Способ определения белков с помощью гигантского комбинационного рассеяния с использованием криозолей плазмонных наночастиц

Изобретение относится к области определения биомолекул с помощью эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и может быть использовано в медицинской диагностике для определения белков-маркеров различных патологий, в том числе с использованием технологии «лаборатория на чипе». Способ определения белков включает приготовление твердофазного ГКР-субстрата, представляющего собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, замороженную на подложке из теплопроводного не имеющего собственного КР-спектра материала; воздействие на полученный субстрат лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии, запись ГКР-спектра и его матобработку. Технический результат состоит в повышении интенсивности и увеличении соотношения сигнал/шум получаемых спектров, в т.ч. в присутствии примесей, и в повышении стабильности получаемых результатов анализа во времени. 8 з.п. ф-лы, 7 ил.

 

Изобретение относится к области определения биомолекул с помощью эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и может быть использовано в медицинской диагностике для определения белков-маркеров различных патологий, в том числе, с использованием технологии «лаборатория на чипе».

В настоящее время все более широкое применение находят микрофлюидные устройства, так называемые «лаборатории на чипе», позволяющие быстро и надежно обнаруживать и количественно определять в биологических жидкостях пациента (кровь, моча, слюна и др.) наличие биомаркеров, свидетельствующих о развитии тех или иных заболеваний. Эти устройства, предназначенные для экспресс-диагностики «у постели больного», должны быть компактны, мобильны, недороги, просты в изготовлении и использовании и обеспечивать получение надежных диагностических результатов.

Для идентификации биомаркеров в подобных системах в числе других применяют методы, основанные на эффекте гигантского комбинационного рассеяния, см., например, [US 7267948 В2, опубл. 11.09.2007] и др. В англоязычной литературе для его обозначения используют аббревиатуру SERS (Surface Enhanced Raman Scattering). Эффект ГКР наблюдается при регистрации комбинационного рассеяния (КР) света от молекул, адсорбированных на поверхности наноструктур некоторых металлов, в частности, серебра и золота. При облучении лазером за счет индукции локализованных поверхностных плазмонов в металлических наноструктурах достигается многократное усиление локальных электрических полей, что позволяет усилить сигнал КР. Спектроскопия с использованием эффекта ГКР обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения и определения анализируемых веществ, в частности, большая скорость анализа, возможность регистрировать спектр ГКР заданного вещества в смеси с посторонними веществами за счет возможности выделить спектр отдельного соединения из общих спектральных данных, высокая чувствительность, сравнимая с классическими иммуноферментными методами анализа. Во всем мире наблюдается повышенный интерес к практическому применению спектроскопии ГКР для детекции и/или идентификации биомаркеров различных патологий, в том числе, биомаркеров белковой природы.

Для усиления локальных электромагнитных полей и получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния часто применяют коллоидные растворы плазмонных наночастиц, обычно серебра или золота [Lucas A. Lane, Ximei Qian, Shuming Nie, SERS Nanoparticles in Medicine: From Label-Free Detection to Spectroscopic Tagging, Chemical Reviews, 2015, 115(19), 10489-10529]. В отличие от ГКР-активных наноструктурированных поверхностей, получаемых при помощи литографических методов, наночастицы относительно дешевы, долго хранятся и не требуют сложного оборудования для получения и использования. Как правило, раствор анализируемого образца смешивают с коллоидным раствором наночастиц, после чего наночастицы должны сформировать агрегаты, имеющие частоты плазмонного резонанса, близкие к частоте лазера, используемого для получения сигнала КР. Получают спектры ГКР с высокими коэффициентами усиления сигнала, что позволяет обнаруживать наличие в растворе низких концентраций целевых белков и проводить их количественное определение по интенсивности характерных полос на получаемом спектре.

Однако, достаточное для получения надежного диагностического результата усиление сигнала полностью зависит от характера агрегации плазмонных наночастиц, приводящего к формированию «горячих точек» -участков максимального усиления локального электрического поля в результате плазмонного резонанса в отдельных участках, расположенных между агрегированными частицами. Неагрегированные наночастицы имеют пренебрежимо малую ГКР-активность, из-за чего проблема контролируемой агрегации наночастиц является одним из основных направлений исследований в области применения ГКР.

В присутствии анализируемого вещества агрегация может быть самопроизвольной. Так, в статье [Li-Jia Xu, Cheng et. al. "Label-Free Detection of Native Proteins by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Using Iodide-Modified Nanoparticles", Analytical Chemistry, 2014, 86: 2238-2245] описано определение нативных белков с помощью ГКР, включающее самопроизвольную агрегацию серебряных наночастиц в золе в присутствии исследуемого белка, со снятием спектров непосредственно из жидкой капли. В этом случае молекула белка служит в качестве моста, связывающего отдельные плазмонные наночастицы в агрегаты, в центре которых находится белок. Такой подход позволяет получить очень интенсивные спектры, но не обеспечивает хорошую воспроизводимость - в статье указано, что для некоторых аналитов авторы дополнительно добавляют в качестве агрегирующего реагента сульфат магния. Кроме того, самопроизвольная агрегация обычно происходит в относительно чистых растворах - присутствие примесей зачастую препятствует формированию агрегатов из белковых молекул и плазмонных наночастиц. Такой способ агрегации также требует контроля рН раствора и знания изоэлектрической точки исследуемых белков, т.к. в большинстве случаев связывание белка и плазмонных наночастиц, которые обычно отрицательно заряжены, обусловлено электростатическим притяжением за счет положительного заряда белков. Соответственно, становится необходимо использовать значения рН, при которых белок имеет достаточно большой положительный заряд. Это накладывает ограничения на универсальность метода, поскольку многие белки теряют стабильность при тех значениях рН, при которых они приобретают положительный заряд.

Улучшения воспроизводимости результатов для различных типов аналитов можно добиться при помощи принудительной агрегации частиц в золе. С этой целью для получения агрегированных наноструктур в коллоидных растворах наночастиц металлов используют химические агрегирующие агенты, как правило, соли металлов, например, хлорид лития [WO 2005065541 (А2), опубл. 21.07.2005], хлорид натрия [Soumik Siddhanta, Dhanasekaran Karthigeyan, Partha P. Kundu, Tapas K. Kundu, Chandrabhas Narayana, Surface enhanced Raman spectroscopy of Aurora kinases: direct, ultrasensitive detection of autophosphorylation, RSC Advances, 2013, 3: 4221-4230], закисленный сульфат натрия [Xiao X. Han, et. al. "Label-Free Highly Sensitive Detection of Proteins in Aqueous Solutions Using Surface-Enhanced Raman Scattering, Analytical Chemistry, 2008, 81: 3329-3333]. Однако, образцы, полученные из биологического материала пациента, не являются чистыми растворами анализируемых белков и могут содержать множество примесей, способных препятствовать агрегации наночастиц даже после добавления агрегирующего реагента. Агрегирующий реагент также может вытеснять анализируемое вещество с поверхности наночастиц, тем самым препятствуя получению сигнала. Применяемый чаще всего в качестве агрегирующего реагента хлорид натрия может служить типичным примером - хлорид-ион способен вытеснять с поверхности серебра многие вещества, которые в его отсутствие могли бы дать интенсивный сигнал. Сродство аналитов к серебру варьирует, поэтому сложно подобрать агрегирующий реагент, не имеющий собственного спектра и пригодный к использованию для определения широкого круга анализируемых веществ, тем более в присутствии посторонних примесей. Другое ограничение связано с тем, что в присутствии агрегатора может наблюдаться нерегулируемый рост степени агрегации, в результате чего интенсивность сигнала ГКР начинает падать, при этом регистрирация ГКР-спектров с временами накопления больше 20-60 секунд, становится неэффективной. Это связано с тем, что упомянутые выше «горячие точки» расположены по всему объему растущего агрегата, а сигнал ГКР генерируется только «горячими точками», расположенными на его поверхности. По мере роста агрегатов отношение объема к поверхности растет, и количество анализируемого белка, попавшего в «горячие точки», находящиеся внутри агрегата и таким образом экранированные, растет, в то время как количество аналита в «горячих точках» на поверхности агрегатов падает вместе с общей поверхностью раздела фаз в коллоидной системе. В результате, существует оптимальный уровень агрегации, в котором система пребывает ограниченное время.

Достижение принудительной агрегации наночастиц металлов в коллоидных растворах возможно под действием физических методов. В статье [Jianhua Zhou et. al. "Convenient formation of nanoparticle aggregates on microfluidic chips for highly sensitive SERS detection of biomolecules" Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402: 1601-1609] для принудительной агрегации золь золотых наночастиц пропускают через микрофлюидный канал микрочипа, снабженного клапаном, пропускающим воду, но задерживающим наночастицы. Наночастицы, концентрируясь в зоне перед клапаном, агрегируются за счет концентрирования и механического столкновения под действием потока жидкости. Через эту же зону пропускают раствор с анализируемым белком, который адсорбируется на сформированные агрегаты наночастиц и генерирует сигнал ГКР. После регистрации спектра ГКР клапан открывают, и агрегаты удаляются потоком, затем процесс можно повторить. К недостаткам способа следует отнести:

- необходимость использования меньших, чем обычно, мощностей лазера с целью предотвращения формирования пузырьков газа в микрофлюидном канале;

- потеря в интенсивности сигнала, вызванная тем, что анализируемый белок подают уже после формирования агрегатов, когда общая поверхность, доступная для адсорбции уже уменьшилась;

- уязвимость к наличию примесей, конкурентно связывающихся с наночастицами.

В работе [Barbara Fazio et. al. "SERS detection of Biomolecules at Physiological pH via aggregation of Gold Nanorods mediated by Optical Forces and Plasmonic Heating", Scientific Reports 2016, 6, doi:10.1038/srep26952] описан способ ГКР анализа биомолекул, в котором агрегацию плазмонных наночастиц индуцируют при помощи оптических сил и плазмонного нагрева, т.е. наночастицы вынужденно двигаются под давлением света и концентрируются около поверхности ячейки, оставаясь в луче лазера из-за взаимодействия индуцированного в частице дипольного момента и электрического поля лазера. Смесь раствора анализируемого образца и золя наночастиц помещают под лазер, в результате чего происходит самопроизвольная сборка агрегатов, включающих наночастицы и молекулы анализируемого вещества. Недостатком способа является необходимость использования наночастиц определенной формы (авторы используют золотые наностержни), т.к. форма наночастиц влияет на характеристики движения под действием света. Как и в большинстве других способов, в данном случае также существует непредсказуемость и невоспроизводимость результатов при исследовании растворов, содержащих разнообразные примеси, например, биологических жидкостей и их экстрактов. Также, поскольку агрегаты формируются в течение длительного времени (до 30 минут), возможна денатурация белковых молекул из-за длительного нагрева лазером.

Общей чертой всех упомянутых аналогов является то, что формирование агрегатов наночастиц с белковыми молекулами происходит в жидкой фазе. В качестве прототипа настоящего изобретения взят способ определения белка с помощью ГКР, основанный на использовании твердофазного ГКР-субстрата, содержащего агрегаты наночастиц серебра с белком [Sercan Keskina, Mustafa Culha, "Label-free detection of proteins from dried-suspended droplets using surface enhanced Raman scattering", International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 537-547]. Для получения твердого ГКР-субстрата навеску белка (лизоцим, цитохром С, миоглобин, BSA и др.) растворяют в воде и добавляют золь серебряных наночастиц, приготовленный по общепринятой методике [Ratyakshi, R.P. Chaunan, Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles, Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116] путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия при кипячении. В одном из вариантов способа каплю смеси помещают на нижнюю сторону горизонтально расположенной подложки из фторида кальция, после чего высушивают при комнатной температуре. После высушивания подложку переворачивают и проводят измерение сигналов ГКР с поверхности высушенной капли с использованием конфокального микроскопа на спектрометре с длиной волны лазера 785 нм. В процессе высушивания наночастицы формируют агрегаты постоянного размера, что позволяет получать сигналы ГКР, не деградирующие со временем. При этом агрегаты включают в себя белок независимо от заряда белковой молекулы, что позволяет использовать отрицательно заряженные наночастицы для определения отрицательно заряженных белков. К недостаткам способа следует отнести:

- относительно низкий уровень сигнала, поскольку сигнал снимается с плоской поверхности, которая содержит меньше «горячих точек», чем аналогичный объем жидкости,

- невозможность использования больших мощностей лазера, что вызвано неэффективным отводом тепла от точки фокусировки лазера - высушенный золь не является сплошной металлической пленкой и обладает ограниченной теплопроводностью, а плазменный резонанс приводит к усиленному поглощению энергии лазера и нагреву агрегатов.

- ненадежность результатов в присутствии примесей. В процессе высушивания увеличение концентрации примесей может индуцировать неконтролируемую агрегацию наночастиц и нарушить равномерное распределение наночастиц и анализируемых белков в высушенной капле.

- сложность подготовки ГКР-субстрата, связанная с необходимостью использования специальных материалов подложки и обеспечения гладкости и чистоты поверхности.

Техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в совершенствовании ГКР-способа анализа белков с использованием твердофазного ГКР-субстрата. Настоящее изобретение обеспечивает повышение интенсивности и увеличение соотношения сигнал/шум получаемых спектров в отсутствие агрегирующих реагентов, в том числе, в присутствии примесей, а также позволяет повысить стабильность и воспроизводимость получаемых результатов анализа во времени.

Техническая проблема решена заявляемым способом определения белков с использованием гигантского комбинационного рассеяния, включающим приготовление твердофазного ГКР-субстрата, содержащего смесь плазмонных наночастиц с содержащим белок анализируемым образцом, воздействие на полученный субстрат лучом лазера, запись ГКР-спектра и его математическую обработку, отличающимся тем, что в качестве твердофазного ГКР-субстрата используют криозоль, представляющий собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, при этом капля смеси заморожена на подложке из теплопроводного, не имеющего собственного спектра комбинационного рассеяния, преимущественно, отражающего свет материала, а воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии в процессе анализа.

Перечисленные ниже графические материалы поясняют сущность изобретения. На всех фигурах по оси ординат указана интенсивность ГКР-спектра в CCDcts (CCD counts - количество условных цифровых единиц, накопленных ПЗС матрицей).

Фиг. 1. ГКР-спектр миоглобина в присутствии мочевины, полученный заявляемым способом. Образец для анализа - криозоль, полученный замораживанием в течение 20 мин. при температуре - 8°С смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором миоглобина, содержащего примесь мочевины. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы - 5×10¹⁰ ч./мл, миоглобин - 50 нг/мл, мочевина - 0,5 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек. Образец криозоля во время анализа охлаждают сухим льдом.

Фиг. 2. ГКР-спектр той же смеси в жидком виде без замораживания. Условия анализа: спектрометр BWTek i-Raman 532 nm, длина волны лазера 532 нм, мощность 7,5 мВт, время накопления 100 сек.

Фиг. 3 Сопоставление ГКР-спектров, представленных на Фиг. 1 и 2, приведенных в одном масштабе. А - ГКР-спектр криозоля, Б - ГКР-спектр жидкого золя.

Фиг. 4. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, полученных в соответствии с заявляемым способом, в зависимости от времени приготовления криозоля. Концентрация компонентов в криозоле: наночастицы - 5×10¹⁰ ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления криозоля, Б -зависимость интенсивности пика 1002 см^-1 от времени хранения криозоля. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.

Фиг. 5. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина, в жидком золе, полученных в разное время после приготовления. Концентрация компонентов в анализируемой смеси: наночастицы - 5×10¹⁰ ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. А - ГКР-спектры, измеренные через 1, 5, 10, 15 и 20 мин после приготовления раствора, Б - зависимость интенсивности пика 1002 см^-1 от времени хранения образца. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.

Фиг. 6. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина без и в присутствии примеси сахарозы. Образец для анализа - жидкий золь, полученный смешением (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина. В смесь добавляют NaCl и перемешивают. Концентрация компонентов в анализируемой смеси - наночастицы - 5×10¹⁰ ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, NaCl - 40 мМ. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек. А - ГКР-спектр гемоглобина без примеси сахарозы, Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в концентрации 10 мкг/мл.

Фиг. 7. Сопоставление ГКР-спектров гемоглобина в присутствии примеси сахарозы, полученных из криозоля и из раствора. А - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в криозоле, полученном замораживанием смеси (1:1 по объему) золя серебряных наночастиц (размер частиц 42 нм) с раствором гемоглобина, содержащего примесь сахарозы, в течение 60 мин при температуре -3°С. Концентрация компонентов в криозоле - наночастицы -5×10¹⁰ ч./мл, гемоглобин - 1000 нг/мл, сахароза - 10 мкг/мл. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек., охлаждение криозоля сухим льдом. Б - ГКР-спектр гемоглобина в присутствии сахарозы в жидком золе. Условия анализа: спектрометр BWTek innoRam 785 nm, длина волны лазера 785 нм, мощность 42 мВт, время накопления 5 сек.

Сущность физических процессов, предположительно, происходящих при формировании криозоля плазмонных наночастиц, описана ниже. При комнатной температуре в жидком водном золе в отсутствии агрегирующих реагентов плазмонные наночастицы (например, серебра или золота) находятся в состоянии свободной подвижности; по мере роста кристаллов льда плазмонные наночастицы концентрируются между кристаллами и агрегируют, формируя в местах столкновения фронтов кристаллизации воды трехмерные структуры, повторяющие контуры кристаллов льда. Особенностью заявляемого способа является одновременное концентрирование молекул определяемых белков в зоне формирования агрегатов в пространстве между растущими кристаллами льда.

Механизмы агрегации частиц в разбавленных коллоидных растворах недостаточно изучены, однако, на основании имеющихся данных можно предполагать, как формируется криозоль при замораживании раствора. Известно, что при замораживании водных растворов формирование льда начинается в отдельных центрах кристаллизации с постепенным ростом кристаллов, которые прекращают расти после столкновения разных фронтов кристаллизации. Растворимость веществ в формируемом кристалле, как правило, ниже, чем в жидкой фазе, поэтому по мере замерзания в растворе растет концентрация веществ, которые были исключены из объема жидкости, потраченного на образование кристаллов. Между растущим льдом и жидкой водой существует равновесное соотношение концентрации растворенного вещества, из-за чего по мере кристаллизации концентрация растворенных веществ в жидкой фазе линейно растет, при условии ограниченного объема. Однако, это справедливо только при условии, что растворенное вещество успевает распределиться по всему объему за счет диффузии. При быстром росте кристалла диффузионные процессы начинают отставать от притока нового вещества в жидкую фазу, растворенное вещество не успевает диффундировать от фронта кристаллизации, а перед растущим кристаллом формируется зона повышенного содержания растворенных веществ. Чем быстрее растет кристалл льда и чем меньше растворимость вещества в твердой фазе, тем более резкий получается градиент концентрации. Максимальная концентрация должна наблюдаться на границе двух отдельных кристаллов льда.

Агрегация наночастиц происходит в результате похожего процесса концентрирования коллоидных частиц, вызванного их термодинамическим отталкиванием от растущего кристалла льда. Приток воды к поверхности кристалла и структурирование приповерхностных слоев молекул делает энергетически невыгодным нахождение частицы около интерфейса кристаллизации. Энергия взаимодействия воды с наночастицей служит энергетическим барьером для формирования льда и приводит к сверхохлаждению пограничного слоя воды, что замедляет рост кристалла и способствует вытеснению коллоидных частиц в жидкую фазу. Природа явления отличается от концентрирования растворенных веществ, но результат такой же. При этом, из-за малой скорости диффузии в коллоидных растворах даже перед медленно растущим кристаллом формируется слой с повышенной концентрацией наночастиц [Anthony М. Anderson, М. Grae Worster, «Freezing colloidal suspensions: periodic ice lenses and compaction)), Journal of Fluid Mechanics, 2014, 758: 786-808]. По мере преодоления электростатического отталкивания, сближенные наночастицы формируют перманентные агрегаты за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

Таким образом, в криозоле формируются зоны повышенной концентрации наночастиц и белков, особенно в местах столкновения двух растущих кристаллов льда. Формирующиеся агрегаты захватывают из раствора белковые молекулы, часть которых сорбируется в так называемых «горячих точках» (представляют собой зоны максимального усиления электромагнитного поля за счет эффекта ГКР), расположенных в основном между соседними частицами в агрегатах. Процесс сорбции белка в агрегатах имеет равновесный характер и зависит от концентрации белка в растворе, поэтому концентрирование белка вместе с наночастицами вносит вклад в усиление сигнала ГКР. При этом, как показывают экспериментальные данные и в соответствии с теоретическими представлениями, присутствие примесей в образце меньше влияет на агрегацию наночастиц при формировании криозоля, чем при агрегации в растворе.

По сравнению с прототипом, использование криозоля позволяет получить преимущество в интенсивности ГКР-спектров также за счет того, что рассеяние света происходит в объеме образца, а не на плоской поверхности. При этом большее количество «горячих точек», имеющихся в объеме, вносит вклад в интенсивность сигнала. Как показывают эксперименты, оптимальная интенсивность сигнала достигается при высоте столба замороженной жидкости около 1 мм.

Возможность использования эффекта совместной агрегации плазмонных наночастиц с молекулами белка при замораживании разбавленных коллоидных растворов для получения ГКР-субстратов, позволяющих регистрировать спектры аналитов непосредственно из замерзшей капли, обнаружена нами впервые и не является очевидной, поскольку процессы агрегирования, происходящие в концентрированных и разбавленных коллоидных системах, не идентичны и не до конца изучены.

В качестве плазмонных наночастиц могут быть использованы любые частицы, для которых агрегация способствует усилению эффекта ГКР, в частности, наночастицы серебра, или наночастицы золота, или гибридные наночастицы («core-shell» и др.), размером в диапазоне от 10 до 100 нм, обеспечивающем получение спектров с максимальной интенсивностью. Для получения криозолей могут быть использованы плазмонные наночастицы, полученные любым известным способом, например, путем восстановления нитрата серебра гидроксиламин-гидрохлоридом в щелочных условиях [Nicolae Leopold, Bernhard Lendl, "A New Method for Fast Preparation of Highly Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) Active Silver Colloids at Room Temperature by Reduction of Silver Nitrate with Hydroxylamine Hydrochloride", Journal of Physical Chemistry B, 2003, 107(24): 5723-5727] или восстановлением нитрата серебра цитратом натрия при кипячении [Ratyakshi, R.P. Chaunan, "Colloidal Synthesis of Silver Nano Particles", Asian Journal of Chemistry, 2009, 21(10): 113-116]. Содержание наночастиц в золе, используемом для получения криосубстрата, может варьировать в пределах от 10¹⁰ до 10¹³ ч./мл в зависимости от характеристик используемых наночастиц.

Анализируемый раствор белка и золь наночастиц смешивают в соотношении, близком к 1:1, обеспечивающим, как определено экспериментально, максимально равномерное смешение компонентов и эффективную сорбцию белка на поверхности наночастиц. Смесь перемешивают, затем замораживают, предпочтительно в темноте, при температуре, обеспечивающей формирование в условиях эксперимента агрегатов наночастиц такого размера, который соответствует максимальной интенсивности ГКР-спектров. На практике для большинства белков для получения криозоля используют температуру в диапазоне от минус 1°С до минус 10°С. Для получения криозоля аликвоту смеси помещают на светоотражающую поверхность теплопроводного материала, не имеющего собственного выраженного КР-спектра. На практике удобно использовать подложку из алюминия. Полученный твердый субстрат можно использовать сразу, или хранить в закрытом контейнере в течение нескольких недель при температуре минус 20°С или ниже.

Для измерения ГКР-спектра образец криозоля, охлаждаемый сухим льдом или другим хладагентом, помещают под объектив микроскопа спектрометра, предпочтительно изолированного от внешних источников света. Охлаждение позволяет использовать максимально возможную мощность лазера без риска расплавить криозоль, а также проводить настройку параметров измерения или повторные накопления сигнала без временных ограничений. Для получения ГКР-спектров может быть использовано лазерное излучение с любой подходящей длиной волны, что определяется свойствами анализируемого образца и имеющимися техническими возможностями. Сначала снимают спектр фона при выключенном лазере, затем включают лазер и регистрируют ГКР-спектр. Время накопления сигнала и мощность лазерного излучения подбирают экспериментально с учетом требуемой интенсивности спектра. Полученный спектр подвергают математической обработке с использованием программного обеспечения, позволяющего анализировать спектральные данные.

Ниже приведены примеры, демонстрирующие возможность осуществления предлагаемого способа с получением заявленного технического результата.

Пример 1. Получение спектра миоглобина в присутствии примеси мочевины.

Известно, что присутствие примеси мочевины затрудняет агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя.

Раствор миоглобина в воде 100 нг/мл, содержащий 1 мМ мочевины, смешивают в объемном соотношении 1:1 с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм), содержащем 10¹¹ ч./мл. Конечная концентрация белка в смеси составляет 50 нг/мл, наночастиц - 5×10¹⁰ ч./мл, мочевины - 0,5 мМ. Для получения криозоля каплю полученной смеси (-20 мкл) помещают в пластиковое кольцо толщиной 1 мм и диаметром 5 мм, размещенное на алюминиевой пластине, после чего образец помещают в морозильную камеру с температурой -8°С на 20 мин. Пластину с криозолем в пластиковом контейнере с сухим льдом помещают под объектив микроскопа спектрометра BWTek i-Raman 532, с длиной волны лазера 532 нм. Устанавливают время накопления 100 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем на мощности лазера 20% (7,5 мВт) накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра в процессе обработки полученных спектров с помощью специального программного обеспечения происходит автоматически. Полученный спектр показан на фиг. 1. Как видно из рисунка, на ГКР-спектре криозоля присутствуют характерные полосы высокой интенсивности, соответствующие миоглобину и мочевине.

На такой же алюминиевой пластине снимают ГКР-спектр жидкого золя, имеющего тот же состав, что и состав криозоля: 20 мкл смеси помещают в пластиковое кольцо, лежащее на подложке из алюминия, и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала и получение спектра осуществляют аналогично тому, как описано выше для криозоля. Полученный спектр, показанный на фиг. 2, не содержит выраженных сигналов миоглобина, присутствуют только пики мочевины и слабо выраженные сигналы, которые сложно опознать в связи с их низкой интенсивностью. Также обращает на себя внимание неблагоприятное соотношение сигнал/шум на спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.

При сопоставлении спектров криозоля и жидкого образца, представленных на одном рисунке в одинаковом масштабе, как показано на Фиг. 3, наглядно видно, что спектр ГКР криозоля, содержащего миоглобин в присутствии мочевины, в десятки раз превосходит по интенсивности ГКР-спектр жидкого золя аналогичного состава (ср. интенсивность пика мочевины при 1002 см^-1). Значительно более высокое соотношение интенсивности сигнал/шум на спектре, полученном для криозоля, обеспечивает более высокую чувствительность определения белка по сравнению с жидким субстратом.

Как отмечено выше, в спектре жидкого золя, содержащего миоглобин и примесь мочевины, отсутствуют характерные ГКР-сигналы миоглобина. Показательно, что в отсутствие мочевины удается получить спектр миоглобина в растворе, хотя и существенно менее интенсивный, чем с использованием криозоля. Мочевина способствует исчезновению ГКР-спектра белка, предположительно, из-за нарушения самопроизвольной агрегации наночастиц серебра.

Таким образом, использование заявляемого способа позволяет не только увеличить интенсивность спектра белка по сравнению с использованием жидкого субстрата, но и получать ГКР-спектр белка высокой интенсивности при наличии примесей, присутствие которых в образце делает получение спектра белка из раствора невозможным. Использование криозоля также позволяет повысить чувствительность способа за счет возрастания соотношения сигнал/шум.

Пример 2. Получение спектра гемоглобина в присутствии сахарозы.

Для приготовления криозоля использованы водные растворы гемоглобина (2000 нг/мл), не содержащие примесей и содержащие примесь сахарозы (10 мкг/мл) сахарозы, которая негативно влияет на агрегацию наночастиц, уменьшая ГКР-активность золя. Исследуемый раствор смешивают с золем серебряных наночастиц (гидродинамический диаметр 42 нм, концентрация 10¹¹ ч./мл) в объемном соотношении 1:1. Конечная концентрация белка в смеси составляет 1000 нг/мл, наночастиц -5×10¹⁰ ч./мл, сахарозы, если она присутствует - 10 мкг/мл. Для приготовления образца 5 мкл смеси помещают в алюминиевую лунку высотой 1 мм и диаметром 2 мм. Алюминиевую лунку помещают на 1 час в термоконтейнер, наполненный колотым льдом из замороженного 20% водного раствора глицерина, с температурой около -4°С. Затем образец, помещенный в пластиковый контейнер с сухим льдом, переносят под объектив микроскопа спектрометра BWTek innoRam 785, с длиной волны лазера 785 нм. Устанавливают время накопления 5 сек с 5 повторами для усреднения, снимают фоновый спектр, предварительно экранировав микроскоп от внешних источников света. Затем включают лазер на мощности 20% (42 мВт) и накапливают ГКР-спектр с тем же временем накопления. Вычитание фонового спектра происходит автоматически.

В такой же алюминиевой лунке снимают ГКР-спектр жидкого золя: помещают 5 мкл смеси в лунку, в качестве агрегирующего реагента добавляют NaCl в конечной концентрации 40 мМ, перемешивают и помещают образец под микроскоп спектрометра. Накопление сигнала осуществляют аналогично тому, как для замороженных образцов.

Изменение интенсивности спектра во времени отличается для измерений и использованием криозоля и с использованием жидкого золя. Как видно на фиг. 4, спектр чистого раствора гемоглобина, полученный с использованием криозоля, не убывает в интенсивности в течение, как минимум, 25 минут после замораживания, форма спектра также не меняется. На фиг. 5 представлены спектры такого же раствора белка, полученные с использованием жидкого золя. В этом случае, график на фиг. 5Б демонстрирует падение интенсивности ГКР-сигнала со временем. При сравнении спектров в криозоле и в жидком субстрате в начальный момент времени можно также отметить, что с использованием криозоля интенсивность спектра как минимум в 2,5 раза выше.

На Фиг. 6 сопоставлены ГКР-спектры чистого гемоглобина и в присутствии примеси сахарозы, полученные с использованием жидкого золя. Спектр на фиг. 6А получен для раствора гемоглобина без примеси сахарозы, спектр фиг. 6Б - с примесью сахарозы. Видно, что спектр гемоглобина с примесью сахарозы имеет существенно более низкую интенсивность, а также в нем отсутствуют некоторые, характерные для гемоглобина, пики. Очевидно, что присутствие сахарозы в жидком золе значительно затрудняет получение ГКР-спектров белка.

ГКР-спектр, полученный с использованием криозоля, при добавлении того же количества сахарозы оказывается только в два раза менее интенсивным по сравнению с криозолем без сахарозы, при этом полностью сохраняется форма спектра, что видно при сравнении спектра А на фиг. 7 со спектрами на Фиг. 4. Влияние сахарозы на интенсивность и, особенно, на форму спектра белка в криозоле значительно менее выражено, чем в жидком золе. При сравнении на фиг. 7 ГКР-спектров одной и той же смеси гемоглобина с сахарозой, полученных с использованием криозоля и жидкого субстрата (А и Б соответственно), видно, что усиление в криозоле, как минимум, в пять раз выше, чем в жидком золе, если сравнивать по пику на 1002 см^-1, а пик 1046 см^-1, вообще не определяется на ГКР-спектре, полученном с использованием жидкого субстрата.

Полученные результаты показывают, что использование криозоля для получения ГКР-спектра гемоглобина демонстрирует ряд преимуществ по сравнению с использованием жидкого золя: получение стабильного во времени ГКР-спектра, по сравнению с затухающим сигналом в жидком золе; повышение интенсивности ГКР-спектра и соотношения сигнал/шум; менее выраженное влияние примеси сахарозы на интенсивность ГКР-спектра; отсутствие влияния примеси сахарозы на форму ГКР-спектра; возможность получения полноценного ГКР-спектра белка в присутствии примеси сахарозы, по сравнению со спектром в жидком золе, в котором исчезла часть пиков, характерных для гемоглобина.

Таким образом, заявляемый способ характеризуется следующими преимуществами относительно известных аналогов и прототипа:

- отсутствие необходимости использовать агрегирующий реагент для получения интенсивных ГКР-спектров;

- способ позволяет определять белковые аналиты даже в присутствии веществ, обычно препятствующих агрегации, таких, как мочевина, сахароза и др., что позволяет использовать его для анализа белкового состава образцов, полученных из биологических жидкостей, и содержащих примеси, в присутствии которых невозможно индуцировать агрегацию наночастиц классическими методами;

- способ позволяет получить стабильные агрегаты плазмонных наночастиц, сохраняющие высокую ГКР-активность во времени, что позволяет получать спектры ГКР с большими временами накопления и значительно повышает чувствительность метода, а также позволяет сохранять образцы для проведения повторных измерений;

- способ характеризуется высокой чувствительностью благодаря увеличению интенсивности и соотношения сигнал/шум получаемых ГКР-спектров.

1. Способ определения белков с использованием гигантского комбинационного рассеяния (далее - ГКР), включающий приготовление твердофазного ГКР-субстрата, содержащего смесь плазмонных наночастиц с содержащим белок анализируемым образцом, воздействие на полученный субстрат лучом лазера, запись ГКР-спектра и его математическую обработку, отличающийся тем, что в качестве твердофазного ГКР-субстрата используют криозоль, представляющий собой каплю смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца, при этом капля смеси заморожена на подложке из теплопроводного не имеющего собственного спектра комбинационного рассеяния материала, а воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера при охлаждении ГКР-субстрата до температуры, обеспечивающей существование субстрата в твердом состоянии.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве плазмонных наночастиц используют наночастицы серебра, или наночастицы золота, или гибридные наночастицы.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что содержание плазмонных наночастиц в золе составляет 10¹⁰-10¹³ ч./мл.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для замораживания смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца используют подложку из светоотражающего материала.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для замораживания смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца используют подложку из алюминия.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что замораживание смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца осуществляют при температуре минус 4°С.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что замораживание смеси золя плазмонных наночастиц с раствором содержащего белок анализируемого образца осуществляют при температуре минус 8°С.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера с длиной волны 785 нм.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что воздействие на ГКР-субстрат осуществляют лучом лазера с длиной волны 532 нм.