Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека



Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека
Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека
Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека
Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека
Плазмида для выявления эпителиального состояния клетки человека
C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2716054:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается плазмиды для трансфекции в клетки человека для выявления их эпителиального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающей участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:l промотера гена-маркера эпителиального состояния, в качестве которого используют эпителиальный кадгерин человека и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера эпителиального состояния. Изобретение может использоваться в высокопроизводительном поиске лекарственных средств, а также для изучения факторов, влияющих на эффективность метастазирования. 3 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, а именно касается генетической конструкции, позволяющей оценивать эпителиальное состояние клеток человека. Представленная конструкция включают помимо стандартных элементов для функционирования данной конструкции участок промотера эпителиального кадгерина (CDH1) с нуклеотидной последовательностью Cdh1 - SEQ ID N0:1, а также флуорофор. Решение можно реализовать в высокопроизводительном поиске лекарственных средств, а также для выявления факторов, влияющих на эффективность метастазирования.

Уровень техники

Причиной более 90% смертельных исходов при онкологических заболеваниях является развитие метастазов [Каприн А.Д., Старинский В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность). 2015; Samatov T.R. et al. Novel biomarkers in cancer: The whole is greater than the sum of its parts // Seminars in Cancer Biology. 2016] Малигнизация опухолевых клеток сопровождается фенотипическими и функциональными изменениями, которые приводят к повышению пролиферативной активности и инвазивного потенциала. Приобретение клетками инвазивного фенотипа обусловлено процессом эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) [Samatov T.R. et al. Modelling the metastatic cascade by in vitro microfluidic platforms. // Prog. Histochem. Cytochem. 2015. Vol. 49, №4. P. 21-29]. При ЭМТ происходит разрушение межклеточных контактов, перестройка цитоскелета, а также повышение уровня экспрессии ряда генов-маркеров мезехимального состояния, таких как виментин, десмин и интегрин α5β1. Многочисленные исследования показали, что данный процесс ассоциирован с ключевыми стадиями процесса метастазирования [Yang J., Weinberg R.A. Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. // Dev. Cell. 2008. Vol. 14, №6. P. 818-829]. Таким образом ЭМТ рассматривается как потенциальная мишень при разработке противоопухолевых препаратов [Marcucci F., Stassi G., De Maria R. Epithelial-mesenchymal transition: a new target in anticancer drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 15, №5. P. 311-325].

В отличии от большинства систем скрининга противоопухолевых препаратов, основанных на измерении активности определенных молекулярных мишеней, все описанные на сегодняшний день подходы к выявлению молекул-ингибиторов ЭМТ основаны на регистрации изменения фенотипа модельных клеток. Это объясняется комплексностью процесса перехода клетки из эпителиального состояния в мезенхимальное. Так, стимулами данного процесса могут являться гипоксия, механический стресс, иммунный ответ, состав внеклеточного матрикса и противоопухолевые препараты [Marcucci F., Stassi G., De Maria R. Epithelial-mesenchymal transition: a new target in anticancer drug discovery // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 15, №5. P. 311-325]. В ряде работ были предприняты попытки идентифицировать отдельные молекулярные мишени для ингибирования ЭМТ, однако полученные данные являются противоречивыми [Reka А.K. et al. Identifying inhibitors of epithelial-mesenchymal transition by connectivity map-based systems approach. // J. Thorac. Oncol. 2011. Vol. 6, №11. P. 1784-1792; Polireddy K. et al. Targeting Epithelial-Mesenchymal Transition for Identification of Inhibitors for Pancreatic Cancer Cell Invasion and Tumor Spheres Formation. // PLoS One. 2016. Vol. 11, №10. P. e0164811; Lotz-Jenne C. et al. A high-content EMT screen identifies multiple receptor tyrosine kinase inhibitors with activity on TGFβ receptor. // Oncotarget. 2016. Vol. 7, №18].

Одним из способов определения соединений, влияющих на процесс ЭМТ, является регистрация изменения уровня экспрессии генов-маркеров эпителиального и мезенхимального состояний.

Из уровня техники известен способ выявления циркулирующих опухолевых клеток, сущность которого заключается в сборе цельной крови пациентов, удалении эритроцитов, выделении рибонуклеиновых кислот (РНК) опухолевых клеток и проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с специфичными праймерами к генам-маркерам эпителиального (ЕРСАМ, CDH1, KRT7, KRT19 и KRT20) и мезенхимального (CDH2, виментин, фибронектин, ММР9 и AKT2) состояния с регистрацией сигнала флуориметрическим детектором. Данное решение также применимо и к культурам клеток (CN 106868101, 2017-06-20). Недостатком данного способа является высокая длительность процедур выделения РНК и ПЦР, что не позволяет использовать данное решение для высокопроизводительного поиска лекарств.

Из уровня техники также известен способ определения и типирования циркулирующих опухолевых клеток, сущность которого заключается в регистрации количества клеток, находящихся в эпителиальном или в мезенхимальном состоянии, методом проточной цитометрии и антител, меченных флуорофорами, специфичных к белкам-маркерам эпителиального (ЕРСАМ, CDH1, KRT5, KRT7, KRT8, KRT16, KRT17, KRT18, KRT19, KRT20) и мезенхимального (CDH2, виментин, фибронектин, ММР2, ММР3, ММР9, AKT2, ZEB1, FOXC1, FOXC2, SNAI1, SNAI2, SERPINE1) состояния (CN 106996975, 2017-08-01). Недостатком данного способа является длительность процедуры проточной цитометрии, высокой стоимости используемых антител и оборудования.

Из уровня техники также известен способ выявления терапевтических мишеней, ассоциированных с ЭМТ, который заключается в определение содержания РНК генов-мишеней нейронального кадгерина и белков-мишеней в опухолевых тканях методами ПЦР, иммуноблоттинга, секвенирования и масс-спектрометрии (US 20130137584, 2013-05-30). Недостатком данного способа является отсутствие маркеров эпителиального состояния, что не позволяет оценивать соотношение клеток, находящихся в эпителиальном и мезенхимальном состоянии клеток, а также низкую производительность, что не позволяет использовать данный способ для высокопроизводительного поиска лекарств.

Из уровня техники также известен способ определения ЭМТ, который заключается в магнитной сепарации опухолевых клеток из цельной крови пациента с последующей оценкой уровня экспрессии генов-маркеров мезенхимального состояния (CDH2, виментин, фибронектин, Snail1, Snail2, Twist1 и др.) и стволовых клеток (FGF2, BMI1, ALDH1, CD44, CD24, KRT19 и др.) методом ПЦР (WO 200936968, 2009-03-26). Недостатком данного способа является высокая длительность процедур выделения РНК и ПЦР, что не позволяет использовать данный способ для высокопроизводительного поиска лекарств.

Наиболее близким решением является способ определения состояния клеток с использованием флуоресцентных репортеров, описанный в работе [Toneff M.J. et al. The Z-cad dual fluorescent sensor detects dynamic changes between the epithelial and mesenchymal cellular states // BMC Biol. 2016. Vol. 14, №1.P. 1-16], которой заключается в применении разработанного клеточного сенсора для слежения за динамикой перехода из эпителиального в мезенхимальные состояние и обратно. В качестве репортера эпителиального состояния используется флуоресцентный белок RFP, экспрессируемый под промотором CDH1, а в качестве маркера мезенхимального состояния - флуоресцентный белок GFP 3'-некодируемой областью (3'-UTR) ZEB1. Недостатком данного сенсора является механизм активации репортера мезехимального состояния, которая указывает не на транскрипционную регуляцию транскрипционного фактора CDH2, а на его пост-транскипционную регуляцию с помощью микроРНК.

Отличительной чертой ЭМТ является снижение уровня экспрессии эпителиального кадгерина (Е-кадгерина, ген CDH1), что приводит к разрушению межклеточных контактов. Подавление экспрессии генов, кодирующих белки эпителиальных клеточных контактов, сопровождается активацией генов, способствующих мезенхимальной адгезии. В частности, понижение экспрессии Е-кадгерина сопровождается повышением экспрессии мезенхимального нейронального кадгерина, N-кадгерина (CDH2). В результате у клеток появляется аффинность к мезенхимальным клеткам за счет гомотипичных белковых взаимодействий N-кадгеринов. Эти взаимодействия слабее, чем гомотипичные взаимодействия Е-кадгеринов, и способствуют клеточной миграции и инвазии [Theveneau Е., Mayor R. Cadherins in collective cell migration of mesenchymal cells // Current Opinion in Cell Biology. 2012. Vol. 24, №5. P. 677-684]. Таким образом, определение уровней экспрессии генов CDH1 и CDH2 может быть использовано для определения мезенхимального или эпителиального состояния клетки.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание генетической конструкции, обеспечивающей быструю и достоверную оценку эпителиального состояния клетки.

Сущностью заявленного технического решения является генетическая конструкция, способные обеспечивать экспрессию различных флуорофоров в клетках человека, находящихся в эпителиальном состоянии.

Техническим результатом изобретения является сокращение по времени выявление фенотипического состояния клеток до 2-3 часов, с высокой степенью достоверности.

Поставленная задача решается плазмидой для трансфекции в клетки человека для выявления их эпителиального состояния, включающей участок с нуклеотидной последовательностью промотера гена-маркера эпителиального состояния и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера эпителиального состояния, при этом в качестве гена-маркера эпителиального состояния используют эпителиальный кадгерин человека с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1.

Краткое описание чертежей

Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими материалами.

Фиг. 1 - Физическая карта генетической конструкции CDH1-TurboGFP.

Фиг. 2 - Фотография флюоресценции культуры клеток SH-SY5Y, находящихся в эпителиальном состоянии и экспрессирующих ген GFP после трансфекции конструкцией CDH1-TurboGFP.

Фиг. 3 - Фотография флюоресценции и культуры клеток иммунофлуоресцентный анализ состояния клеток MDA-MB-231 до индукции (А), фотография флюоресценции и культуры клеток иммунофлуоресцентный анализ состояния клеток MDA-MB-231 после индукции (Б.)

Осуществление изобретения

Средства и методы конструирования широко известны и описаны [Lundblad, R., Macdonald, F. (Ed.). Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Edition. 2010. Boca Raton: CRC Press].

Получение конструкций проводят, выделяя общую ДНК из первичных клеток или клеточных линий человека с использованием предназначенных для этого коммерческих наборов, например, PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Thermo Scientific, США) или аналогичных. Для этого отбирают образец ткани или проводят культивирование клеток в лабораторных условиях, отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, и далее следуют инструкции производителя. Отдельно синтезируются праймеры, специфичные к началу и концу промотера эпителиального кадгерина (CDH1). Праймеры должны дополнительно содержать участки с последовательностями, распознаваемыми эндонуклеазами рестрикции, аналогичные тем, что присутствуют в выбранном векторе, например SacI, Sall, XbaI, XhoI и др., причем при выборе сайтов рестрикции необходимо руководствоваться тем, содержащиеся в векторе последовательности флуоресцентных белков, должны находиться под контролем промотера CDH1. Для этого встраиваемая последовательность промотера CDH1 должна находиться на 5' конце последовательности последовательности флуоресцентного белка.

Затем проводят реакцию ПЦР с праймерами и используя полученную ДНК в качестве матрицы, а также коммерчески-доступных высокоточных полимераз, например Q5® High-Fidelity DNA Polymerase в буфере High GC Enhancer (New England Biolabs, США).

При выборе вектора руководствуются не только наличием необходимых сайтов рестрикции, но и наличием регуляторных элементов. В качестве векторов для создания генетических векторов могут быть использованы любые коммерческие векторы, содержащие ген устойчивости к антибиотикам для возможности селекции, например, ампициллин, канамицин, зеомицин и др., регуляторные элементы для экспрессии в эукариотических клетках, селективный маркер для возможности селекции плазмиды в бактериях, SV40 концевой интрон, ро1у(А)-сигнал, последовательность флуорофора, например, pNeoEGFP, pTurboRFP-PRL и другие. В качестве флуорофоров могут быть использованы и флуоресцентные белки, способные экспрессироваться в эукариотических клетках, например, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, синий флуоресцентный белок и другие.

Полученные в результате реакции ПЦР фрагменты и выбранный вектор подвергаются рестрикции по соответствующим сайтам. После этого, продукты рестрикции очищают, проводя электрофорез в 1% агарозном геле и выделяя с использованием коммерчески-доступных наборов для выделения из агарозного геля, innuPREP Gel Extraction Kit (Analytik Jena, Германия). Очищенный продукты рестрикции смешивают следующим образом: рестрицированный фрагмент промотора эпителиального кадгерина смешивают с рестрицированным вектором, рестрицированный фрагмент промотора нейронального кадгерина смешивают с рестрицированным вектором. Полученные смеси лигируют с использованием коммерчески-доступных лигаз, например, с помощью набора Quick Ligation™ Kit (New England Biolabs, США). После проведения лигирования, проводят трансфекцию клеток линий человека. В качестве клеточных линий могут быть использованы любые иммортализованные клеточные культуры человека, за исключением эмбриональных клеток человека. Так, например, могут быть использованы клеточные линии: SH-SY5Y, MCF-7, А-549, MDA-MB-231, DU-4477 и другие. Трансфекцию проводят с использованием и по протоколу коммерчески-доступных реагентов для трансфекции, например, Turbofect (Thermo Scientific Fisher).

Затем проводят селекцию на антибиотике, к которому в векторе содержится ген устойчивости, например, на ампициллине, канамицине, зеомицине и др. Для этого проводят культивирование клеток в среде, содержащей соответствующий антибиотик, например, 700 мкг/мл G-418 (Thermo Fischer Scientific) в течение трех недель со сменой среды каждые 3 дня. В результате получают клетки, трансфецированные вектором, содержащим участок промотера CDH1.

После этого полученные клетки используют для изучения воздействия лекарственных соединений на эпителиальное состояние трансфецированных клеток. Для этого проводят культивирование клеток в планшетах, в среде, содержащей различные концентрации изучаемого вещества или различные изучаемые соединения. После инкубации в течение 3-5 часов, проводят визуализацию клеток проводили с использованием флуоресцентного микроскопа, например, Carl Zeiss Axio Observer Z1 на каналах флуоресценции alexa 488 (для GFP) и в фазовом контрасте. По соотношению количества клеток, видимых на канале alexa 488 до и после инкубации с изучаемым соединением, оценивают его эффективность.

Осуществление заявленного технического решения демонстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В примере продемонстрирован процесс получения генетических конструкции, включающей участки промоторов промотеров эпителиального кадгерина (CDH1) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, а также флуорофор на основе генетической последовательности peTurboGFP-PRL-dest1.

При выборе длины клонируемого участка промоторов CDH1 учитывали два фактора: фрагмент промотора должен содержать сайты связывания с известными факторами транскрипции данных генов и в то же время обладать минимальным размером во избежание сложностей при амплификации.

В промоторной области CDH1 находятся несколько сайтов связывания транскрипционных факторов, регулирующих ЭМТ: Nf-kappaB (-516 п.н.), РАХ4 (-211 п.н.), ZEB1 (-1423 п.н.) и CREB1 (-480, -1404 п.н.). Помимо этого, на участке -1133 - -212 п.н. расположено 12 сайтов связывания ESR1, который является лиганд-независимым регулятором CDH1 [Cardamone M.D. et al. ERalpha as ligand-independent activator of CDH-1 regulates determination and maintenance of epithelial morphology in breast cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009. Vol. 106, №18. P. 7420-7425]. Существует ряд работ по исследованию эффективности люциферазного репортера в зависимости от длины контролирующего его участка промотора Е-кадгерина (от -1484 до -108 п.н.) в различных типах клеток, в том числе в клетках рака молочной железы [Hajra K.М., Ji X., Fearon E.R. Extinction of E-cadherin expression in breast cancer via a dominant repression pathway acting on proximal promoter elements. // Oncogene. 1999. Vol. 18. P. 7274-7279; Hajra K.M., David Y.S.C., Fearon E.R. The SLUG zinc-finger protein represses E-cadherin in breast cancer // Cancer Res. 2002. Vol. 62, №6. P. 1613-1618; Ji X. et al. Transcriptional defects underlie loss of E-cadherin expression in breast cancer. // Cell Growth Differ. 1997. Vol. 8, №7. P. 773-778]. Было показано, что участок промотора от -400 п.н. достаточен для экспрессии люциферазного репортера, однако его может быть недостаточно для негативной регуляции экспрессии Е-кадгерина. В работе [Toneff M.J. et al. The Z-cad dual fluorescent sensor detects dynamic changes between the epithelial and mesenchymal cellular states // BMC Biol. 2016. Vol. 14, №1. P. 1-16] был получен флуоресцентный репортер, экспрессирующий RFP под фрагментом промотора Е-кадгерина длиной 1370 п.н.; с использованием данного репортера было показано, что при индукции ЭМТ экспрессия RFP падала, что свидетельствует о том, что на участке промотора длиной 1370 п.н. содержатся сайты связывания факторов подавления экспрессии Е-кадгерина. Для создания репортерной системы был выбран участок промотора CDH1 -1433 - -48 п.н.

Культивируют любые клетки человека, например клетки линии SH-SY5Y или HEK-293 в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см2 в 5 мл среды DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Thermo Scientific, США) и 0,1% пенициллин/стрептомицина (Gibco, США). Из клеток выделяют общую ДНК, например, с использованием специализированного коммерческого набора Nucleospin tissue kit (производства фирмы Macherey Nagel, Германия). Последовательность участка промотера CDH1 представлена последовательностью SEQ ID NO:l. Данный фрагмент получают с использование выделенной ДНК в качестве матрицы, специфичных праймеров, представленных последовательностям SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, а также высокоточной полимеразы, например Q5® High-Fidelity DNA Polymerase в буфере High GC Enhancer (New England Biolabs, США).

После проведения амплификации промоторный участок гена CDH1 клонируют по сайтам рестрикции SacI и SalI, а участок промотора CDH2 по сайтам рестрикции NdeI и BblII, с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции (Thermo Fischer, США). Затем проводят электрофорез для полученных реакционных смесей в 0,5% агарозном геле, фрагменты с нужной массой выделяют с помощью набора innuPREP Gel Extraction Kit (Analytik Jena, Германия). Очищенный фрагмент промотора CDH1 лигируют с помощью набора Quick Ligation™ Kit (New England Biolabs, США) с предварительно рестрицированой плазмидой peTurboGFP-PRL-dest1 (Евроген, Россия). В результате был получен репортеры CDH1-TurboGFP (Фиг. 1).

Пример 2.

Накопление флуорофоров в клетках, находящихся в эпителиальном (на примере клеток линии SH-SY5Y).

Полученной в примере 1 репортерной конструкцией CDH1-TurboGFP трансфецируют клетки эпителиального (SH-SY5Y) фенотипа. Трансфекцию проводят с помощью трансфекционного агента Turbofect (Thermo Scientific Fisher) в двух повторах. Для получения стабильных линий клетки инкубируют в селективной среде, содержащей 700 мкг/мл G-418 (Thermo Fischer Scientific) в течение трех недель со сменой среды каждые 3 дня. Визуализацию клеток проводят с использованием микроскопа Carl Zeiss Axio Observer Z1 на каналах флуоресценции alexa 488 (для GFP) и в фазовом контрасте. На Фиг. 2 представлена фотография культуры клеток эпителиального фенотипа (SH-SY5Y). Установленная флюоресценция на канале флуоресценции alexa 488 свидетельствует о наличии зеленого флуоресцентного белка в данных клетках и об успешной экспрессии гена зеленого флуоресцентного белка с использованием генетической конструкции-репортера эпителиального состояния.

Пример 3

Изменение количества флуорофора в клетках при изменении их фенотипа. Полученную в примере 1 репортерную конструкцию CDH1-TurboGFP трансфецируют в клетки MDA-MB-231 как указано в примере 2. Проводят визуализацию клеток с использованием микроскопа Carl Zeiss Axio Observer Z1 на канале флуоресценции alexa 488 (для GFP) и в фазовом контрасте. Клетки культивируют, как указано во примере 2, затем меняют среду на бессывороточную и культивируют еще 24 часа. После этого индуруют ЭМТ с помощью раствора TGFβ (5 нг/мл) в бессывороточной среде и инкубируют в течение 72 часов. Затем часть клеток клеток повторно визуализируют с использованием флуоресцентного микроскопа, другую часть клеток фиксируют в 4% формальдегиде в фосфатном буфере (0,01 М фосфатно-солевой буфер) в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем обрабатывают 10% метанолом при -20°С в течение 5 минут. Клетки отмывают в фосфатном буфере и блокируют 1 час в 2% бычьей фетальной сыворотке в фосфатном буфере. Затем клетки инкубируют в течение двух часов с первичными антителами к Е-кадгерину (Invitrogen), в качестве маркера эпителиального состояния. Далее клетки промывают 5 раз по 5 минут фосфатным буфером, а затем инкубируют один час с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными метками AlexaFluor488 (1:1000, Abcam), и промывают 5 раз по 5 минут буфером ПБС. Клетки окрашивают DAPI (1:2000), промывают дважды ПБС и анализируют при помощи флуоресцентного микроскопа Фиг. 3.

Из данных, представленных на Фиг. 3 видно, что данные иммунофлуоресцентного анализа и фотографий флуоресценции репортера сходятся. Без индукции ЭМТ наблюдается экспрессия Е-кадгерина и накопление зеленого флуоресцентного белка.

Приведенные примеры осуществления предлагаемого изобретения показывают его осуществимость с использованием стандартного оборудования и материалов, полезность для применения в биотехнологиях, например, для высокопроизводительного поиска лекарств - ингибиторов ЭМТ.

Плазмида для трансфекции в клетки человека для выявления их эпителиального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающая участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:l промотера гена-маркера эпителиального состояния, в качестве которого используют эпителиальный кадгерин человека и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера эпителиального состояния.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду для трансфекции в клетки человека для выявления их мезенхимального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающую участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 промотера гена-маркера мезенхимального состояния, в качестве которого используют нейрональный кадгерин человека, и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера мезенхимального состояния.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, которое специфично связывается с PD-1. Также раскрыты композиция, содержащая указанное антитело, нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, вектор и клетка-хозяин, содержащие указанную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена молекула, специфически связывающая лиганд-1 белка программируемой смерти (PDL1) и ее применение, например, в составе фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные к специфическому связыванию с PD-L1.

Настоящая группа изобретений относится к адоптивной терапии. Предложены химерные рецепторы антигена (CAR), содержащие мезотелин-связывающий домен, а также кодирующие их нуклеиновые кислоты, вектор и клетка.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены биспецифическое антитело и слитый белок для специфического связывания с GD2 и CD3.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты антител к C10orf54 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, каждый из которых характеризуется наличием соответствующих CDRs1-3.

Настоящее изобретение относится к получению мультиспецифических конструкций. Предложены полинуклеотиды, вектор экспрессии, клетка-хозяин и способ получения мультиспецифического или биспецифического антитела.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложены новые варианты антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфично связываются с ММР9 и содержат вариабельные области тяжелой и легкой цепей, каждая из которых характеризуется наличием по меньшей мере соответствующих CDRs1-3.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана система CRISPR класса 2, содержащая: (i) единичный полинуклеотид, содержащий (a) нацеленную на мишень область, содержащую дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК); и (b) активирующую область, смежную с указанной нацеленной на мишень областью, содержащую ДНК; и где указанная активирующая область содержит стебель и выпетливание и способна взаимодействовать с белком Cas9; и (ii) Cas9.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду для трансфекции в клетки человека для выявления их мезенхимального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающую участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 промотера гена-маркера мезенхимального состояния, в качестве которого используют нейрональный кадгерин человека, и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера мезенхимального состояния.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к акушерству, гинекологии, инфекционной патологии и иммунологии, и может быть использовано при прогнозировании исхода беременности при урогенитальной инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам определения полиморфизма гена, ассоциированного с нежелательным рецессивным генетическим дефектом дупликации развития, характерного для крупного рогатого скота абердин-ангусской породы, а именно гена NHLRC2, ассоциированного с гаплотипом DDC.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus рода Alphatorquevirus семейства Anelloviridae.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генотерапевтическим ДНК-векторам для таргетной терапии, штамму Escherichia coli JM110-NAS и выбору для таргетной генной терапии генотерапевтического ДНК-вектора.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена экспрессионная кассета, содержащая промоторную нуклеотидную последовательность гена, кодирующего внутренний белок плазматической мембраны сои, функционально связанную с гетерологичной нуклеиновой кислотой.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к редактированию генов, и может быть использовано в медицине. Способ лечения дистрофического буллезного эпидермолиза включает доставку в кератиноциты пациента путем введения в эпидермис синтетической РНК, кодирующей редактирующий ген белок, который нацелен на ген COL7 и вызывает двухцепочечный разрыв в гене COL7, и доставку матрицы для репарации COL7 пациенту, для редактирования гена COL7.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный рецептор.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, специфически связывающемуся со склеростином человека, молекуле ДНК, его кодирующей, а также к вектору и клетке-хозяину, содержащим вышеуказанную молекулу ДНК. Также раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Изобретение также относится к применению вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции, его содержащей, для лечения костного заболевания или расстройства, опосредованного склеростином человека (SOST), и для применения в повышении по меньшей мере одного из костной массы, минеральной плотности костей, минерального содержания костей или прочности костей. Изобретение позволяет эффективно осуществлять лечение заболевания или расстройства, опосредованного склеростином человека. 13 н. и 20 з.п. ф-лы, 2 ил., 11 табл., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается плазмиды для трансфекции в клетки человека для выявления их эпителиального состояния в отношении процесса эпителиально-мезенхимальной трансформации, включающей участок с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:l промотера гена-маркера эпителиального состояния, в качестве которого используют эпителиальный кадгерин человека и по меньшей мере одну последовательность флуоресцентного белка TurboGFP, при этом участок нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка находится под контролем промотера гена-маркера эпителиального состояния. Изобретение может использоваться в высокопроизводительном поиске лекарственных средств, а также для изучения факторов, влияющих на эффективность метастазирования. 3 ил.

Наверх