печени и заканчивается достоверным увеличением объема гепатоцитов без нарушения строения печени.

Однако в данном способе подобное воздействие может проводиться только под общей анестезией в виде операции с раскрытием брюшной полости для получения доступа к органу.

Наиболее близким аналогом (прототипом) средства для стимулирования регенерации ткани печени является фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] и фармацевтически приемлемый носитель (патент РФ №2297239, МПК A61K 38/06, A61P 1/16, опубл. 20.04.2007 г.).

Наиболее близким способом стимуляции регенерации ткани печени (прототипом) является способ, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта (патент РФ №2297239, МПК A61K 38/06, A61P 1/16, опубл. 20.04.2007 г.). Введение осуществляют внутримышечно. Применение фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH в разных дозировках, способствовало нормализации уровня билирубина и активности АЛТ, что свидетельствует о нормализации метаболических процессов в печени, снижении активности воспалительного процесса и восстановлении синтеза тканеспецифических белков клетками печени. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о свойстве фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, стимулировать регенерацию ткани печени. Кроме того, результаты исследований подтверждают целесообразность применения фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, в комплексном лечении хронического гепатита в фазе обострения и ремиссии.

Однако данное средство-прототип и способ его применения обладают недостаточным терапевтическим действием вследствие малого накопления препарата в печени, из-за наличия нарушений тканевого кровообращения данного органа, свойственных хроническим гепатитам и циррозам, а также недостаточная биодоступность данного препарата для ткани печени при введении его внутримышечно.

Техническим результатом изобретения является повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечения гепатита, цирроза печени, острой печеночной недостаточности, хронической недостаточности печени за счет повышения накопления пробиотика Bacillus subtillis в печени.

Указанный технический результат достигается тем, что средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении в организм, согласно изобретению, оно содержит жидкую форму жизнеспособных клеток бактерий Bacillus subtillis в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида. В качестве бактерий Bacillus subtillis Bacillus subtillis оно содержит рекомбинантный штамм Bacillus subtillis ВКПМ В-10641, обладающий антибактериальной, фунгицидной и вирулицидной активностью и продуцирующий альфа-2 интерферон человека.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе стимуляции регенерации ткани печени, включающем парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта, согласно изобретению, в качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии, а введение указанного средства осуществляют инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве 1-2 мл на 1 кг живой массы тела при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Штамм бактерий Bacillus subtillis IC-1435-1-1 обладает бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10641. Штамм Bacillus subtillis IC-1435-1-1 получен путем селекции рекомбинантного штамма бактерий Bacillus subtillis IC-16. Указанный штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибного роста, а также по признаку количества продуцируемого интерферона α-2 лейкоцитарного человеческого.

Плазмида рВМВ 105 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода Candida, возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины. Определение активности интерферона проводили на культуре клеток с использованием вируса энцефаломиокардита мышей. Концентрация человеческого альфа-2 интерферона, полученная методом подавления ЦПД, была не менее 30 МЕ/г исследуемого образца, что на порядок выше, чем в исходном штамме-прототипе B. subtillis В-7092.

Механизмы пробиотического действия бактерий Bacillus subtillis, в том числе Bacillus subtillis ВКПМ В-10641, связаны с синтезом противомикробных веществ, усилением неспецифического и специфического иммунитета, стимуляцией роста нормальной микрофлоры кишечника и выделением пищеварительных ферментов. B. subtillis выделяет рибосомально синтезируемые пептиды, нерибосомально синтезируемые пептиды и непептидные вещества с широким спектром противомикробной активности, охватывающим грамположительные, грамотрицательные бактерии, вирусы и грибы. Резистентность к данным противомикробным веществам возникает редко. Усиление неспецифического иммунитета связано с активацией макрофагов и высвобождением из них провоспалительных цитокинов, повышением барьерной функции слизистой оболочки кишечника, выделением витаминов и аминокислот (включая незаменимые). Усиление специфического иммунитета проявляется активацией Т и В-лимфоцитов и высвобождением из последних иммуноглобулинов - IgG и IgA. B. subtillis стимулирует рост нормальной микрофлоры кишечника, в частности бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium (Севастьяненко А.В. Механизмы действия пробиотиков на основе B. subtillis // Актуальная инфектология. №2(11), стр. 35-44). http://cyberleninka.ru/article/n/mehanizmy-deystviya-probiotikov-na-osnove-bacillus-subtilis#ixzz4YGwap3ZK.

Методика культивирования бактерий Bacillus subtillis для получения микробной биомассы заявляемого средства.

Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:

- пептон мясной ферментативный - 10,0 г;

- дрожжевой экстракт - 5,0 г;

- хлорид натрия - 5,0 г;

- дистиллированная вода - до общего объема 1 дм³.

рН (7,2±0,2).

На 1 дм³ ферментационной питательной среды использовали 10 см³ посевного материала с титром 10⁸ КОЕ/см³. Процесс выращивания биомассы осуществляли в ферментере в течение (48±2) часов. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10¹⁰ КОЕ/см³.

Полученную биомассу бактерий разбавляли изотоническим раствором натрия хлорида до получения титра не менее 10⁷ КОЕ/мл.

Ниже приведены примеры 1-2 заявляемого средства в жидкой форме следующих составов:

Пример 1.

Бактерии штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641- 10⁹ КОЕ/мл живых клеток и спор; натрия хлорида - 70 г; воды дистиллированной - до одного литра.

Пример 2.

Бактерии штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641- 10⁷ КОЕ/мл живых клеток и спор; натрия хлорида - 90 г; воды дистиллированной - до одного литра.

Пример 3.

Способ стимуляции регенерации ткани печени. Способ включает парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. В качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии. По показаниям указанное средство используют в соответствии с примером 1 или 2 инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве не более 250 мкл на 1 кг живой массы тела при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида.

Ниже приведены экспериментальные данные в примерах 4, 5, и 6, подтверждающие эффективность использования заявляемого способа.

Пример 4.

Было проведено доклиническое исследование штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 на крысах породы Вистар. Животные выращивались в условиях питомника лабораторных животных по стандартной технологии. На момент проведения эксперимента все подопытные животные были массой (260-280) г. Способ введения штамма - инъекция в хвостовую вену суспензии штамма в изотоническом растворе натрия хлорида. Доза штамма на одно животное - 1 мл. Введение медленное струйное.

В опыте определяли время персистирования штамма в крови животных, физиологический статус по общему и биохимическому анализу крови, гистологическую структуру внутренних органов животных, для чего были сформированы по принципу аналогов 6 групп, по 10 голов обоего пола в каждой:

1 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁴ КОЕ/мл, однократно.

2 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁵ КОЕ/мл, однократно.

3 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁶ КОЕ/мл, однократно.

4 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁷ КОЕ/мл, однократно.

5 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁸ КОЕ/мл, однократно.

6 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл, однократно.

Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл жидкого штамма B. subtillis В-10641 в разных концентрациях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из хвостовой вены с периодичностью один раз в сутки до прекращения выделения бактерий. Для определения лейкоцитарной формулы и проведения биохимического анализа сыворотки кровь отбирали до начала эксперимента, на третий день и после окончания персистирования штамма при эвтаназии. Органы для изучения морфологии отбирали после окончания персистирования штамма при убое.

При ежедневном клиническом осмотре животных опытных групп в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме.

Динамика выделения штамма из крови представлена в таблице 1.

Поскольку в группах 1, 2, 3 уже через сутки от момента начала эксперимента титр штамма B. subtillis был равен нулю, последующее снятие данных в этих группах было прекращено. В группах с введением суспензии препарата с титрами 10⁷, 10⁸ КОЕ/мл на голову время персистирования штамма В. subtilis в крови составило 5 суток, с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову - 7 суток.

До эксперимента показатели общеклинического анализа крови животных соответствовали норме (табл. 2), наблюдали незначительное понижение общего количества лейкоцитов (лейкопению), которая при сохранении нормальности лейкоцитарной формулы не имеет в данном случае диагностического значения. На третьи сутки со дня начала эксперимента у животных, которым вводили штамм с титрами (10⁷-10⁹) КОЕ/мл, наблюдали повышение общего количества лейкоцитов, которое соответствовало норме, а также сдвиг в лейкоцитарной формуле с увеличением содержания эозинофилов и палочкоядерных нейтрофилов. Кровь опытных животных, которым вводили штамм с титрами (10⁴-10⁶) КОЕ/мл, согласно изученным показателям общеклинического анализа, соответствовала крови нативных животных, исследованных до начала эксперимента. К моменту выведения штамма из крови у животных всех опытных групп показатели общего анализа крови соответствовали нормальным (табл. 3 и 4).

Примечание: Б - базофилы, Э - эозинофилы, ПН - палочкоядерные нейтрофилы, СН - сегментоядерные нейтрофилы, Л - лимфоциты, М - моноциты.

Лейкоцитарная формула крови подопытных животных также не имела отклонений.

Примечание: (+) - наличие штамма, (-) - отсутствие штамма, 0 - штамм не выделен.

До начала эксперимента животные имели некоторые отклонения в биохимическом профиле сыворотки крови. Так, у самцов и самок было пониженное содержание щелочной фосфатазы и глюкозы, а также повышен креатинин относительно нормальных показателей (табл. 5).

По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. В таблице 5 представлены данные по морфометрии печени и селезенки.

Установлено, что при введении суспензии штамма B. subtillis с титрами 10⁴-10⁶ КОЕ/мл линейные размеры печени и селезенки остаются неизменными в сравнении с нативными животными, органы которых были исследованы до начала эксперимента. При введении суспензии штамма B. subtillis с титрами (10⁷-10⁹) КОЕ/мл наблюдали незначительное увеличение длины печени и ее массы, а также повышение клеточности паренхимы органа.

Результаты биохимического исследования крови представлены в табл. 6.

По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. Ниже представлены данные по морфометрии печени и селезенки (табл. 6).

Результаты биохимического исследования крови представлены в табл. 7.

Повторный забор крови у всех животных опытных групп осуществляли на третий день от начала эксперимента (от введения штамма парентерально внутривенно). Результаты представлены в табл. 8. Установлено, что введение штамма с титрами (10⁴-10⁶) КОЕ/мл не вызывает увеличения ACT в сыворотке крови. У животных, которым вводили штамм с титрами (10⁷-10⁸) КОЕ/мл, происходит увеличение активности печеночных ферментов, а именно ACT, и одного субстрата - общего билирубина. Прочие ферменты, в том числе ферменты печени АЛТ, щелочная фосфатаза, субстрат - общий белок, остаются в норме. В группах животных, которым вводили штамм с титрами 10⁵, 10⁶ КОЕ/мл, незначительно увеличивается содержание общего билирубина.

Так же, как и у нативных животных, у опытных уровень глюкозы в сыворотке крови остается пониженным, поэтому несоответствие норме данного показателя нельзя относить на счет влияния парентерального введения штаммов в кровь животных.

Окончательные результаты биохимического анализа сыворотки крови представлены в табл. 9. Установлено, что все показатели, имевшие отклонения животных опытных групп, на момент выведения штамма из крови пришли в норму, в том числе ферменты и субстраты, характеризующие работу печени.

Пример 5

Было изучено действие штамма бактерий Bacillus subtillis ВКПМ В-10641, ресуспендированного в изотоническом растворе натрия хлорида при парентеральном (внутривенном) введении на кроликах, и динамика персистирования штамма в организме животных. Объектами исследований были кролики породы «советская шиншилла», обоего пола, возраста 12 месяцев, массой (3500±100) г. Штамм бактерий Bacillus subtillis ВКПМ В-10641.

Эксперимент состоял из нескольких этапов.

На первом определяли время персистирования штамма в крови животных, для чего были сформированы по принципу аналогов 6 групп, по 10 голов обоего пола в каждой:

1 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁴ КОЕ/мл, однократно.

2 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁵ КОЕ/мл, однократно.

3 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁶ КОЕ/мл, однократно.

4 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁷ КОЕ/мл, однократно.

5 группа: штамм B. subtillis В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁸ КОЕ/мл, однократно.

6 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл, однократно.

Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл жидкого штамма B. subtillis; ВКПМ В-10641 в разных концентрациях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из ушной вены с периодичностью один раз в 2 суток до прекращения выделения бактерий.

На втором этапе определяли время персистирования штамма в крови животных групп 1-3 первого эксперимента в связи с тем, что первоначально выбранная кратность забора крови (через 24 часа от начала введения) не позволила выявить введенный штамм в крови.

Для этого из животных были сформированы по принципу аналогов 3 группы, по 5 голов обоего пола в каждой:

1 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10⁴ КОЕ/мл на голову, однократно.

2 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10⁵ КОЕ/мл на голову, однократно.

3 группа: штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10⁶ КОЕ/мл на голову, однократно.

Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл штамма B. subtillis ВКПМ В-10641 в разных разведениях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из ушной вены с периодичностью один раз в час до прекращения выделения бактерий.

На третьем этапе определяли летальную дозу штамма B. subtillis ВКПМ В-10641, для чего из животных были сформированы по принципу аналогов 4 группы, по 5 голов обоего пола в каждой:

1 группа (группа D): штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 500 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.

2 группа (группа С): штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 700 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.

3 группа (группа В): штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.

4 группа (группа А): штамм B. subtillis ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 2000 мкл/кг живой массы с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.

После инъекции (инфузии) определяли физиологическое состояние животных и в динамике отслеживали выживаемость.

В ходе эксперимента определяли следующие показатели:

1. Физиологические данные:

- температура тела;

- пульс;

- число дыхательных движений в минуту.

2. Показатели крови:

- биохимические;

- микробиологические (для определения времени персистирования штамма в крови);

- гематологические (определение количества лейкоцитов, лейкограмма).

3. Гистологическое исследование внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце, легкие).

4. Наличие штамма B. subtillis ВКПМ В-10641 во внутренних органах (печени, селезенке, почках, сердце, легких).

Физиологические данные и показатели крови определяли с первой учетной даты (перед инъекцией (инфузией) препарата) и до прекращения персистирования штамма в крови. Эвтаназия всех животных первого этапа была произведена на 11-й день эксперимента.

При ежедневном клиническом осмотре животных опытных групп первого этапа в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме.

Динамика выделения штамма из крови представлена в таблице 10.

Поскольку в группах 1, 2, 3 уже на 1 день эксперимента титр штамма B. subtillis был равен нулю, последующее снятие данных в этих группах было прекращено. В группах с введением суспензии штамма с титрами 10⁷, 10⁸ КОЕ/мл на голову время персистирования штамма B. subtillis в крови составило 5 суток, с титром 10⁹ КОЕ/мл на голову - 7 суток.

Количество лейкоцитов у подопытных животных соответствовало физиологической норме.

Примечания: Б - базофилы, Э - эозинофилы, ПН - палочкоядерные нейтрофилы, СН - сегментоядерные нейтрофилы, Л - лимфоциты, М - моноциты.

Лейкоцитарная формула крови подопытных животных также не имела отклонений (табл. 11, 12).

Примечание: (+) - наличие штамма, (-) - отсутствие штамма, 0 - штамм не выделен.

По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. У животных 6 группы отмечено незначительное увеличение селезенки, не выходящее за пределы анатомической нормы для данного вида животных. Внутренние органы были стерильны, за исключением печени и селезенки, в которых выявляли введенный штамм (табл. 13).

Результаты второго этапа эксперимента представлены в таблице.

Установлено, что среднее время персистирования штамма в крови подопытных животных (табл. 14) при введении суспензии штамма B. subtillis ВКПМ В-10641 с титрами (10⁴-10⁶) КОЕ/мл на голову составляет в среднем (12-13) часов.

По результатам третьего этапа эксперимента при введении доз 500, 700, 1000 и 2000 мкл/кг живой массы у животных отмечали легкое возбуждение и увеличение частоты дыхания. Через 30 мин от начала введения препарата зарегистрированные симптомы исчезали, показатели возвращались к норме. При ежедневном клиническом осмотре третьего этапа эксперимента в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме. В результате исследования крови животных третьего этапа эксперимента не установлено отклонений от физиологической нормы в количественных показателях лейкоцитов и сдвигов в лейкоцитарной формуле.

На Фиг. 1 и 2 представлены фотографии печени кролика, увеличение 10×40, окраска гематоксилин-эозином.

Морфологическое изучение гистологических срезов печени и селезенки показало наличие процессов пролиферации клеток в дольках печени, а также увеличение диаметра гепатоцитов и появление многоядерных клеток и клеток в состоянии митоза (фиг. 1, 2).

Наиболее выраженные положительные гистологические изменения были отмечены при введении штамма с титрами (10⁷-10⁹) КОЕ/мл.

Таким образом, оптимальной концентрацией штамма B. subtillis ВКПМ В-10641 для парентерального (инъекционного, инфузионного) внутривенного введения с целью стимуляции регенерационных процессов в печени является 10⁷ КОЕ/мл. Дальнейшее увеличение титра нецелесообразно, поскольку не вызывает существенно большую стимуляцию регенерации печеночной паренхимы, чем введение штамма с титром 10⁷ КОЕ/мл.

Пример 6.

Гепатотропное действие заявляемого препарата на острую токсичность определяли (Прозоровский В.Б. и др. "Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки", Фармакология и токсикология, 1978, №4, с. 494-502) штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 на крысах породы Вистар. Животные выращивались в условиях питомника лабораторных животных по стандартной технологии. На момент проведения эксперимента все подопытные животные были массой (260-280) г.

Группе 1 вводили заявляемый препарат по примеру 2, содержащий бактерии штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641 в количестве 10⁷ КОЕ/мл живых клеток; натрия хлорида - 90 г; воды дистиллированной - до одного литра. Препарат вводили способом по примеру 3 инфузионно внутривенно (медленное струйное) в хвостовую вену однократно в количестве 1 мл на одно животное.

Группе 2 вводили препарат-аналог, содержащий Эссенциале.

Группа 3 - крысы с модельным гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом - не получала лечебные препараты. Группа 4 - интактные животные.

Каждая группа состояла из 10 особей обоего пола массой (140-160) г.

Четыреххлористый углерод вводили подкожно ежедневно в 50% растворе в вазелиновом масле в течение 4 дней подряд в количестве 0,4 мл/100 г массы.

Клиническая картина отравления CCl₄ развивается медленно. Основные симптомы тяжелой интоксикации проявляются только к концу 2-х суток и через 4-7 суток приводят к летальному исходу. У всех пораженных наблюдается тяжелое повреждение печени вплоть до жирового перерождения органа.

Результаты сравнительной эффективности заявляемого препарата по примеру 2 и препарата-аналога Эссенциале представлены в таблице 15.

При гепатите в сыворотке крови крыс регистрировалось повышение уровня аланинаминотрансферазы (АлАТ) в полтора раза, незначительно изменялся уровень аспартатаминотрансферазы (АсАТ), на 30% снижался коэффициент де

Ритиса (АсАТ/АлАТ), на 17% возрастала щелочная фосфатаза, в 3 раза повышалась тимоловая проба и на 25% снижался уровень общего белка.

Биохимические показатели сыворотки крови свидетельствовали о наличии у крыс умеренной гиперферментемии, следовательно, и умеренной степени цитолитического синдрома (модель гепатита).

Как видно из таблицы 15, введение животным заявляемого препарата по примеру 2 улучшало биохимические показатели сыворотки крови и значительно снижало степень цитолиза. При этом заявляемый препарат уменьшал явления цитолиза и другие показатели крови на большую величину, чем аналог Эссенциале. Различия в их действии наиболее заметны по показателю тимоловой пробы. Это позволяет признать заявляемый препарат более эффективным при лечении экспериментального гепатита.

Анализ биохимических показателей липидного обмена в паренхиме печени показал, что введение животным CCl₄ (модель гепатита) вызывало значительные сдвиги в липидном обмене гепатоцитов. Так, уровень общего холестерина (ОХ) в печени вырос более чем в 3 раза (таблица 16) и, соответственно, возросли в процентном соотношении: триглицериды (ТГ), эфиры холестерина (ЭХ); в абсолютных величинах: ЭХ, ТГ, неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), свободный холестерин (СХ), фосфолипиды (ФЛ). Кроме того, изменилось процентное соотношение липидных фракций в печени.

Прием заявляемого препарата привел к снижению доли общего холестерина, по сравнению с моделью гепатита; уровень фосфолипидов как в абсолютном, так и процентном отношении приблизился к показателям интактных животных; снизились по сравнению с моделью уровень эфиров холестерина и повысился уровень неэтерифицированных жирных кислот, что является показателем стимуляции компенсаторных механизмов, сопровождающих нормализацию липидного обмена в печени.

Таким образом, вышеприведенные результаты, приведенные в примерах 4-6, подтверждают заявленный технический результат изобретения: повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечения гепатита, цирроза печени, острой печеночной недостаточности, хронической недостаточности печени за счет повышения накопления пробиотика Bacillus subtillis в печени. Бактерии-пробиотики, в частности бактерии штамма Bacillus subtillis ВКПМ В-10641, при парентеральном введении в организм оказывают стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов (на клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы) организма. Повышение активности системы фагоцитирующих мононуклеаров активирует внутриклеточную (в печени) регенерацию.

1. Средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении в организм, характеризующееся тем, что оно содержит жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что в качестве бактерий Bacillus subtilis оно содержит рекомбинантный штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, обладающий антибактериальной, фунгицидной и вирулицидной активностью и продуцирующий альфа-2 интерферон человека.

3. Способ стимуляции регенерации ткани печени, включающий парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта, отличающийся тем, что в качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 по пп. 1 и 2 формулы в концентрации не менее 10⁷ КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии, а введение указанного средства осуществляют инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве не более 250 мкл на 1 кг живой массы тела.