Способ получения и концентрирования микрорнк-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток. Способ включает выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения. В качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфа-МЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри. При достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7 дней. При получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа. В результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами. Полученные экзосомы могут быть использованы в течение 2 недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6 месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2 лет при отрицательных температурах или +4°С. Использование данного способа позволяет получить и концентрировать микроРНК-содержащие экзосомы мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в средствах для стимуляции регенеративных процессов.

 

Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологиям, а более конкретно к способам получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.

Регуляторные микроРНК вырабатываются практически всеми клетками организма и выделяются во внеклеточное пространство в виде экзосом. Экзосомы образуются из эндосомальных мультивезикулярных телец и состоят из двухслойного липидного слоя, включая керамиды, холестерол, сфинголипиды, фосфоглицериды и белки-рецепторы (Tkach, Mercedes et al. Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go. Cell, Volume 164, Issue 6, 1226-1232. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.043). Экзосомы являются универсальным транспортом микроРНК, обеспечивая их защиту и проникновение в клетки. В большинстве случаев высокоспециализированные клетки, такие как гепатоциты, альвеоциты, кардиомиоцты синтезируют свой, уникальный спектр микроРНК, свойственный для своего микроокружения (Chen-Rong Tsao et al. Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes: A New Hope for the Treatment of Cardiovascular Disease? Acta Cardiol Sin 2014; 30:395-400). Например, гепатоциты вырабатывают те микроРНК, действие которых приводит к пролиферации гепатоцитов, регкрутингу их предшественников, повышению синтетической активности (Herrera Sanchez et al. Extracellular vesicles from human liver stem cells restore argininosuccinate synthase deficiency. Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:176, DOI 10.1186/s 13287-017-0628-9).

Таким образом, использование микроРНК в практике ограничивается их составом и происхождением.

Согласно данным литературы, стволовые клетки участвуют в стимуляции регенеративных процессов практически при любой патологии. Согласно современным данным, это отчасти зависит и от их синтетической активности (Lu et al. Exosomes as potential alternatives to stem cell therapy for intervertebral disc degeneration: in-vitro study on exosomes in interaction of nucleus pulposus cells and bone marrow mesenchymal stem cells Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:108, DOI 10.1186/s 13287-017-0563-9).

Основной регенеративный эффект стволовых клеток обусловлен за счет экспрессии специфических микроРНК, активирующих пролиферативные и другие необходимые для регенерации процессы. Поэтому особенно важно разработать способ, позволяющий эффективно выделять из культуры стволовых клеток экзосомы, обогащать их и использовать для разработки лекарственных и косметических средств.

Известен способ получения экзосом (Processes for producing stable exosome formulations US 20160158291 A1 Номер заявки US 14/958,804, Дата публикации 9 июня 2016): в котором экзосомы получают из другого типа клеток (кардиосфер). Выделение экзосом проводится с помощью фильтрации и ультрафильтрации.

Недостатком известного способа является сложность и длительность процесса обогащения экзосом в культуральной жидкости.

Известен также способ получения экзосом (Method of purifying exosomes WO 2012087241 A1 (Номер заявки PCT/SG2011/000441, Дата публикации 28 июня 2012): в котором используются мезенхимально-стромальные клетки, а для получения экзосом использованы ионнообменные колонны.

Недостатком способа является его сложность.

Известен также способ получения экзосом (Methods and compositions for exosome isolation US 20130273544 A1 Номер заявки US 13/765,677,

Дата публикации 17 окт 2013): данный способ использует полимеры для разделения экзосом.

Недостатком метода является невысокая эффективность.

Известен метод получения экзосом из клеток плаценты и жира, (Exosome compositions and methods for preparation and use thereof for regulating and conditioning skin and hair WO 2017023690 A1 Номер заявки PCT/US2016/044458 Дата публикации 9 фев 2017): Данный патент описывает получение экзосом из клеток плаценты и жира, для выделения экзосом используется ультрацентрифугирование, а для получения экзосом с повышенным содержанием белка используют «тепловой шок».

Известен способ производства крема (Skin cream WO 2015009325 A1 (Номер заявки PCT/US2013/051394, Дата публикации 22 янв 2015), содержащего экзосомы и цитокины. В качестве клеток - продуцентов экзосом используются трансформированные и обычные фибробласты, а для выделения экзосом использована химическая преципитация и ультрацентрифугирование.

Известна кондиционная среда, предназначенная для лечения повреждений нормальных тканей (коржи и слизистых), вызванных ожогом. Она содержит минеральные соли, антибиотики и питательные вещества, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека, включая продукты их жизнедеятельности. Кондиционную среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в Go периоде клеточного цикла, а затем среду собирают, (патент RU 2292212 (Заявка: 2005116811/15, 02.06.2005, Опубликовано: 27.01.2007):

Недостатком известной кондиционной среды является ее использование только для лечения ожогов.

Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является метод получения экзосом из клеток плаценты и жира, (Exosome compositions

and methods for preparation and use thereof for regulating and conditioning skin and hair WO 2017023690 Al Номер заявки PCT/US2016/044458 Дата публикации 9 фев 2017), в котором получают экзосомы из клеток плаценты и жира, для выделения экзосом используется ультрацентрифугирование, а для получения экзосом с повышенным содержанием белка используют «тепловой шок».

Недостатком известного способа является то, что экзосомы получают только из клеток плаценты и жира, из-за чего количество получаемых экзосом ограничено и не позволяет получать экзосомы в необходимых количествах.

Задачей изобретения является создание эффективного и производительного способа получения и концентрирования микроРНК содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток, содержащий выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения, в котором в качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфаМЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100%

монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным, или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри, и при достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя, культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7-и дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами, далее полученные экзосомы могут быть использованы в течении 2-х недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6-ти месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2-х лет при отрицательных температурах или +4°C.

Способ основан на выработке мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующим культивированием и сбором культуральной жидкости, обогащенной экзосомами. В дальнейшем, производится концентрация экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации. Полученный концентрат замораживается или высушивается для долгосрочного хранения.

Преимущества способа заключаются в источнике экзосом, их особенности получения, концентрировании и хранении.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфаМЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным, или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри, и при достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя, культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7-и дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных

частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами, далее полученные экзосомы могут быть использованы в течении 2-х недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6-ти месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2-х лет при отрицательных температурах или +4°С.

Процесс лиофилизации проводится в лиофильной сушке в два этапа. Предварительно экзосомальный концентрат замораживают в соответствующей посуде для сушки до -70°С в морозильной камере, затем проводится сушка в лиофильной камере по схеме:

Первичная сушка

Шаг 1 - охлаждение до -40°С и выдержка 90 минут, давление 100 mT

Шаг 2 - охлаждение до -30°С и выдержка 600 минут, давление 100 mT

Шаг 3 - охлаждение до -10°С и выдержка 300 минут, давление 100 mT

Шаг 4 - охлаждение до 0°С и выдержка 120 минут, давление 100 mT

Шаг 5 - нагрев до +10°С и выдержка 120 минут, давление 100 mT

Вторичная сушка проводится при +20°С минимум 120 минут при 100 mT

Концентрат экзосом, полученный предлагаемым способом, может быть использован для добавления в косметическую продукцию с целью замедления процессов старения кожи, стимуляции синтеза внеклеточного матрикса и улучшения состояния кожи. Так же, экзосомы могут быть использованы для создания кремов и гелей для стимуляции регенерации поверхностных и глубоких повреждений или для создания инъекционных препаратов, стимулирующих восстановление утраченных функций. Предлагаемый способ эффективен и имеет высокую производительность

Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток, содержащий выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения, в котором в качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфа-МЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри, и при достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7 дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами, далее полученные экзосомы могут быть использованы в течение 2 недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6 месяцев или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2 лет при отрицательных температурах или +4°С.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного. Для этого проводят забор пуповины у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным пептидам, и может быть использовано для понижения или блокирования иммунного ответа к антигену, входящему в состав иммуногенного пептида.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к стабильной клеточной линии карциномы молочной железы человека SKBR-kat, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2. Линия получена путем трансфекции клеток исходной линии SKBR-3 плазмидой, содержащей ген флуоресцентного белка Katushka.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую тирозин в концентрации от 4 до 50 мМ и поливиниловый спирт (PVA) в концентрации от 0,5 до 10 г/л и способ культивирования клеток, включающий приведение клеток млекопитающего в контакт со средой для культивирования клеток эмбриональной почки человека (293), клеток почки новорожденного хомячка (BHK), клеток яичника китайского хомячка (CHO), мышиных клеток Сертоли, клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток рака шейки матки человека (HeLa), клеток почки собаки, клеток печени крысы линии Buffalo, клеток легкого человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мыши, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к культивированию стволовой клетки с субфракционированием. Способ включает культивирование клеток костного мозга, выделенных от индивидуума, перенос только супернатанта в новую емкость и культивирование указанного супернатанта.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования клетки млекопитающего, при этом способ предусматривает: обеспечение многолуночного планшета, содержащего по меньшей мере одну лунку, содержащую клетку млекопитающего, помещенную в первую жидкую культуральную среду, причем первая жидкая культуральная среда занимает от приблизительно 5% до приблизительно 70% объема лунки; инкубирование многолуночного планшета в течение некоторого периода времени при от приблизительно 31°C до 40°C и с перемешиванием вращением со скоростью от приблизительно 320 оборотов в минуту (об/мин) до приблизительно 500 об/мин; и непрерывно или периодически, в течение этого периода времени, удаление первого объема первой жидкой культуральной среды и добавление к первой жидкой культуральной среде второго объема второй жидкой культуральной среды, причем первый и второй объемы являются приблизительно равными, где: многолуночный планшет инкубируют в течение периода времени более 7 дней и в 1-3 день инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 30% до приблизительно 50% объема первой жидкой культуральной среды; в 4-6 день инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 40% до приблизительно 70% объема первой жидкой культуральной среды; и в 7 день и при дальнейшей инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 90% до приблизительно 150% объема первой жидкой культуральной среды.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для терапевтического применения, содержащая: кондиционированную мезенхимальными стволовыми клетками среду, причем кондиционированная среда содержит терапевтически эффективные количества: по меньшей мере двух факторов, которые оказывают противовоспалительное действие; по меньшей мере двух факторов, которые вызывают иммуномодулирующее действие; по меньшей мере двух факторов, которые участвуют в процессах васкулогенеза и ангиогенеза; и по меньшей мере двух факторов, которые стимулируют регенерацию ткани; один или более модификатор реологии; и один или более кондиционирующий агент; причем стволовые клетки, применяемые для кондиционирования среды, характеризуются положительной экспрессией маркеров CD29 и CD44 и отрицательной экспрессией маркеров CD11b и CD45.

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен связывающий домен против EGFRvIII, содержащий его химерный антигенный рецептор, кодирующие нуклеиновые кислоты, вектор, клетка, а также применения указанных изобретений в производстве лекарственного средства, способы создания клетки и получения популяции клеток, способ обеспечения иммунитета, способ лечения.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к нерегламентирорванному замораживанию клеток-предшественников периферической крови. Способ включает приготовление раствора криоконсерванта, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП 0,200-0,220, в условиях гипотермии добавляют его в раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10% и производят смешивание его с концентратом аферезных клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях, замораживание от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной контрольной температурой изотермической холодовой адаптации на каждом этапе замораживания.

Изобретение относится к области биотехнологии. Данный способ витрификации ооцитов млекопитающих может быть успешно применён к сельскохозяйственным животным, в частности для крупного рогатого скота (КРС).

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, а именно к композиции для лечения дегенеративных заболеваний суставов. Композиция для лечения дегенеративных заболеваний суставов, включающая мультипотентные мезенхимные стромальные клетки из жировой ткани (ММСК ЖТ), гель «Линтекс мезогель», аутосыворотку и физиологический раствор, взятые в эффективных количествах.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и может быть использовано для лечения пациентов с диагнозом лейкоз. Способ иммунотерапии раковых заболеваний заключается в том, что для пациентов с диагнозом лейкоз получают 5 мл костного мозга от здорового донора, затем выделяют из него мононуклеарные клетки, далее культивируют их в полной культуральной среде следующего состава: среда DMEM/F12 1:1 с HEPES с добавлением 2 ммоль/мл или 3,65 мг/10 мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной сыворотки, в условиях Т=37°С и 5% CO2 в течение 48-72 часов, затем выделяют из полученной культуральной среды экзосомосодержащий осадок путем дифференциального центрифугирования, растворяют его в фосфатно-солевом буфере в соотношение 1:5 - 1:20 и далее полученный раствор вводят per os пациенту с диагнозом лейкоз 1 раз в три дня после еды в утренние часы.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. Для трансплантации стволовых клеток при повреждении пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) в эксперименте у кролика проводят витрэктомию.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии, и представляет собой крем с секретомом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток для коррекции псориазиформного воспаления в эксперименте, содержащий 8 – 10 мл секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, содержащего 10-1000 мкг белка на 1 мл питательной среды, и до 100 мл индифферентной кремовой основы.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной и клинической медицине. Не менее чем за 50-58 часов до выполнения хирургической операции из костного мозга донора выделяют мононуклеарную фракцию клеток костного мозга.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен выделенный или по существу очищенный гепарансульфат HS8, при этом указанный HS8 способен специфически и с высокой аффинностью связываться с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности YCKNGGF (SEQ ID NO: 2) и имеющим от 0 до 20 дополнительных аминокислот на одном или на обоих концах указанной аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, при этом указанный по существу очищенный гепарансульфат HS8 содержит по меньшей мере 80% HS8, и при этом указанный гепарансульфат HS8 имеет определенный дисахаридный состав.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для оперативного лечения свежего перелома кости при нестабильном остеосинтезе.

Изобретение относится к эстетической медицине и может быть использовано для лечения нерубцовой алопеции. Способ лечения нерубцовой алопеции, заключающийся в том, что предварительно получают клеточный материал в виде аутологичных клеток волосяного фолликула, для чего выдергивают волосы из волосистой части головы взрослого донора и помещают их в раствор Хенкса с антибиотиком и антимикотиком, отбирают волосы, находящиеся в стадии анагена, и отсекают от них волосяные фолликулы, которые промывают раствором Хенкса с добавлением антибиотика и антимикотика и переносят в раствор коллагеназы I-го типа, где их инкубируют, и переносят в культуральные флаконы, а через 21 день клеточный материал диссоциируют из сфероидов, образованных в культуральных флаконах, получая окончательно клеточный материал в виде аутологичных клеток волосяного фолликула, и получают также клеточный материал в виде мезенхимальных стромальных клеток плаценты человека и клеточный материал в виде эндотелиоцитов пуповинной вены, после чего каждый вид клеточного материала переносят в суспензию с использованием раствора трипсина с версеном, материал промывают физиологическим раствором с последующим переносом в стерильной среде в вакуумную пробирку, затем клеточный материал трех полученных видов, полученный при определенных условиях, смешивают, переносят в пробирку и хранят, при определенных условиях, для последующего введения через иглу в мезодермальный слой кожи в виде папул с размером от 2 до 4 мм при угле наклона иглы в 45°.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для адаптивной клеточной иммунотерапии. Композиция по изобретению содержит T-лимфоциты CD4+ и T-лимфоциты CD8+, модифицированные химерным рецептором антигена.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для лечения остеоартроза коленного сустава. Производят введение в пораженный сустав через прокол нижне-латеральным доступом иглой 20G (0,9×70 мм) в наружный отдел полости коленного сустава 4,5 мл суспензии стромально-васкулярной фракции клеточного продукта в растворе Хартмана.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к композиции для индукции дифференцировки стволовых клеток в адипоциты. Композиция для индукции дифференцировки стволовых клеток в адипоциты для регенерации жировых тканей содержит в качестве ингредиента экзосомы, полученные из стволовых клеток, полученных из жировой ткани и дифференцирующихся в адипоциты, где экзосомы характеризуются тем, что содержат макрофагальный колониестимулирующий фактор (MCSF), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), лептин, инсулин, ангиопоэтин-1 (ANGPT1) и адипонектин с молекулярной массой 30 кДа (Acrp30). Группа изобретений относится также к инъекционной форме препарата, содержащей указанную композицию. Использование данной группы изобретений позволяет применять данную композицию в качестве агентов, индуцирующих дифференцировку стволовых клеток, инъекционных форм препаратов для регенерации тканей путем экспрессии экзосомами биоактивных факторов, оказывающих воздействие на дифференцировку в адипоциты. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 20 ил, 5 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток. Способ включает выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения. В качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфа-МЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови, культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100 монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри. При достижении 80-100 монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7 дней. При получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа. В результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами. Полученные экзосомы могут быть использованы в течение 2 недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6 месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2 лет при отрицательных температурах или +4°С. Использование данного способа позволяет получить и концентрировать микроРНК-содержащие экзосомы мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в средствах для стимуляции регенеративных процессов.

Наверх