Способ прогнозирования эффективности лечения больных острыми миелобластными лейкозами противоопухолевыми препаратами даунорубицином и цитозин-арабинозидом

Изобретение относится к онкогематологии. Способ прогнозирования эфективности лечения больного ОМЛ характеризуется тем, что у больного берут пробу крови или костного мозга, выделяют опухолевые клетки, культивируют их с дуанорубицином и цитозин-арабинозидом в отдельности, добавляют раствор WST-1, определяют относительную плотность живых клеток в лунках планшета и IC50 для каждого цитостатического препарата, при значении IC50 для даунорубицина, попадающем в области 0,014-0,25 мкМ/л; от более 0,25 до 0,5, включая 0,5 мкМ/л; более 0,5 мкМ/л, а значении IC50 для цитарабина, попадающем в области 0,3-1,5 мкМ/л, от более 1,5 до 8, включая 8 мкМ/л; более 8 мкМ/л, устанавливают соответственно высокую, среднюю или низкую чувствительность опухолевых клеток пациента in vitro к даунорубицину и цитарабину соответственно; и по данным о чувствительности опухолевых клеток пациента к даунорубицину и цитарабину судят об эффективности лечения больного ОМЛ данными препаратами. 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к онкогематологии.

Из уровня техники известен ряд способов прогнозирования эффективности лечения онкологических больных, в частности следующий.

Способ прогнозирования чувствительности к химиотерапии у больных с лимфопролиферативными заболеваниями по патенту РФ №2593020 состоит в том, что в сыворотке крови пациента до начала лечения определяют содержание тимидинкиназы-1 (TK-1) и β2-микроглобулина (β2-МГ), а после первого курса химиотерапии (XT) - активность TK-1. Если активность ТК-1 до начала лечения <150,0 ДЕд/л или уровень β2-МГ до начала лечения <2200,0 мкг/л, то в результате 6-8 курсов XT достигается полная или частичная ремиссия. Если активность ТК-1 после 1 курса XT возрастает более, чем в 4 раза относительно исходного уровня, то в результате 6-8 курсов XT достигается полная или частичная ремиссия.

В данном способе чувствительность к химиотерапии прогнозируется на основании 2-х параметров (TK-1 и β2-МГ), которые косвенно отражают стадию заболевания, агрессивность его течения, т.е. в определенной мере отражают состояние организма. Данный способ прогнозирования чувствительности больного к химиотерапии не учитывает саму предстоящую терапию, не позволяет оценить чувствительность опухолевых клеток к конкретному цитостатическому препарату и выбрать наиболее рациональные схемы лечения.

Чувствительность опухолевых клеток к цитостатическим препаратам может определяться различными способами.

Дифференцированное окрашивание клеток на цитотоксичность (differential staining cytotoxicity assay - DiSC) с целью определения их лекарственной восприимчивости основано на неодинаковой инкорпорации гематоксилин-эозина в нормальные и трансформированные живые клетки, а также нигрозина (fastgreen-Nigrosin) в погибшие. Лекарственная восприимчивость оценивается по соотношению количества живых клеток в лунках планшета с клетками, обработанными цитостатическими препаратами, и количества живых клеток в необработанных контрольных лунках, которое должно составлять не менее 80% жизнеспособных клеток (Иншаков А.Н. Фармакодинамическое моделирование чувствительности опухолевых клеток хронического лимфолейкоза и множественной миеломы к химиопрепаратам in vitro: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.12 // Рос. онкол. науч. центр им. Н.Н. Блохина РАМН. - М., 2012; 26 с; Bosanquet AG. Correlations between therapeutic response of leukaemias and in-vitro drug-sensitivity assay. Lancet: 1991; 337 (8743): 711-14).

В данном методе анализируется морфология клетки с помощью оптической микроскопии. Основными ограничениями DiSC-анализа являются его трудоемкость и субъективность, обусловленная квалификацией персонала, производящего окраску мазков и подсчет клеток под микроскопом.

В статье «Разработка принципов создания диагностического набора для определения лекарственной чувствительности лейкозных клеток» А.И. Свирновского, Т.Ф. Сергиенко, В.В. Пасюкова и др. («Проблемы здоровья и экологии», 2011, №3) для доклинической диагностики лекарственной чувствительности опухолевых клеток кроветворной ткани использован МТТ тест. Химиопрепараты использовали в концентрации, близкой к терапевтической в крови или готовили ряд разведений препаратов для определения концентрации, при которой погибает 50% опухолевых клеток (IC50). Чувствительность опухолевых клеток к цитостатическим препаратам определяли с помощью МТТ-теста, для чего 96-луночный планшет с анализируемыми концентрациями цитостатического препарата и клетками в питательной среде инкубировали в течение 44 часов, затем в каждую лунку планшета добавляли по 20 мкл раствора МТТ. Через 4 часа инкубации с МТТ во все лунки добавляли равный объем солюбилизирующей смеси с додецилсульфатом натрия. Закрытый планшет переносили в холодильник на 20-25 мин до осаждения пены в тестируемых лунках, затем на спектрофотометре на длине волны 540 нм определяли оптическую плотность в лунках и процент жизнеспособных клеток.

Для МТТ-анализа пригодны, в основном, адгезионные культуры [Ross D.D., Thompson B.W., Ordez J.V., Joneckis С.С. Improvement of flow-cytometric detection of multidrug-resistant cells by cell-volume normalization of intracellular daunorubicin content. Cytometry: 1989; 10(2): 185-91].

Обычно при выполнении МТТ-теста перед добавлением в лунки планшета раствора ДМСО или SDS для растворения кристаллов формазана, из лунок планшета отбирают среду, что усложняет и удлиняет методику, а в случае суспензионных культур приводит к потере части клеток, что может искажать результаты теста.

Кроме того, DMSO и SDS являются токсичными не только для человека, выполняющего тест, но и для самих клеток, могут вызвать гибель части клеток в контрольных лунках (в отсутствие цитостатических препаратов) и в опытных, что также может искажать результаты теста (Цитотоксичность додецилсульфата натрия в отношении кератиноцитов линии НаСаТ: сравнительный анализ различных методов оценки жизнеспособности клеток/ Русанов А.Л., Лузгина Н.Г., Лисица А.В.// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2017. - N 2.-С. 256-260).

Известна статья «Прогностическое значение определения чувствительности бластных клеток детей с острым лимфобластным лейкозом к химиопрепаратам in vitro /Кузнецова С.С, Иншаков А.Н., Маякова С.А., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю // Российский биотерапевтический журнал, 2004 (https://cyberleninka.ru/article/n/prognosticheskoe-znachenit-opredeleniea-chuvstvitelnosti-blastnyh-kletok-detey-s-ostrym-limfoblastnym-leykozom-k-himiopreparatam-in).

У 35 детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в возрасте от 1 года до 17 лет определялась чувствительность бластных клеток к 7 химиопрепаратам (преднизолону, винкристину, рубомицину, доксорубицину, цитарабину, пуринетолу и вепезиду) in vitro двумя методами: МТТ-тестом и DISC-методом. Выявлялась корреляционная зависимость между степенью чувствительности бластов in vitro и группами прогноза, возрастом, полом и инициальным количеством лейкоцитов в периферической крови, сроками выхода пациентов в ремиссию. При сопоставлении групп детей с ОЛЛ по доле эффективных препаратов in vitro с достижением ремиссии на 33-й день от начала терапии получены статистически достоверные различия (р=0,008). Все пациенты, у которых доля эффективных препаратов составила более 40%, достигли ремиссии.

Данная работа касается острого лимфобластного лейкоза, в ней использован МТТ-тест, недостатки которого отмечены выше.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа прогнозирования эффективности лечения больного острым миелобластным лейкозом (далее ОМЛ) противоопухолевыми препаратами даунорубицином и цитозин-арабинозидом (далее цитарабином) состоит в следующем.

У больного берут пробу крови, если у него наблюдается гиперлейкоцитоз, или костного мозга, если отсутствует гиперлейкоцитоз, выделяют опухолевые (лейкозные) клетки, культивируют их в лунках планшета с каждым цитостатическим препаратом (даунорубицином, цитарабином) в отдельности, используя ряд концентраций цитостатического препарата, позволяющий определить ту его концентрацию, при которой in vitro выживает 50% лейкозных клеток данного пациента (IC50), добавляют раствор WST-1 (Water Soluble Tetrazolium), измеряют на спектрофотометре оптическую плотность в каждой лунке, определяют относительную плотность живых клеток в лунках.

Определяют IC50 для даунорубицина и цитарабина. При значении IC50 даунорубицина у обследуемого пациента, попадающем в области значений 0,014-0,25 мкМ/л; от болеее 0,25 до 0,5, включая 0,5 мкМ/л; более 0,5 мкМ/л устанавливают соответственно высокую (1 балл), среднюю (2 балла) или низкую (3 балла) чувствительность опухолевых клеток пациента к даунорубицину in vitro.

При значении IC50 цитарабина у обследуемого пациента, попадающем в области значений 0,3-1,5 мкМ/л; от более 1,5 до 8, включая 8 мкМ/л; более 8 мкМ/л устанавливают соответственно высокую (1 балл), среднюю (2 балла) или низкую (3 балла) чувствительность опухолевых клеток пациента к цитарабину in vitro.

Если опухолевые клетки пациента in vitro:

характеризуются низкой чувствительностью к даунорубицину и цитарабину, прогнозируют очень высокую вероятность резистентности пациента к лечению данными препаратами;

характеризуются низкой чувствительностью к цитарабину, прогнозируют очень высокую вероятность резистентности пациента к монотерапии цитарабином (монотерапия цитарабином применяется в случае высокой коморбидности пациента, наличии у него заболеваний, исключающих прием даунорубицина);

высокочувствительны к даунорубицину, при этом высоко-, средне- или низкочувствительны к цитарабину, прогнозируют высокую вероятность ремиссии или ремиссии с последующим ранним (в течение первых двенадцати месяцев) рецидивом при лечении двумя данными препаратами;

высокочувствительны к даунорубицину и цитарабину, прогнозируют примерно 50%-ную вероятность ремиссии у пациента при лечении его двумя данными препаратами или только цитарабином.

Опухолевые клетки выделяют из пробы крови или костного мозга путем центрифугирования через LSM (Lymphocyte Separation Medium), затем в течение суток их культивируют в СО₂-инкубаторе перед внесением в лунки планшета.

В каждую лунку планшета помещают 50-200 тысяч опухолевых клеток для культивирования их с цитостатическим препаратом.

Для определения IC50 опухолевые клетки культивируют со следующими концентрациями даунорубицина (мкМ/л): 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 2 и (отдельно) со следующими концентрациями цитарабина (мкМ/л): 0; 0,001; 0,01; 0,2; 0,8; 4,1; 40,8; 82 в течение 48-72 часов.

Раствор WST-1 добавляют в лунки планшета, содержащие 150 мкл среды, в объеме 10 мкл исходного раствора WST-1 с концентрацией 0,5 мг/мл и культивируют с WST-1 в течение 2-3 часов.

IC50 определяют путем построения в прямоугольной системе координат графика зависимости процента выживших клеток в лунках от концентрации цитостатического препарата в этих лунках или с помощью программы OriginPro 7.5.

Техническими результатами предлагаемого способа являются следующие:

1) предлагаемый способ так же, как и аналог по патенту РФ №2593020, включает исследование некоторых параметров организма (в аналоге это тимидинкиназа-1 и β2-микроглобулин, в предлагаемом способе - опухолевые клетки), в определенной мере отражающих стадию и агрессивность течения заболевания, но, в отличие от указанного аналога, предлагаемый способ позволяет прогнозировать эффективность лечения на основе проверки до начала лечения эффективности предполагаемых для лечения препаратов полихимиотерапии (ПХТ), дает возможность оценить чувствительность опухолевых клеток пациента к цитостатическим препаратам, входящим в стандартные схемы лечения ОМЛ, и таким образом до начала лечения выбрать более эффективный препарат (препараты);

2) предлагаемый способ по сравнению со способами, использующими МТТ-тест, менее трудоемок, требует меньше времени для его осуществления;

3) результаты исследования чувствительности опухолевых клеток, выполненного при помощи WST-1 теста, по сравнению с теми, что выполнены при помощи МТТ-теста, являются более точными и достоверными, т.к.:

- на суспензионных культурах, к которым относятся лейкозные клетки, не теряется часть клеток, вследствие таких необходимых при выполнении МТТ-теста манипуляций, как отбор среды с клетками из лунок, ее центрифугирование, ресуспендирование клеток, перенос их обратно в планшет перед добавлением в лунки ДМСО или додецилсульфата;

- не погибает часть клеток под воздействием токсичных ДМСО или додецилсульфата, используемых при выполнении МТТ-теста;

4) вероятность резистентности пациента к лечению даунорубицином и цитарабином при низкой чувствительности in vitro его опухолевых клеток к указанным препаратам является очень высокой и составляет в исследованной группе 100%;

5) вероятность резистентности пациента к монотерапии цитарабином при низкой чувствительности in vitro его опухолевых клеток к цитарабину является очень высокой и составляет в исследованной группе 100%;

6) высокая, средняя и низкая чувствительность клеток in vitro к цитостатическому препарату (цитостатическим препаратам) совпадает соответственно с ремиссией, ремиссией с ранним рецидивом и с резистентностью пациента к лечению данным цитостатическим препаратом (цитостатическими препаратами) у 64,5% пациентов;

7) предлагаемый способ позволяет сделать в два раза более точный прогноз относительно результата лечения пациента на основании выявленной in vitro низкой чувствительности опухолевых клеток пациента к даунорубицину и цитарабину, чем на основании выявленной in vitro высокой чувствительности его опухолевых клеток к указанным препаратам. Низкая чувствительность опухолевых клеток к тем цитостатическим препаратам (препарату), которые (который) получал пациент, совпадает с резистентностью пациента к терапии этими препаратами (этим препаратом) в обследованной группе в 84,2% случаев, а высокая чувствительность опухолевых клеток с ремиссией у пациента - в 42,9% случаев.

Иллюстративный материал

Фиг. 1. Пример схемы размещения контрольных и опытных лунок в 96-луночном планшете. Обозначения: цифрами 1-8 обозначены номера 12-луночных рядов в планшете (на схеме они горизонтальные); К - клетки, например, 100 тысяч в лунке; С - среда питательная, например, 150 мкл в лунке; Д - даунорубицин в следующих концентрациях от 1-го до 8-го ряда лунок соответственно (мкМоль/л): 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1; 2; Ц-цитарабин в следующих концентрациях от 1-го до 8-го ряда лунок соответственно (мкМоль/л): 0; 0,001; 0,01; 0,2; 0,8; 4,1; 40,8; 82. Одна и та же концентрация каждого цитостатического препарата присутствует в трех опытных и одной контрольной лунках.

Пример осуществления изобретения

У пациента с подтвержденным диагнозом ОМЛ берут пробу крови, если у пациента наблюдается гиперлейкоцитоз, или костного мозга, если у него отсутствует гиперлейкоцитоз. Если объем пробы костного мозга не достаточен, то берут дополнительно пробу крови.

Пробу крови (5 мл), костного мозга (3 мл) забирают в пробирки с ЭДТА. Образцы крови и костного мозга обрабатывают сразу или в течение нескольких часов после сбора.

Забирают из пробы 800 мкл крови или костного мозга, добавляют 4,2 мл 0,9% раствора хлористого натрия.

Опухолевые клетки выделяют следующим образом.

На дно центрифужной пробирки помещают 2 мл LSM, сверху наслаивают 5 мл суспензии клеток в 0,9% растворе хлористого натрия и центрифугируют при 800g в течение 20 мин при температуре 21°С.

Отбирают полученную фракцию опухолевых клеток, переносят ее в другую пробирку, содержащую 2 мл 0,9% раствора хлористого натрия, ресуспендируют.

Суспензию клеток центрифугируют в течение 10 минут при 680g. Сливают надосадочную жидкость, к осадку добавляют 1 мл модифицированной по Пскову питательной среды Дульбекко (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, клетки ресуспендируют.

Помещают в камеру Горяева 7,5 мкл полученной клеточной суспензии, определяют концентрацию и количество живых клеток в суспензии.

Взвесь клеток в объеме 1 мл помещают в чашку Петри, содержащую 3 мл среды IMDM, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), 1% раствором антибиотика (10000 мкг / мл стрептомицина, 10000 ME / мл пенициллина), 25 мкг / мл антимикотика амфотерицина и в течение суток культивируют в СО₂-инкубаторе при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Получают, условно называемую, исходную взвесь (суспензию) клеток. Определяют концентрацию живых клеток в исходной суспензии и готовят рабочую суспензию клеток для раскапывания в лунки планшета.

Используют 96-луночные планшеты.

Вносят клетки в лунки планшета по 50-200 тысяч клеток, например, по 100 тысяч клеток в 75 мкл питательной среды в лунку. Цитостатический препарат вносят в лунку планшета в 75 мкл среды; в одной и той же концентрации его вносят в три опытные лунки. Каждый цитостатический препарат в опыте используют в семи различных концентрациях. На фиг. 1 показана схема 96-луночного планшета, на которой приведен пример расположения опытных (содержащих клетки, питательную среду и цитостатический препарат) и контрольных лунок. Лунки первого контроля содержат клетки (100 тыс.) и питательную среду - 150 мкл, лунки второго контроля - только 150 мкл среды.

Высаженные на планшет клетки инкубируют в течение 48-72 ч. в присутствии вышеуказанных концентраций даунорубицина и цитарабина в среде IMDM в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5%-го CO₂.

По окончании инкубации в опытные и контрольные лунки планшета в стерильных условиях раскапывают раствор WST-1в концентрации 0.5 мг/мл по 10 мкл в лунку. Планшеты снова помещают в СО₂-инкубатор на 2-3 часа.

После инкубации клеток с раствором WST-1 измеряют на многоканальном спектрофотометре оптическую плотность в каждой лунке планшета, определяя разность поглощения на длинах волн 620 и 450 нм.

После определения относительной плотности живых клеток (относительно плотности живых клеток в контрольных лунках без цитостатического препарата, содержащих только среду и клетки) во 2-8-й лунках с различными концентрациями цитостатического препарата строят график зависимости процента живых клеток в лунках от концентрации цитостатического препарата в данных лунках в прямоугольной системе координат и определяют среднее значение IC50 - концентрации цитостатического препарата, при которой выживает 50% лейкозных клеток.

IC50 можно определить также с помощью программы Origin (OriginPro 7.5). Вносят в программу значения концентрации цитостатического препарата в лунках, процент живых клеток в лунках с разными концентрациями цитостатического препарата и аппроксимируют зависимость процента живых клеток от концентрации цитостатического препарата экспоненциальной функцией.

Полученное среднее значение IC50 для обследуемого пациента сравнивают с разработанной авторами шкалой высокой, средней и низкой чувствительности опухолевых клеток больных ОМЛ к данному цитостатическому препарату.

Значения IC50, соответствующие высокой, средней или низкой чувствительности даунорубицина и цитарабина, а также соответствующий им прогноз указаны выше, а также приведены ниже.

Общая характеристика группы обследованных больных ОМЛ

Группу обследованных составили 53 пациента Городского гематологического центра города Новосибирска с диагнозом "Острый миелобластый лейкоз" (ОМЛ).

Средний возраст пациентов составил 51,23±14,5 лет. Распределение по полу было следующим: мужчины - 25 пациентов (48,15%), женщины - 28 пациенток (51,85%).

Обязательный комплекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнеза, объективный осмотр, лабораторные методы: общий анализ крови и мочи, биохимические тесты (общий белок, АЛТ, ACT, протромбиновый индекс, тимоловая проба), в том числе С-реактивный белок, фибриноген, лактатдегидрогеназа и щелочная фосфатаза для определения биохимической активности опухолевого процесса. Всем пациентам проводилась компьютерная томография малого таза, забрюшинного пространства, брюшной полости, грудной клетки, исследование пунктата костного мозга с подсчетом миелограммы, иммунофенотипирование опухолевых клеток методом проточной цитофлуорометрии, кариотипирование методом метафазных пластинок, а также молекулярно-цитогенетическое исследование клеток FISH-методом. Диагноз острого лейкоза был установлен на основании цитологического исследования костного мозга с иммунофенотипированием опухолевых клеток методом проточной цитофлуорометрии с использованием широкой панели моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемопоэтических клеток.

У всех больных была произведена оценка уровня лейкоцитоза, определен первичный/вторичный лейкоз, наличие экстрамедуллярных поражений, цитогенетических мутаций.

Гепаринизированные образцы периферической крови или костного мозга брали во время диагностики перед химиотерапией и обрабатывали либо сразу, либо после хранения в 10%-ном диметилсульфоксиде в жидком азоте.

Показатели гемограммы больных до начала лечения показали, что у 42 больных из 53-х были обнаружены бласты в периферической крови. Среднее их содержание составило 55,69±29,26% по отношению к лейкоцитам. У остальных 11 больных бласты были только в костном мозге.

Анализ особенностей миелограммы показал, что среднее содержание бластных элементов у 53-х пациентов составило 58,92±30,04% по отношению ко всем клеткам костного мозга.

У всех 53-х пациентов содержание 6 ластов в костном мозге превышало 20% по отношению ко всем клеткам костного мозга.

При наличии определенной совокупности признаков определялся прогноз для каждого пациента на основании известной из уровня техники информации; данные представлены в таблицах 1 и 2.

У 10 пациентов из 53-х (18,87%) определялся благоприятный прогноз, у 43-х пациентов (81,13%) - неблагоприятный.

Сбор образцов периферической крови и костного мозга

Периферическая кровь у пациентов с лейкемией была получена в BD Vacutainer путем пункции периферической вены (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Образцы костного мозга собирали в стеклянные пробирки с ЭДТА или гепарином путем прокола иглой для стернальной пункции или аспирации / биопсии подвздошного гребня с помощью иглы Джамшиди.

Выделение клеток и культивирование

Образцы крови и костного мозга обрабатывали сразу или в течение нескольких часов после сбора. Критерии для бластных клеток больных ОМЛ были основаны на соответствующих цитологических и фенотипических характеристиках.

Лейкозные клетки были выделены из периферической крови и костного мозга пациентов с помощью LSM с последующим центрифугированием (MP Biomedicals, США) в соответствии с инструкциями производителя. После выделения клетки культивировали в питательной среде IMDM, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS), 1% раствором антибиотика (10000 мкг/мл стрептомицина, 10000 МЕ/мл пенициллина) и антимикотиком амфотерицином 25 мкг/мл (ICN, Германия), при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО₂.

Клетки культивировали в чашках Петри в течение суток для адаптации к условиям in vitro. Затем высаживали в 96-луночный планшет в определенной концентрации (0.5×10⁵-2×10⁵ на лунку) и инкубировали с цитостатическим препаратом (опыт) или без цитостатического препарата (контроль) в течение 48-72 часов.

Оценка чувствительности лейкозных клеток к цитостатическим препаратам (даунорубицину и цитарабину) с использованием WST-1-теста

Даунорубицин (5 мг, TEVA, Израиль), цитарабин (100 мг / мл, TEVA, Израиль) хранили в соответствии с рекомендациями производителя и разводили в нужных концентрациях только перед использованием.

После инкубации с указанными химиотерапевтическими лекарственными препаратами добавляли раствор WST-1 (Roche, Швейцария) в концентрации 0,5 мг/мл в соответствии с инструкцией к реактиву, и клетки дополнительно инкубировали в течение 2-3 часов.

Абсорбцию измеряли спектрофотометрически с использованием Multiscan RC (Labsystems, Finland) при длинах волн 450 и 620 нм. IC50 рассчитывали по трем независимым измерениям оптической плотности в трех лунках с одной и той же концентрацией цитостатического препарата. Значение различий было проанализировано с использованием t-критерия Стьюдента. Для каждого пациента были определены значения IC50 для даунорубицина и цитарабина.

Для оценки чувствительности опухолевых клеток пациентов к цитостатическим препаратам in vitro была разработана шкала на основе определения IC50 и IC75 у группы больных, относительно которых было заранее известно, что они высокочувствительны к конкретному препарату.

Опухолевые клетки пациента оценивали как высоко-, средне- или низкочувствительные к цитостатическому препарату, если значение IC50 цитостатического препарата у данного пациента попадало в следующие диапазоны шкалы:

для цитарабина: 1 балл (высокая чувствительность) - 0,3-1,5 мкМоль/л; 2 балла (средняя чувствительность) – от более 1,5 до 8, включая 8 мкМоль/л; 3 балла (низкая чувствительность) - более 8 мкМоль/л;

для даунорубицина: 1 балл (высокая чувствительность) - 0,014-0,25 мкМоль/л; 2 балла (средняя чувствительность) - от более 0,25 до 5, включая 0,5 мкМоль/л, 3 балла (низкая чувствительность) - более 0,5 мкМоль/л.

После постановки диагноза пациентам назначался курс лечения в Городском гематологическом центре города Новосибирска. Результаты WST-теста и результаты клинических и параклинических исследований оценивали в совокупности.

Часть пациентов, прошедших 1-2 курса ПХТ, в связи с высокой коморбидностью получала только один цитостатический препарат - цитарабин в рамках протоколов ПХТ МДД21 и МДЦ 28 (доза цитарабина 10 мг/м 2 раза в сутки); другие пациенты получали 2 цитостатических препарата в рамках протокола ПХТ «7+3» (даунорубицин в дозе 60 мг/м и цитарабин в дозе 200 мг/м²).

Был проведен сравнительный анализ уровня IC50 для цитостатических препаратов у пациентов до начала лечения с результатами лечения пациентов (клинико-гематологическим ответом) после 1-2 курсов ПХТ. Клинико-гематологический ответ оценивали по количеству бластов в костном мозге или на основе следующей разработанной шкалы эффективности лечения:

1 балл - полная клинико-гематологическая ремиссия (ПКГР): доля бластных клеток в миелограмме снижается до уровня менее 5%, отсутствуют внекостномозговые лейкемические очаги поражения, в периферической крови отсутствуют бластные клетки, в костном мозге отсутствуют бластные клетки с палочками Ауэра, количество собственных тромбоцитов у пациента (т.е. не приобретенных в результате гемотрансфузий) равно или больше 100 тыс./мкл, количество собственных гранулоцитов - больше или равно 1 тыс./мкл;

2 балла - ремиссия с последующим ранним (в течение первых двенадцати месяцев) рецидивом, доля бластов в костном мозге после 1-2 курсов ПХТ от 5 до 20%;

3 балла - рецидив с последующей резистентностью; первичная резистентность - нет эффекта (ПКГР) на индукционных курсах; доля бластов после 1-2 курсов ПХТ в костном мозге больше 20%.

Ниже в таблице 3 представлены данные для 31 больного из обследованных 53-х, для которых имелись все данные из следующих: IC50 даунорубицина и цитарабина, если пациент получал оба препарата; IC50 цитарабина, если пациент получал только этот препарат; ответ на терапию даунорубицином и цитарабином или только цитарабином; цитостатические препараты, которые получал данный больной.

Примечания:

* ответ на терапию указан в % бластов в миелограмме после 1-2 курсов лечения и/или согласно вышеприведенной классификации в баллах (в скобках);

** крестиком отмечены препараты, которые получал пациент.

Приведенные в таблице 3 данные показывают следующее.

Благоприятный результат лечения (ремиссия, 1 балл) наступил у 7 пациентов из 31 (22,6%). Результат лечения, оцениваемый в 2 и 3 балла, наблюдался у 5 (16,1%) и 19 (61,3%) больных соответственно, что в сумме составило 24 (77,4%) пациента. Полученные результаты близки к прогнозу, полученному на основании молекулярно-генетических и клинических признаков, приведенных в табл. 2.

В обследованной группе 21 пациент из 31-го получали даунорубицин и цитарабин. Из них у 8 человек опухолевые клетки были in vitro низкочувствительными и к даунорубицину, и к цитарабину. Все 8 человек (100%) оказались резистентными к лечению данными препаратами (р=0,0029).

В обследованной группе 10 больных получали цитарабин (без даунорубицина). У 8 из них опухолевые клетки были in vitro низкочувствительными к цитарабину, лечение цитарабином оказалось неэффективным (3 балла) у всех 8 человек, т.е. в 100% случаев (р=0,0297). В одном из двух других случаев опухолевые клетки оказались in vitro высокочувствительными к цитарабину, в другом - среднечувствительными к нему. В обоих случаях лечение цитарабином оказалось эффективным, у пациентов наступила ремиссия.

В обследованной группе высокочувствительными in vitro к даунорубицину оказались опухолевые клетки у 10 пациентов, которые получали оба препарата. При этом опухолевые клетки у них были высоко, средне- или низкочувствительны к цитарабину. Из указанных 10 пациентов у 5 наблюдалась ремиссия, еще у 3х - ремиссия с ранним рецидивом. Таким образом, у 8 человек из 10 (80%) наблюдалась ремиссия или ремиссия с последующим ранним (в течение первых 12 месяцев) рецидивом при лечении двумя данными препаратами.

В обследованной группе высокочувствительными in vitro к даунорубицину и к цитарабину оказались опухолевые клетки у 6 человек. Из них у 3-х пациентов (50%), получавших оба препарата или только цитарабин, наступила ремиссия.

Чувствительность клеток к цитостатическим препаратам (препарату), которые (который) получал пациент, оцененная в баллах, совпадает с результатом лечения, оцененным в баллах (см. ниже) в исследованной группе у 64,5% пациентов.

Низкая чувствительность опухолевых клеток к цитостатическим препаратам (препарату), которые (который) получал пациент, совпадает с резистентностью пациента к лечению в обследованной группе в 84.2% случаев (у 16 человек из 19, у которых результат лечения оценивался 3-мя баллами), а высокая чувствительность к препаратам (препарату), которые (который) получал пациент, с ремиссией - в 42,9% случаев (у 3-х человек из 7-и, у которых наступила ремиссия).

1. Способ прогнозирования эффективности лечения больного острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) противоопухолевыми препаратами дуанорубицином и цитозин-арабинозидом (далее цитарабином) характеризуется тем, что у больного берут пробу крови или костного мозга, выделяют опухолевые клетки, культивируют их с каждым цитостатическим препаратом в отдельности, используя ряд концентраций цитостатического препарата, который позволяет определить его IC50 в отношении клеток данного пациента, добавляют раствор WST-1, определяют относительную плотность живых клеток в лунках и IC50 для каждого цитостатического препарата,

при значении IC50 для даунорубицина у обследуемого пациента, попадающем в области значений 0,014-0,25 мкМ/л; от более 0,25 до 0,5, включая 0,5 мкМ/л; более 0,5 мкМ/л, устанавливают соответственно высокую, среднюю или низкую чувствительность опухолевых клеток пациента к даунорубицину in vitro;

при значении IC50 для цитарабина у обследуемого пациента, попадающем в области значений 0,3-1,5 мкМоль/л, от более 1,5 до 8, включая 8 мкМ/л; более 8 мкМ/л, устанавливают соответственно высокую, среднюю или низкую чувствительность опухолевых клеток пациента к цитарабину in vitro; и если опухолевые клетки пациента:

характеризуются низкой чувствительностью к даунорубицину и цитарабину, прогнозируют очень высокую вероятность резистентности пациента к лечению данными препаратами;

характеризуются низкой чувствительностью к цитарабину, прогнозируют очень высокую вероятность резистентности пациента к монотерапии цитарабином;

высокочувствительны к даунорубицину, при этом высоко-, средне- или низкочувствительны к цитарабину, прогнозируют высокую вероятность ремиссии или ремиссии с последующим ранним (в течение первых двенадцати месяцев) рецидивом при лечении двумя данными препаратами;

высокочувствительны к даунорубицину и цитарабину, прогнозируют примерно 50%-ную вероятность ремиссии у пациента при лечении его двумя данными препаратами или только цитарабином.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опухолевые клетки выделяют из пробы крови или костного мозга путем центрифугирования через LSM (Lymphocyte Separation Medium).

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделенные опухолевые клетки перед размещением в лунках планшета культивируют в СО₂-инкубаторе в течение суток.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в каждую лунку планшета для культивирования клеток с цитостатическим препаратом помещают 50-200 тысяч опухолевых клеток.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опухолевые клетки культивируют со следующими концентрациями даунорубицина (мкМ/л): 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1;2.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опухолевые клетки культивируют со следующими концентрациями цитарабина (мкМоль/л): 0; 0,001; 0,01; 0,2; 0,8; 4,1; 40,8; 82.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опухолевые клетки культивируют с цитостатическими препаратами в течение 48-72 часов.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что раствор WST-1 добавляют по 10 мкл исходного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл в каждую опытную и контрольную лунку.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опухолевые клетки культивируют с WST-1 в течение 2-3 часов.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что IC50 определяют с помощью графика зависимости процента выживших клеток в лунках от концентрации цитостатического препарата в этих лунках или с помощью программы OriginPro 7.5.