Способ ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей
Владельцы патента RU 2713798:
федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии. Осуществляют ортотопическую трансплантацию культуры опухолевых клеток человека пищевода в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей, включающий рассечение кожи на шее иммунодефицитной мыши, тупое выделение трахеи и нижележащего пищевода от окружающих тканей и последующую инъекцию культуры опухолевых клеток в мышечную оболочку пищевода. При этом рассекают кожу у основания правой ушной раковины и достигают разрезом основания левой ушной раковины. Далее рассекают кожу по средней линии туловища длиной не менее 5 мм, начиная от первого разреза и заканчивая на уровне соединения третьих ребер с грудиной. После инъекции образовавшийся кожный дефект ушивают лигатурой с двумя иглами, одну из которых вводят у основания левой ушной раковины и протягивают к противоположному концу разреза, вторую иглу выкалывают в области основания правой ушной раковины. Ушивают горизонтальное рассечение кожи от правого и левого оснований ушных раковин правым и левым концами лигатуры соответственно до середины разреза, после чего ушивают кожное рассечение, идущее по средней линии туловища, поочередно двумя концами лигатуры, которые подтягивают по достижении нижнего края разреза, завязывают узел. Способ позволяет обеспечить оптимальный малотравматичный доступ к шейному отделу пищевода животного с последующим ушитием операционной раны с использованием только одной лигатуры при ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей с целью получения опухолевых моделей для доклинических исследований различных вариантов терапии рака пищевода. 5 ил.
Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей для получения ортотопической опухолевой модели, наиболее адекватно отражающей морфо-физиологические особенности развития рака верхнего отдела пищевода человека.
Ежегодно в мире наблюдается увеличение процента злокачественных новообразований в общей структуре заболеваемости. 3% от всех онкозаболеваний составляет рак пищевода, занимая по встречаемости третье место среди злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта (см. Янкин А.В. Рак пищевода: от статистики к диагностике // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4. - №2. - С. 61-65). Рак пищевода у 900 тыс. умерших онкологических больных является основной причиной смерти (см. Peto R. The causes of cancer // ECCO. - 1999. - Vol. 446. - S. 125.). Скрытое течение этого заболевания обусловливает позднюю диагностику и как следствие малоуспешное лечение (см. Ильин И.А., Малькевич В.Т. Отдаленные результаты хирургического лечения рака пищевода при различных типах оперативных вмешательств // Онкологический журнал. - 2016. - Т. 10. - №1 (37). С. 84-92). Рак пищевода характеризуется агрессивностью течения, выражающейся возникновением рецидивов и метастазов в течение первого года с момента установления диагноза (см. Скворцов М.Б. Рак пищевода: хирургическое лечение // Сибирский онкологический журнал. - 2011. - №4. - С. 21-30; см. Siegel R., Ward Е., Brawley О., Jenal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths // CA Cancer J. Clin. - 2011. - Vol. 61. - №4. - P. 212-236). Проблема терапии рака пищевода связана со сложностью выполнения хирургического лечения, носящего порой калечащий характер, ввиду трехзональной локализации органа и его тесной взаимосвязью с находящимися рядом жизненно важными органами (см. Ильин И.А., Малькевич В.Т. Отдаленные результаты хирургического лечения рака пищевода при различных типах оперативных вмешательств // Онкологический журнал. - 2016. - Т. 10. - №1 (37). С. 84-92. см. Гарин A.M., Базин И.С. Лекарственная терапия опухолей желудочно-кишечного тракта // Онкология, гематология и радиология. - 2015. - №2. С. 16-23). В связи с вышесказанным актуальным является усовершенствование терапевтических стратегий и разработка новых лекарственных препаратов.
Как известно, при разработке новых терапевтических подходов, а также изучении противоопухолевой активности новых веществ основополагающим этапом являются доклинические исследования, проводимые in vitro и in vivo с использованием живых тест-систем. Таковыми могут являться модели ксенографтов рака пищевода на иммунодефицитных животных.
Известен способ трансплантации карциномы пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитным крысам, включающий небольшое поперечное рассечение кожи на шее животного и разделение мышц, необходимое для доступа к трахее и нижележащему пищеводу, а также подшитие фрагмента опухоли к предварительно поврежденной стенке пищевода (см. Takeshi Hori, Yoshito Yamashita, Masaichi Ohira et al. A novel orthotopic implantation model of human esophageal carcinoma in nude rats: CD44H mediates cancer cell invasion in vitro and in vivo // Int. J. Cancer, 2001, 92, P. 489-496). Экстраполяция данного метода на иммунодефицитных мышей имеет недостаток - неудобный доступ к пищеводу из-за небольшого поперечного разреза шеи.
Известен способ ксенотрансплантации различных клеточных линий в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей методом инъекции. Доступ к пищеводу обеспечивали путем вертикального разреза длиной 10 мм и горизонтального поперечного разреза кожи шеи по типу «крест-накрест» (см. Lai Nar Tung, Senchuan Song, Kin Tak Chan et al. Preclinical Study of Novel Curcumin Analogue SSC-5 Using Orthotopic Tumor Xenograft Model for Esophageal Squamous Cell Carcinoma // Cancer Res Treat, 2018, 50(4), P. 1362-1377). Описанный способ обеспечивает достаточно широкий, а, следовательно, и удобный доступ к пищеводу. Однако, при таком разрезе обнажаются Salivary Gland, а вертикальный разрез достигает начала подбородка, что может доставлять неудобства животному в послеоперационном периоде. Еще одним недостатком является отсутствие описания ушития операционной раны, что является важным аспектом, определяющим качество жизни экспериментального животного. Неправильно наложенная лигатура может сковывать движения мыши, либо животное может разорвать шовный материал передними или задними конечностями.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей, обеспечивающего оптимальный малотравматичный доступ к шейному отделу пищевода животного с последующим ушитием операционной раны с использованием только одной лигатуры.
Технический результат изобретения достигается тем, что осуществляют ортотопическую трансплантацию культуры опухолевых клеток человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей, включающий рассечение кожи на шее иммунодефицитной мыши, тупое выделение трахеи и нижележащего пищевода от окружающих тканей и последующую инъекцию культуры опухолевых клеток в мышечную оболочку пищевода, отличающийся тем, что рассекают кожу у основания правой ушной раковины и достигают разрезом основания левой ушной раковины, далее рассекают кожу по средней линии туловища длиной не менее 5 мм, начиная от первого разреза и заканчивая на уровне соединения третьих ребер с грудиной, после инъекции образовавшийся кожный дефект ушивают лигатурой с двумя иглами, одну из которых вводят у основания левой ушной раковины и протягивают к противоположному концу разреза, вторую иглу выкалывают в области основания правой ушной раковины, ушивают горизонтальное рассечение кожи от правого и левого оснований ушных раковин правым и левым концами лигатуры соответственно до середины разреза, после чего ушивают кожное рассечение, идущее по средней линии туловища, поочередно двумя концами лигатуры, которые подтягивают по достижении нижнего края разреза, завязывают узел.
Способ осуществляют следующим образом.
Стандартизированная культура опухолевых клеток пищевода человека отмывается и ресуспендируется в бессывороточной культуральной среде 199, не содержащей антибиотики.
Реципиентом опухолевого материала служат иммунодефицитные мыши Balb/c Nude.
В качестве премедикации используют ксилазин концентрацией 20 мг/мл. Животных наркотизируют при помощи золетила концентрацией 22,57 мг/мл.
Для обеспечения доступа к шейному отделу пищевода иммунодефицитной мыши Balb/c Nude рассекают кожу на шее, начиная от основания правой ушной раковины и заканчивая у основания левой ушной раковины. Технически необходимое увеличение операционного поля осуществляется благодаря рассечению кожи перпендикулярно первому разрезу, по средней линии туловища длиной не менее 5 мм, начиная от первого разреза и заканчивая на уровне соединения третьих ребер с грудиной.
При помощи прямого анатомического пинцета производят тупое выделение трахеи и нижележащего пищевода от окружающих тканей.
Инъекцию суспензии культуры клеток осуществляют при помощи инсулинового шприца (100 U) с иглой 27 G. Объем вводимой суспензии составляет 20 мкл. Иглу шприца вводят с левой стороны от трахеи в мышечный слой пищевода. Об успешности проведенной инъекции должен свидетельствовать образующийся отек стенки пищевода в месте введения суспензии.
Кожное рассечение ушивают лигатурой из неабсорбируемого полипропилена толщиной 4-0 с двумя иглами, одну из которых вводят у основания левой ушной раковины и протягивают к противоположному концу разреза, вторую иглу выкалывают в области основания правой ушной раковины. Горизонтальный разрез кожи ушивают от правого и левого оснований ушных раковин правым и левым концами лигатуры соответственно по направлению к средней линии туловища. Вертикальный разрез кожи ушивают поочередно двумя концами лигатуры, которые подтягивают по достижении нижнего края рассечения, завязывают узел.
Изобретение иллюстрируется фигурами (1-5).
На Фиг 1 изображено тупое выделение трахеи и нижележащего пищевода от окружающих тканей у иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 2 изображена инъекция суспензии культуры клеток в стенку пищевода иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 3 изображена схема введения лигатуры у основания левой ушной раковины и ее выкалывания в области основания правой ушной раковины иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 4 изображена схема ушития операционной раны на шее иммунодефицитной мыши Balb/c Nude.
На Фиг 5 изображена иммунодефицитная мышь Balb/c Nude после ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток человека в шейный отдел пищевода.
Данным способом произведена ортотопическая трансплантация культуры опухолевых клеток человека в шейный отдел пищевода 30 иммунодефицитным мышам Balb/c Nude.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в том, что он позволяет обеспечить оптимальный малотравматичный доступ к шейному отделу пищевода животного с последующим ушитием операционной раны, не сковывающим движения животного в послеоперационном периоде благодаря использованию только одной лигатуры при ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей с целью получения опухолевых моделей для доклинических исследований различных вариантов терапии рака пищевода.
Способ ортотопической трансплантации культуры опухолевых клеток пищевода человека в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей, включающий рассечение кожи на шее иммунодефицитной мыши, тупое выделение трахеи и нижележащего пищевода от окружающих тканей и последующую инъекцию культуры опухолевых клеток в мышечную оболочку пищевода, отличающийся тем, что рассекают кожу у основания правой ушной раковины и достигают разрезом основания левой ушной раковины, далее рассекают кожу по средней линии туловища длиной не менее 5 мм, начиная от первого разреза и заканчивая на уровне соединения третьих ребер с грудиной, после инъекции образовавшийся кожный дефект ушивают лигатурой с двумя иглами, одну из которых вводят у основания левой ушной раковины и протягивают к противоположному концу разреза, вторую иглу выкалывают в области основания правой ушной раковины, ушивают горизонтальное рассечение кожи от правого и левого оснований ушных раковин правым и левым концами лигатуры соответственно до середины разреза, после чего ушивают кожное рассечение, идущее по средней линии туловища, поочередно двумя концами лигатуры, которые подтягивают по достижении нижнего края разреза, завязывают узел.
