Конъюгаты антитела и лекарственного средства (adc) и конъюгаты антитела и пролекарства (apdc), содержащие ферментативно расщепляемые группы

Изобретение относится к конъюгатам связующего с молекулами лекарственного средства. Конъюгат имеет формулу где СВЯЗУЮЩЕЕ представляет собой анти-HER2 антитело, анти-EGFR антитело, анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L представляет собой линкер, в котором аминокислоты находятся в природной L-конфигурации, n представляет собой число от 1 до 20 и KSP представляет собой ингибитор кинезина веретена (лекарственное средство), где эта формула имеет указанные в п.1 структуры. Также изобретение относится к фармацевтической композиции на основе указанного выше конъюгата. Технический результат: получены конъюгаты, полезные для лечения и/или профилактики заболеваний, таких как гиперпролиферативные и/или ангиогенные заболевания. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 149 пр.

 

Введение и уровень техники

Изобретение относится к новым конъюгатам связующего и пролекарства (APDC), в которых связующее конъюгировано с неактивными соединениями - предшественниками ингибиторов белка кинезина веретена, и к конъюгатам связующего и лекарственного средства (ADC), к активным метаболитам этих конъюгатов связующего и пролекарства и конъюгатов связующего и лекарственного средства, к способам получения этих APDC и ADC, к применению этих конъюгатов для лечения и/или профилактики заболеваний и к применению этих конъюгатов для приготовления лекарственных средств для лечения и/или предотвращения заболеваний, в частности гиперпролиферативных и/или ангиогенных нарушений, таких как, например, злокачественные заболевания. Такие лечения можно осуществлять в виде монотерапии или также в комбинации с другими лекарственными средствами, или дополнительными терапевтическими мерами. В соответствии с изобретением, связующее предпочтительно означает антитело.

Злокачественные заболевания являются следствием неконтролируемого роста клеток самых разнообразных тканей. Во многих случаях новые клетки пенетрируют в существующую ткань (инвазивный рост), или они метастазируют в удаленные органы. Злокачественные заболевания возникают в большом разнообразии различных органов и часто имеют тканеспецифическое течение. Термин "злокачественное новообразование" в качестве общего термина описывает большую группу определенных заболеваний различных типов органов, тканей и клеток.

Некоторые опухоли на ранних стадиях могут быть удалены хирургически и с помощью лучевой терапии. Метастазированные опухоли, как правило, можно только лечить паллиативно с помощью химиотерапевтических средств. В данном случае, задача состоит в достижении оптимальной комбинации улучшения качества жизни и пролонгирования жизни.

Конъюгаты связующих белков с одной или несколькими молекулами лекарственного средства известны, в частности, в форме конъюгатов антитела и лекарственного средства (ADC), в которых интернализирующееся антитело, нацеленное на связанный с опухолью антиген, ковалентно присоединено через линкер к цитотоксическому средству. После введения ADC в опухолевую клетку и последующего диссоциации конъюгата, либо само цитотоксическое средство, либо цитотоксический метаболит, образованный из него, высвобождается в опухолевой клетке и может проявлять свое действие в ней непосредственно и селективно. Таким путем, в отличие от общепринятой химиотерапии, повреждение нормальной ткани находится в существенно низких пределах [см., например, J.М. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A.M. Wu и P.D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P.D. Senter, Curr. Opin. 13, 235-244 (2009); L. Ducry и В. Stump, Bioconjugate Chem. Таким образом, WO 2012/171020 описывает ADC, в которых множество токсофорных молекул присоединены через полимерный линкер к антителу. В качестве возможных токсофоров, WO 2012/171020 упоминаются, среди других, вещества SB 743921, SB 715992 (испинесиб), MK-0371, AZD8477, AZ3146 и ARRY-520.

Вещества, упомянутые последними, представляют собой ингибиторы белка кинезина веретена. Белок кинезина веретена (KSP, также известен как Eg5, HsEg5, KNSL1 или KIF11) представляет собой кинезиноподобный двигательный белок, который является важным для функционирования биполярного митотического веретена. Ингибирование KSP приводит к блокировке митоза и, в течение относительно долгого периода времени, к апоптозу (Тао и др., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). После открытия первого проникающего в клетку KSP ингибитора, монастрола, KSP ингибиторы сами были квалифицированы в качестве класса новых химиотерапевтических средств (Mayer и др., Science 286: 971-974, 1999), и они являются объектами различных патентных заявок (например, WO 2006/044825; WO 2006/002236; WO 2005/051922; WO 2006/060737; WO 03/060064; WO 03/040979; и WO 03/049527). Тем не менее, поскольку KSP активны только в течение относительно короткого периода времени во время фазы митоза, KSP ингибиторы должны присутствовать в достаточно высокой концентрации во время этой фазы. WO 2014/151030 раскрывает ADC, включая определенные ингибиторы KSP.

Легумаин представляет собой связанную с опухолью аспарагинил-эндопептидазу (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J.M. Chen и др. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) и был использован для процессинга пролекарственных препаратов малых цитотоксических молекул, например, среди других, производных доксорубицина и этопозида (W. Wu и др. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern и др. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri и др. ChemMedChem 2011, 6, 54).

Другими лизосомальными ферментами являются, например, катепсин или гликозидазы, например, β-глюкуронидазы, которые также использовались для высвобождения активных ингредиентов путем ферментативного расщепления пролекарственных препаратов. Группы, расщепляемые ферментативно in vivo, представляют собой, в особенности, 2-8-олигопептидные группы или гликозиды. Сайты расщепления пептидов раскрыты в Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 и Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346, а также Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. Они включают, например, валин-аланин, валин-лизин, валин-цитруллин, аланин-лизин и фенилаланин-лизин (необязательно с дополнительной амидной группой).

Краткое изложение сущности изобретения

Для дальнейшего улучшения опухолевой селективности ADC и их метаболитов, были обеспечены конъюгаты связующего с пептидными производными, которые могут высвобождаться с помощью связанных с опухолью ферментов, таких как легумаин или катепсин. Таким образом, опухолевая селективность определяется не только выбором антитела, но, дополнительно, ферментативным отщеплением пептидного производного, например, с помощью связанного с опухолью фермента легумаина.

В соответствии с изобретением, пептидное производное может присутствовать в линкере, который соединяет связующее с KSP ингибитором. Такие соединения являются конъюгатами связующего и лекарственного средства (ADC) в соответствии с изобретением.

Ингибиторы белка кинезина веретена, применяемые в соответствии с изобретением, содержат аминогруппу, которая имеет важное значение для обеспечения их действия. С помощью модификации этой аминогруппы пептидными производными, действие в отношении белка кинезина веретена блокируется и, следовательно, развитие цитотоксического эффекта также ингибируется. Однако, если такой пептидный остаток может быть высвобожден связанными с опухолью ферментами, такими как легумаин, действие в опухолевой ткани может быть восстановлено контролируемым образом. Модификация аминогруппы в данном случае не затрагивает часть линкера. Таким образом, настоящее изобретение относится к конъюгатам связующего, содержащим молекулы неактивных предшественников ингибиторов белка кинезина веретена, которые процессируются только в опухоли с помощью связанной с опухолью лизосомальной эндопептидазы легумаина с получением активных метаболитов, чтобы, таким образом, иметь возможность снова проявлять свою цитотоксическую активность контролируемым образом в опухоли. Конъюгаты связующего с ингибиторами KSP, где их свободная аминогруппа соответствующим образом блокируется, также называются в соответствии с изобретением как APDC. APDC являются особенно предпочтительными.

Таким образом, изобретение обеспечивает конъюгаты связующего или его производного с одной или несколькими молекулами лекарственного средства или его одного или нескольких про лекарств, которые имеют следующую формулу I:

где СВЯЗУЮЩЕЕ представляет собой связующее или его производное (предпочтительно антитело), L представляет собой линкер, n представляет собой число от 1 до 50, предпочтительно от 1.2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 8, и KSP представляет собой ингибитор белка кинезина веретена или его пролекарство, где L-KSP имеет следующую формулу (IIa):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y², или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z'), или -CH(CH₂W)Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH;

где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -L-#1, Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой Н или -(СН₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -L-#1, -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

или R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

или R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где R¹⁰ представляет собой Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH, галоген (в особенности, F или Cl), C_1-4-алкил, С_1-4-галогеналкил, С_1-4-алкокси, гидроксил-замещенный C_1-4-алкил, СОО(С_1-4-алкил), -ОН и где атом водорода вторичной аминогруппы в пирролидиновом кольце может быть заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=N-NH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно -L-#1 или С_1-10алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -O-С(=O)-алкильных групп, 1-3 -O-С(=O)-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-С(=O)-алкильных групп, 1-3 -NH-С(=O)-NH-алкильных групп, 1-3 -S(=O)_n-алкильных групп, 1-3 -S(=O)₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHC(=O)CH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z', или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН,

(где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -CO₂H, -NH₂ или -L-#1;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴ и R⁸ представляет собой или (в случае R⁸) содержит -L-#1,

-L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой Н, галоген или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную гидрокарбильную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y-, (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHC(=O)NH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-(CH=N-NH₂), сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, С₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, и

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

где выполняется одно или несколько следующих условий (i) - (iii):

(i) -L-#1 включает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-СН(СН₂СОХ)-СО-,

где X представляет собой -NH₂ или -СООН, предпочтительно -NH₂; Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(ii) R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

(iii) R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где вторичный атом водорода вторичной аминогруппы пирролидинового кольца заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

и их соли, сольваты, соли сольватов и эпимеры.

В ADC в соответствии с изобретением, -L-#1 - включает или означает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3) _(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-. Особое предпочтение отдают тем группам формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, которые, как было установлено, способны расщепляться в исследовании с легумаином, описанном в Экспериментальном разделе. Более предпочтительно, один из заместителей R¹, R³ или R⁴ является -L-#1. Когда R⁴ представляет собой -L-#1, карбонильная группа аспарагина или аспарагиновой кислоты присоединена непосредственно к атому азота, который присоединен к R⁴ в вышеприведенной формуле.

В APDC в соответствии с изобретением, R⁴ означает R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-, или атом водорода NH в пирролидиновом кольце заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-SIG-.

R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO- и R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-SIG- группы расщепляются in vivo, вероятно, ферментом легумаином. Эти группы поэтому также называются в дальнейшем как "расщепляемые легумаином группы". Расщепляемая легумаином группа имеет формулу -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONX)-CO-. В APDC в соответствии с изобретением, группа предпочтительно имеет формулу R21-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-#, означающую, что расщепляемая легумаином группа содержит группу R²¹ на одном конце, а на другом конце (-#) она присоединена к аминогруппе, соответствующей положению R⁴ в формуле IIa.

В данном случае, NH-CH(CH₂COX)-CO- (то есть аспарагин или аспарагиновая кислота) присутствует в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают тем группам, которые, как было установлено, способны расщепляться в исследовании с легумаином, описанном в Экспериментальном разделе. APDC в соответствии с изобретением могут, в дополнение к отщепляемой легумаином или катепсином группе R⁴, содержать линкер -L-#1, содержащий расщепляемую легумаином или катепсином группу.

-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- в расщепляемой легумаином группе означает аспарагин; -NH-CH(CH₂COOH)-CO- в расщепляемой легумаином группе означает аспарагиновую кислоту. Аспарагин и аспарагиновая кислота присутствуют здесь в виде L(-)-аспарагина и L-аспарагиновой кислоты, соответственно. Расщепляемая легумаином группа содержит, наряду с аспарагином или аспарагиновой кислотой, от 1 до 3 дополнительных аминокислот (т.е., в случае аспарагина, -P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-; -Р3-Р2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO; -(P3)₍₂₎-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-), и является, таким образом, ди-, три- или тетрапептидом или его производным (дипептид: -P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-; трипептид: -P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO; тетрапептид: -(P3)₂-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- (где две аминокислоты Р3 могут быть различными).

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно выбранной из Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, цитруллина и Asn. P2 обычно находится в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают L-Ala.

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина, или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот. Р3 предпочтительно выбирают из His, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Ser, Phe, цитруллина и Gln. Р3 обычно находится в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают L-Ala. Когда присутствует более чем одна аминокислота Р3, эти аминокислоты могут различаться в рамках вышеуказанного определения.

Более предпочтительно, расщепляемая легумаином группа означает -L-Ala-L-Ala-L-Asn- (т.е., в случае APDC, R²¹-L-Ala-L-Ala-L-Asn-#).

R²¹ предпочтительно представляет собой -Н, C_1-5-алкил-, C_5-10-аралкил-, C_1-5-алкокси-, С_6-10-арилокси группу, C_5-10-гетероалкильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_5-10-гетероалкокси или C_5-10-гетероциклоалкокси группу, каждая из которых может быть замещена с помощью - -СООН, СООалкила, COONH₂, NH₂ или N(алкила)₂, или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² означает -Н, -алкил -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂). "Алкил" в данном случае относится к алкильной группе, содержащей вплоть до 20 атомов углерода, предпочтительно C1-12-алкилу.

Расщепляемая катепсином группа имеет формулу -(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-. В APDC в соответствии с изобретением, группа имеет формулу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-#, означающую, что расщепляемая катепсином группа содержит группу R²¹ на одном конце, а на другом конце (-#) она присоединена к аминогруппе, соответствующей положению R⁴ в формуле IIa. В данном случае, R21, Р2 и Р3 являются такими, как определено для расщепляемой легумаином группы. Является ли группа формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2--# расщепляемой катепсином, может быть определено на основании исследования с катепсином, описанного в Экспериментальном разделе. Особенно предпочтительными расщепляемыми катепсином группами являются те, в которых Р2 выбирают из аланина, лизина и цитруллина, и Р3 выбирают из валина, аланина и фенилаланина, в особенности, группы формулы R²¹-(CO)(_0-1)-P3-P2-.

Описание фигур

Фигура 1: Выравнивание TWEAKR обогащенного цистеином домена (аминокислоты 34 - 68) различных видов. (Нумерация указывает положение аминокислоты в полноразмерных конструкциях, включая сигнальные последовательности; SEQ ID NO: 169).

Фигура 2: А - Схематическая диаграмма структуры TWEAKR (SEQ ID NO: 169). На диаграмме показан внеклеточный домен (аминокислоты 28-80) (SEQ ID NO: 168), включая обогащенный цистеином домен (36-67), трансмембранный домен - ТМ (81-101) и внутриклеточный домен (102-129). ТРР-2202 - полный эктодомен (28-80), с которым слит Fc домен hIgG1. ТРР-2203 - внеклеточный домен с N- и С-концевым усечением (34-68), слитый с Fc доменом hIgG1. Дисульфидные мостики Cys36-Cys49, Cys52-Cys67 и Cys55-Cys64 указаны черными полосами. Для обеспечения надлежащей укладки, ТРР-2203 содержит на две аминокислоты больше на N-конце и на одну аминокислоту больше на С-конце, по сравнению с чистым обогащенным цистеином доменом. ТРР-1984 - внеклеточный домен с С-концевым усечением (28-68), слитым с HIS6 меткой. Все эти три конструкции проявляют сопоставимое связывание с антителами в соответствии с изобретением и PDL-192 (ТРР-1104). Р4А8 (ТРР-1324) связывается только с полноразмерным внеклеточным доменом (ТРР-2202).

В - Аминокислотная последовательность внеклеточного домена: Было опубликовано, что аминокислота 64 является существенной для связывания TWEAK лиганда, и аминокислота 47 является существенной для связывания антител в соответствии с изобретением, как определено в настоящей заявке.

Фигура 3: Схематическая диаграмма катализируемой трансглутаминазой конъюгационный сайт-специфической функционализации негликозилированных антител.

Фигура 4: Диаграмма последовательных ферментативных стадий высвобождения лекарственного средства с помощью гистондеацетилазы и катепсина L в соответствии с Nat. Commun., 2013, 4, 2735.

Подробное описание изобретения

Изобретение обеспечивает конъюгаты связующего или его производного с одной или несколькими молекулами лекарственного средства или его пролекарств, причем молекула лекарственного средства является ингибитором белка кинезина веретена (KSP ингибитор).

Далее следует описание связующих, пригодных в соответствии с изобретением, ингибиторов KSP, пригодных в соответствии с изобретением или их пролекарств, и линкеров, пригодных в соответствии с изобретением, которые можно применяться в комбинации без ограничений. Более конкретно, можно применять связующие, описанные в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных в комбинации с KSP ингибиторами или пролекарствами, описанными в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных, необязательно в комбинации с линкерами, описанными в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных.

Ингибиторы KSP и их конъюгаты со связующими

В соответствии с изобретением, KSP-L в формуле I имеет следующую формулу (IIa):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, NH₂, SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -L-#1, -Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -L-#1, Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

или R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С₁-₁₀-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_ν-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и ν представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

или R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где R¹⁰ представляет собой Н, NH₂, SO₃H, СООН, SH, галоген (в особенности, F или Cl), C_1-4-алкил, С_1-4-галогеналкил, C_1-4-алкокси, гидроксил-замещенный C_1-4-алкил, COO(С_1-4-алкил), ОН или R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=N-NH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно -L-#1 или С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или С_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-СО-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, F, Cl, Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -СО₂Н, -NH₂ или -L-#1;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴ и R⁸ представляет собой или (в случае R⁸) содержит -L-#1,

-L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(Gl)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -O-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью NHC(=O)NH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -С(=O)-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂), сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

где выполняется одно или несколько следующих условий (i) - (iii):

(i) -L-#1 включает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-СН(СН₂СОХ)-СО-,

где X представляет собой -NH₂ или -СООН, предпочтительно -NH₂;

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(ii) R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(iii) R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где вторичный атом водорода вторичной аминогруппы пирролидинового кольца заменен на R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

и включает его соли, сольваты, соли сольватов и эпимеры.

Определения

Термин "замещенный" означает, что один или несколько атомов водорода на указанном атоме или указанной группе заменен(-ы) заместителем, выбранным из оговоренной группы, при условии, что нормальная валентность указанного атома не превышена при рассматриваемых обстоятельствах. Допустимы комбинации заместителей и/или переменных.

Термин "необязательно замещенный" означает, что число заместителей может быть равным нулю или отличаться от нуля. Если не указано иначе, необязательно замещенные группы могут быть замещены таким числом необязательных заместителей, которое можно достичь путем замены каждого атома водорода на заместитель, не являющийся водородом, на любом доступном атоме углерода или азота или серы. Обычно число необязательных заместителей (если присутствует) может равняться 1, 2, 3, 4 или 5, в особенности, 1, 2 или 3.

В контексте настоящего изобретения, выражение "моно- или поли-", например, в определении заместителей соединений общих формул настоящего изобретения, означает "1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1, 2 или 3, наиболее предпочтительно 1 или 2".

Если радикалы в соединениях в соответствии с изобретением замещенными, такие радикалы, если не указано иначе, могут быть моно- или полизамещенными. В рамках объема настоящего изобретения, определения всех радикалов, которые встречаются более одного раза, независимы друг от друга. Замещение одним, двумя или тремя одинаковыми или разными заместителями является предпочтительным. Особенно предпочтительным является замещение одним заместителем.

Алкил

Алкил означает линейный или разветвленный насыщенный одновалентный углеводородный радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода (C₁-С₁₀-алкил), обычно от 1 до 6 (C₁-С₆-алкил), предпочтительно от 1 до 4 (С₁-С₄-алкил) и более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода (C₁-С₃-алкил).

Предпочтительные примеры включают:

метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, 2-метилбутил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, 1,2-диметилпропил, неопентил, 1,1-диметилпропил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 2-этилбутил, 1-этилбутил, 3,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,1-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, и 1,2-диметилбутил.

Особое предпочтение отдают метильному, этильному, пропильному, изопропильному или трет-бутильному радикалу.

Гетероалкил

Гетероалкил означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR^y-, -NR^yC(=O)-, -C(=O)-NR^y-, -NR^yNR^y-, -S(=O)₂-NR^yNR^y-, -C(=O)-NR^yNR^y-, -CR^x=N-O-, причем углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^y в каждом случае означает заместитель -Н, фенил, С₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, который, в свою очередь, может быть замещен в каждом случае с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^x означает -Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

Алкенил

Алкенил означает прямоцепочечную или разветвленную одновалентную углеводородную цепь, содержащую одну или две двойные связи и 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (С₂-С₁₀-алкенил), в особенности, 2 или 3 атома углерода (С₂-С₃-алкенил), где, как очевидно, когда алкенильная группа содержит более чем одну двойную связь, двойные связи могут быть изолированными друг от друга или сопряжены друг с другом. Алкенильная группа, например, означает такие группы, как этенил (или винил), проп-2-ен-1-ил (или "аллил"), проп-1-ен-1-ил, бут-3-енил, бут-2-енил, бут-1-енил, пент-4-енил, пент-3-енил, пент-2-енил, пент-1-енил, гекс-5-енил, гекс-4-енил, гекс-3-енил, гекс-2-енил, гекс-1-енил, проп-1-ен-2-ил (или "изопропенил"), 2-метилпроп-2-енил, 1-метилпроп-2-енил, 2-метилпроп-1-енил, 1-метилпроп-1-енил, 3-метилбут-3-енил, 2-метилбут-3-енил, 1-метилбут-3-енил, 3-метилбут-2-енил, 2-метилбут-2-енил, 1 -метилбут-2-енил, 3-метилбут-1-енил, 2-метилбут-1-енил, 1-метилбут-1-енил, 1,1-диметилпроп-2-енил, 1-этилпроп-1-енил, 1-пропилвинил, 1-изопропилвинил, 4-метилпент-4-енил, 3-метилпент-4-енил, 2-метилпент-4-енил, 1-метилпент-4-енил, 4-метилпент-3-енил, 3-метилпент-3-енил, 2-метилпент-3-енил, 1-метилпент-3-енил, 4-метилпент-2-енил, 3-метилпент-2-енил, 2-метилпент-2-енил, 1-метилпент-2-енил, 4-метилпент-1-енил, 3-метилпент-1-енил, 2-метилпент-1-енил, 1-метилпент-1-енил, 3-этилбут-3-енил, 2-этилбут-3-енил, 1-этилбут-3-енил, 3-этилбут-2-енил, 2-этилбут-2-енил, 1-этилбут-2-енил, 3-этилбут-1-енил, 2-этилбут-1-енил, 1-этилбут-1-енил, 2-пропилпроп-2-енил, 1-пропилпроп-2-енил, 2-изопропилпроп-2-енил, 1-изопропилпроп-2-енил, 2-пропилпроп-1-енил, 1-пропилпроп-1-енил, 2-изопропилпроп-1-енил, 1-изопропилпроп-1-енил, 3,3-диметилпроп-1-енил, 1-(1,1-диметилэтил)этенил, бута-1,3-диенил, пента-1,4-диенил или гекса-1,5-диенил. Более конкретно, данная группа означает винил или аллил.

Алкинил

Алкинил означает прямоцепочечную или разветвленную одновалентную углеводородную цепь, содержащую одну тройную связь и 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (С₂-С₁₀-алкинил), в особенности, 2 или 3 атома углерода (С₂-С₃-алкинил). С₂-С₆-Алкинильная группа, например, означает такие группы, как этинил, проп-1-инил, проп-2-инил (или пропаргил), бут-1-инил, бут-2-инил, бут-3-инил, пент-1-инил, пент-2-инил, пент-3-инил, пент-4-инил, гекс-1-инил, гекс-2-инил, гекс-3-инил, гекс-4-инил, гекс-5-инил, 1-метилпроп-2-инил, 2-метилбут-3-инил, 1-метилбут-3-инил, 1-метилбут-2-инил, 3-метилбут-1-инил, 1-этилпроп-2-инил, 3-метилпент-4-инил, 2-метилпент-4-инил, 1-метилпент-4-инил, 2-метилпент-3-инил, 1-метилпент-3-инил, 4-метилпент-2-инил, 1-метилпент-2-инил, 4-метилпент-1-инил, 3-метилпент-1-инил, 2-этилбут-3-инил, 1-этилбут-3-инил, 1-этилбут-2-инил, 1-пропилпроп-2-инил, 1-изопропилпроп-2-инил, 2,2-диметилбут-3-инил, 1,1-диметилбут-3-инил, 1,1-диметилбут-2-инил или 3,3-диметилбут-1-инил. Более конкретно, алкинильная группа означает этинил, проп-1-инил или проп-2-инил.

Циклоалкил

Циклоалкил означает насыщенный одновалентный моно- или бициклический гидрокарбильный радикал, содержащий 3-12 атомов углерода (С₃-С₁₂-циклоалкил).

В данном контексте, моноциклический гидрокарбильный радикал означает одновалентный гидрокарбильный радикал, содержащий обычно от 3 до 10 (С₃-С₁₀-циклоалкил), предпочтительно от 3 до 8 (С₃-С₈-циклоалкил) и более предпочтительно от 3 до 7 (С₃-С₇-циклоалкил) атомов углерода.

Предпочтительные примеры моноциклических гидрокарбильных радикалов включают:

циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

Особое предпочтение отдают циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу, циклогексилу и циклогептилу.

В данном контексте, бициклический гидрокарбильный радикал означает гидрокарбильный радикал, содержащий обычно от 3 до 12 атомов углерода (С₃-С₁₂-циклоалкил), который следует понимать в данном описании в значении конденсации двух насыщенных кольцевых систем, которые вместе делят два расположенных непосредственно рядом атома. Предпочтительные примеры бициклических гидрокарбильных радикалов включают: бицикло[2.2.0]гексил, бицикло[3.3.0]октил, бицикло[4.4.0]децил, бицикло[5.4.0]ундецил, бицикло[3.2.0]гептил, бицикло[4.2.0]октил, бицикло[5.2.0]нонил, бицикло[6.2.0]децил, бицикло[4.3.0]нонил, бицикло[5.3.0]децил и бицикло[6.3.0]ундецил.

Гетероциклоалкил

Гетероциклоалкил означает неароматическую моно- или бициклическую кольцевую систему, содержащую один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными. Гетероатомы могут представлять собой атомы азота, атомы кислорода или атомы серы.

Моноциклическая кольцевая система в соответствии с настоящим изобретением может содержать от 3 до 8, предпочтительно от 4 до 7 и более предпочтительно 5 или 6 кольцевых атомов.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 3 кольцевых атома, включают:

азиридинил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 4 кольцевых атома, включают:

азетидинил, оксетанил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 5 кольцевых атомов, включают:

пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, пирролинил, диоксоланил и тетрагидрофуранил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 6 кольцевых атомов, включают:

пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, диоксанил, тетрагидропиранил и тиоморфолинил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 7 кольцевых атомов, включают:

азепанил, оксепанил, 1,3-диазепанил, 1,4-диазепанил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 8 кольцевых атомов, включают:

оксоканил, азоканил.

Среди моноциклических гетероциклоалкильных радикалов, предпочтение отдают 4- 7-членным насыщенным гетероциклильным радикалам, содержащим вплоть до двух гетероатомов из группы, включающей О, N и S.

Особое предпочтение отдают морфолинилу, пиперидинилу, пирролидинилу и тетрагидрофуранилу.

Бициклическая кольцевая система, содержащая один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными, в соответствии с настоящим изобретением может содержать от 6 до 12 и предпочтительно от 6 до 10 кольцевых атомов, где один, два, три или четыре атома углерода могут быть заменены на одинаковые или различные гетероатомы из группы, включающей О, N и S.

Примеры включают: азабицикло[3.3.0]октил, азабицикло[4.3.0]нонил, диазабицикло[4.3.0]нонил, оксаазабицикло[4.3.0]нонил, тиазабицикло[4.3.0]нонил или азабицикло[4.4.0]децил, и радикалы, полученные из дальнейших возможных комбинаций согласно определению.

Особое предпочтение отдают пергидроциклопента[с]пирролилу, пергидрофуро[3,2-с]пиридинилу, пергидропирроло[1,2-а]пиразинилу, пергидропирроло[3,4-с]пирролилу и 3,4-метилендиоксифенилу.

Арил

Арил означает одновалентную моно- или бициклическую ароматическую кольцевую систему, состоящую из атомов углерода. Примерами являются нафтил и фенил; предпочтение отдают фенилу, или фенильному радикалу.

C₆-C₁₀-Аралкил

С_6-10-Аралкил в контексте изобретения означает моноциклический ароматический арил, в качестве примера фенил, к которому присоединена С₁-С₄-алкильная группа.

Иллюстративная С_6-10-аралкильная группа означает бензил.

Гетероарил

Гетероарил означает одновалентную моноциклическую, бициклическую или трициклическую ароматическую кольцевую систему, которая содержит 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 кольцевых атомов ("5-14-членная гетероарильная" группа), в особенности, 5, 6, 9 или 10 кольцевых атомов, и содержит по меньшей мере один кольцевой гетероатом и необязательно один, два или три дополнительных кольцевых гетероатомов из группы, состоящей из N, О и S, и присоединена через кольцевой атом углерода или необязательно (когда позволяет валентность) через кольцевой атом азота.

Гетероарильная группа может представлять собой 5-членную гетероарильную группу, например, тиенил, фурил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил или тетразолил; или 6-членную гетероарильную группу, например, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил или триазинил; или трициклическую гетероарильную группу, например, карбазолил, акридинил или феназинил; или 9-членную гетероарильную группу, например, бензофуранил, бензотиенил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензимидазолил, бензотиазолил, бензотриазолил, индазолил, индолил, изоиндолил, индолизинил или пуринил; или 10-членную гетероарильную группу, например, хинолинил, хиназолинил, изохинолинил, циннолинил, фталазинил, хиноксалинил или птеридинил.

В общем, и если не указано иначе, гетероарильные радикалы включают все возможные свои изомерные формы, например, таутомеры и позиционные изомеры в отношении места присоединения к остальной части молекулы. Таким образом, в качестве иллюстративного, неисключительного примера, термин пиридинил включает пиридин-2-ил, пиридин-3-ил и пиридин-4-ил; или термин тиенил включает тиен-2-ил и тиен-3-ил.

С₅-С₁₀-Гетероарил

С_5-10-Гетероарил в контексте изобретения означает моно- или бициклическую ароматическую кольцевую систему, содержащую один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными. Гетероатомами, которые могут встречаться в данном случае, являются: N, О, S, S(=O) и/или S(=O)₂. Связывающая валентность может находиться на любом ароматическом атоме углерода или на атоме азота.

Моноциклический гетероарильный радикал в соответствии с настоящим изобретением содержит 5 или 6 кольцевых атомов.

Предпочтение отдают гетероарильным радикалам, содержащим один или два гетероатома. Особое предпочтение отдают в данном случае одному или двум атомам азота.

Гетероарильные радикалы, содержащие 5 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

тиенил, тиазолил, фурил, пирролил, оксазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, оксадиазолил, триазолил, тетразолил и тиадиазолил.

Гетероарильные радикалы, содержащие 6 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил и триазинил.

Бициклический гетероарильный радикал в соответствии с настоящим изобретением содержит 9 или 10 кольцевых атомов.

Гетероарильные радикалы, содержащие 9 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

фталидил, тиофталидил, индолил, изоиндолил, индазолил, бензотиазолил, бензофурил, бензотиенил, бензимидазолил, бензоксазолил, азоцинил, индолизинил, пуринил, индолинил.

Гетероарильные радикалы, содержащие 10 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

изохинолинил, хинолинил, хинолизинил, хиназолинил, хиноксалинил, циннолинил, фталазинил, 1,7- и 1,8-нафтиридинил, птеридинил, хроманил.

Гетероалкокси

Гетероалкокси означает прямоцепочечную и/или разветвленную гидрокарбильную цепь, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и присоединена к остальной части молекулы через -О- и дополнительно может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR_y-, -NR^yC(=O)-, -C(=O)-NR^y-, -NR^yNR^y-, -S(=O)₂-NR^yNR^y-, -C(=O)-NR^yNR^y-, -CR^x=N-O-, и где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^y в каждом случае означает -Н, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, который, в свою очередь, может быть замещен в каждом случае с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^x означает -Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

Галоген или атом галогена в контексте изобретения означает фтор (-F), хлор (-Cl), бром (-Br), или йод (-I).

Фторалкил, фторалкенил и фторалкинил означает, что алкил, алкенил и алкинил может быть моно- или полизамещен фтором.

Пролекарства ингибитора белка кинезина веретена предпочтительно имеют следующую формулу (III):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой -Н, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHC(=O)NH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или С_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-СО-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)г групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(СН₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z' -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -H, -SO₃H, -NH₂ или -СООН,

(где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, F, Cl, Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -H, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -CO₂H или -NH₂;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или С₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHC(=O)-, -C(=O)NH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, и

G3 представляет собой Н или СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

и включают их соли, сольваты и соли сольватов.

Путем замещения атома водорода в R¹, R², R³, R⁴, R⁵ или R⁸ или в пирролидиновом кольце (R¹⁰), образованном R² и R⁴, способом, известным среднему специалисту в данной области техники, соединение формулы (III) можно присоединить к линкеру. Это дает конъюгаты формулы (IIa), где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁸ или R¹⁰ представляет собой -L-#1, L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному. Если ингибитор KSP (или KSP-L) в соответствии с формулой (IIa) конъюгирован со связующим, то один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R^5, R⁸ или R¹⁰ таким образом представляет собой -L-#1, где L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному. Другими словами, в случае конъюгатов, один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R^5, R⁸ и R¹⁰ представляет собой -L-#1, где -L-#1 присоединен к связующему, например, антителу. Особенно предпочтительно, один из заместителей R¹, R³ или R⁴ представляет собой -L-#1. Связующее предпочтительно представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-EGFR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-HER2 антитело. Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителам ТРР-2090 и ТРР-2658, или анти-EGFR антителам цетуксимабу или нимотузумабу или HER-2 антителу трастузумабу.

Также возможно, чтобы в соединении формулы IIa взамен -L-#1 присутствовала группа -L-#3, где L представляет собой линкер и #3 представляет собой реакционно-способную группу для присоединения к связующему или его производному. Соединения, включающие -L-#3, представляют собой реакционноспособные соединения, которые реагируют со связующим или его производным. #3 предпочтительно означает группу, которая реагирует с амино или тиольной группой с образованием ковалентной связи, предпочтительно с остатком цистеина в белке. Остаток цистеина в белке может иметь природное происхождение, может быть введен биохимическими методами или, предпочтительно, может быть образован путем предварительного восстановления дисульфидных фрагментов связующего.

Когда R¹ не означает Н, атом углерода, к которому присоединяется R¹, является стереоцентром, который может находиться в L и/или D конфигурации, предпочтительно в L конфигурации.

Когда R² не означает Н, атом углерода, к которому присоединяется R², является стереоцентром, который может находиться в L и/или D конфигурации.

Соединения формулы (IIa), в которой один из заместителей R¹, R³, и R⁴ представляет собой -L-#1, и в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

являются особенно предпочтительными,

в особенности предпочтительными являются те, в которых

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N. Особое предпочтение отдают соединениям, в которых X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N.

Для А предпочтение отдают СО (карбонил).

Предпочтительными для R¹ являются -L-#1, -MOD, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или -NH₂. Если R⁴ представляет собой -L-#1, R¹ предпочтительно означает -MOD (в особенности, если R³ не представляют собой -MOD).

Предпочтительным для R² является -Н.

Предпочтительными для R⁴ являются -Н, -L-#1 или расщепляемая легумаином группа формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-. Как описано выше, в данном случае, -L-#1 содержит группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO*-, где карбонильная группа (L-)аспарагина или (L-)аспарагиновой кислоты (обозначенная с помощью *) присоединена непосредственно к атому азота, который присоединен к R⁴ в вышеприведенной формуле. Если R⁴ представляет собой -L-#1, R¹ или R³ предпочтительно означает -MOD.

Предпочтительными для R³ являются -L-#1, -MOD или С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-С(=O)-NH-алкила, NH-С(=O)-алкила, NH-C(=O)-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил). Если R⁴ представляет собой -L-#1, R³ предпочтительно означает -MOD (в особенности, если R¹ не представляют собой -MOD).

Предпочтительным для R⁵ являются -Н или -F.

Предпочтительными для R⁶ и R⁷, независимо друг от друга, являются -Н, (необязательно фторированный) С_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген.

Предпочтительными для R⁸ являются разветвленная C_1-5-алкильная группа, в частности группа формулы -С(СН₃)₂-(СН₂)_0-2-R_y, где R_y представляет собой -Н, -ОН, -CO₂H или -NH₂. Особое предпочтение отдают группе формулы -С(СН₃)₂-(СН₂) -R_y, где R_y представляет собой -Н.

Предпочтительными для R⁹ являются -Н или -F.

Предпочтительным для -MOD является HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-СО-, где x представляет собой число от 2 до 6, X представляет собой -Н, -NH₂ или -СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO- (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-).

В особенности, предпочтительными являются соединения формулы (IIa), в которой один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А представляет собой -С=(O)-;

R¹ представляет собой -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или NH₂;

R² представляет собой -Н;

R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

R³ представляет собой фенильную группу, которая может быть моно- или полизамещена галогеном (в частности, F) или необязательно фторированным C_1-3-алкилом, или представляет собой необязательно фторированную С_1-10-алкильную группу, которая необязательно может быть замещена с помощью -OY⁴, -SY⁴, -O-CO-Y⁴, -O-CO-NH-Y⁴, NH-CO-Y⁴, -NH-CO-NH-Y⁴, S(O)_n-Y⁴ (где n представляет собой 0, 1 или 2), -SO₂-NH-Y⁴, NH-Y⁴ или N(Y⁴)₂, где Y⁴ представляет собой Н, фенил (необязательно моно- или полизамещенный галогеном (в частности, F) или необязательно фторированным C_1-3-алкилом), или алкил (где алкильная группа может быть замещена с помощью -ОН, -СООН, и/или -NHCO-C_1-3-алкила и где алкил предпочтительно представляет собой С_1-3-алкил);

где особенно предпочтительно R³ может быть замещена с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-CO-NH-алкила, -NH-CO-алкила, -NH-CO-NH-алкила, -S(O)_n-алкила, -SO₂-NH-алкила, -NH-алкила, -N(алкила)₂ или -NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2 (где алкил предпочтительно означает C_1-3-алкил),

R⁵ означает -H или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ представляет собой -Н или -F.

В особенности, предпочтительными являются также соединения формулы (IIa), в которой заместитель R⁴ представляет собой -L-#1, и

в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и X₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и X₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А представляет собой СО (карбонил);

R¹ представляет собой -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂, -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -H или -NH₂, или HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-CO-, где X означает число от 2 до 6, X представляет собой -Н, -NH₂ или -СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO-, (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; НООС-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-).

R² представляет собой -Н;

R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными) или HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-CO-, где X означает число от 2 до 6, X представляет собой Н, NH₂ или СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO-, (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; НООС-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-) или -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ означает -Н или -СОСН₃;

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ представляет собой -Н или -F.

Кроме того, является предпочтительным, когда (отдельно или в комбинации)

• R¹ представляет собой -L-#1, -СООН, НООС-СН₂-СН₂-СН(СООН)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO- или -Н,

• R² представляет собой -Н,

• R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

• А представляет собой -С(=O)-,

• R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными), HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-), -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ означает -Н или -СОСН₃, или представляет собой -L-#1;

• R⁵ представляет собой -Н,

• R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, С_1-3-алкил или галоген; в частности, R⁶ и R⁷ представляют собой -F;

• R⁸ представляет собой С_1-4-алкил (предпочтительно трет-бутил); и/или

• R⁹ представляет собой -Н,

• где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1.

Дополнительно, в соответствии с изобретением является предпочтительным, когда

• R¹ представляет собой -L-#1, -СООН, НООС-СН₂-СН₂-СН(СООН)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO- или -Н,

• R² представляет собой -Н,

• R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-)

• А представляет собой -С(=O),

R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными), или представляет собой -L-#1,

• R⁵ представляет собой -Н,

• R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, C_1-3-алкил или галоген; в частности, R⁶ и R⁷ представляют собой -F;

• R⁸ представляет собой С_1-4-алкил (предпочтительно трет-бутил); и

• R⁹ представляет собой -Н,

• где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1.

Кроме того, предпочтение отдают в соответствии с изобретением следующим ADC или APDC:

Формула (IIb):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), R¹, R², R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), А представляет собой -С(=O)-, В представляет собой одинарную связь, -О-СН₂- или -СН₂-О- и R²⁰ представляет собой NH₂, F, CF₃ или CH₃ и n представляет собой 0, 1 или 2.

Формула (IIc):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIIa) или (III) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), A, R¹, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), где А предпочтительно представляет собой -С(=O)- и R³ представляет собой -СН₂ОН, -СН₂ОСН₃, -СН(СН₃)ОН или -СН(CH₃)OCH₃, и LEG представляет собой расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, где R²¹, Р2 и Р3 имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa).

Формула (IId):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), A, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), где А предпочтительно означает -С(=O)- и R³ означает -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -COCH₃, и LEG представляет собой расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, где R²¹, Р2 и Р3 имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa).

Формула (IIe):

где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N, A, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIIa) или (III) и R¹ представляет собой -L-#.

Кроме того, является предпочтительным, когда в соединениях формул (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe) (отдельно или в комбинации):

• Z представляет собой -Cl или -Br;

• R¹ представляет собой -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -СО-NY¹Y², где Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' и Y¹ представляет собой -Н, -NH₂ или -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z';

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -СООН;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один из радикалов Y⁴ представляет собой изопропил, а другой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один из радикалов Y⁴ представляет собой -СН₃, а другой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂;

• по меньшей мере один типичный представитель Y⁴ выбирают из изопропила и -СН₃;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -CONHCHY⁴COOH и Y⁴ представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

• Y⁴ представляет собой аминобензил;

• R² представляет собой -(CH₂)_0-3Z и Z представляет собой -SY³;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой Н;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -СО-CHY⁶-NH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂.

Кроме того, является предпочтительным, когда R¹, R² или R³ в формуле (IIa) представляет собой -MOD, в частности, когда R⁴ представляет собой -L-#1 (в частности, когда -L означает расщепляемый линкер, который расщепляется непосредственно по -N-R⁴ или -N-L-#1, так что R⁴ или L заменяется на Н).

Особенно предпочтительно, R³ представляет собой -MOD и R¹ или R⁴ представляет собой -L-#1 или -L-СВЯЗУЮЩЕЕ,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -O-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -С(=O)-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН; и

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН.

Особенно предпочтительно, группа -MOD содержит (предпочтительно концевую) -СООН группу, например, в бетаиновой группе. Предпочтительно, группа -MOD имеет формулу -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y6 представляет собой -Н или -СОСН₃.

Кроме того, является предпочтительным, когда (отдельно или в комбинации) в формуле (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe):

• Z представляет собой -Cl или -Br;

• R¹ представляет собой -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -CONY¹Y², где Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)_0-3-(СН₂)_0-3Z' и Y¹ представляет собой -Н, -NH₂ или -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z';

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -СООН;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один типичный представитель Y⁴ представляет собой изопропил, а другой представляет собой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один типичный представитель Y⁴ представляет собой -CH₃, а другой представляет собой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂;

• по меньшей мере один типичный представитель Y⁴ выбирают из группы, состоящей из изопропила и -СН₃.

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -CONHCHY⁴COOH и Y⁴ представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

• Y⁴ представляет собой аминобензил;

• R² представляет собой -(CH₂)_0-3Z и Z представляет собой -SY³;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -Н;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -СО-CHY⁶-NH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный С_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂.

Кроме того, предпочтение отдают соединениям формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe), где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, NH₂, -SO₃H, -COOH, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH,

где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный С_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых имеет 1-3 атома галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH((CH₂CH₂O)1-20H) групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где n представляет собой 0, 1 или 2, Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно означает С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -MOD, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил или (необязательно фторированный) С4-10-циклоалкил;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет или ни один из них не представляет собой -L-#1,

L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-C₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

и их солям, сольватам и солям сольватов.

Кроме того, предпочтение отдают соединениям формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe), в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂г представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-,

А представляет собой -С(=O), -S(=O), -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомами галогена), 1-3 -О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH((CH₂CH₂O)1-20H) групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где n представляет собой 0, 1, или 2, Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно означает С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -MOD, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет или ни один из них не представляет собой -L-#1,

L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -СОСН₃,

и его солям, сольватам, солям сольватов и эпимерам.

Особое предпочтение в соответствии с изобретением отдают следующим соединениям формул V, VI и VII, где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ имеют значения, упомянутые выше (как упомянуто, например, для формулы (IIa)):

Особое предпочтение отдают соединениям формул V, VI, VII, где R¹ и R⁵ представляют собой Н или -L-#1; R² представляет собой Н; R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-, где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His; P3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1. В особенности, предпочтительными являются соответствующие соединения формулы VI.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) в соответствии с изобретением предпочтительно имеют следующую формулу VIII:

где

m означает число от 0 до 2;

n представляет собой 0 или 1;

X означает -CONH₂ или -СООН;

L_a представляет собой саморасщепляющийся линкер;

L_c представляет собой линкер;

A₁ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

A₂ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

D1 означает соединение формулы III;

R представляет собой Z₁-(CO)_q-, где q представляет собой 0 или 1 и Z₁ представляет собой С_1-10-алкильную, C_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_5-10-гетероарилалкокси, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, -NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R¹ представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂), и АВ представляет собой антитело, и s означает число от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 8, более предпочтительно от 3 до 5, например, 4.

Конъюгаты антитело-пролекарство (APDC) в соответствии с изобретением предпочтительно имеют следующую формулу IX:

где

m означает число от 0 до 2;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1;

X означает -CONH₂ или -СООН;

L_a представляет собой саморасщепляющийся линкер;

L_b представляет собой линкер;

A₁ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

A₂ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

D1 означает соединение формулы III;

R представляет собой Z₁-(CO)_q-, где q представляет собой 0 или 1 и Z₁ представляет собой С_1-10алкильную, С_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, C_5-10-гетероарилалкокси, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, -NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R¹ представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂), и АВ представляет собой антитело, и s означает число от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 8, более предпочтительно от 3 до 5, например, 4.

Линкеры

В литературе раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул со связующими, такими как, например, антитела (см., например, K. Lang и J.W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, М. Rashidian и др. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Предпочтение в соответствии с изобретением отдают конъюгированию KSP ингибиторов или пролекарства к антителу через один или несколько атомов серы остатков цистеина антитела, которые либо уже присутствуют в виде свободных тиолов, либо образуются путем восстановления дисульфидных мостиков, и/или через один или несколько групп NH остатков лизина антитела. Тем не менее, также можно присоединить KSP ингибитор или пролекарство к антителу через остатки тирозина, через остатки глутамина, через остатки аминокислот не природного происхождения, через свободные карбоксильые группы или через остатки сахаров антитела.

В соответствии с изобретением также возможно конъюгировать молекулы лекарственных средств со специфическими конъюгационными сайтами связующего, что улучшает гомогенность продукта. В литературе описаны различные методы конъюгационный сайт-специфического конъюгирования (Agarwal и др., Bioconjug. Chem. 26, 176-192 (2015); Cal и др., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 10585-10587 (2014); Behrens и др., MAbsA, 46-53 (2014); Panowski и др., MAbs 6, 34-45 (2014)). Эти методы также включают, в частности, методы ферментативного конъюгирования, в которых применяют, например, трансглутаминазы (TGазы), гликозилтрансферазы или формилглицин-генерирующий фермент ((Sochaj и др., Biotechnology Advances 33, 775-784, (2015)).

В соответствии с изобретением, можно обеспечить конъюгаты конъюгационный сайт-специфических связующих с ингибиторами белка кинезина веретена, в которых ингибиторы белка кинезина веретена конъюгированы с глутаминовыми боковыми цепями связующих.

Когда связующее представляет собой антитело, оно содержит акцепторный глутамин, предпочтительно в константном участке. Такие акцепторные глутамины могут быть введены с помощью мутаций подходящих положений в глутамин (например, мутация N297Q тяжелой цепи, EU нумерация Кэббота) или путем создания дегликозилированных или негликозилированных антител (например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297X тяжелой цепи, EU нумерация Кэббота (X в данном случае может быть любой аминокислотой за исключением N)). В последнем случае дегликозилированного или негликозилированного антитела, остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи становится акцепторным глутамином. Особое предпочтение отдают антителу, содержащему N297A или N297Q мутацию (EU нумерация Кэббота). Следовательно, все антитела, описанные в данном изобретении, также включают негликозилированные варианты этих антител, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (EU нумерация Кэббота) (система нумерации антител Кебота, см. Kabat и др., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд. (1991)) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту, за исключением N. Кроме того, все антитела, описанные в настоящей заявке, также содержат варианты описанных антител, которые благодаря конструированию содержат один или несколько акцепторных остатков глутамина для реакций, катализируемых трансглутаминазой.

Один из способов такого конъюгационный сайт-специфического конъюгирования представляет собой подходы, описанные в литературе, которые касаются конъюгационный сайт-специфического конъюгирования связующих с помощью трансглутаминазы. Трансглутаминазы (ТГазы), которые также включают бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13), представляют собой семейство ферментов, которые катализируют образование ковалентной связи между γ-карбониламидной группой глутаминов и первичной аминогруппой лизинов. Поскольку такие трансглутаминазы также акцептируют субстраты, отличающиеся от лизина в качестве донора амина, то их можно применять для модификации белков, включая антитела, на подходящих акцепторных глутаминах (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010); Josten и др., J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000); Mindt и др., Bioconjugate Chem. 19, 271-278 (2008); Dennler и др., в Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L., ред.), cc. 205-215, Humana Press. (2013)). С одной стороны, трансглутаминазы были применены для конъюгирования лекарственных препаратов с антителами, содержащими искусственные глутаминовые метки, которые являются акцепторными остатками глутамина, которые были введены в антитело с помощью генетической инженерии (Strop и др., Chem. Biol. 20, 161-167 (2013)). С другой стороны, было заявлено, что консервативный остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) константного участка тяжелой цепи антител представляет собой только γ-карбониламидный донор для бактериальной трансглутаминазы (ЕС 2.3.2.13) в пределах каркаса негликозилированных IgG1 молекул, и является, таким образом, акцепторным глутамином, тогда как акцепторный глутамин отсутствует в пределах каркаса IgG1, когда антитело гликозилировано в положении N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)). В заключение, бактериальную трансглутаминазу можно применять для конъюгирования аминодонорного субстрата, например, конструкта лекарственное средство-линкер, по остатку акцепторного глутамина антитела. Такие акцепторные глутамины могут быть введены путем конструирования антитела с помощью мутаций или путем создания негликозилированных антител. Такие негликозилированные антитела могут быть введены путем дегликозилирования с использованием N-гликозидазы F (ПНГаза F) или путем мутации N297 сайта гликозилирования тяжелой цепи (EU нумерация Кэббота) на любую другую аминокислоту, исключением N. Ферментативное конъюгирование таких негликозилированных антител с применением бактериальной трансглутаминазы было описано для негликозилированных вариантов антител, содержащих мутации N297D, N297Q (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) или N297S (см. патентные заявки WO 2013092998 A1 и WO 2013092983 A2). Ферментативное конъюгирование таких негликозилированных антител с помощью трансглутаминазы обычно обеспечивает ADC, имеющие DAR 2, в которых обе тяжелые цепи специфически функционализированы в положении Q295 (EU нумерация Кэббота). Только мутация N297Q тяжелой цепи обеспечивает дополнительный сайт конъюгирования на тяжелой цепи. Конъюгирование таких вариантов приводит к ADC, имеющим DAR 4, в которых обе тяжелые цепи специфически функционализированы в положениях Q295 и Q297.

Варианты антител, в которых тяжелые цепи несут мутации Q295N и N297Q, содержат только один остаток акцепторного глутамина в положении Q297 (номенклатура Кэбота) на тяжелую цепь (Simone Jeger, Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase, Thesis at ETH Zurich (2009)). В литературе представлено несколько примеров, которые описывают конъюгационный сайт-специфическое конъюгирование негликозилированных антител с применением бактериальной трансглутаминазы (например, Dennler и др., Bioconjugate Chemistry 19, 569-578 (2014); Lhospice и др., Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015)). Стратегия катализируемой трансглутаминазой конъюгационный сайт-специфической функционализации негликозилированных антител обобщена на Фигуре 3.

Сочетание - как конъюгационный сайт-специфическим, так и конъюгационный сайт-неспецифическом образом - осуществляют с применением так называемых линкеров. Линкеры могут быть классифицированы на группу линкеров, которые могут быть расщеплены in vivo, и группу линкеров, которые являются стабильными in vivo (см. L. Ducry и В. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)). Линкеры, которые могут быть расщеплены in vivo, имеют группу, которая может быть расщеплена in vivo, где, в свою очередь, различие можно провести между группами, которые расщепляются in vivo химически и группами, которые расщепляются in vivo ферментативно. "Химически расщепляемые in vivo" и "ферментативно расщепляемые in vivo" означает, что линкеры или группы стабильны в системе кровообращения и расщепляются только на или в целевой клетке посредством химически или ферментативно отличной окружающей среды в этом месте (сниженное рН; повышенная концентрация глутатиона; присутствие лизосомальных ферментов, таких как легумаин, катепсин или плазмин, или гликозидазы, такие как, например, β-глюкуронидазы), таким образом высвобождая низкомолекулярный KSP ингибитор или его производное. Группами, которые могут быть расщеплены химически in vivo, являются, в частности, дисульфид, гидразон, ацеталь и аминаль; группами, которые могут быть расщеплены ферментативно in vivo, являются, в частности 2-8-олигопептидная группа, в особенности, дипептидная группа или гликозид. Сайты расщепления пептидов раскрыты в Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 и Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346, а также Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. Они включают, например, аланин-аланин-аспарагин, валин-аланин, валин-лизин, валин-цитруллин, аланин-лизин и фенилаланин-лизин (необязательно с дополнительной амидной группой).

Для того чтобы обеспечить эффективное высвобождение свободного лекарственного средства, необязательно также можно включить так называемые саморасщепляющиеся линкерные элементы (SIG, например, в вышеприведенной формуле IIa или La, в вышеприведенных формулах VIII и IX) между ферментативным сайтом расщепления и лекарственным средством (Anticancer Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Лекарственное средство может быть высвобождено различными механизмами, например, после первоначального ферментативного высвобождения нуклеофильной группы, путем последующей элиминации с помощью электронного каскада (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71) или путем циклизации соответствующего линкерного элемента (Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 2241) или с помощью комбинации таких двух механизмов (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Примеры таких линкерных элементов показаны на фигуре:

Примеры последовательных ферментативных стадий высвобождения лекарственного средства, например, с помощью гистондеацетилазы и катепсина L, описаны в Nat. Commun., 2013, 4, 2735 (см. Фигуру 4).

Линкеры, которые являются стабильными in vivo, отличаются высокой стабильностью (меньше, чем 5% метаболитов через 48 часа в плазме) и не имеют химически или ферментативно in vivo расщепляемых групп, указанных выше.

Линкер -L- (подобный Lc в формуле VIII и также Lb в формуле IX) предпочтительно имеет одну из следующих основных структур (i)-(iv):

(i) -(C=O)_m-SG1-L1-L2-

(ii) -(C=O)_m-L1-SG-L1-L2-

(iii) -(C=O)_m-L1-L2-

(iv) -(C=O)_m-L1-SG-L2

где m представляет собой 0 или 1; SG означает (химически или ферментативно) in vivo расщепляемую группу (в частности, дисульфид, гидразон, ацеталь и аминаль; или 2-8-олигопептидную группу, которая может быть расщеплена с помощью легумаина, катепсина или плазмина), SG1 означает олигопептидную группу или предпочтительно дипептидную группу, L1 представляют собой in vivo стабильные органические группы, и L2 представляет собой соединяющую группу со связующим или одинарную связь. В данном случае сочетание имеет место предпочтительно с остатком цистеина или остатком лизина антитела. Альтернативно, сочетание может имеет место к остатку тирозина, остатку глутамина или к неприродной аминокислоте антитела. Неприродные аминокислоты могут содержать, например, альдегидные или кетонные группы (как, например, формилглицин) или азидные или алкиновые группы (см. Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806).

Особое предпочтение в соответствии с изобретением отдают основной линкерной структуре (iii). Посредством метаболизации, введение конъюгата в соответствии с изобретением, имеющего основную линкерную структуру (iii) и сочетание линкера с остатком цистеина или лизина антитела, приводит к производным цистеина или лизина следующих формул:

где L1 в каждом случае присоединен к низкомолекулярному KSP ингибитору, например, соединению формулы (III) или (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), или (IV), где -L-#1 представляет собой один из двух радикалов выше, которые являются производными лизина и цистеина соответственно.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают основным линкерным структурам (ii) и (iv), в частности, когда присоединение осуществлено в положении R¹, в частности, когда группа L1 имеет одну из следующих структур:

(a) -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-Y⁷, где Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -COCH₃, и Y⁷ представляет собой одинарную связь или -NH -(СН₂)_0-4 -CHNH₂-CO-, таким образом, что после расщепления соответствующей структуры получают -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-COOH или -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-NH-(CH₂)_0-4-CHNH₂-COOH.

(b) -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-CO-, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -СОСН₃, таким образом, что после расщепления соответствующей структуры получают -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают основной линкерной структуре (i), при присоединении к положению R⁴, в частности, если m=0.

Если линкер присоединен к цистеиновой боковой цепи или остатку цистеина, группа L2 предпочтительно представляет собой производное из группы, которая реагирует с сульфгидрильной группой цистеина. Такие группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилоилы, арилирующие соединения, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB тиолы и дисульфид-восстановители. Эти группы обычно реагируют электрофильным путем с сульфгидрильной связью, образуя сульфидный (например, простой тиоэфирный) или дисульфидный мостик. Предпочтение отдают стабильным сульфидным мостикам. L2 предпочтительно означает

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹, и

R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONHR, -CONR₂ (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

Особенно предпочтительным для L2 является:

или

где #¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела, #² обозначает место присоединения к лекарственному средству, x представляет собой 1 или 2, и R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONR₂, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН. Является предпочтительным, когда х=1 и R²² представляет собой -СООН.

В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина антитела присутствуют в степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к антителу), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы A3 или А4. В данном случае структуры формулы A3 или А4 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к антителу. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

В соответствии с изобретением, L1 предпочтительно представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (R¹⁰ предпочтительно не означает NH₂, если G1 представляет собой -NHCO- или

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 100 атомов углерода из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -C(NH)NR^y-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой -H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил) и/или 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 5-10-членным ароматическим или неароматическим гетероциклом, содержащим вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

G2 предпочтительно представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил) и 3-10-членного, например, 5-10-членного, ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂) -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

Дополнительными прерывающими группами в G2 предпочтительно являются

где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

В данном случае #1 означает связь к KSP ингибитору или пролекарству и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2).

Прямоцепочечная или разветвленная углеводородная цепь ариленовых групп и/или прямоцепочечные и/или разветвленные и/или циклические алкиленовые группы обычно включает α,ω-двухвалентный алкильный радикал, содержащий соответствующее указанное число атомов углерода. Предпочтительные примеры включают: метилен, этан-1,2-диил (1,2-этилен), пропан-1,3-диил (1,3-пропилен), бутан-1,4-диил (1,4-бутилен), пентан-1,5-диил (1,5-пентилен), гексан-1,6-диил (1,6-гексилен), гептан-1,7-диил (1,7-гексилен), октан-1,8-диил (1,8-октилен), нонан-1,9-диил (1,9-нонилен), декан-1,10-диил (1,10-децилен). Тем не менее, алкиленовые группы в углеводородной цепи также могут быть разветвленными, то есть один или несколько атомов водорода прямоцепочечных алкиленовых групп, указанных выше, необязательно могут быть замещены C1-10-алкильными группами, таким образом образуя боковые цепи. Углеводородная цепь может дополнительно содержать циклические алкиленовые группы (циклоалкандиил), например, 1,4-циклогександиил или 1,3-циклопентандиил. Эти циклические группы могут быть ненасыщенными. В частности, ароматические группы (ариленовые группы), например, фенилен, могут присутствовать в углеводородной группе. В свою очередь, в циклических алкиленовых группах и также ариленовых группах, один или несколько атомов водорода необязательно могут быть замещены С1-10-алкильными группами. Таким путем, образуется необязательно разветвленная углеводородная цепь. Эта углеводородная цепь содержит в общей сложности от 0 до 100 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 50, особенно предпочтительно от 2 до 25 атомов углерода.

Боковые цепи, если присутствуют, могут быть моно- или полизамещены одинаково или по-разному с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

Углеводородная цепь может быть прервана один раз или более одного раза одинаково или по-разному с помощью -О-, -S-, -SO-, -SO₂-, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 5-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно

Дополнительными прерывающими группами в G2 предпочтительно являются

Предпочтительно, линкер соответствует приведенной ниже формуле:

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства и

§§ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку, и

L1 и L2 имеют значения, приведенные выше.

Особенно предпочтительно, L1 имеет формулу -NR¹¹B-, где

R¹¹ представляет собой -Н или -NH₂;

В представляет собой -[(CH₂)_x-(X⁴)_y]_w-(CH₂)_z-,

w = от 0 до 20;

х = от 0 до 5;

х = от 0 до 5;

у = 0 или 1;

z = от 0 до 5; и

X⁴ представляет собой -О-, -CONH-, -NHCO- или

Линкеры L, которые являются предпочтительными в соответствии с изобретением, имеют приведенную ниже формулу:

где

#₃ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства,

#₄ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку,

R¹¹ представляет собой -Н или -NH₂;

В представляет собой -[(CH₂)_x-(X⁴)_y]_w-(CH₂)_z-,

w = от 0 до 20;

х = от 0 до 5;

у = 0 или 1;

z = от 1 до 5; и

X⁴ представляет собой -О-, -CONH-, -NHCO- или

Предпочтение также отдают линкерам, где линкер L₁ представляет собой одну из следующих групп:

§-NH-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₆-§§;

§-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₄-§§

§-NH-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-O-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₃-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(CH₃)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₄-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(C₂H₄COOH)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₃-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-S(=O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₃-NH-C(=O)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH(CH₂COOH)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(C₂H₄COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH(CH₂OH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂COOH]-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₃-NH-C(=O)-NH₂]-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-CH(CH₃)-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₃-NH-C(=O)-NH₂]-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₅-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(-O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(NH₂)-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄ -(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-CH(C₂H₄COOH)-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-CH₃]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH₂)₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§

или

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§, где

§ представляет собой связь к молекуле активного компонента

§§ представляет собой связь к антителу и

изоС₃Н₇ представляет собой изопропильный радикал.

Упомянутые выше линкеры являются, в особенности, предпочтительными в конъюгатах формулы (IIa), в которых линкер присоединен путем замещения атома водорода в R¹ или, в случае комбинации с расщепляемым линкером SG1, в R4, то есть R1 представляет собой -L-#1 или R4 представляет собой -SG1-L-#1, где #1 представляет собой связь к антителу.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают приведенным ниже линкерам: В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина антитела присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к антителу), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А5 или А6:

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹, и

R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONR₂, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

В данном случае структуры формулы А5 или А6 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к антителу. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

Другие линкеры -L-, присоединенные к цистеиновой боковой цепи или остатку цистеина, имеют следующую формулу:

где

§ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства и

§§ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку,

m представляет собой 0, 1, 2 или 3;

n представляет собой 0, 1 или 2;

p представляет собой 0 to 20; и

L3 представляет собой

где

о представляет собой 0 или 1;

и

G3 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или циклических алкиленовых групп и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного (предпочтительно 5-10-членного) ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или SO₂ (предпочтительно где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

В приведенной выше формуле, предпочтительно

m означает 1;

p означает 0;

n означает 0;

и L3 представляет собой

где

о представляет собой 0 или 1; и

G3 представляет собой -(CH₂CH₂O)_s(CH₂)_t(CONH)_u CH₂CH₂O)_v(CH₂)_w-, где

s, t, v и w каждый независимо друг от друга означают число от 0 до 20, и u представляет собой 0 или 1.

Предпочтительные группы L1 в приведенной выше формуле §-(CO)_m-L1-L2-§§ представляют собой те группы, приведенные ниже, где r представляет собой число от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 15, особенно предпочтительно от 1 до 20, в особенности, предпочтительно от 2 до 10:

Дополнительные примеры L1 приведены в Таблице С, в которой эта группа выделена обведением линией.

Примеры остатка линкера L1 приведены в Таблицах А и А' ниже. Кроме того, в таблице также указано, с какой группой L2 предпочтительно объединяют эти примеры L1, а также предпочтительное место присоединения (R¹ или R³ или R⁴) и предпочтительное значение для т, то есть, присутствует ли карбонильная группа перед L1, или нет (см. §-(CO)_m-L1-L2-§§). Эти линкеры предпочтительно соединены с остатком цистеина. Если L2 означает сукцинимид или получен из него, этот имид может также полностью или частично находиться в форме гидролизованного сукцинамида с открытой цепью, как описано выше. В зависимости от L1, этот гидролиз до сукцинамидов с открытой цепью может быть более или менее выраженным или не наблюдаться вообще.

** Особенно предпочтительно, приведенные в этих строках линкеры L1 присоединены к линкеру L2, выбранному из:

и/или

где #¹ обозначает место присоединения к атому серы связующего, #2 обозначает место присоединения к группе L¹, R₂₂ предпочтительно представляет собой СООН. В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина связующего присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к связующему), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А7 или А8. В данном случае структуры формулы А7 или А8 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к связующему. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

**: См. примечание** для Таблицы А.

***: Когда присутствует данная структура L2, одновременно может существовать структура L2 формулы ниже:

Примеры конъюгатов, содержащих соответствующие линкеры, имеют следующие структуры, где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N и L1 имеет значение, приведенное выше, L2 и L3 имеют такие же значения, что и L1, AK1 представляет собой антитело, присоединенное через остаток цистеина и n означает число от 1 до 10. Более предпочтительно, AK1 предпочтительно означает человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело. Особое предпочтение отдают негликозилированному анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

Когда линкер присоединен к лизиновой боковой цепи или остатку лизина, можно применять такие же линкеры, как описано выше для сочетания с цистеиновой боковой цепи, за исключением того, что L2 предпочтительно означает карбонильную группу (сочетание осуществляется, например, через соответствующую активированную карбоновую кислоту).

Примеры конъюгатов, имеющих основную структуру (i), имеют одну из следующих структур, где X1 представляет собой СН, Х2 представляет собой С и Х3 представляет собой N, L4 имеет такое же значение, что и L1, AK1 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток цистеина, и n означает число от 1 до 10, и атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в -NH₂ группе) заменен на расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-:

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН: Р2 означает одинарную связь или аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His;

Р3 означает одинарную связь или аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His.

Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности, негликозилированному анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

В случае конъюгатирования, катализируемого трансглутаминазой, в литературе раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул со связующими, например, антителами, конъюгационный сайт-специфическим образом (см., например, Sochaj и др., Biotechnology Advances, 33. 775-784, (2015), Panowski и др., MAbs 6, 34-45 (2014)). В соответствии с изобретением предпочтение отдают конъюгированию KSP ингибиторов или пролекарств с антителом с помощью акцепторных остатков глутамина антитела, используя трансглутаминазу. Такие акцепторные остатки глутамина могут быть образованы путем конструирования антитела или с помощью мутаций, которые создают негликозилированные антитела. Количество таких акцепторных глутаминов в антителе предпочтительно составляет 2 или 4. Для сочетания (конъюгирования) используют подходящие линкеры. Подходящими структурами линкеров являются те, которые обладают свободной аминодонорной функциональностью, которая представляет собой подходящий субстрат для трансглутаминазы. Линкер может быть присоединен к антителу различными путями.

Предпочтительно, в случае конъюгирования, катализируемого трансглутаминазой, линкер имеет одну из вышеуказанных основных структур (i) - (iv), где L1, SG, SG1 и m имеют значения, указанные выше, но L2 предпочтительно означает одну из следующих групп:

где Ry означает -Н, NHCOaлкил, -NH₂

или

где

Ry означает -СОNНалкил, -CONH₂, где

#¹ представляет собой место присоединения к L¹,

#² представляет собой место присоединения к остатку глутамина связующего.

Предпочтительно, Ry означает Н или -NHCOMe.

Примеры соответствующих конъюгатов имеют следующие структуры, где X₁, Х₂, Х₃, Ry и L1 имеют такие же значения, что и указанные выше, AK представляет собой связующее, предпочтительно антитело, где n предпочтительно означает 2 или 4:

Особенно предпочтительные конъюгаты KSP ингибитора

Особое предпочтение отдают в соответствии с изобретением конъюгатам KSP ингибитора, приведенным ниже, где AK (AK₁; AK₂; AK₃) представляют собой связующее или их производные (предпочтительно антитело), и n означает число от 1 до 50, предпочтительно от 1.2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 8. AK1 предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток цистеина; AK₂ предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток лизина; AK₃ предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток глутамина. Связующие или антитела, использованные в данном случае, предпочтительно представляют собой связующие и антитела, описанные в качестве предпочтительных в описании.

Промежуточные соединения KSP ингибитор-линкер или промежуточные соединения пролекарство-линкер и получение конъюгатов

Конъюгаты в соответствии с изобретением получают, обеспечивая сначала низкомолекулярный KSP ингибитор или его пролекарство с линкером. Полученное таким путем промежуточное соединение затем подвергают реакции со связующим (предпочтительно антителом).

Предпочтительно, для сочетания с остатком цистеина, одно из соединений, указанных ниже, подвергают реакции с содержащим цистеин связующим, таким как антитело, которое необязательно частично восстанавливают для этой цели:

где R представляет собой -Н или -СООН,

где K представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C₁-С₆алкил, который необязательно замещен с помощью C₁-С₆-алкокси или -ОН, и

где X₁ представляет собой СН, X₂ представляет собой С и X₃ представляет собой N, SG₁, L₁, L₂, L₃ и L₄ имеют такие же значения, как описано выше.

В вышеописанных формулах, также как и в схемах реакций и структурных формулах, следующих далее, атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в -NH₂ группе) может быть заменен на группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(1-2)-P2-

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина, и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН.

В каждом из вышеуказанных соединений и в соединениях, приведенных ниже, трет-бутильная группа может быть заменена на циклогексил.

Соединение можно использовать, например, в форме его соли с трифторуксусной кислотой. Для реакции со связующим, таким как, например, антитело, соединение предпочтительно применяют в 2-12-кратном молярном избытке относительно связующего.

Предпочтительно, для сочетания с остатком лизина, одно из соединений ниже подвергают реакции с содержащим лизин связующим, таким как антитело:

где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N и L₄ имеет такое же значение, что и L₁, и L₁ имеет такое же значение, как и описано выше.

В случае сочетания промежуточного соединения с остатком цистеина, реакции можно проиллюстрировать следующим образом:

Другие промежуточные соединения и другие антитела может подвергать реакции соответственно.

В случае сочетания промежуточного соединения с остатком лизина, реакцию можно проиллюстрировать следующим образом:

В зависимости от линкера, сукцинимид-присоединенные ADC, после конъюгирования, могут быть превращены в сукцинамиды с открытой цепью, которые имеют выгодный профиль стабильности.

Эту реакцию (раскрытия кольца) можно проводить при рН 7.5-9, предпочтительно при рН 8, при температуре от 25°С до 37°С, например, путем перемешивания. Предпочтительное время перемешивания составляет от 8 до 30 часов.

В вышеприведенных формулах, X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N, SG₁ и L₁ имеют такие же значения, как описано выше и L₂, L₃ и L₄ имеют такие же значения, что и L1; и R и K имеют такие же значения, как описано выше. AK1 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток цистеина, и AK2 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток лизина. Более предпочтительно, AK1 и AK2 означают негликозилированное анти-TWEAKR антитело, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности негликозилированное анти-TWEAKR антитело ТРР-2658.

Дальнейшие определения

Выражение "трансглутаминаза", также используемая взаимозаменяемо с "ТГазой" или "TG", следует онимать в значении фермента, обладающего способностью сшивать белки путем реакции переноса ацила между γ-карбоксамидной группой связанного с пептидом глутамина и ε-аминогруппой лизина или структурно родственного первичного амина, например, аминопентильной группой или, например, связанного с пептидом лизина, что приводит к образованию 8-(γ-глутамил)-лизин изопептидной связи. ТГазы включают бактериальную трансглутаминазу (BTG), например, фермент, имеющий ЕС ссылка номер 2.3.2.13 (белок-глутамин γ-глутамилтрансфераза).

Выражение "акцепторный глутамин" обозначает, когда относится к аминокислотному остатку антитела, остаток глутамина, который, в подходящих условиях, распознается трансглутаминазой и может быть связан при катализе трансглутаминазой по реакции между этим специфическим глутамином и лизином или структурно родственным первичным амином, например, аминопентильной группой. Акцепторный глутамин представляет собой расположенный на поверхности глутамин.

"Аминокислотная модификация" или "мутация" в настоящей заявке означает аминокислотную замену, инсерцию и/или делецию в полипептидной последовательности. Предпочтительная аминокислота модификация в настоящей заявке представляет собой замену. "Аминокислотная замена" или "замена" в настоящей заявке означает замену аминокислоты в данном положении в белковой последовательности на другую аминокислоту. Например, замена Y50W описывает вариант родительского полипептида, в котором тирозин в положении 50 заменен на триптофан. "Вариант" полипептида описывает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по существу идентична сравнительному полипептиду, типично нативному или "родительскому" полипептиду. Полипептидный вариант может обладать одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями и/или инсерциями в определенных положениях в нативной аминокислотной последовательности.

Выражение "конъюгационный сайт-специфический конъюгат" описывает конъюгат связующего, предпочтительно антитела, и остатка, предпочтительно остатка линкер-лекарственное средство, где связующее функционализировано в одном или нескольких определенных положениях, предпочтительно глутаминовых остатках. Трансглутаминазы (ТГазы), включая бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13), демонстрируют строгую специфичность в распознавании субстратов глутамин-белок и могут катализировать "конъюгационный сайт-специфическое конъюгирование".

Выражение "гомогенный конъюгат" или "гомогенный ADC" описывает смесь конъюгационный сайт-специфических конъюгатов, где по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% связующих имеют идентичное число конъюгированных остатков на связующее. В случае антитела, такое число должно быть четным числом, предпочтительно 2 или 4.

Связующие

В самом широком смысле, термин "связующее" следует понимать в значении молекулы, которая связывается с целевой молекулой, присутствующей в определенной целевой популяции клеток, на которую нацелен конъюгат связующего и лекарственного средства. Термин связующее следует понимать в его самом широком значении, а также включает, например, лектины, белки, способные связываться с определенными цепями сахаров, и белки, связывающие фосфолипиды. Такие связующие включают, например, высокомолекулярные белки (связывающие белки), полипептиды или пептиды (связывающие пептиды), непептидные связующие (например, аптамеры (US 5,270,163) обзор Keefe AD., и др., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), или витамины) и все другие молекулы или субстанции, связывающие клетки. Связывающие белки представляют собой, например, антитела и фрагменты антител или антитела-миметики, такие как, например, аффитела, аднектины, антикалины, дарпины, авимеры, нанотела (обзор Gebauer М. и др., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. и др., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Связывающие пептиды представляют собой, например, лиганды пары лиганд/рецептор, такие как, например, VEGF пары лиганд/рецептор VEGF/KDR, такие как трансферрин пары лиганд/рецептор трансферрин/рецептор трансферрина или цитокин/ рецептор цитокина, такой как TNFальфа пары лиганд/рецептор TNFальфа/ рецептор TNFальфа.

"Связующее" может содержать остаток акцепторного глутамина, который может быть функционализирован трансглутаминазой (ТГаза), включая бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13). Этот акцепторный глутамин может либо присутствовать в природной форме в связующем, либо его вводят специально. Акцепторный глутамин может быть образован посредством инсерции остатка глутамина в подходящем положении (например, с помощью слияния с меткой, содержащей акцепторный глутамин, или путем мутации подходящего положения с получением остатка глутамина), или акцепторный глутамин образуют путем мутации любой аминокислоты, которая приводит к превращению конкретного остатка глутамина, который ранее не распознавался трансглутаминазой, в акцепторный глутамин, или акцепторный глутамин образуют путем модификации по типу пост-трансляционной модификация (например, гликозилирования), где это изменение имеет такой эффект, что встречающийся в природе глутамин, который ранее не распознавался трансглутаминазой, становится акцепторным глутамином. Когда связующее представляет собой антитело, то оно содержит акцепторный глутамин, предпочтительно в константном участке. Такие акцепторные глутамины могут быть образованы с помощью мутаций подходящих положений в глутамин (например, мутация N297Q, EU нумерация Кэббота) или путем создания дегликозилированных или негликозилированных антител (например, путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297X, EU нумерация Кэббота). В последнем случае дегликозилированного или негликозилированного антитела, остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи становится акцепторным глутамином. Особое предпочтение отдают антителу, содержащему N297A или N297Q мутацию (EU нумерация Кэббота).

Термин "негликозилированный антитело" или "дегликозилированное антитело" используют в данном случае для определения антитела или производного антитела, содержащего FC участок, с отсутствием гликанов, присоединенных к консервативному сайту L-гликозилирования в СН2 домене. Негликозилированные антитела можно получить, например, путем мутации сайта гликозилирования N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи или путем экспрессии антител в экспрессирующих системах с отсутствием гликозилирующей способности. Способы дегликозилирования антител широко известны в данной области техники (например, Winkelhake & Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4):1074-80)). Дегликозилированные антитела могут быть созданы, например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F. В одном варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить путем экспрессии в прокариотических хозяевах. Подходящие прокариотические хозяева включают, но не ограничиваясь только ими, Е. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и некоторые виды из родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить с использованием экспрессионных систем с клетками млекопитающих вместе с ингибитором гликозилирования туникамицином (Nose & Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). В данном случае модификация состоит в предотвращении гликозилирования по консервативном сайту N-гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи в СН2 домене Fc участка антитела.

В литературе также раскрыты различные опции для конъюгационного сайт-специфического ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул с антителами. Особого внимания в отношении настоящего изобретения заслуживает конъюгирование токсофоров с антителами через два или четыре акцепторных глутаминовых остатках антитела.

В литературе также раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул с антителами. Предпочтение в соответствии с изобретением отдают конъюгированию токсофоров с антителом через один или несколько атомов серы остатков цистеина антитела и/или через одну или несколько NH групп остатков лизина антитела. Тем не менее, также можно присоединить токсофор к антителу через свободные карбоксильные группы или через остатки сахаров антитела.

Под "целевой молекулой" в самом широком смысле понимают молекулу, которая присутствует в популяции целевых клеток и которая может представлять собой белок (например, рецептор фактора роста) или непептидную молекулу (например, сахар или фосфолипид). Она предпочтительно представляет собой рецептор или антиген.

Термин "внеклеточная" целевая молекула описывает целевую молекулу, присоединенную к клетке, которая локализована на внешней поверхности клетки, или часть целевой молекулой, которая локализована на внешней поверхности клетки, то есть связующее может связываться на интактной клетке с его внеклеточной целевой молекулой. Внеклеточная целевая молекула может быть заякорена в клеточную мембрану или являться компонентом клеточной мембраны. Специалисту в данной области техники известны методы идентификации внеклеточных целевых молекул. Для белков, это может осуществлять путем определения трансмембранного(-ых) домена(-ов) и ориентации белка на мембране. Эти данные обычно задепонированы в белковых базах данных (например, SwissProt).

Термин "раковая целевая молекула" описывает целевую молекулу, которая в количестве присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани. Предпочтительно, раковая целевая молекула селективно присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани, где селективность описывает по меньшей мере двукратное обогащение в раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани ("селективная раковая целевая молекула"). Применение раковых целевых молекул предоставляет возможность селективной терапии раковых клеток с применением конъюгатов в соответствии с изобретением.

Связующее может быть присоединено к линкеру с помощью связи. Присоединение связующего может осуществляться через гетероатом связующего. В соответствии с изобретением, гетероатомы связующего, которые могут быть использованы для присоединения, представляют собой серу (в одном варианте присоединение осуществляется через сульфгидрильную группу связующего), кислород (в соответствии с изобретением присоединение осуществляется с помощью карбоксильной или гидроксильной группы связующего) и азот (в одном варианте осуществления присоединение осуществляется через первичную или вторичную аминогруппу или амидную группу связующего). Эти гетероатомы могут присутствовать в природном связующем или вводятся химическими методами или методами молекулярной биологии. В соответствии с изобретением, присоединение связующего к токсофору оказывает только незначительное влияние на связывающую активность связующего по отношению к целевой молекуле. В предпочтительном варианте осуществления, присоединение не оказывает влияния на связывающую активность связующего по отношению к целевой молекуле.

В соответствии с настоящим изобретением, термин "антитело" следует понимать в его самом широком значении и включает молекулы иммуноглобулинов, например, интактные или модифицированные моноклональные антитела, поликлональные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Молекула иммуноглобулина предпочтительно включает молекулу, содержащую четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (Н цепи) и две легкие цепи (L цепи), которые типично связаны с помощью дисульфидных мостиков. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный домен тяжелой цепи (сокращенно VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может, например, содержать три домена CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельный домен (сокращенно VL) и константный домен. Константный домен легкой цепи включает один домен (сокращенно CL). VH и VL домены дополнительно могут быть разделены на участки, имеющие гипервариабельность, также называемые участками, определяющими комплементальность (сокращенно CDR), и участки, имеющие последовательность с низкой вариабельностью (каркасный участок, сокращенно FR). Типично, каждый VH и VL участок состоит из трех CDR и вплоть до четырех FR. Например, начиная с аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитело можно получить из любых доступных видов, как, например, кролик, лама, верблюд, мышь или крыса. В одном варианте осуществления, антитело имеет человеческое или мышиное происхождение. Антитело может быть, например, человеческим, гуманизированным или химерным.

Термин "моноклональное" антитело относится к антителам, полученным из популяции по существу гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела в популяции являются идентичными за исключением встречающихся в природе мутаций, которых может быть небольшое количество. Моноклональные антитела распознают единичный антигенный связывающий сайт с высокой специфичностью. Термин моноклональное антитело не относится к конкретному способу получения.

Термин "интактное" антитело относится к антителам, содержащим как антигенсвязывающий домен, так и константный домен легкой и тяжелой цепи. Константный домен может представлять собой встречающийся в природе домен или его вариант, имеющий некоторое количество модифицированных аминокислотных положений, и также может быть негликозилированным.

Термин "модифицированное интактное" антитело относится к интактным антителам, слитым через их амино-концевой участок или карбокси-концевой участок с помощью ковалентной связи (например, пептидной связи) с другим полипептидом или белком, не имеющим происхождения из антитела. Кроме того, антитела могут быть модифицированы таким образом, что, в определенных положениях, введены реакционно-способные цистеины для облегчения связывания с токсофором (см. Junutula и др. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Термин "человеческое" антитело относится к антителам, которые могут быть получены из человека или которые представляют собой синтетические антитела человека. "Синтетическое" антитело человека представляет собой антитело, которое частично или полностью можно получить in silico из синтетических последовательностей на основании анализа последовательностей антитела человека. Антитело человека может кодироваться, например, нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения. Пример такого антитела можно найти в и др., Nature Biotech. 2000, 18:853-856. Такие "человеческие" и "синтетические" антитела также включают негликозилированные варианты, которые были продуцированы либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту.

Термин "гуманизированное" или "химерное" антитело описывает антитела, состоящие из нечеловеческой и человеческой части последовательности. В этих антителах, часть последовательностей человеческого иммуноглобулина (реципиент) заменена частями последовательности нечеловеческого иммуноглобулина (донор). Во многих случаях, донор представляет собой мышиный иммуноглобулин. В случае гуманизированных антител, аминокислоты CDR реципиента заменены на аминокислоты донора. В некоторых случаях, аминокислоты каркасного участка, также заменены на соответствующие аминокислоты донора. В некоторых случаях гуманизированное антитело содержит аминокислоты, которые отсутствуют как в реципиенте, так и в доноре, и которые введены во время оптимизации антитела. В случае химерных антител, вариабельные домены донорного иммуноглобулина слиты с константными участками человеческого антитела. Такие "гуманизированные" и "химерные" антитела также включают негликозилированные варианты, которые были продуцированы либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту.

Термин гипервариабельный участок (CDR), как используется в настоящей заявке, относится к тем аминокислотам вариабельного домена антитела, которые необходимы для связывания с антигеном. Типично, каждый вариабельный участок имеет три CDR участка, которые обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждый CDR участок может включать аминокислоты в соответствии с определением Кэбота и/или аминокислоты гиперварибельной петли, определяемые в соответствии с Хотиа. Определение в соответствии с Кэботом включает, например, участок от приблизительно положения аминокислоты 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) вариабельной легкой цепи и 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд. (1991)). Определение в соответствии с Хотиа включает, например, участок от приблизительно положения аминокислоты 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 91-96 (CDR3) вариабельной легкой цепи и 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) и 96-101 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи (Chothia и Lesk; J Mol Biol 196). В некоторых случаях, CDR может включать аминокислоты из CDR участка, определенного в соответствии с Кэботом и Хотиа.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи, антитела могут быть разделены на различные классы. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены на дополнительные подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам, обозначаются как [альфа/α], [дельта/δ], [эпсилон/ε], [гамма/γ] и [мю/μ]. Известны как трехмерные структуры, так и субъединичные структуры антител.

Термин "функциональный фрагмент" или "антигенсвязывающий фрагмент антитела" антитела/иммуноглобулина определяют как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельные домены IgG), которые все еще содержат антигенсвязывающие домены антитела/иммуноглобулина. "Антигенсвязывающий домен" антитела типично включает один или несколько гипервариабельных участков антитела, например, CDR, CDR2 и/или CDR3 участок. Тем не менее, "каркасный" или "скелетный" участок антитела также может играть роль во время связывания антитела с антигеном. Каркасный участок образует скелет CDR. Предпочтительно, антигенсвязывающий домен включает по меньшей мере аминокислоты 4-103 вариабельной легкой цепи и аминокислоты 5-109 вариабельной тяжелой цепи, более предпочтительно аминокислоты 3-107 вариабельной легкой цепи и 4-111 вариабельной тяжелой цепи, особенно предпочтительно полных вариабельных легких и тяжелых цепей, то есть аминокислоты 1-109 из VL и 1-113 из VH (нумерация в соответствии с WO 97/08320).

"Функциональные фрагменты" или "антигенсвязывающие фрагменты антител" согласно изобретению охватывают, неокончательно, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, антитела с единичным доменом (DAb), линейные антитела, индивидуальные цепи антител (одноцепочечное Fv, сокращенно scFv); и мультиспецифические антитела, такие как би- и три-специфические антитела, например, образованные из фрагментов антител С.А. K Borrebaeck, редактор (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, редакторы (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag. Антитела, отличающиеся от "мультиспецифических" или "мультифункциональных" антител, представляют собой те антитела, которые имеют идентичные связывающие сайты. Мультиспецифические антитела могут быть специфичными к различным эпитопам антигена или могут быть специфичными к эпитопам более чем одного антигена (см., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, и др., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; или Kostelny и др., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). F(ab')₂ или Fab молекула может быть сконструирована таким образом, что некоторое количество внутримолекулярных дисульфидных взаимодействий, встречающихся между Ch1 и CL доменами, может быть уменьшено или даже полностью предотвращено.

"Эпитопы" относятся к белковым детерминантам, способным связываться специфически с иммуноглобулином или рецепторами Т-клеток. Эпитопные детерминантны обычно состоят из химических активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров или их комбинаций, и обычно имеют специфические 3-х мерные структурные свойства, а также специфические свойства заряда.

"Функциональные фрагменты" или "антигенсвязывающие фрагменты антител" могут быть слиты с другим полипептидом или белком, не имеющим происхождения из антитела, через их амино-конец или карбоксильный конец, с помощью ковалентной связи (например, пептидной связи). Кроме того, антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть модифицированы путем интродукции реакционно-способных цистеинов в различные локализации, для облегчения связывания с токсофором (см. Junutula и др. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Поликлональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники. Моноклональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники ( и Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Человеческое и гуманизированное моноклональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники (Olsson и др., Meth Enzymol. 92, 3-16 или Cabilly и др. US 4,816,567 или Boss и др. US 4,816,397).

Средний специалист в данной области техники знаком с различными способами получения человеческих антител и их фрагментов, такими как, например, с помощью трансгенных мышей (N Lonberg и D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93) или Phage Display Technologien (Clackson и др., Nature. 1991 Aug 15; 352(6336):624-8). Антитела согласно изобретению можно получить из библиотеки рекомбинантных антител, например, состоящей из аминокислотных последовательностей ряда антител, компилированных от большого количества здоровых добровольцев. Антитела также можно получить с помощью известных технологий рекомбинантных ДНК. Последовательность нуклеиновых кислот антител может быть получена с помощью обычного секвенирования или доступна из общедоступных баз данных.

"Выделенное" антитело или связующее было очищено для удаления других компонентов клетки. Загрязняющие компоненты клетки, которые могут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению представляют собой, например, ферменты, гормоны, или другие пептидные или непептидные компоненты клетки. Предпочтительное антитело или связующее представляет собой такое, которое было очищено до степени, более чем 95% по массе, относительно антитела или связующего (определенной, например, с помощью метода Лоури, УФ-Вид спектроскопии или путем SDS капиллярного гель-электрофореза). Кроме того, подразумевается антитело, которое было очищено до такой степени, что возможно определить по меньшей мере 15 аминокислот аминоконцевой области или внутренней аминокислотной последовательности, или которое было очищено до гомогенности, где гомогенность определяют с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях (определение можно осуществить с помощью окрашивания кумасси голубым или предпочтительно с помощью окрашивания серебром). Тем не менее, антитело обычно получают с помощью одной или нескольких стадий очистки.

Термин "специфическое связывание" или "связывается специфически" относится к антителу или связующему, которое связывается с заранее определенным антигеном/целевой молекулой. Специфическое связывание антитела или связующего типично описывает антитело или связующее, имеющее аффинность по меньшей мере 10^-7 М (в виде Kd значения; то есть предпочтительно те, у которых значения Kd меньше, чем 10^-7 М). с антителом или связующим, имеющим по меньшей мере в два раза более высокую аффинность для заранее определенного антигена/целевой молекулы, чем для неспецифического антигена/целевой молекулы (например, бычий сывороточный альбумин, или казеин), которое не представляет собой заранее определенный антиген/целевую молекулу или близкородственный антиген/целевую молекулу. Антитела предпочтительно имеют аффинность по меньшей мере 10^-7 М (в виде Kd значения; другими словами предпочтительно те, значения Kd которых меньше, чем 10^-7 М), предпочтительно по меньшей мере 10^-8 М, более предпочтительно в диапазоне от 10^-9 М до 10^-11 М. Kd значения можно определить, например, с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно изобретению также проявляют аффинности в этих диапазонах. На аффинность предпочтительно не оказывает существенного влияния конъюгирование лекарственных препаратов (в целом, аффинность уменьшается меньше, чем на один порядок величин, другими словами, например, не более чем от 10^-8 М до 10^-7 М).

Антитела, применяемые в соответствии с изобретением, также являются заметно предпочтительными благодаря высокой селективности. Высокая селективность проявляется, если антитело согласно изобретению проявляет аффинность к целевому белку, которая больше чем, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 5 раз или более предпочтительно в 10 раз, чем к независимому другому антигену, например, сывороточному альбумину человека (аффинность можно определить, например, с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии).

Кроме того, применяемые антитела согласно изобретению предпочтительно реагирует перекрестно. Для облегчения и лучшей интерпретации доклинических исследований, например, токсикологических исследований или исследований активности (например, на ксенотрансплантированных мышах), является предпочтительным, если антитело, применяемое в соответствии с изобретением, не только связывается с целевым белком человека, но также связывается с видовым целевым белком в видах, используемых для исследований. В одном варианте осуществления антитело, применяемое в соответствии с изобретением, дополнительно к целевому белку человека, перекрестно реагирует с целевым белком по меньшей мере одного дополнительного вида. Для токсикологических исследований и исследований активности является предпочтительным использовать виды семейств грызунов, собак и примат, отличающихся от человека. Предпочтительными видами грызунов являются мыши и крысы. Предпочтительными приматами, отличающимися от человека, являются макака-резус, шимпанзе и длиннохвостый макак.

В одном варианте осуществления антитело, применяемое в соответствии с изобретением, дополнительно к целевому белку человека, перекрестно реагирует с целевым белком по меньшей мере одного дополнительного вида, выбранного из группы видов, состоящей из мыши, крысы и длиннохвостого макака (Масаса fascicularis). В особенности, предпочтительными являются антитела, применяемые в соответствии с изобретением, которые дополнительно к целевому белку человека по меньшей мере перекрестно реагирует с мышиным целевым белком. Предпочтение отдают перекрестно-реагирующим антителам, аффинность которых к целевому белку других видов, отличающихся от человека, отличается не более, чем в 50 раз, более конкретно не более чем в 10 раз, от аффинности к целевому белку человека.

Антитела, нацеленные на раковую целевую молекулу

Целевая молекула, на которую нацелено связующее, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предпочтительно означает раковую целевую молекулу. Термин "раковая целевая молекула" описывает целевую молекулу, которая в большем количестве присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток, по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани. Предпочтительно, раковая целевая молекула селективно присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани, где селективность описывает по меньшей мере двукратное обогащение в раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани ("селективная раковая целевая молекула"). Применение раковых целевых молекул предоставляет возможность селективной терапии раковых клеток с применением конъюгатов в соответствии с изобретением.

Антитела, которые специфичны к антигену, например, антигену раковых клеток, могут быть получены средним специалистом в данной области техники с помощью методов, которые ему известны (таких как, например, рекомбинантная экспрессия) или могут быть приобретены коммерчески (как, например, от Merck KGaA, Германия). Примерами известных коммерчески доступных антител для противораковой терапии являются Эрбитукс® (цетуксимаб, Merck KGaA), Avastin® (бевацизумаб, Roche) и Герцептин® (трастузумаб, Genentech). Трастузумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело IgG1 каппа типа, которое в исследовании на клетках (Kd=5 нМ) связывает внеклеточные домены рецептора эпидермального фактора роста человека с высокой аффинностью. Антитело получают рекомбинантно в СНО клетках. Все эти антитела также могут быть получены в виде негликозилированных вариантов этих антител, либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту.

В предпочтительном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой селективную раковую целевую молекулу.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой белок.

В одном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой внеклеточную целевую молекулу. В предпочтительном варианте осуществления, внеклеточная целевая молекула представляет собой белок.

Раковые целевые молекулы известны специалистам в данной области. Их примеры представлены ниже.

Примерами раковых целевых молекул являются:

(1) EGF рецептор (NCBI эталонная последовательность NP_005219.2), SEQ ID NO: 213 (1210 аминокислот):

Внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(2) мезотелин (SwissProt ссылка Q13421-3), SEQ ID NO: 214 (622 аминокислот):

где мезотелин кодируется аминокислотами 296-598. Аминокислоты 37-286 кодируют мегакариоцит-потенциирующий фактор. Мезотелин заякорен в клеточную мембрану с помощью GPI якоря и локализирован внеклеточно.

(3) карбоангидраза IX (SwissProt ссылка Q16790), SEQ ID NO: 215 (459 аминокислот):

Внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(4) С4.4а (NCBI эталонная последовательность NP_055215.2; синоним LYPD3), SEQ ID NO: 216 (346 аминокислот):

Зрелый внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(5) CD52 (NCBI эталонная последовательность NP_001794.2), SEQ ID NO: 217

(6) Her2 (NCBI эталонная последовательность NP_004439.2), SEQ ID NO: 218

(7) CD20 (NCBI эталонная последовательность NP_068769.2), SEQ ID NO: 219

(8) антиген активации лимфоцитов CD30 (SwissProt ID Р28908), SEQ ID NO: 220

(9) CD22 молекула адгезии лимфоцитов (SwissProt ID P20273), SEQ ID NO: 221

(10) поверхностный антиген CD33 миелоидных клеток (SwissProt ID P20138), SEQ ID NO: 222

(11) трансмембранный гликобелок NMB (SwissProt ID Q14956), SEQ ID NO: 223

(12) молекула адгезии CD56 (SwissProt ID P13591), SEQ ID NO: 224

(13) поверхностная молекула CD70 (SwissProt ID Р32970), SEQ ID NO: 225

(14) поверхностная молекула CD74 (SwissProt ID P04233), SEQ ID NO: 226

(15) антиген CD19 В-лимфоцитов (SwissProt ID P15391), SEQ ID NO: 227

(16) поверхностный белок муцин-1 (SwissProt ID P15941), SEQ ID NO: 228

(17) поверхностный белок CD 138 (SwissProt ID PI8827), SEQ ID NO: 229

(18) интегрин альфаV ((№ доступа Genbank: NP_002201.1), SEQ ID NO: 230

(19) фактор роста 1, имеющий происхождение из тератокарциномы, белок TDGF1 (№ доступа Genbank: NP_003203.1), SEQ ID NO: 231

(20) простато-специфический мембранный антиген PSMA (Swiss Prot ID: Q04609), SEQ ID NO: 232

(21) тирозинпротеин киназа ЕРНА2 (Swiss Prot ID: P29317), SEQ ID NO: 233

(22) поверхностный белок SLC44A4 (№ доступа Genbank: NP_001171515), SEQ ID NO: 234

(23) поверхностный белок BMPR1B (SwissProt: 000238)

(24) транспортный белок SLC7A5 (SwissProt: Q01650)

(25) эпителиальный простатический антиген STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8)

(26) антиген карциномы яичников MUC16 (SwissProt: Q8WXI7)

(27) транспортный белок SLC34A2 (SwissProt: 095436)

(28) поверхностный белок SEMA5b (SwissProt: Q9P283)

(29) поверхностный белок LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)

(30) рецептор эндотелина типа В EDNRB (SwissProt: Р24530)

(31) белок безымянного пальца RNF43 (SwissProt: Q68DV7)

(32) белок, ассоциированный с карциномой простаты STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)

(33) катионный канал TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)

(34) рецептор комплемента CD21 (SwissProt: Р20023)

(35) белок, ассоциированный с комплексом антиген-распознающего В-клеточного рецептора CD79b (SwissProt: Р40259)

(36) антиген клеточной адгезии СЕАСАМ6 (SwissProt: Р40199)

(37) дипептидаза DPEP1 (SwissProt: P16444)

(38) рецептор интерлейкина IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4)

(39) протеогликан BCAN (SwissProt: Q96GW7)

(40) рецептор эфрина ЕРНВ2 (SwissProt: Р29323)

(41) белок, ассоциированный со стволовыми клетками простаты PSCA (№ доступа Genbank: NP_005663.2)

(42) поверхностный белок LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)

(43) рецепторный белок TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)

(44) белок, ассоциированный с комплексом антиген-распознающего В-клеточного рецептора CD79a (SwissProt: P11912)

(45) рецепторный белок CXCR5 (SwissProt: Р32302)

(46) ионный канал Р2Х5 (SwissProt: Q93086)

(47) антиген лимфоцитов CD180 (SwissProt: Q99467)

(48) рецепторный белок FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)

(49) рецепторный белок FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)

(50) антиген молекулы Ia класса II МНС HLA-DOB (№ доступа Genbank: NP_002111.1)

(51) белок Т-клеток VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)

(52) TWEAKR (SEQ ID NO: 169 (белок); SEQ ID NO: 170 (ДНК).

(53) антиген лимфоцитов CD37 (Swiss Prot: P11049)

(54) FGF рецептор 2; FGFR2 (Gene ID: 2263; Официальное обозначение: FGFR2), FGFR2 рецептор встречается в различных варианты сплайсинга (альфа, бета, IIIb, IIIc). Все варианты сплайсинга могут действовать в качестве целевой молекулы.

(55) трансмембранный гликобелок В7Н3 (CD276; Gene ID: 80381)

(56) рецептор В клеток BAFFR (CD268; Gene ID: 115650)

(57) рецепторный белок ROR 1 (Gene ID: 4919)

(58) поверхностный рецептор IL3RA (CD123; Gene ID: 3561)

(59) рецептор СХС хемокина CXCR5 (CD185; Gene ID 643)

(60) рецепторный белок синцитин (Gene ID 30816)

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, раковую целевую молекулу выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52).

В дальнейшем особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, связующее связывается с внеклеточной раковой целевой молекулой, которую выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52).

В дальнейшем особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, связующее специфически связывается с внеклеточной раковой целевой молекулой, которую выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52). В предпочтительном варианте осуществления связующее, после связывания с его внеклеточной целевой молекулой на целевой клетке, интернализируется целевой клеткой в результате связывания. Это вызывает поглощение целевой клеткой конъюгата связующего и лекарственного средства, который может представлять собой иммуноконъюгат или ADC. Связующее затем процессируется, предпочтительно внутриклеточно, преимущественно лизосомально.

В одном варианте осуществления связующее представляет собой связывающий белок. В предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело, негликозилированное антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, мультиспецифическое антитело или миметик антитела.

Предпочтительные миметики антител представляют собой аффитела, аднектины, антикалины, дарпины, авимеры или нанотела. Предпочтительные мультиспецифические антитела представляют собой биспецифические и триспецифические антитела.

В предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, более предпочтительно выделенное антитело или выделенный антигенсвязывающий фрагмент антитела.

Предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты антител представляют собой Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, DAb, линейные антитела и scFv. Особенно предпочтительными являются Fab, диатела и scFv.

В особенно предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело. Особенно предпочтительными являются моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Дальнейшими особенно предпочтительными являются человеческое, гуманизированное или химерное антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают раковые целевые молекулы, могут быть получены средним специалистом в данной области техники с использованием известных процессов, таких как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Связующие для раковых целевые молекул могут быть приобретены коммерчески или могут быть получены средним специалистом в данной области техники с использованием известных процессов, таких как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Другие способы получения антител или антигенсвязывающих фрагментов антител описаны в WO 2007/070538 (см. стр. 22 "Антитела"). Для специалиста в данной области техники известно, какие процессы, такие как библиотеки фагового дисплея (например, Morphosys HuCAL Gold) могут быть компилированы и использоваться для открытия антител или антигенсвязывающих фрагментов антитела (см. WO 2007/070538, стр. 24 и далее, и AK Пример 1 на стр. 70, AK Пример 2 на стр. 72). Другие способы получения антител, в которых используют библиотеки ДНК из В-клеток, описаны, например, на стр. 26 (WO 2007/070538). Способы гуманизации антител описаны на стр. 30-32 WO 2007070538 и более подробно в Queen, и др., Pros. Natl. Acad. Sci. USA 8610029-10033,1989 или в WO 90/0786. Кроме того, способы для рекомбинантной экспрессии белков в целом и антител в частности известны специалисту в данной области техники (см., например, в Berger и Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, т. A Laboratory Manual, (второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) т. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausabel и др. [Ред.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow и др., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988, Paul [Ред.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); и Harlow, и др., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Для специалиста в данной области техники известны соответствующие векторы, промоторы и сигнальные пептиды, которые необходимы для экспрессии белка/антитела. Рутинные способы также описаны в WO 2007/070538 на страницах 41-45. Способы получения IgG1 антитела описаны, например, в WO 2007/070538 в Примере 6 на стр. 74 и далее. Способы, которые предоставляют возможность определения интернализации антитела после связывания с его антигеном, известны специалисту в данной области техники и описаны например, в WO 2007/070538 на стр. 80. Для получения антител с другой специфичностью целевой молекулы специалист в данной области техники по аналогии может использовать способы, описанные в WO 2007/070538, которые применяют для получения антитела карбоангидразы IX (Mn).

анти-EGFR антитела

Примерами антител, которые связывают раковые целевые молекулы EGFR, являются цетуксимаб (INN номер 7906), панитумумаб (INN номер 8499) и нимотузумаб (INN номер 8545). Цетуксимаб (Номер доступа Drug Bank DB00002) представляет собой химерное анти-EGFR1 антитело, которое продуцируют в клетках SP2/0 миеломы мыши и продают ImClone Systems Inc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co. Цетуксимаб предназначен для лечения метастазирующей, EGFR экспрессирующей, колоректальной карциномы с диким типом гена K-Ras. Он имеет аффинность 10^-10 М.

Последовательность:

Цетуксимаб Легкая цепь (каппа), SEQ ID NO: 235:

Цетуксимаб Тяжелая цепь, SEQ ID NO: 236:

Панитумумаб (INN номер 8499) (Номер доступа Drug Bank DB01269) представляет собой рекомбинантное моноклональное IgG2 антитело человека, которое специфически связывается с EGF рецептором 1 человека и продается Abgenix/Amgen. Панитумумаб получают при иммунизации трансгенных мышей (XenoMouse). Эти мыши способны продуцировать человеческий иммуноглобулин (легкие и тяжелые цепи). Отбирают специфический клон В-клеток, который продуцирует антитела к EGFR, и этот клон иммортализуют с СНО клетками (клетки яичника китайского хомячка). Эти клетки в настоящее время используют для получения 100% антител человека. Панитумумаб предназначен для лечения EGFR-экспрессирующей, метастазирующей колоректальной карциномы, которая резистентна к химиотерапевтическому лечению с применением фторпиримидина, оксалиплатина и иринотекана. Он имеет аффинность 10^-11 М.

Последовательность:

Панитумумаб Легкая цепь (каппа), SEQ ID NO: 237:

Панитумумаб Тяжелая цепь, SEQ ID NO: 238:

Нимотузумаб (INN номер 8545) (ЕР 00586002, ЕР 00712863) представляет собой гуманизированное моноклональное IgG1 антитело, которое специфически связывается с EGF рецептором 1 человека и продается YM BioScienecs Inc. (Mississauga Canada). Оно продуцируется в несекретирующих NSO клетках (клеточная линия млекопитающих). Нимотузумаб одобрен для лечения опухолей головы и шеи, чрезвычайно злокачественной астроцитомы и многоформной глиобластомы (не в EU и US) и карциномы поджелудочной железы (Орфанное лекарственное средство, ЕМА). Он имеет аффинность 10^-8 М.

Нимотузумаб легкая цепь (SEQ ID NO: 239):

Нимотузумаб тяжелая цепь (SEQ ID NO: 240):

Другие варианты осуществления EGFR антител являются следующими:

• залутумумаб / 2F8 / HuMax-EGFr, от Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN номер 8605)

• нецитумумаб / 11F8, ImClone / IMC-11F8, от ImClone Systems Inc. [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (ЕР 01735348-A1, US 2007/0264253-A1, US 7,598,350, WO 2005/090407-A1), INN номер 9083)

• матузумаб / анти-EGFR MAb, Merck KGaA / анти-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 и EMD-55900 / MAb 425 / моноклональное антитело 425, от Merck KGaA / Takeda (WO 92/15683, INN номер 8103 (Матузумаб))

• RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-5083945 / RO4858696 / RO5083945, от Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/112413-A1, WO 2010/115554)

• GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, от Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (ЕР 01900750-A1, ЕР 01911766-A1, ЕР 02073842-A2, US 2010/0028947-A1)

• ISU-101, от Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834-A1)

• ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / анти-EGFR моноклональное антитело 806, от Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771, WO 2005/081854 и WO 2009/023265)

• SYM-004 (состоит из двух химерных IgG1 антител (992 и 1024)), от Symphogen A/S (WO 2010/022736-А2)

• MR1-1 /MR1-1KDEL, от IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (патент: WO 2001/062931-A2)

• Антитело к делеционному мутанту, EGFRvIII, от Amgen/Abgenix (WO 2005/010151, US 7,628,986)

• SC-100, от Scancell Ltd (WO 01/088138-A1)

• MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, от Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO 91/05871, WO 92/15683)

• анти-EGFR-Mab, от Xencor (WO 2005/056606)

• DXL-1218 / анти-EGFR моноклональное антитело (рак), InNexus, от InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638

В предпочтительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба, панитумумаба, нимотузумаба, залутумумаба, нецитумумаба, матузумаба, RG-716, GT-MAB 5.2-GEX, ISU-101, АВТ-806, SYM-004, MR1-1, SC-100, MDX-447 и DXL-1218.

В особенно предпочтительном варианте осуществления анти-EGFR антитела выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба, панитумумаба, нимотузумаба, залутумумаба, нецитумумаба и матузумаба.

Для специалиста в данной области техники известны способы, которые можно использовать для получения других антител, из CDR участков вышеуказанных антител с помощью вариаций последовательностей, эти дальнейшие антитела имеют сходную или лучшую аффинность и/или специфичность к целевой молекуле.

В дополнительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из

антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, содержащих три CDR участка легкой цепи и три CDR участка тяжелой цепи одного из следующих антител: цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб, залутумумаб, нецитумумаб, матузумаб, RG-716, GT-MAB 5.2-GEX, ISU-101, АВТ-806, SYM-004, MR1-1, SC-100, MDX-447 и DXL-1218.

В дополнительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из

антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, содержащих три CDR участка легкой цепи и три CDR участка тяжелой цепи одного из следующих антител: цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб, залутумумаб, нецитумумаб, матузумаб. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к карбоангидразе IX

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу карбоангидразы IX описаны в WO 2007/070538-А2 (например, пункты 1-16).

В предпочтительном варианте осуществления антитела к карбоангидразе IX или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из антител к карбоангидразе IX или антигенсвязывающих фрагментов антител 3ее9 (пункт 4 (а) в WO 2007/070538-А2), 3ef2 (пункт 4 (b) в WO 2007/070538-A2), 1е4 (пункт 4 (с) в WO 2007/070538-А2), 3а4 (пункт 4 (d) в WO 2007/070538-А2), 3ab4 (пункт 4 (е) в WO 2007/070538-А2), 3ah10 (пункт 4 (f) в WO 2007/070538-А2), 3bb2 (пункт 4 (g) в WO 2007/070538-A2), 1aa1 (пункт 4 (h) в WO 2007/070538-A2), 5a6 (пункт 4 (i) в WO 2007/070538-A2) и 5аа3 (пункт 4 (j) в WO 2007/070538-А2).

Анти-С4.4а антитела:

В соответствии с изобретением, можно применять С4.4а антитела.

Примеры С4.4а антител и антигенсвязывающих фрагментов описаны в WO 2012/143499 А2. В качестве ссылки, все антитела WO 2012/143499 А2 таким образом включены в описание настоящего изобретения, и они могут применяться в настоящем изобретении. Последовательности антител приведены в Таблице 1 WO 2012/143499 А2, где в каждой строчке показаны соответствующие CDR аминокислотные последовательности вариабельной легкой цепи, или вариабельная тяжелая цепь антитела представлена в колонке 1.

В одном варианте осуществления, анти-С4.4а антитела или их антигенсвязывающие фрагменты после связывания с клеткой, экспрессирующей С4.4а, интернализируются клеткой.

В дополнительном варианте осуществления, анти-С4.4а антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител содержат по меньшей мере одну, две или три CDR аминокислотные последовательности антитела, представленные в Таблице 1 WO 2012/143499 А2 или Таблице 2 WO 2012/143499 А2. Предпочтительные варианты осуществления таких антител также представлены в WO 2012/143499 А2 и включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Анти-HER2 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой Her2 является трастузумаб (Genentech). Трастузумаб представляет собой гуманизированное антитело, применяемое среди прочего для лечения рака молочной железы.

Дополнительными примерами антител, которые связываются с HER2, являются, дополнительно к трастузумабу (INN 7637, CAS №: RN: 180288-69-1) и пертузумабу (CAS №: 380610-27-5), антитела, раскрытые в WO 2009/123894-А2, WO 200/8140603-А2 или в WO 2011/044368-А2. Примером анти-HER2 конъюгата является трастузумаб-эмтанзин (INN-№9295). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения. Кроме того, можно применять негликозилированные варианты трастузумаба, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту. Кроме того, также можно применять варианты антител которые были сконструированы таким образом, чтобы они содержали один или несколько акцепторных глутаминов для опосредованных трансглутаминазой реакций.

Анти-CD20 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой CD20, является ритуксимаб (Genentech). Ритуксимаб (CAS номер: 174722-31-7) представляет собой химерное антитело, применяемое для лечения неходжкинской лимфомы. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD52 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой CD52, является алемтузумаб (Genzyme). Алемтузумаб (CAS номер: 216503-57-0) представляет собой гуманизированное антитело, применяемое для лечения хронического лимфолейкоза. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к мезотелину:

Примеры антител к мезотелину описаны, например, в WO 2009/068204. В качестве ссылки, все антитела, описанные в WO 2009/068204, таким образом включены в настоящее описание, так, что эти антитела можно использовать в контексте изобретения, раскрытого в настоящей заявке.

Антитела к мезотелину, применяемые в соответствии с изобретением, также являются заметно предпочтительными для инвариантного связывания с мезотелином. Инвариантное связывание характеризуется тем, что, например, антитело, применяемое в соответствии с изобретением, связывается с эпитопом мезотелина, который не может быть замаскирован другим внеклеточным белком. Такой другой внеклеточный белок представляет собой, например, белковый антиген рака яичника 125 (СА125). Антитела, которые применяют с предпочтением, характеризуются тем, что их связывание с мезотелином не блокируется СА125.

Анти-CD30 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD30, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, ходжкинской лимфомы, являются брентуксимаб, иратумумаб и антитела, раскрытые в WO 2008/092117, WO 2008/036688 или WO 2006/089232. Примером анти-CD30 конъюгата является брентуксимаб ведотин (INN №9144). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD22 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD22, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, лимфомы, являются инотузумаб и эпратузумаб. Примерами анти-CD22 конъюгатов являются инотузумаб озогамицин (INN №8574) или анти-CD22-ММАЕ и анти-CD22-МС-ММАЕ (CAS RN: 139504-50-0 и 474645-27-7, соответственно). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD33 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD33, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, лейкоза, являются гемтузумаб и линтузумаб (INN 7580). Примером анти-CD33 конъюгата является гемтузумаб-озагамицин. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-NMB антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу NMB, и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, меланомы или рака молочной железы, является глембатумумаб (INN 9199). Примером анти-NMB конъюгата является глембатумумаб ведотин (CAS RN: 474645-27-7). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD56 антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD56, и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, мелкоклеточного рака легких, МСС или карциномы яичников, является лорвотузумаб. Примером анти-CD57 конъюгата является лорвотузумаб метранзин (CAS RN: 139504-50-0). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD70 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD70, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы или почечно-клеточного рака, раскрыты в WO 2007/038637-А2 и WO 2008/070593-А2. Примером анти-CD70 конъюгата является SGN-75 (CD70 MMAF). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD74 антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD74 и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, является милатузумаб. Примером анти-CD74 конъюгата является милатузумаб-доксорубицин (CAS RN: 23214-92-8). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD19 антитела

Пример антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD19 и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы, раскрыт в WO 2008/031056-А2. Другие антитела и примеры анти-CD19 конъюгата (SAR3419) раскрыты в WO 2008/047242-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к муцину

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу муцин-1 и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы, являются кливатузумаб и антитела, раскрытые в WO 2003/106495-А2, WO 2008/028686-А2. Примеры конъюгатов к муцину раскрыты в WO 2005/009369-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD138 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD138, и их конъюгатов, которые могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, раскрыты в WO 2009/080829-А1, WO 2009/080830-А1. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к интегрин альфаV

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу интегрин альфаV, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, меланомы, саркомы или карциномы, являются интетумумаб (CAS RN: 725735-28-4), абциксимаб (CAS RN: 143653-53-6), этарацизумаб (CAS RN: 892553-42-3) и антитела, раскрытые в US 7,465,449, ЕР 719859-А1, WO 2002/012501-А1 и WO 2006/062779-A2. Примерами конъюгатов к интегрин альфаV являются интетумумаб-DM4 и другие ADC, раскрытые в WO 2007/024536-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-TDGF1 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу TDGF1 и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, являются антитела, раскрытые в WO 02/077033-А1, US 7,318,924, WO 2003/083041-А2 и WO 2002/088170-А2. Примеры анти-TDGF1 конъюгатов раскрыты в WO 2002/088170-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-PSMA антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу PSMA и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы предстательной железы, являются антитела, раскрытые в WO 97/35616-А1, WO 99/47554-А1, WO 01/009192-А1 и WO2003/034903. Примеры анти-PSMA конъюгатов раскрыты в WO 2009/026274-А1 и WO 2007/002222. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-ЕРНА2 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу ЕРНА2 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, раскрыты в WO 2004/091375-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-SLC44A4 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу SLC44A4 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы поджелудочной железы или предстательной железы, раскрыты в WO 2009/033094-A2 и US 2009/0175796-A1. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-HLA-DOB антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой HLA-DOB, является антитело Lym-1 (CAS RN: 301344-99-0), которое можно применять для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы. Примеры анти-HLA-DOB конъюгатов раскрыты, например, в WO 2005/081711-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-VTCN1 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу VTCN1 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы яичников, рака поджелудочной железы, легких или молочной железы, раскрыты в WO 2006/074418-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-FGFR2 антитела

В соответствии с изобретением, можно применять анти-FGFR2 антитела.

Примеры анти-FGFR2 антител и антигенсвязывающих фрагментов описаны в WO 2013076186. В качестве ссылки, все антитела WO 2013076186 таким образом включены в описание настоящего изобретения, и они могут применяться в настоящем изобретении. Последовательности антител представлены в Таблица 9 и Таблице 10 WO 2013076186. Предпочтение отдают антителам, антигенсвязывающим фрагментам и вариантам антител, производным антител, которые обозначены как M048-D01 и M047-D08. Предпочтительные анти-FGFR2 связываются с различными вариантами сплайсинга, известными для FGFR2.

В одном варианте осуществления, анти-FGFR2 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты после связывания с клеткой, экспрессирующей FGFR2, интернализируются клеткой.

В дополнительном варианте осуществления, анти-FGFR2 антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител содержат по меньшей мере одну, две или три CDR аминокислотные последовательности антитела, представленные в Таблице 9 или Таблице 10 WO 2013076186. Предпочтительные варианты осуществления таких антител также представлены в WO 2013076186 и включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Анти-TWEAKR антитела

В предпочтительном варианте осуществления, когда анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент применяют в способах в соответствии с настоящим изобретением, это антитело или фрагмент выбирают из структур, описанных ниже (также опубликованы в WO 2014/199817 (А1)). Кроме того, антитела, которые связываются с TWEAKR, известны специалисту в данной области техники, см., например, WO 2009/020933 (A2) или WO 2009140177 (А2). Кроме того, можно применять негликозилированные варианты описанных анти-TWEAKR антител, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту. Кроме того, также можно применять варианты антител, которые были сконструированы таким образом, чтобы они содержали один или несколько акцепторных глутаминов для опосредованных трансглутаминазой реакций.

Изобретение относится, в частности, к конъюгатам с антителами или их антигенсвязывающими фрагментами или их вариантами, которые приводят к сильной активации TWEAKR (SEQ ID NO: 169 (белок); SEQ ID NO: 170 (ДНК)), что приводит к сильной индукции апоптоза в различных раковых клетках, сверхэкспрессирующих TWEAKR.

Агонистическая активность TWEAKR по отношению к индукции апоптоза и ингибированию пролиферации уже описанных анти-TWEAKR антител (например, PDL-192) ограничена и не достигает эффективности эндогенного лиганда TWEAK. Это отсутствие достаточной агонистической активности не основывается на уменьшенной аффинности, поскольку эти антитела, связывающиеся с TWEAKR с аффинностями, которые сопоставимы с эндогенным лигандом TWEAK, находятся в сходном диапазоне (Michaelson JS и др., MAbs. 2011 Jul-Aug; 3(4):362-75; Culp РА и др., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15; 16(2):497-508), и даже антитела, имеющие более высокую связывающую аффинность, не обязательно проявляют более эффективную активность передачи сигналов (Culp РА, и др., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15; 16(2):497-508). Кроме того, было показано, что противоопухолевая активность уже описанных антител зависит от Fc эффекторной функции, и было показано, что ADCC играет важную роль для эффективности in-vivo на мышиных моделях.

Создание анти-TWEAKR антитела

Полную фаговую библиотеку антител человека (Hoet RM и др., Nat Biotechnol 2005; 23(3):344-8) использовали для выделения TWEAKR-специфических человеческих моноклональных антител настоящего изобретения путем пэннинга белка (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005; 23(3):1105-16), используя димерные Fc-слитые внеклеточные домены человеческого и мышиного TWEAKR в качестве иммобилизованной мишени. Идентифицировали 11 различных Fab фагов, и соответствующие антитела клонировали в EgG экспрессионном векторе млекопитающих, который обеспечивает отсутствие СН2-СН3 доменов в растворимом FAb. После идентификации предпочтительных антител, их экспрессировали в виде полноразмерных IgG. Негликозилированные варианты описанных антител создавали путем введения мутаций N297A или N297Q в тяжелой цепи соответствующего антитела. Эти конструкции экспрессировали, например, транзиентно в клетках млекопитающих, как описано Tom и др., глава 12 в Methods Express: Expression Systems, под редакцией Micheal R. Dyson и Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 (см. AK-Пример 1). Антитела очищали с помощью хроматографии на белке-А и дополнительно характеризовали с помощью их связывающей аффинности к растворимому мономерному TWEAKR, используя ELISA и BIAcore анализ, как описано в AK-Примере 2. Для определения характеристик клеточного связывания анти-TWEAKR антител, связывание исследовали с помощью проточной цитометрии на ряде клеточных линий (НТ29, HS68, HS578). Проводили исследования NFκB репортерного гена для определения агонистической активности всех идентифицированных 11 антител (IgG1 человека). Антитело, имеющее наивысшую активность in vitro (ТРР-883) отбирали для дальнейшего созревания активности и аффинности (см. AK-Пример 1 для более подробной информации). Детектировали вариант с одной заменой, имеющий улучшенную агонистическую активность: G102T из CDR-H3. В конечном итоге, отбирали 7 вариантов на основании повышенной аффинности по сравнению с наилучшим вариантом с одной заменой G102T. Их соответствующую ДНК клонировали в IgG экспрессионном векторе млекопитающих и исследовали для определения функциональной активности в исследовании NF-каппаВ репортерного гена, упомянутом выше. В конечном итоге, полученные последовательности сравнивали с последовательностями зародышевой линии человека, и адаптировали отклонения без какого-либо существенного влияния на аффинность и эффективность. Получали следующие антитела путем скрининга библиотек антител и путем созревания аффинности и/или активности: "ТРР-2090", "ТРР-2149", "ТРР-2093", "ТРР-2148", "ТРР-2084", "ТРР-2077", "ТРР-1538", "ТРР-883", "ТРР-1854", "ТРР-1853", "ТРР-1857", и "ТРР-1858".

Кроме того, антитела согласно изобретению можно получить с помощью методов, известных в данной области техники, таких как скрининг фагового дисплея антител (см., например, Hoet RM и др., Nat Biotechnol 2005; 23(3):344-8), хорошо разработанной гибридомная технология (см., например, и Milstein Nature. 1975 Aug 7; 256(5517):495-7) или иммунизация мыши, среди прочего иммунизация мыши hMAb (например, VelocImmune mouse®).

Конкретные варианты осуществления анти-TWEAKR антител

Одним вариантом согласно изобретению является обеспечение антител или их антигенсвязывающих фрагментов или их вариантов, проявляющих сильную индукцию каспазы 3/7 в одной или нескольких клеточных линиях, экспрессирующих TWEAKR. В предпочтительном варианте осуществления, одна или несколько клеточных линий, экспрессирующих TWEAKR, представлена/представлены в группе, состоящей из WiDr, А253, NCI-H322, НТ29 и 786-O. "Индукция каспазы 3/7" может быть измерена с помощью общепринятых методов, известных в данной области техники, включая описанные в настоящей заявке. В одном варианте осуществления, "индукцию каспазы 3/7" определяют в соответствии с настоящим изобретением, используя определение активности с раствором каспазы 3/7 (Promega, #G8093) и считывания люминесценцию на VICTOR V (Perkin Elmer). После окончания времени инкубирования, определяли активность каспазы 3/7 и определяли фактор индукции каспазы 3/7 по сравнению с необработанными клетками. Считают, что антитело проявляет "сильную индукцию" каспазы 3/7, если фактор индукции больше, чем 1.2, предпочтительно больше, чем 1.5, еще более предпочтительно больше, чем 1.8, еще более предпочтительно больше, чем 2.1, еще более предпочтительно больше, чем 2.5. Обеспечиваются анти-TWEAKR антитела, приводящие к более сильной индукции каспазы 3/7 в НТ29 клетках по сравнению с уже описанными агонистичными антителами [например, PDL-192(ТРР-1104), Р4А8(ТРР-1324), 136.1(ТРР-2194)] и также по сравнению с 300 нг/мл рекомбинантного человеческого TWEAK. Эту сильную активность индуцирования каспазы 3/7 в раковых клетках также наблюдали в WiDr, А253, NIC-H322 и 786-O клетках, где в большинстве экспериментов исследуемые антитела согласно изобретению индуцировали больше факторов изменения по сравнению со сравнительными антителами [PDL-192(TPP-1104), Р4А8(ТРР-1324)] и с 300 нг/мл TWEAK. Некоторые антитела согласно изобретению связываются с TWEAKR только с умеренной аффинностью (>10 нМ), которая значительно ниже, чем аффинность эндогенного лиганда TWEAK, а также ниже по сравнению с другими известными агонистическими антителами. Это свойство обеспечивает дальнейшие возможные преимущества, такие как, например, потенциально более глубокое проникновение в опухоль.

В этой связи, одним вариантом согласно изобретению является обеспечение антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются специфически с TWEAKR в новом эпитопе, характеризующихся селективным связыванием с аспартатом (D) в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169; см. также Фигуру 1). Эти зависимости, идентифицированные для определенных TWEAKR аминокислот для взаимодействия антител, коррелируют с агонистической активностью, определенной для этих антител. Нативный лиганд TWEAK проявляет эффективную активацию TWEAKR и связывается в зависимости от лейцина 46 в обогащенном цистеином домене TWEAKR (Pellegrini и др., FEBS 280:1818-1829). Р4А8 проявляет чрезвычайно низкую агонистическую активность и взаимодействует по меньшей мере частично с доменами, за пределами обогащенного цистеином домена TWEAKR. PDL-192 проявляет умеренную агонистическую активность и связывается в зависимости от R56 с обогащенным цистеином доменом, но противоположно сайту TWEAK лиганда. Антитела согласно настоящему изобретению (например, ТРР-2090) связываются в зависимости от D47, и TWEAK связывается в зависимости от L46. Таким образом, TWEAK связывается со сходным, но другим связывающим сайтом (Фигура 7). Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению проявляют сильную агонистическую активность связывания с новым эпитопом (D47-зависимым) для антител, связанных с чрезвычайно высокой агонистической активностью.

Аминокислота в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169 считается решающей для связывания антител в соответствии с изобретением, что означает, что антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 20%, альтернативно более чем 30%, альтернативно более чем 40%, альтернативно более чем 50%, альтернативно более чем 60%, альтернативно более чем 70%, альтернативно более чем 80%, альтернативно более чем 90%, альтернативно 100% его ELISA сигнала путем модификации этого остатка на аланин, как описано в AK-Примере 2 и на Фигуре 6. Альтернативно, антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 20%, альтернативно более чем 30%, альтернативно более чем 40%, альтернативно более чем 50%, альтернативно более чем 60%, альтернативно более чем 70%, альтернативно более чем 80%, альтернативно более чем 90%, альтернативно 100% его ELISA сигнала для ТРР-2614 по сравнению с ТРР-2203. Предпочтительно, антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 80% его ELISA сигнала для ТРР-2614 по сравнению с ТРР-2203.

В настоящей заявке представлены ссылки на следующие предпочтительные антитела согласно изобретению, как показано в таблице ниже: "ТРР-2090", "ТРР-2149", "ТРР-2093", "ТРР-2148", "ТРР-2084", "ТРР-2077", "ТРР-1538", "ТРР-883", "ТРР-1854", "ТРР-1853", "ТРР-1857", "ТРР-1858; ТРР-2658".

ТРР-2090 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 2, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-2658 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 241, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-5442 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 242, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-8825: представляет собой антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 243, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-2149 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 12, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 11.

ТРР-2093 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 22, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 21.

ТРР-2148 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 32, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 31.

ТРР-2084 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 42, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 41.

ТРР-2077 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 52, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 51.

ТРР-1538 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 62, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 61.

ТРР-883 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 72, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 71.

ТРР-1854 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 82, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 81.

ТРР-1853 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 92, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 91.

ТРР-1857 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 102, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 101.

ТРР-1858 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 112, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 111.

ТРР-2090 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-2658 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-5442 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-8825 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-2149 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 20, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 19.

ТРР-2093 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 30, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 29.

ТРР-2148: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 40, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 39.

ТРР-2084: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 50, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 49.

ТРР-2077: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 60, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 59.

ТРР-1538: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 70, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 69.

ТРР-883: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 80, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 79.

ТРР-1854: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 90, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 89.

ТРР-1853: представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 100, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 99.

ТРР-1857: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 110, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 109.

ТРР-1858: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 120, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 119.

Предпочтительные варианты осуществления анти-TWEAKR антитела приведены ниже:

Негликозилированное анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(-ый) специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1, где антитело представляет собой агонистическое антитело.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1 или 2, которое(-ый) содержит:

вариабельную тяжелую цепь, содержащую:

CDR1 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу PYPMX (SEQ ID NO: 171), где X означает I или М;

CDR2 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO: 172), где X означает S или K; и

CDR3 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO: 173);

и вариабельную легкую цепь, содержащую:

CDR1 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу RASQSISXYLN (SEQ ID NO: 174), где X означает G или S;

CDR2 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу XASSLQS (SEQ ID NO: 175), где X означает Q, А или N; и

CDR3 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу QQSYXXPXIT (SEQ ID NO: 176), где X в положении 5 означает Т или S, X в положении 6 означает Т или S и X в положении 8 означает G или F.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее(-ий):

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7, и вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 8, и

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 3, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 4, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 5 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 13, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 15 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 26, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 27, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 28, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 23, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 25 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 36, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 37, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 38, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 33, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 34, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 35 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 46, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 47, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 48, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 43, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 44, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 45 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 56, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 57, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 58, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 53, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 54, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 55 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 66, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 67, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 68, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 64, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 65 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 76, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 77, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 78, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 73, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 74, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 86, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 87, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 88, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 83, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 84, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 85 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 96, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 97, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 98, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 93, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 94, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 95 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 106, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 107, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 108, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 103, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 104, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 105 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 116, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 117, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 118, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 113, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 114, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 115.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее(-ий):

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 10, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 9, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 20, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 19, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 30, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 29, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 40, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 39, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 50, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 60, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 59, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 70, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 69, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 80, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 79, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 90, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 89, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 100, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 99, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 110, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 109, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 120, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 119.

Антитело в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое представляет собой IgG антитело.

Антитело в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее:

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 2, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 12, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 11, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 21, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 32, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 31, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 42, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 41, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 52, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 51, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 62, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 61, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 72, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 71, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 82, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 81, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 92, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 91, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 102, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 101, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 112, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 111, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 241, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 242, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 243, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1.

Антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления или антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, который представляет собой scFv, Fab, Fab' фрагмент или F(ab')2 фрагмент.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое(-ый) представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое(-ый) представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечиваются антитела, которые являются подходящими для опосредованного трансглутаминазой конъюгирования ингибитора белка кинезина веретена.

Полноразмерные антитела дикого типа изотипа человека обладают консервативным акцепторным глутамином в положении 295 (EU нумерация Кэббота) в тяжелой цепи, который доступный и реакционноспособный в присутствии трансглутаминазы, которая приводит к образованию конъюгата антитела и подходящего соединения, когда антитело находится в негликозилированной форме. Такие негликозилированные антитела или дегликозилированные антитела испытывают отсутствие гликанов, присоединенных к консервативному сайту гликозилирования N297 в СН2 домене Fc участка. Негликозилированные антитела можно получить, например, путем мутации сайта гликозилирования N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи или путем экспрессии антител в экспрессирующих системах с отсутствием гликозилирующей способности. Способы дегликозилирования антител широко известны в данной области техники (например, Winkelhake & Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4): 1074-80)). Дегликозилированные антитела могут быть созданы, например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F. В одном варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить путем экспрессии в прокариотических хозяевах. Подходящие прокариотические хозяева включают, но не ограничиваясь только ими, Е. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и некоторые виды из родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить с использованием экспрессионных систем с клетками млекопитающих вместе с ингибитором гликозилирования туникамицином (Nose & Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). В данном случае модификация состоит в предотвращении гликозилирования по консервативном сайту N-гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи в СН2 домене Fc участка антитела.

В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела получают путем мутации сайта гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) в тяжелой цепи. Ферментативное конъюгирование таких сконструированных негликозилированных антител было описано для вариантов антител, содержащих мутации N297D, N297Q (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) или N297S (см. патентные заявки WO 2013092998 A1 и WO 2013092983 A2). Кроме того, в настоящем изобретении было показано, что трансглутаминаза может эффективно катализировать конъюгирование вариантов негликозилированных антител, несущих мутацию N297A (EU нумерация Кэббота).

Дополнительные или альтернативные реакционноспособные остатки в присутствии трансглутаминазы могут быть созданы путем конструирования антител. Соединения в соответствии с изобретением включают глутаминовые сконструированные антитела, в которых одна или несколько аминокислот дикого типа или родительского антитела заменяют на глутамины, или в которых глутаминовый остаток, необязательно вместе с другой аминокислотой (например, меткой, содержащей акцепторный глутамин), интродуцируют родительскую молекулу или молекулу дикого типа.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на остаток, отличающийся от глутамина. Предпочтение отдают N297D, N297Q, N297S или N297A, еще большее предпочтение отдают N297A. Антитело, имеющее N297X замену и глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота) следовательно, имеет один акцепторный глутамин на тяжелую цепь. Полная форма IgG, следовательно, имеет два сайта конъюгирования на антитело.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на глутамин. Антитело следовательно, имеет N297Q замену. Антитело, имеющее N297Q замену и глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота) следовательно, имеет два акцепторных глутамина и, следовательно, два сайта конъюгирования на тяжелую цепь. Полная форма IgG следовательно, имеет четыре сайта конъюгирования на антитело.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на глутамин и в положении 295 заменен глутамин. Антитело следовательно, имеет N297Q и Q295X замену. Предпочтение отдают Q295N замене. Антитело, имеющее N297Q замену и не содержащее глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота), следовательно, имеет один акцепторный глутамин и следовательно, один сайт конъюгирования на тяжелую цепь. Полная форма IgG, следовательно, имеет два сайта конъюгирования на антитело.

Предпочтительные антитела, пригодные для опосредованного трансглутаминазой конъюгирования, таким образом включают:

i. N297X замену, где X означает любую аминокислоту за исключением аспарагина; более предпочтительными являются N297D, N297Q, N297S или N297A, еще более предпочтительными являются N297A и N297Q.

ii. N297Q замену и Q295X замену, где X означает любую аминокислоту за исключением глутамина, предпочтение отдают Q295N.

Изотопы, соли, сольваты, изотопные варианты

Настоящее изобретение также охватывает все приемлемые изотопные варианты соединений в соответствии с изобретением. Под изотопным вариантом соединения в соответствии с изобретением в данной заявке понимают соединение, в котором, по крайней мере, один атом в соединении в соответствии с изобретением был заменен на другой атом с тем же атомным номером, но с другой атомной массой, чем атомная масса, которая, обычно или преимущественно встречается в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения в соответствии с изобретением, представляют собой такие водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, хлора, брома и йода, такие как ²Н (дейтерий), ³Н (тритий), ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³²Р, ³³Р, ³³S, ³⁴S, ³⁵S, ³⁶S, ¹⁸F, ³⁶Cl, ⁸²Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁹I и ¹³¹I. Конкретные варианты изотопных соединений в соответствии с изобретением, в частности, те, в которые были включены один или несколько радиоактивных изотопов, могут быть полезными, например, для изучения механизма действия лекарственного средства или его распределения в организме; благодаря возможности сравнительно легкого получения и способности к обнаружению, в частности, соединения, меченные с помощью ³Н или ¹⁴С изотопов, являются приемлемыми для этой цели. Кроме того, включение изотопов, например, дейтерия, может привести к конкретным терапевтическим преимуществам, вследствие более высокой метаболической стабильности соединения, например, увеличению периода полураспада в организме или снижению необходимой дозы активного соединения; такие модификации соединений в соответствии с изобретением могут, таким образом, в некоторых случаях также представлять собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Изотопные варианты соединений в соответствии с данным изобретением могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники, например, способами, описанными ниже, и в соответствии с методиками, описанными в рабочих примерах, при использовании соответствующих изотопных модификаций соответствующих реагентов и/или исходных соединений.

Предпочтительные соли в контексте настоящего изобретения представляют собой физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с изобретением. Сюда также включены все соли, которые не являются сами по себе пригодными для фармацевтического применения, но могут быть использованы, например, для выделения или очистки соединений в соответствии с изобретением.

Физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с изобретением включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например, соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.

Физиологически приемлемые соли соединения в соответствии с изобретением также включают соли обычных оснований, в качестве примера и с предпочтением соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция и магния) и соли аммония, полученные из аммиака или органических аминов, имеющих от 1 до 16 атомов углерода, в качестве примера и с предпочтением соли этиламина, диэтиламина, триэтиламина, этилдиизопропиламина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, дициклогексиламина, диметиламиноэтанола, прокаина, дибензиламина, N-метилпиперидина, N-метилморфолина, аргинина, лизина, этилендиамина и 1,2-этилендиамина.

Формы соединений в соответствии с изобретением, в контексте изобретения называемые сольватами. представляют собой формы, которые в твердом или жидком состоянии образуют комплекс путем координации с молекулами растворителя. Гидраты представляют собой особую форму сольватов, в которых осуществляется координация с водой. Предпочтительные сольваты в контексте настоящего изобретения представляют собой гидраты.

Настоящее изобретение дополнительно также охватывает пролекарства соединений в соответствии с изобретением. Термин "пролекарство" в данном контексте относится к соединениям, которые сами могут быть биологически активными или неактивными, но превращаются (например, метаболически или гидролитически) в соединения в соответствии с изобретением в течение периода пребывания их в организме.

Конкретные варианты осуществления

Следующие варианты осуществления являются особенно предпочтительными:

Вариант осуществления А:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или следующей формулы (IIf), связующее означает человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (предпочтительно анти-HER2 антитело, анти-EGFR антитело или анти-TWEAKR антитело, более предпочтительно анти-TWEAKR антитело, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в особенности, анти-TWEAKR антитело ТРР-2658), и n означает число от 1 до 10:

Формула (IIf):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает -С(=O)-(карбонил);

R¹ представляет собой -L-#l, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или -NH₂;

R² означает -H;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)(_0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, C_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группа (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ представляет собой -L-#1 или C1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, О-алкила, SH, S-алкила, О-СО-алкила, О-CO-NH-алкила, NH-CO-алкила, NH-CO-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил);

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную С_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

-L - представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Линкер предпочтительно означает линкер

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного ароматический или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

В данном случае #1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к связующему (например, L2).

Вариант осуществления В:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf) или следующей формулы (IIg), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIg):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

Х₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает СО (карбонил);

R¹ означает -L-#1, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ"(CH₂)_1-3NH₂ и -CONZ"CH₂COOH, где Z" представляет собой -Н или -NH₂;

R² означает -Н;

R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ представляет собой -L-#1 или С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, О-алкила, SH, S-алкила, О-СО-алкила, О-CO-NH-алкила, NH-CO-алкила, NH-CO-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает C_1-3-алкил);

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

-L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу.

-L- предпочтительно представлен формулой

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Альтернативно, линкер может быть присоединен к лизиновой боковой цепи или остатку лизина.

Вариант осуществления С:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение следующей формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), (IIg) или следующей формулы (IIh), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIh):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает -С(=O)-(карбонил);

R¹ означает -L-#1;

R² означает-Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ означает С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-CO-NH-алкила, -NH-CO-алкила, -NH-CO-NH-алкила, -S(O)_n-алкила, -SO₂-NH-алкила, -NH-алкила, N(алкила)₂ или -NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил), или -MOD;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает NH₂);

n представляет собой 0 или 1; о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y - (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, где группа -MOD предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

R⁵ означает H или F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную С_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает Н или F,

где -L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

где -L- представлен формулой

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, С1-С3-алкил или фенил) и 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#¹ означает связь к KSP ингибитору и #² означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Вариант осуществления D:

Конъюгат антитела, имеющий формулу

,

где

R2 и R5 представляют собой -Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R3 представляет собой -СН₂ОН;

R1 представляет собой -L1-L2-СВЯЗУЮЩЕЕ, где

L1 представляет собой

где #2 представляет собой место присоединения к L2 и #1 представляет собой место присоединения к L1;

и L2 представляет собой одну или обе структуры формул А5 и А6, указанных ниже:

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы связующего,

#² обозначает место присоединения к группе L, и

R₂₂ представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к цистеиновому остатку связующего присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к связующему) особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А5 или А6.

В данном случае структуры формулы А5 или А6 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к связующему. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

Связующее предпочтительно означает связующий белок или пептид, особенно предпочтительно человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-EGFR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителу ТРР-2658, или анти-EGFR антителу цетуксимабу или нимотузумабу. В качестве альтернативы связующему, также может присутствовать остаток цистеина.

Вариант осуществления Е:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение следующей формулы (IIa), (IIb), (IIe), (IId), (IIe), (IIf), (IIg), (IIh) или следующей формулы (IIi), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIi):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает СО (карбонил);

R¹ означает -Н или -СООН,

R² означает -Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ означает -L-#1;

R⁵ означает Н или F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н, (необязательно фторированный) С_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где -L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

где -L- представлен формулой

§-(C=O)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 представляет собой

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы или атому азота антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O-(где R^x представляет собой Н, С1-С3-алкил или фенил) и 3-10-членного ароматический или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Терапевтическое применение

Гиперпролиферативные заболевания, для лечения которых могут применяться соединения в соответствии с изобретением, включают, в частности, группу раковых и опухолевых заболеваний. В контексте настоящего изобретения, подразумеваются, в особенности, следующие заболевания, но не ограничиваясь каким-либо образом только ими: карциномы млекопитающих и опухоли млекопитающих (карциномы млекопитающих, включая протоковые и дольковые формы, также in situ), опухоли респираторного тракта (мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома, бронхиальная карцинома), опухоли головного мозга (например, ствола мозга и гипоталамуса, астроцитома, эпендимома, глиобластома, глиома, медуллобластома, менингиома и нейроэктодермальные опухоли и опухоли шишковидной железы), опухоли пищеварительных органов (карциномы пищевода, желудка, желчного пузыря, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки и анальная карцинома), опухоли печени (среди прочего печеночно-клеточная карцинома, холангиокарцинома и смешанная печеночно-клеточная холангиокарцинома), опухоли головы и шеи (карциномы глотки, гортаноглотки, носоглотки, ротоглотки, губ и ротовой полости, оральные меланомы), опухоли кожи (базалиомы, спиналиомы, плоскоклеточные карциномы, саркома Капоши, злокачественная меланома, немеланомный рак кожи, рак кожи из клеток Меркеля, опухоли тучных клеток), опухоли мягких тканей (среди прочего саркомы мягких тканей, остеосаркомы, злокачественные фиброзные гистиоцитомы, хондросаркомы, фибросркомы, гемангиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, лимфосаркомы и рабдомиосаркомы), опухоли глаз (среди прочего внутриглазная меланома и ретинобластома), опухоли эндокринных и экзокринных желез (например, карциномы, аденокарциномы щитовидной и паращитовидной желез, поджелудочной железы и слюнных желез), опухоли мочевыводящих путей (опухоли мочевого пузыря, полового члена, почек, почечной лоханки и уретры) и опухоли репродуктивных органов (карциномы эндометрия, шейки матки, яичников, влагалища, вульвы и матки у женщин и карциномы предстательной железы и яичек у мужчин). Они также включают пролиферативные болезни крови, лимфатической системы и спинного мозга, в солидной форме и в виде циркулирующих клеток, таких как лейкозы, лимфомы и миелопролиферативные заболевания, например, острый миелоидный, острый лимфобластный, хронический лимфоцитарный, хронический миелогенный лейкоз и волосатоклеточный лейкоз, и AIDS-коррелирующие лимфомы, ходжкинские лимфомы, неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, лимфомы Беркита и лимфомы в центральной нервной системе.

Эти хорошо описанные заболевания у людей также могут встречаться со сравнимой этиологией у других млекопитающих и, следовательно, могут подвергаться лечению соединениями настоящего изобретения.

Лечение злокачественных заболеваний, указанных выше, соединениями в соответствии с изобретением включает как лечение солидных опухолей, так и лечение их местастазирующих или циркулирующих форм.

В контексте настоящего изобретения, термин "лечение" или "лечить" используется в общепринятом понимании и обозначает уход, заботу и помощь пациенту с целью борьбы, уменьшения, ослабления или облегчения заболевания или аномального состояния здоровья, и улучшения условий жизни, нарушенных этим заболеванием, как, например, в случае злокачественного новообразования.

Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением для лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением в способе лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений, с применением эффективного количества по меньшей мере одного из соединений в соответствии с изобретением.

Соединения в соответствии с изобретением можно применять отдельно или, при необходимости, в комбинации с одним или несколькими другими фармакологически активными веществами, при условии, что эта комбинация не приводит к нежелательным и неприемлемым побочным действиям. Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает лекарственные средства, содержащие по меньшей мере одно из соединений в соответствии с изобретением и одно или несколько других лекарственных препаратов, в особенности, для лечения и/или предотвращения указанных выше нарушений.

Например, соединения настоящего изобретения можно комбинировать с известными анти-гипер-пролиферативными, цитостатическими или цитотоксическими веществами для лечения злокачественных заболеваний. Примеры подходящих комбинаций лекарственных препаратов включают:

131I-chTNT, абареликс, абиратерон, акларубицин, адо-трастузумаб эмтанзин, афатиниб, афлиберцепт, альдеслейкин, алемтузумаб, алендроновая кислота, алитретиноин, альтретамин, амифостин, аминоглютетимид, гексил 5-аминолевулинат, амрубицин, амсакрин, анастрозол, анцестим, анетол дитиолетион, ангиотензин II, антитромбин III, апрепитант, арцитумомаб, арглабин, триоксид мышьяка, аспарагиназа, акситиниб, азацитидин, белотекан, бендамустин, белиностат, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бизантрен, блеомицин, бортезомиб, бусерелин, бозутиниб, брентуксимаб ведотин, бусульфан, кабазитаксел, кабозантиниб, фолинат кальция, левофлинат кальция, капецитабин, капромаб, карбоплатин, карфилзомиб, кармофур, кармустин, катумаксомаб, целекоксиб, целмолейкин, церитиниб, цетуксимаб, хлорамбуцил, хлормадинон, хлорметин, цидофовир, цинакальцет, цисплатин, кладрибин, клодроновая кислота, клофарабин, копанлисиб, крисантаспаза, кризотиниб, циклофосфамид, ципротерон, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, дабрафениб, дазатиниб, даунорубицин, децитабин, дегареликс, денилейкин-дифтитокс, деносумаб, депреотид, деслорелин, дексразоксан, диброспидий хлорид, диангидрогалактитол, диклофенак, доцетаксел, доласетрон, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин + эстрон, дронабинол, эдреколомаб, элиптиний ацетат, эндостатин, эноцитабин, энзалутамид, эпирубицин, эпитиостанол, эпоэтин-альфа, эпоэтин-бета, эпоэтин-дзета, эптаплатин, эрибулин, эрлотиниб, эзомепразол, эстрамустин, этопозид, эверолимус, эксеместан, фадрозол, фентанил, флуоксиместерон, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, фолиевая кислота, форместан, фосапрепитант, фотемустин, фулвестрант, гадобутрол, гадотеридол, меглуминовая соль гадотеровой кислоты, гадоверсетамид, динатриевая соль гадоксетовой кислоты (gd-EOB-DTPA динатриевая соль), нитрат галия, ганиреликс, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб, глюкарпидаза, глутоксим, гозерелин, гранисетрон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), дигидрохлорид гистамина, гистрелин, гидроксикарбамид, зерна I-125, ибандроновая кислота, ибритумомаб тиуксетан, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, имиквимод, импросульфан, индисетрон, инкадроновая кислота, ингенол мебутат, интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, йобитридол, йобенгуан (123I), йомепрол, ипилимумаб, иринотекан, итраконазол, иксабепилон, ланреотид, лансопразол, лапатиниб, лазохолин, леналидомид, лентинан, летрозол, лейпрорелин, левамизол, левоноргестрел, левотироксин натрий, липегфилграстим, лизурид, лобаплатин, ломустин, лонидамин, мазопрокол, медроксипрогестерон, мегестрол, меларсопрол, мелфалан, мепитиостан, меркаптопурин, месна, метадон, метотрексат, метоксален, метиламинолевулинат, метилпреднизолон, метилтестостерон, метирозин, мифамуртид, милтефозин, мириплатин, митобронитол, митогуазон, митолактол, митомицин, митотан, митоксантрон, могамулизумаб, молграмостим, мопидамол, гидрохлорид морфина, сульфат морфина, набилон, набиксимолс, нафарелин, налоксон + пентазоцин, налтрексон, нартограстим, недаплатин, неларабин, неридроновая кислота, ниволумаб пентетреотид, нилотиниб, нилутамид, ниморазол, нимотузумаб, нимустин, нитракрин, ниволумаб, обинутузумаб, октреотид, офатумумаб, мепесукцинат омацетаксина, омепразол, ондансетрон, орготеин, орилотимод, оксалиплатин, оксикодон, оксиметолон, озогамицин, р53 генная терапия, паклитаксел, зерна палладия-103, палоносетрон, памидроновая кислота, панитумумаб, пантопразол, пазопаниб, пегаспаргаза, пембролизумаб, ПЭГ-интерферон альфа-2b, пеметрексед, пентостатин, пепломицин, перфлубутан, перфосфамид, пертузумаб, пицибанил, пилокарпин, пирарубицин, пиксантрон, плериксафор, пликамицин, полиглусам, полиэстрадиол фосфат, поливинилпирролидон + гиалуронат натрия, полисахарид-K, помалидомид, понатиниб, порфимер натрия, пралатрексат, преднимустин, преднизон, прокарбазин, прокодазол, пропанолол, квинаголид, рабепразол, ракотумомаб, хлорид радия-223, радотиниб, ралоксифен, ралтитрексед, рамосетрон, рамуцирумаб, ранимустин, расбуриказа, разоксан, рефаметиниб, регорафениб, ризедроновая кислота, этидронат рения-186, ритуксимаб, ромидепсин, ромуртид, ронициклиб, самарий (153Sm) лексидронам, сатумомаб, секретин, сипулейцел-Т, сизофиран, собузоксан, натрия глицидидазол, сорафениб, станозолол, стрептозоцин, сунитиниб, талапорфин, тамибаротен, тамоксифен, тапентадол, тазонермин, тецелейкин, технеция (99mTc) нофетумомаб мерпентан, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-октреотид, тегафур, тегафур + гимерацил + отерацил, темопорфин, темозоломид, темсиролимус, тенипозид, тестостерон, тетрофосмин, талидомид, тиотепа, тималфазин, тиротропин альфа, тиогуанин, тоцилизумаб, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трабектедин, трамадол, трастузумаб, треосульфан, третиноин, трифлуридин + типирацил, траметиниб, трилостан, трипторелин, трофосфамид, тромбопоетин, убенимекс, валрубицин, вандетаниб, вапреотид, ваталаниб, вемурафениб, винбластин, винкристин, виндезин, винфлунин, винорелбин, висмодегиб, вориностат, стеклянные микросферы иттрия-90, циностатин, циностатин стималамер, золедроновая кислота, зорубицин.

Кроме того, антитела могут быть выбраны из класса ингибиторов MPS1 или антител против мишеней ОХ-40, CD137 / 4-1ВВ, DR3, IDO1 / IDO2, LAG-3 и CD40.

Кроме того, соединения в соответствии с изобретением быть можно применять в комбинации с лучевой терапией и/или хирургическим вмешательством.

В целом, следующие задачи могут быть решены с помощью комбинаций соединений настоящего изобретения с другими цитостатически или цитотоксически активными средствами:

• улучшенная эффективность замедления роста опухоли, уменьшение ее размера или даже полная ее элиминация, по сравнению с лечением индивидуальным активным компонентом;

• возможность применения химиотерапевтических средств, используемых в более низкой дозировке, по сравнению с таковой в случае монотерапии;

• возможность более переносимой терапии с меньшими побочными эффектами по сравнению с индивидуальным введением;

• возможность лечения более широкого спектра опухолей;

• достижение большей ответной реакции на терапию;

• более длительное время выживания пациента по сравнению с существующей в настоящее время стандартной терапией.

Кроме того, соединения в соответствии с изобретением быть можно применять в комбинации с лучевой терапией и/или хирургическим вмешательством.

Настоящее изобретение также обеспечивает лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением, типично вместе с одним или несколькими инертными, нетоксичными, фармацевтически приемлемыми наполнителями, и их применение для вышеуказанных целей.

Соединения в соответствии с изобретением могут действовать системно и/или местно. Для этой цели, они могут вводиться подходящим образом, например, парентерально, возможно ингаляционно или в виде имплантов или стентов.

Соединения в соответствии с изобретением можно вводить в лекарственных формах, подходящих для этих путей введения.

Парентеральное введение может обходиться без стадии абсорбции (например, внутривенное, внутриартериальное, интракардиальное, интраспинальное или интралюмбальное) или включать поглощение (например, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, чрескожное или внутрибрюшинное). Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают препараты для инъекций и инфузии в виде растворов, суспензий, эмульсий или лиофилизатов. Предпочтение отдают парентеральному введению, в особенности, внутривенному введению.

В общем, было обнаружено, что благоприятным в случае парентерального введения является введение количеств от приблизительно 0.001 до 1 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 0.01 до 0.5 мг/кг, массы тела для достижения эффективных результатов.

Тем не менее, в некоторых случаях может быть необходимым отклоняться от указанных количеств, специфически в зависимости от массы тела, пути введения, индивидуального ответа на лекарственное средство, природы препарата и времени или интервала, в течение которого осуществляется введение. Таким образом, в некоторых случаях, может быть достаточно меньше вышеуказанного минимального количества, в то время как в других случаях верхний указанный предел следует превысить. В случае введения больших количеств, может быть желательным разделять их на несколько индивидуальных доз в течение суток.

Примеры

Примеры, которые представлены далее, иллюстрируют изобретение. Изобретение не ограничивается примерами.

Если не указано иначе, процентные значения в тестах и примерах, которые представлены далее, представляют собой процентные значения по массе; части представляют собой массовые части. Соотношения растворителей, степени разведения и данные концентрации для растворов жидкость/жидкость в каждом случае пересчитаны на объем.

Пути синтеза:

В качестве примера "рабочих примеров", следующие схемы показывают иллюстративные пути синтеза, приводящие к рабочим примерам: В этих схемах атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в группе -NH₂) может быть заменен на группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН.

Схема 1: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 2: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 3: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 4: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 5: Синтез лизин-присоединенных ADC

а) трифосген, ТГФ, в атмосфере аргона

Схема 6: Синтез лизин-присоединенных ADC

Схема 7: Синтез молекул-предшественников ADC

[a): EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, КТ; b) этанол, пиперидин, метиламин, вода, КТ; с) HATU, диизопропилэтиламин, КТ; d) ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 8: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; b) например, ДХМ/ТФУ 20:1, КТ; с) например, HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 9: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, тетрафторборат 2-бром-1-этилпиридиния, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ; b) например, 2М раствор LiOH, ТГФ, вода, КТ, ВЭЖХ разделение региоизомеров; с) например, EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 10: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Н₂, Pd-C, EtOH, КТ; b) например, n-нитробензил бромид, K₂CO₃, ДМФА; с) например, этанол, раствор 40% концентрации метиламина в воде, 50°С; d) например, дитионит динатрия, ТГФ, вода, 50°С; е) например, HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; f) например, пиперидин, раствор 40% концентрации метиламина в воде, этанол, 50°С; g) например, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; h) например, пиперидин, ДМФА, КТ; i) ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 11: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Et₃N, ДМФА, КТ; b) например, Н₂, Pd-C, EtOH/этилацетат/ТГФ (1:1:1), КТ; с) например, 4-метилморфолин, ДМФА, КТ; d) например, HATU, HOAt, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; е) например, ТФУ, КТ]

Схема 12: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; b) например, хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, Cs₂CO₃, ДМФА, 50°С; d) например, гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1), T3P^(R), диизопропилэтиламин, MeCN, КТ; е) например, ТФУ, КТ]

Схема 13: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, метансульфонил хлорид, NEt₃, дихлорметан, 0°С; b) например, NaN₃, ДМФА, 40°С; с) например, Н₂, Pd-C, EtOH/этилацетат (1:1), КТ; d) например, TBAF, ТГФ, КТ; е) например, 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дион, NEt₃, CaCO₃, 1,4-диоксан, КТ; f) например, N-хлорсукцинимид, TEMPO, хлорид тетра-н-бутиламмония, хлороформ, 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1); g) например, NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; h) например, хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; i) например, TBAF, ТГФ, вода, КТ; j) например, 4-метилморфолин, ДМФА, КТ; k) например, ТФУ, КТ]

Схема 14: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, формальдегид, Na₂CO₃, вода, КТ; b) например, Ас₂О, пиридин, ТГФ, КТ; с) например, ди-трет-бутил малонат, KOtBu, ТГФ, КТ; d) например, LiBH₄, ТГФ, КТ; е) например, TBDMSCl, имидазол, ДХМ, КТ; f) например, периодинан Десса-Мартина, ДХМ; g) например, триацетоксиборогидрид натрия, АсОН, ДХМ, КТ; h) например, nBu₄NF, ТГФ, КТ; i) например, SOCl₂, ТГФ, КТ; j) например, AcSK, nBu₄NI, ДМФА, 90°С; k) например, NaOH, МеОН, ТГФ, КТ; 1) например, ТСЕР, диоксан, КТ; m) например, разделение эпимеров; n) например, 6 н. хлористоводородная кислота, ТГФ, КТ; о) например, Mal-dPEG(3)-Mal, PBS буфер, ACN, КТ]

Схема 15: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Mal-dPEG(3)-Mal, PBS буфер, ACN, КТ]

Схема 16: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, BF₃OEt₂, ТГФ, 0°С; b): например, изоамилнитрит, -10°С, 0.5 ч; с): например, метил 2-хлор-3-оксобутаноат, пиридин, вода, -5°С; d): например, NEt₃, толуол, KT; е): например, Et₃SiH, ТФУ, КТ; f): например, LiBH₄, ТГФ, 60°С; g): например, периодинан Десса-Мартина, ДХМ, КТ; h): например, (R)-(+)-метил-2-пропансульфинамид, изопропилат титана(IV), ТГФ, КТ; i): например, трет-BuLi, пентан, ТГФ, -78°С; j): например, HCl в диоксане, ТГФ, МеОН, КТ; k): например, 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналь, NaB(OAc)₃H, АсОН, ДХМ, КТ; l): например, 2-хлор-2-оксоэтилацетат, NEt₃, ДХМ, КТ; m): например, метиламин, вода, EtOH, 50°С]

Схема 17: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-5-оксо-b-норвалинат, NaB(OAc)₃H, АсОН, ДХМ, КТ; b): например, 2-хлор-2-оксоэтилацетат, NEt₃, ДХМ, КТ; с): например, метиламин, вода, EtOH, 60°С; d): например, ТГФ, ДХМ, 50°С; е): например, Boc₂O, NEt₃, ДХМ, КТ; f): например, трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1), HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; f): например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 18: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 19: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 20: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 21: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 22: Синтез промежуточных соединений

[а): например, триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) например, ацетоксиацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, LiOH, ТГФ/вода, КТ; d) например, Н₂, Pd-C, EtOH, КТ; е) например, Teoc-OSu, NEt₃, диоксан, КТ; f) например, Fmoc-Cl, диизопропилэтиламин, диоксан/вода 2:1, КТ]

Схема 23: Синтез промежуточных соединений

[а): например, триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) например, ацетоксиацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, LiOH, метанол, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ; е) например, Boc₂O, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ]

Схема 24: Синтез промежуточных соединений

[а): например, бензил бромид, Cs₂CO₃, ДМФА, КТ; b) например, Pd(dppf)₂Cl₂, ДМФА, Na₂CO₃, 85°С; с) например, LiAlH₄, ТГФ, 0°С; MnO₂, ДХМ, КТ; d) например, Ti(iOPr)₄, ТГФ, КТ; е) например, tBuLi, ТГФ, -78°С; МеОН, NH₄Cl; f) например, HCl/1,4-диоксан]

Схема 25: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 26: Синтез цистеин-присоединенных ADC через гидролизованные сукцинамиды

Этот способ использовали, в частности, для ADC, где L1=СН₂, для превращения этих ADC в связующую форму с открытой цепью.

Схема 27: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) ацетоксиацетил хлорид, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ; с) LiOH, МеОН, КТ;

d) трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 28: Синтез молекул-предшественников ADC

[a): HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; b) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 29: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) ацетоксиацетил хлорид, триэтиламин, ДХМ, КТ; с) LiOH, МеОН, КТ; d) трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 30: Общий способ синтеза промежуточных соединений и предшественников ADC

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) R²¹-COOH, EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²¹-COOH, HATU, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²¹-COOSu, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Схема 31: Синтез молекул-предшественников ADC, содержащих расщепляемые легумаином линкеры

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Схема 32: Синтез молекул-предшественников ADC, содержащих расщепляемые легумаином линкеры

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Кроме того, другие промежуточные соединения в соответствии со Схемами 32, 33 и 34 могут быть превращены в расщепляемые легумаином ADC и APDC предшественники.

В качестве альтернативы бензилоксикарбонильной группе, показанной на Схемах 32-34, можно использовать другие защитные группы, широко известные в химии пептидов, и присоединять их соответствующими способами, которые также известны. Выбор стратегии применения защитных групп осуществляют в соответствии с требованиями, известными специалистам в данной области касающимися совместимости с другими структурными элементами, которые встречаются в молекуле. Если они все еще присутствуют, дальнейшие защитные группы в молекуле могут быть удалены на последней стадии.

Что касается их последовательности проведения, синтезы необязательно также можно проводить в ином порядке.

Схема 33: Синтез цистеин-присоединенных ADC с отщепляемой легумаином концевой группой

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ; b) 2-5 экв. ТСЕР, PBS рН 7.2, перемешивание при КТ в течение 30 мин; с) перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 90 мин, затем повторная буферизация до рН 8 с помощью PD 10 колонок (Sephadex® G-25, GE Healthcare) и перемешивание в атмосфере аргона при КТ в течение ночи и последующее концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и доведение до желаемой концентрации с помощью PBS при рН 7.2)]

Схема 34: Синтез лизин-присоединенных ADC с расщепляемым легумаином линкером

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ; b) Н₂, 10% Pd-C, метанол 1.5 ч, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, перемешивание при КТ в течение ночи; d) АК2 в PBS, добавление 5 экв. активного сложного эфира, растворенного в ДМСО, перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 60 мин, добавление еще 5 экв. активного сложного эфира, растворенного в ДМСО, перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 60 мин, затем очистка с помощью PD 10 колонок, уравновешенных PBS буфером (рН 7.2) (Sephadex® G-25, GE Healthcare) и последующее концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и доведение до желаемой концентрации с помощью PBS буфера (рН 7.2)]

Схема 35: Синтез ADC предшественников с отщепляемой легумаином концевой группой

[a): NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; b) хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) L-цистеин, NaHCO₃, DBU, изопропанол/вода, 50°С; d) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С; f) d) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ]

Схема 36: Синтез ADC через сочетание с помощью трансглутаминазы

[а: 5 мг AK3 в DPBS рН 7.4 (с~10 мг/мл), 6 эквивалентов токсофорлинкерного предшественника (например, Промежуточного соединения Q31-Q34), добавление 50 мкл раствора 12.5 мкл (1.25 Ед) раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (100 Ед/мл) и 37.5 мкл DPBS рН 7.4, инкубация при 37°С в течение 24 ч].

А. Примеры

Аббревиатуры и сокращения:

Сокращения аминокислот

Ala = аланин

Arg = аргинин

Asn = аспарагин

Asp = аспарагиновая кислота

Cys = цистеин

Glu = глутаминовая кислота

Gln = глутамин

Gly = глицин

His = гистидин

Ile = изолейцин

Leu = лейцин

Lys = лизин

Met = метионин

Nva = норвалин

Phe = фенилаланин

Pro = пролин

Ser = серии

Thr = треонин

Trp = триптофан

Tyr = тирозин

Val = валин

Методы ВЭЖХ и ЖХ-МС:

Метод 1 (ЖХ-МС):

Прибор: Waters ACQUITY SQD UPLC system; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 90% А→1.2 мин 5% А→2.0 мин 5% А; печь: 50°С; скорость потока: 0.40 мл/мин; УФ детектирование: 208-400 нм.

Метод 2 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, ВЕН300, 2.1×150 мм, С18 1.7 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→1.5 мин 2% В→8.5 мин 95% В→10.0 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 0.50 мл/мин; УФ детектирование: 220 нм.

Метод 3 (ЖХ-МС):

МС прибор: Waters (Micromass) QM; ВЭЖХ прибор: Agilent 1100 series; колонка: Agilent ZORBAX Extend-C18 3.0×50 мм 3.5 микрон; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01 моль карбоната аммония, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила; градиент: 0.0 мин 98% А→0.2 мин 98% А→3.0 мин 5% А→4.5 мин 5% А; печь: 40°С; скорость потока: 1.75 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 4 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, HSST3, 2.1×50 мм, С18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 10% В→0.3 мин 10% В→1.7 мин 95% В→2.5 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 5 (ЖХ-МС):

Прибор: Waters ACQUITY SQD UPLC system; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 95% А→6.0 мин 5% А→7.5 мин 5% А; печь: 50°С; скорость потока: 0.35 мл/мин; УФ детектирование: 210-400 нм.

Метод 6 (ЖХ-МС):

Прибор: Micromass Quattro Premier с Waters UPLC Acquity; колонка: Thermo Hypersil GOLD 1.9 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.5 мл муравьиной кислоты 50% концентрации; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.5 мл муравьиной кислоты 50% концентрации; градиент: 0.0 мин 97% А→0.5 мин 97% А→3.2 мин 5% А→4.0 мин 5% А печь: 50°С; скорость потока: 0.3 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 7 (ЖХ-МС):

Прибор: Agilent МС Quad 6150; ВЭЖХ: Agilent 1290; колонка: Waters Acquity UPLC HSS Т3 1.8 мк 50×2.1 мм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 90% А→0.3 мин 90% А→1.7 мин 5% А→3.0 мин 5% А печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 205-305 нм.

Метод 8 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, HSST3, 2.1×50 мм, С18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→2.0 мин 2% В→13.0 мин 90% В→15.0 мин 90% В; печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 9: ЖХ-МС-Преп. метод очистки для примеров 181-191 (Метод LIND-ЖХ-МС-Преп.)

МС прибор: Waters; ВЭЖХ прибор: Waters (колонка Waters X-Bridge С18, 19 мм х 50 мм, 5 мкм, подвижная фаза А: вода + 0.05% аммиака, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) с градиентом; скорость потока: 40 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210 - 400 нм).

или

МС прибор: Waters; ВЭЖХ прибор: Waters (колонка Phenomenex Luna 5 мк С 18(2) 100А, AXIA Tech. 50×21.2 мм, подвижная фаза А: вода + 0.05% муравьиной кислоты, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) с градиентом; скорость потока: 40 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210-400 нм).

Метод 10: ЖХ-МС аналитический метод для примеров 181-191 (LIND_SQD_SB_AQ)

МС прибор: Waters SQD; ВЭЖХ прибор: Waters UPLC; колонка: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 мм × 2.1 мм, 1.8 мкм; подвижная фаза А: вода + 0.025% муравьиной кислоты, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) + 0,025% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 98%А - 0.9 мин 25%А - 1.0 мин 5%А - 1.4 мин 5% А - 1.41 мин 98% А - 1.5 мин 98% А; печь: 40°С; скорость потока: 0.600 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210 нм.

Метод 11 (ВЭЖХ):

Прибор: НР1100 Series;

колонка: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4.6 мм, № кат. 1.51450.0001, предварительная колонка Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4.6 мм, № кат. 1.51470.0001;

Длина волны: 210 нм.

Метод 12 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Thermo Scientific FT-MS; тип прибора УВЭЖХ+: Thermo Scientific UltiMate 3000; колонка: Waters, HSST3, 2.1×75 мм, C18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 10% В→2.5 мин 95% В→3.5 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 0.90 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм / Optimum Integration Path 210-300 нм.

Метод 13: (ЖХ-МС):

МС прибор: Waters (Micromass) Quattro Micro; прибор Waters UPLC Acquity; колонка: Waters ВЕН C18 1.7 мкм 50×2.1 мм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01 моль формиата аммония, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила; градиент: 0.0 мин 95% А→0.1 мин 95% А→2.0 мин 15% А→2.5 мин 15% А→2.51 мин 10% А→3.0 мин 10% А; печь: 40°С; скорость потока: 0.5 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Все реагирующие вещества или реагенты, получение которых не описано в явной форме далее в настоящей заявке, приобретали коммерчески из обычно доступных источников. Для всех реагирующих веществ или реагентов, приготовление которых не описано в явной форме далее в настоящей заявке и которые не получают коммерчески или получают из источников, которые не общедоступны, приведена ссылка на опубликованную литературу, в которой описано их получение.

Метод 14: (ЖХ-МС) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10 мин)

Тип МС прибора: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; тип ВЭЖХ прибора: Agilent 1200SL; колонка: Agilent, POROSHELL 120, 3×150 мм, SB - С18 2.7 мкм; элюент А: 1 л воды + 0.1% трифторуксусной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.1% трифторуксусной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→0.3 мин 2% В→5.0 мин 95% В→10.0 мин 95% В; печь: 40°С; скорость потока: 0.75 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Исходные и промежуточные соединения:

Промежуточное соединение С1

Трифторуксусная кислота - (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали, как описано в WO 2006/002326.

Промежуточное соединение С2

трет-Бутил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноат

4.22 г (14.5 ммоль) трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-гомосерината растворяли в 180 мл дихлорметана, и затем добавляли 3.5 мл пиридина и 9.2 г (21.7 ммоль) 1,1,1-триацетокси-1лямбда5,2-бензйодоксол-3(1Н)-она. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем разбавляли 500 мл дихлорметана и два раза экстрагировали раствором тиосульфата натрия 10% концентрации, и затем последовательно экстрагировали два раза раствором лимонной кислоты 5% концентрации и два раза раствором бикарбоната натрия 10% концентрации. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом магния и затем сушили при пониженном давлении. Остаток вносили в диэтиловый эфир и добавляли HCl (раствор в диэтиловом эфире). Осадок отфильтровывали и фильтрат затем концентрировали и лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 3.7 г (93%) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата, который использовали без дополнительной очистки на следующей стадии. (R_f: 0.5 (ДХМ/метанол 95/5).

3.5 г (9.85 ммоль) Промежуточного соединения С1 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 3.13 г (14.77 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 0.7 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 30 мин. Растворитель затем упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода. Выпавшее в осадок твердое вещество отфильтровывали и сушили, получая 5.46 г (84%) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z = 613 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С3

(2S)-4-[(Ацетоксиацетил){1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

5.46 г (8.24 ммоль) Промежуточного соединения С2 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 4.8 мл триэтиламина и 2.2 мл (20.6 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на Biotage/Isolera (SNAP 340g), используя подвижную фазу циклогексан/этилацетат 2:1. Это приводило к получению 4.57 г (75%) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 713 (М+Н)⁺.

1 г (1.36 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 20 мл ДХМ и добавляли 20 мл ТФУ. После 5 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток растирали два раза с н-пентаном. В каждом случае н-пентан декантировали и твердое вещество, которое осталось, сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.1 г соединения (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-аминобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1). ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z = 557 (М+Н)⁺.

0.91 г (1.57 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 70 мл ДХМ и добавляли 3.43 г (15.7 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и 4.1 мл N,N-диизопропилэтиламина. После 30 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь разбавляли ДХМ и экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток растирали два раза с н-пентаном и в каждом случае н-пентан декантировали. Твердое вещество, которое осталось, лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1, получая 1.11 г указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.55 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.3 мин; МС (ESI положит.): m/z = 657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С4

(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

5.46 г (8.24 ммоль) Промежуточного соединения С2 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 4.8 мл триэтиламина и 2.2 мл (20.6 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на Biotage/Isolera (SNAP 340g), используя подвижную фазу циклогексан/этилацетат 2:1. Это приводило к получению 4.57 г (75%) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 713 (М+Н)⁺.

1.5 г (2.035 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 50 мл этанола и добавляли 5.8 мл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч и затем концентрировали. Остаток вносили в ДХМ и два раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и затем концентрировали. Остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.235 мг этого промежуточного соединения, которое подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

1.235 мг (1.5 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 15 мл ДХМ и добавляли 15 мл ТФУ. После 4 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из ацетонитрила. Это приводило к получению 1.04 г (колич.) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z = 515 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С5

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

0.9 г (1.24 ммоль) Промежуточного соединения С4 растворяли в 60 мл ДХМ и добавляли 2.7 г (12.5 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и 3.3 мл N,N-диизопропилэтиламина. После 45 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток вносили в диэтиловый эфир, и до тех пор, пока смесь не начинала становиться мутной, добавляли н-пентан. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и затем декантировали. Снова к остатку добавляли н-пентан и смесь декантировали. Твердое вещество, которое осталось, лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1, получая 0.95 г (колич.) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 615 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С6

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-гидразино-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

150 мг (0.16 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 21 мл ДМФА, и затем добавляли 37.2 мг (0.19 ммоль) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), 37 мг (0.243 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, 85 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение 45 мг (0.18 ммоль) коммерчески доступного 9Н-флуорен-9-илметил гидразинкарбоксилата. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 60 мг (41% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (ESI положит.): m/z = 893 (М+Н)⁺.

60 мг (0.067 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 19 мл этанола и добавляли 681 мкл пиперидина и 386 мкл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 18 ч и затем концентрировали. Остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 2:1 и доводили до рН 2 с помощью ТФУ. Затем смесь концентрировали снова и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 25 мг (51% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 629 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С7

1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}гидразино)уксусная кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

0.2 г (0.305 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 80 мл ДХМ, добавляли 0.125 г (0.46 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния (ВЕР), 94 мг (0.61 ммоль) коммерчески доступного гидрохлорида этилгидразиноацетата и 159 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и смесь затем перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем к реакционной смеси добавляли этилацетат и воду, и фазы разделяли. Органическую фазу экстрагировали насыщенным раствором хлорида натрия и затем сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток сушили при пониженном давлении и подвергали дальнейшей реакции без очистки. Для этой цели, его вносили в 20 мл тетрагидрофурана и добавляли 10 мл воды и 3.2 мл 2 н. раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем доводили до рН 7, используя ТФУ. Реакционную смесь затем концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Таким путем указанное в заголовке соединение отделяли от его ранее элюирующегося региоизомера. Объединение соответствующих фракций, лиофилизация и сушка давали 19.7 г (8% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения в виде бесцветной пены.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z = 687 (М+Н)⁺.

Установление структуры региоизомеров осуществляли с помощью ЯМР спектроскопии в отдельном эксперименте после разделения региоизомеров на стадии защищенного промежуточного соединения. Защищенное этил (1-{(2S)-4-[(ацетоксиацетил) {(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}гидразино)ацетатное промежуточное соединение указанного в заголовке соединения имело следующий 1Н ЯМР спектр:

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.8 (m, 2Н), 7.4-7.2 (m, 6Н), 7.08 (m, 1Н), 6.73 (d, 1Н), 5.6 (s, 1Н), 5.25 и 4,89 (2d, 2Н), 4.89 и 4.77 (2d, 2Н), 4.62 (t, 1Н), 4.32 и 3.78 (2d, 2Н), 4.1 (t, 2Н), 3.62-3.47 (m), 2.13 (s, 3Н), 1.41 и 0.72 (2m, 2Н), 1.3 (s, 9Н), 1.18 (t, 3Н), 0.92 (s, 9Н).

Промежуточное соединение С8

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}-бета-аланин

293 мг (0.41 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 25 мл ДМФА, и затем добавляли 144 мг (0.75 ммоль) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), 128 мг (0.83 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, 218 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение 70 мг (0.5 ммоль) коммерчески доступного хлорида 3-метокси-3-оксопропан-1-аминия. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 177 мг (53% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.6 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z = 742 (М+Н)⁺.

177 мг (0.22 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 20 мл метанола и добавляли 2.8 мл 2 н. раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. Смесь затем концентрировали, остаток вносили в воду и раствор доводили до рН 5, используя раствор лимонной кислоты 5% концентрации. Смесь затем два раза экстрагировали ДХМ и органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток в заключение лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода, получая 133 мг (81% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.3 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=7.4 мин; МС (ESI положит.): m/z = 686 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С9

(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил} (гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-4,7-диоксо-3,11,14,17-тетраокса-5,8-диазаэйкозан-20-овая кислота

На первой стадии 70 мг (0.114 ммоль) Промежуточного соединения С5 сочетали с 32 мг (0.114 ммоль) трет-бутил 3-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}пропаноата в 15 мл ДМФА в присутствии 44 мг (0.228 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 35 мг (0.228 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 60 мкл N,N-диизопропилэтиламина.

Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 33 мг (33% от теории) защищенного промежуточного соединения. Его перемешивали с 1.1 мл трифторуксусной кислоты в 11 мл дихлорметана в течение 1 ч с получением после обработки 26 мг (98%) соединения с полностью снятой защитой.

В заключение, промежуточное соединение вносили в 2 мл ДХМ и вводили трет-бутоксикарбонильную защитную группу путем добавления, в каждом случае по два раза, 10 мг ди-трет-бутил дикарбоната и 79 мкл N,N-диизопропилэтиламина при перемешивании при КТ в течение 3 дней. Очистка продукта с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 16.4 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.3 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z = 818 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение СЮ

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-(3-аминобензил)-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}карбамат

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С1 за 6 стадий: На первой стадии 1 г (2.77 ммоль) Промежуточного соединения С1 и 0.864 г (5 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата объединяли в 100 мл метанола и добавляли 400 мл уксусной кислоты и 1.288 г (13.9 ммоль) комплекса боран-пиридин. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 дней. Смесь затем концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/этилацетат 9:1 ->дихлорметан/метанол 95:5). Осуществление концентрирования соответствующих фракций и сушки в высоком вакууме приводило к получению 1.255 г (80% от теории) N-алкилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.0 мин; МС (ESI положит.): m/z = 513 (М+Н)⁺.

1.255 г (2.2 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 50 мл ДХМ, и затем добавляли 1.2 мл триэтиламина и 0.52 мл (4.85 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Это приводило к получению 593 мг (41% от теории) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.4 мин; МС (ESI положит.): m/z = 613 (М+Н)⁺.

993 мг (0.91 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 100 мл этанола и, после добавления 60 мг 10% палладия на активированном угле, гидрировали при стандартном давлении водорода при КТ в течение 3 мин. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Это приводило к получению 494 мг (91% от теории) дебензилированного имидазольного производного в виде практически бесцветного масла. ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (ESI положит.): m/z = 523 (М+Н)⁺.

150 мг (0.25 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 15 мл ДМФА и добавляли 69.2 мг (0.5 ммоль) карбоната калия. После 15 мин перемешивания при КТ, добавляли 60 мг (0.28 ммоль) n-нитробензилбромида и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении, и остаток вносили в этилацетат и экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия, концентрировали на роторном испарителе и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали на роторном испарителе и остаток лиофилизировали из 1,4-диоксана. Это приводило к получению 169 мг (колич.) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z = 658 (М+Н)⁺.

165 мг (0.251 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 30 мл этанола и добавляли 0.35 мл водного раствора метанамина 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 5 ч, и такое же количество раствора метиламина затем добавляли еще раз. После 10 ч перемешивания, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Дистиллят повторно перегоняли два раза с диэтиловым эфиром и остаток затем лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 148 мг (89% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.97 мин; МС (ESI положит.): m/z = 616 (М+Н)⁺.

98 мг (0.15 ммоль) предшественника растворяли в 15 мл ТГФ, и затем добавляли раствор 569 мг (3.27 ммоль) дитионита натрия в 6 мл воды при КТ. После 8 ч перемешивания при 50°С, такое же количество дитионита - растворенного в 1 мл Н₂О - добавляли снова. После дополнительных 16 часов перемешивания при 50°С, реакционную смесь охлаждали до КТ и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация остатка из 1,4-диоксана приводила к получению 44.5 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z = 586 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С11

R/S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-гомоцистеин / трифторацетат (1:1)

990.0 мг (2.79 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина сначала загружали в 15.0 мл дихлорметана и добавляли 828.8 мг (3.91 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 129.9 мг (3.21 ммоль) уксусной кислоты, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 698.1 мг (3.21 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата (Промежуточное соединение L58), растворенного в 15.0 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 100:2). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.25 г (73% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z = 556 (М+Н)⁺.

151.4 мг (1.5 ммоль) триэтиламина и 161.6 мг (1.43 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к 400.0 мг (0.65 ммоль) 2-(триметилсилил)этил[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу три раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 254.4 мг (57% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI отрицат.): m/z = 676 (М+НСОО^-)^-.

117.4 мг (0.19 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата растворяли в 10.0 мл изопропанола и добавляли 928.4 мкл 1М NaOH и 50.2 мг (0.37 ммоль) DL-гомоцистеина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 75.3 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z = 731 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.03 (s, 9Н), 0.40 (m, 1Н), 0.75-0.91 (m, 1Н), 1.30 (m, 1Н), 1.99-2.23 (m, 2Н), 2.63-2.88 (m, 4Н), 3.18-3.61 (m, 5Н), 3.79-4.10 (m, 3Н), 4.89 (d, 1Н), 4.89 (d, 1Н), 5.16 (d, 1Н), 5.56 (s, 1Н), 6.82 (m, 1Н), 6.91 (m, 1Н), 6.97 (m, 1Н), 7.13-7.38 (m, 6Н), 7.49 (s, 1Н), 7.63 (m, 1Н), 8.26 (s, 3Н).

Промежуточное соединение С12

R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-карбокси-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил]гомоцистеин

Синтез проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения С11, используя метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат (Промежуточное соединение L57) и Промежуточное соединение С52 в качестве исходных веществ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.18 мин; МС (ESI положит.): m/z = 775 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С13

9-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазаоктадекан-18-овая кислота

90.0 мг (0.15 ммоль) Промежуточного соединения С16 и 43.6 мг (0.23 ммоль) 6-(ацетилсульфанил)гексановой кислоты растворяли в 9.0 мл метанола и добавляли каплю воды и 73.9 мг (0.54 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч и затем разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали водой/насыщенным раствором NaCl и насыщенным раствором NaCl и потом сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:2). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению указанного в заголовке соединения с выходом 83% от теории.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z = 701 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С14

R/S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}амино)-2-оксоэтил]гомоцистеин

100.0 мг (0.17 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил} (хлорацетил)амино] пропил } карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 4.0 мл изопропанола и добавляли 276.5 мг (0.85 ммоль) 1 М раствора NaOH и 45.9 мг (0.34 ммоль) D/L-гомоцистеина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Реакционную смесь сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме.

Это приводило к получению 92.6 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z = 688 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С15

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

750.0 мг (2.11 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) растворяли в 15.0 мл дихлорметана и добавляли 626.0 мг (2.95 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 139 мкл (2.43 ммоль) НОАс, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Затем добавляли 420.3 мг (2.43 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата (синтез в соответствии с литературной методикой J. Med. Chem. 2003, 46, 3536), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли этилацетат и реакционную смесь два раза экстрагировали насыщенным раствором карбоната натрия. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 4:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 881.0 мг (82% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z = 513 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С16

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил} карбамат

373.4 мг (0.73 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (Промежуточное соединение С15) сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана и добавляли 169.5 мг (1.68 ммоль) триэтиламина и 181.0 мг (1.60 ммоль) хлорацетилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли этилацетат и смесь несколько раз экстрагировали водой. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:0.5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 336.0 мг (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z = 589 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С17

9-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овая кислота

50.0 мг (0.09 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 69.1 мг (0.21 ммоль) карбоната цезия и 28.8 мг (0.10 ммоль) 1-сульфанил-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты. Смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли воду и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 25.1 мг (35% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z = 835 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С18

трет-Бутил [22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазапентакозан-25-ил]карбамат

21.0 мг (0.03 ммоль) 9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овой кислоты (Промежуточное соединение С17) и 5.8 мг (0.0.3 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 1.0 мл ацетонитрила и добавляли 26.1 мг (0.20 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 20.9 мг (0.03 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.7 мг (79% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z = 835 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С19

трет-Бутил (13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-10-тиа-7,13-диаза-2-силагексадекан-16-ил)карбамат

58.5 мг (0.10 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 44.0 мг (0.20 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (2-сульфанилэтил)карбамата (Промежуточное соединение L39) и 64.7 мг (0.20 ммоль) карбоната цезия. Смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Реакцию повторяли с 46.6 мг (0.079 ммоль) Промежуточного соединения С16. Две реакционные смеси объединяли и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 98.0 мг (71% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.62 мин; МС (ESI положит.): m/z = 774 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С20

Трифторуксусная кислота / трет-бутил [3-({[(2-аминоэтил)сульфанил]ацетил}{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

98.0 мг (0.13 ммоль) трет-бутил (13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-10-тиа-7,13-диаза-2-силагексадекан-16-ил)карбамата (Промежуточное соединение С19) сначала загружали в 2.0 мл смеси ДМФА/трет-бутанол (9:1) и добавляли 96.2 мг (0.63 ммоль) CsF. Смесь перемешивали при 90°С в течение 16 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 57.1 мг (61% от теории) указанного в заголовке соединения. Соединение также включает соответствующий сульфоксид.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z = 630 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С21

трет-Бутил [38-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,31,37-триоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-35-тиа-4,32,38-триазагентетраконтан-41-ил]карбамат

57.1 мг (0.08 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил [3-({[(2-аминоэтил)сульфанил]ацетил}{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат (Промежуточное соединение С20) сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 53.0 мг (0.08 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 15.5 мг (0.15 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 49.7 мг (49% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z = 1204 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С22

трет-Бутил [38-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-35-оксидо-3,31,37-триоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-35лямбда4-тиа-4,32,38-триазагентетраконтан-41-ил]карбамат

Указанное в заголовке соединение образовалось в качестве побочного продукта в синтезе Промежуточного соединения С21. Это приводило к получению 15.5 мг (15% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.25 мин; МС (ESI положит.): m/z = 1220 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С23

трет-Бутил 3-амино-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат

Смесь стереоизомеров

411.2 мг (1.15 ммоль) трет-бутил 3-формил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L28) и 339.7 мг (0.96 ммоль) М-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 6.0 мл дихлорметана, добавляли 68.9 мг (1.15 ммоль) НОАс и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли 405.2 мг (1.91 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и к остатку добавляли этилацетат и воду. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 40 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 541.5 мг (81% от теории) соединения трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 и 1.29 мин; МС (ESI положит.): m/z = 698 [М+Н]⁺.

541.5 мг (0.78 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 13.0 мл дихлорметана и добавляли 180.6 мг (1.78 ммоль) триэтиламина. Реакционный раствор охлаждали до 0°С, добавляли 233.1 мг (1.71 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 180.6 мг (1.78 ммоль) триэтиламина и 233.1 мг (1.71 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение еще 80 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 40 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 529.2 мг (86% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 и 1.56 мин; МС (ESI положит.): m/z = 798 [М+Н]⁺.

529.2 мг (0.66 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 10.0 мл смеси ДМФА/трет-бутанол (9:1) и добавляли 503.7 мг (3.32 ммоль) CsF. Реакционную смесь перемешивали при 90°С в течение 16 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 25 мл/мин, дихлорметан/метанол). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 172.4 мг (40% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-аминопирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 и 1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z = 654 [М+Н]⁺.

172.4 мг (0.26 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-аминопирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.5 мл смеси метанол/вода (2:1), добавляли 80.2 мг (0.58 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 116.0 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин и 1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z = 612 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С24

Трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-(аминометил)-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат (1:1)

26.8 мг N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) растворяли в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 5.2 мг (0.09 ммоль) НОАс и 22.4 мг (0.11 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 62.4 мг (0.09 ммоль) трет-бутил 3-формил-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L29) и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 57.6 мг (91% от теории) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.25 и 1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 712 [М+Н]⁺.

77.0 мг (0.11 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 21.9 мг (0.22 ммоль) триэтиламина. Затем при 0°С добавляли 29.5 мг (0.22 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в этилацетат. Органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении. Реакцию повторяли с 77.0 мг (0.11 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата. Объединенные остатки очищали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 2:1). Это приводило к получению 171.1 мг (85% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.56 и 1.57 мин; МС (ESI положит.): m/z = 812 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.04 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 0.5 мл раствора TBAF (1М в ТГФ). Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 25.0 мг (92% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z = 626 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С25

4-{[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-1-{трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-карбоновая кислота

171.4 мг (0.48 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 248.5 мг (0.72 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-формилпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L30) и 34.8 мг (0.58 ммоль) НОАс. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли 204.4 мг (0.97 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 60 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, скорость потока 25 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 267.0 мг (77% от теории) соединения трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 683 [М+Н]⁺.

267.0 мг (0.39 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 5.0 мл дихлорметана, добавляли 91.0 мг (0.90 ммоль) триэтиламина и смесь охлаждали до 0°С. Добавляли 117.4 мг (0.86 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 593.4 мг (5.87 ммоль) триэтиламина и 427.0 мг (3.13 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение еще 10 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 216.3 мг (71% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.70 и 1.72 мин; МС (ESI положит.): m/z = 783 [М+Н]⁺.

216.3 мг (0.28 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.0 мл ТГФ и добавляли 16.6 мг (0.28 ммоль) НОАс и раствор 361.1 мг (1.38 ммоль) TBAF (1М в ТГФ). Реакционный раствор перемешивали при КТ в течение 4 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 94.0 мг (51% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=669 [М+Н]⁺.

52.0 мг (0.08 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.0 мл смеси буфер PBS/ацетонитрил (9:1) и добавляли 1.2 мг (0.01 ммоль) TEMPO. Затем одновременно добавляли 14.1 мг (0.16 ммоль) хлорита натрия в 1.0 мл воды и 115.8 мкл (0.16 ммоль) раствора гипохлорита натрия 10% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь выливали в раствор сульфита натрия 10% концентрации и добавляли этилацетат. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z = 683 [М+Н]⁺.

103.0 мг (0.15 ммоль) 4-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-1-{трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-карбоновой кислоты сначала загружали в 4.5 мл смеси метанол/вода (2:1), добавляли 45.9 мг (0.33 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и указанное в заголовке соединение использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z = 641 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С26

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил]карбамат

590 мг (1.69 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 155 мкл (2.70 ммоль, 162 мг) уксусной кислоты сначала загружали в 30 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем по каплям добавляли 600 мг (1.687 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (полученного из соединения трифторуксусная кислота / (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1) путем экстрагирования 1 н. водным раствором гидроксида натрия) и 750 мг (2.362 ммоль) трет-бутил (3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-формилпропил)карбамата, растворенных в 40 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Затем добавляли этилацетат, смесь промывали насыщенным раствором карбоната натрия и органическую фазу концентрировали. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 510 мг (46% от теории) целевого соединения в виде смеси диастереомеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин (51%); МС (EI положит.): m/z = 657 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин (49%); МС (EI положит.): m/z = 657 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С27

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетат

510 мг (0,776 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил]карбамата сначала загружали в 30 мл дихлорметана и добавляли 181 мг (249 мкл, 1.786 ммоль) триэтиламина и 219 мг (1.553 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 290 мг (49% от теории) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.70 мин; МС (EI положит.): m/z = 757 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.72 мин; МС (EI положит.): m/z = 757 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С28

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-(гидроксиметил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетат

285 мг (0.376 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетата растворяли в 5 мл ТГФ. Добавляли 452 мкл (0.452 ммоль) 1 М раствора фторида тетра-н-бутиламмония в ТГФ, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 214 мг (81% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=92%) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (EI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.40 мин; МС (EI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С29

2-([3-(Ацетилсульфанил)-2-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}пропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтилацетат

210 мг (0.301 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-(гидроксиметил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетата сначала загружали в 8 мл абсолютного ТГФ, при КТ по каплям добавляли 178 мг (1.503 ммоль, 109 мкл) тионилхлорида, растворенного в 8 мл абсолютного ТГФ, и смесь перемешивали при КТ в течение 40 мин. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 16 мл абсолютного ДМФА, добавляли 172 мг (1.503 ммоль) тиоацетата калия и 133 мг (0.361 ммоль) йодида тетра-н-бутиламмония и смесь перемешивали при 90°С в течение 2 ч. После охлаждения добавляли воду и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 155 мг (69% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=94%) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.50 мин; МС (EI положит.): m/z=701 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (EI положит.): m/z=701 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С30

Ди-трет-бутил [дисульфандиилбис(2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропан-3,1-диил)]бискарбамат

1.220 г (1.010 ммоль, чистота в соответствии с ЖХ/МС=58%) 2-([3-(ацетилсульфанил)-2-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}пропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтилацетата сначала загружали в 30 мл ТГФ и 30 мл метанола, добавляли 10 мл 1 н. водного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Добавляли воду и реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 390 мг (54% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=86%) целевого соединения в виде смеси диастереомеров.

Изомеры:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.81 мин; МС (EI положит.): m/z=1232 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С31

трет-Бутил 3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамат

390 мг (0.272 ммоль, чистота в соответствии с ЖХ/МС=86%) ди-трет-бутил [дисульфандиилбис(2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропан-3,1-диил)]бискарбамата вносили в 20 мл 1,4-диоксана и 10 мл буфера PBS и добавляли 234 мг (0.817 ммоль) гидрохлорида 3,3',3''-фосфантриилтрипропановой кислоты (1:1). Смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь затем концентрировали на роторном испарителе и растирали с дихлорметаном, и фильтрат концентрировали и сушили в высоком вакууме. Остаток растворяли в 8 мл изопропанола и очищали с помощью хиральной хроматографии (колонка: 250×30 мм, наполненная Daicel Chiralpak AZ-H, подвижная фаза: изогексан/изопропанол = 90:10). Это приводило к получению двух фракций целевого соединения. Фракция 1 содержала 181.2 мг (50% от теории) Изомера 1 и фракция 2 давала 90.2 мг (25% от теории) Изомера 2.

Изомер 1:

Хиральная ВЭЖХ (колонка: 250×4.6 мм, наполненная Diacel Chiralpak AZ-Н, подвижная фаза: изогексан/этанол 90:10): R_t=6.98 мин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=617 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

Хиральная ВЭЖХ (колонка: 250×4.6 мм, наполненная Diacel Chiralpak AZ-Н, подвижная фаза: изогексан/этанол 90:10): R_t=9.39 мин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=617 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С32

Гидрохлорид N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 1)

123 мг (199.42 мкмоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамата (Изомер 1) растворяли в 2 мл ТГФ и перемешивали с 10 мл полуконцентрированной хлористоводородной кислоты при КТ в течение 1 ч. Реакционный раствор дегазировали в атмосфере аргона и затем лиофилизировали. Это приводило к получению 108 мг (98% от теории) целевого соединения.

Изомер 1

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (EI положит.): m/z=517 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С33

Гидрохлорид N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 2)

123 мг (199.42 мкмоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамата (Изомер 2) растворяли в 2 мл ТГФ и перемешивали с 10 мл полуконцентрированной хлористоводородной кислоты при КТ в течение 1 ч. Реакционный раствор дегазировали в атмосфере аргона и затем лиофилизировали. Это приводило к получению 58 мг (63% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=91%) целевого соединения.

Изомер 2

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (EI положит.): m/z=517 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С34

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

3.790 г (10.02 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (полученного из соединения трифторуксусная кислота / (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1) путем экстрагирования 1 н. водным раствором гидроксида натрия), 3.186 г (15.04 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 690 мкл (12.03 ммоль, 722 мг) уксусной кислоты сначала загружали в 100 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Затем добавляли 4.687 г (27.06 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/этилацетат, градиент = 4:1→1:1). Это приводило к получению 2.57 г (48% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.00 мин; МС (EI положит.): m/z=513 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С35

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамат

200 мг (0.38 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата сначала загружали в 9 мл абсолютного дихлорметана, и при КТ добавляли 120 мкл (0.86 ммоль, 87 мг) триэтиламина. При КТ по каплям добавляли 83 мг (0.45 ммоль) 4-нитробензоилхлорида, растворенного в 1 мл абсолютного дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли воду, и смесь концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и сушили. Это приводило к получению 181 мг (73% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=662 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С36

трет-Бутил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамат

170 мг (0.26 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамата сначала загружали в 10 мл уксусной кислоты. Добавляли 143 мг (2.57 ммоль) порошка железа, и смесь перемешивали при 50°С в течение 16 ч. После охлаждения добавляли воду, и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток сушили в ВВ. Это приводило к получению 154 мг (77% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=82%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.73 мин; МС (EI положит.): m/z=632 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С37

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}карбамоил)фенил]-L-аланинамид

38.6 мг (0.05 ммоль, ЖХ/МС чистота = 82%) трет-бутил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамата растворяли в абсолютном ДМФА и добавляли 24.8 мг (0.06 ммоль) HATU и 13.0 мг (0.10 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин, добавляли 63 мг (0.06 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланина и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли 7.5 мг (0.06 ммоль) 3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ола (HOAt), и смесь перемешивали в течение 16 ч. Добавляли 19.1 мг (0.05 ммоль) HATU, и смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. После охлаждения реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 6.5 мг (9% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=83%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 2): R_t=7.89 мин; МС (EI положит.): m/z=1200.6 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С38

2-[3-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-дион

300.0 мг (0.84 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 58.3 мг (0.97 ммоль) НОАс и 250.4 мг (1.18 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 197.2 мг (0.97 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором карбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: этилацетат/циклогексан 1:5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 333.3 мг (70%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 мин; МС (ESI положит.): m/z=543 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С39

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетат

332.3 мг (0.61 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона (Промежуточное соединение С38) сначала загружали в 8.0 мл дихлорметана и добавляли 142.5 мг (1.35 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 184.0 мг (1.35 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: этилацетат/циклогексан 1:3). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 367.1 мг (63%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С40

N-(3-Аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид

583.1 мг (0.91 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетата (Промежуточное соединение С39) сначала загружали в 15.0 мл этанола и добавляли 1.41 г (18.15 ммоль) метанамина (40% в воде). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с толуолом. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 324.9 мг (73%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=471 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С41

Трифторуксусная кислота / L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1)

50.0 мг (0.11 моль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С40) и 30.4 мг (0.11 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланината сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 32.2 мг (0.32 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 19.1 мг (0.32 ммоль) НОАс, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 38.0 мг (56%) соединения трет-бутил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=642 [М+Н]⁺.

33.6 мг (0.05 ммоль) трет-бутил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана. Добавляли 119.4 мг (1.05 ммоль) ТФУ и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 32.8 мг (96%) соединения трифторуксусная кислота / N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=542 [М+Н]⁺.

29.5 мг (0.05 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1) и 14.1 мг (0.05 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валината сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 18.2 мг (0.18 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 23.1 мг (69%) соединения N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.30 мин; МС (ESI положит.): m/z=741 [М+Н]⁺.

19.4 мг (0.03 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида растворяли в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 59.7 мг (0.52 ммоль) ТФУ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 119.4 мг (1.04 ммоль) ТФУ, и смесь снова перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.2 мг (97%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=641 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С42

Тетрафторборат 2,5-дифторбензолдиазония

Сначала загружали 3.00 г (21.16 ммоль, 2.68 мл) комплекса трифторид бора-диэтиловый эфир, и при 0°С медленно по каплям добавляли 1.37 г (10.58 ммоль) 2,5-дифторанилина, растворенного в 27 мл абсолютного ТГФ. При -10°С по каплям добавляли раствор 1.61 г (13.75 ммоль, 1.85 мл) изоамилнитрита, растворенного в 3 мл абсолютного ТГФ, и перемешивание продолжали при той же температуре в течение 30 мин. Добавляли 15 мл диэтилового эфира и выпавшую в осадок соль диазония отфильтровывали, промывали небольшим количеством диэтилового эфира и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.27 г целевого соединения (94% от теории).

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=0.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=141 [М]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 8.11-8.17 (m, 1Н), 8.36-8.43 (m, 1Н), 8.69-8.73 (m, 1Н).

Промежуточное соединение С43

Метил хлор[2-(2,5-дифторфенил)гидразинилиден]ацетат

В атмосфере аргона 3.63 г (24.13 ммоль) метил 2-хлор-3-оксобутаноата сначала загружали в 100 мл воды, и при -5°С добавляли 48.90 г (618.19 ммоль, 50.00 мл) пиридина и смесь перемешивали при этой температуре в течение 10 мин. Затем при -5°С добавляли 5.00 г (21.94 ммоль) тетрафторбората 2,5-дифторбензолдиазония, что приводило к образованию оранжевой суспензии. Смесь перемешивали при этой температуре в течение 30 мин и реакционную смесь разбавляли водой и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.52 г целевого соединения (97% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=249 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.85 (s, 3Н), 6.88-6.94 (m, 1Н), 7.16-7.21 (m, 1Н), 7.31-7.37 (m, 1Н), 10.00 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С44

Метил 4-бензоил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилат

3.50 г (13.52 ммоль) метил хлор[2-(2,5-дифторфенил)гидразинилиден]ацетата (чистота в соответствии с ЖХ/МС 96%) растворяли в 9 мл абсолютного толуола, добавляли 2.61 г (14.87 ммоль) (2Е)-3-(диметиламино)-1-фенилпроп-2-ен-1-она и 3.01 г (29.73 ммоль, 4.14 мл) триэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода с 0.1% муравьиной кислоты, градиент). Это приводило к получению 1.79 г (39% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=343 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.86 (s, 3Н), 7.44-7.50 (m, 1Н), 7.55-7.72 (m, 4Н), 7.81-7.87 (m, 3Н), 8.80 (d, 1Н).

Промежуточное соединение С45

[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]метанол

3.18 г (8.92 ммоль) метил 4-бензоил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилата (чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%) сначала загружали в 50 мл трифторуксусной кислоты, по каплям добавляли 8.74 г (75.13 ммоль, 12 мл) триэтилсилана и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Полученный остаток вносили в 120 мл абсолютного ТГФ, и при 0°С по каплям добавляли 2.89 г (33.63 ммоль, 33.63 мл) комплекса боран-тетрагидрофуран. Смесь перемешивали в течение ночи. По причине низкой степени превращения, добавляли еще 12.33 мл (12.33 ммоль) 1М раствора борогидрида лития в ТГФ. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, при 60°С в течение 30 мин и при 80°С в течение 2 ч. При 0°С реакцию осторожно гасили 60 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Смесь два раза экстрагировали, в каждом случае 100 мл этилацетата, объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.67 г (76% от теории, чистота = 96%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=2.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=329 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.91 (s, 2Н), 4.45 (d, 2Н), 6.51 (s, 1Н), 7.18-7.23 (m, 2Н), 7.27-7.32 (m, 4Н), 7.46-7.53 (m, 1Н), 7.60-7.65 (m, 1Н), 7.95 (d, 1Н).

Промежуточное соединение С46

4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбальдегид

2.66 г (8.50 ммоль) [4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]метанола (чистота 96%) растворяли в 150 мл дихлорметана, и небольшими порциями добавляли 4.33 г (10.20 ммоль) периодинана Десса-Мартина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляли 100 мл полуконцентрированного раствора бикарбоната натрия и 100 мл раствора тиосульфата натрия 10% концентрации, и смесь перемешивали в течение 20 мин. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.35 г (88% от теории, чистота = 95%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=299 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 4.12 (s, 2Н), 7.17-7.21 (m, 1Н), 7.27-7.31 (m, 4Н), 7.37-7.42 (m, 1Н), 7.57-7.62 (m, 1Н), 7.75-7.78 (m, 1Н), 8.22 (d, 1Н), 10.06 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С47

(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин

2.35 г (7.56 ммоль) 4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбальдегида растворяли в 25 мл абсолютного ТГФ и добавляли 1.10 г (9.08 ммоль) (R)-(+)-2-метил-2-пропансульфинамида и 4.73 г (16.64 ммоль) изопропилата титана(IV). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и добавляли 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 30 мл этилацетата. Затем добавляли приблизительно 3 г кизельгура, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Смесь фильтровали и органическую фазу отделяли от фильтрата. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки.

В атмосфере аргона остаток растворяли в 60 мл абсолютного ТГФ, охлаждали до -78°С и по каплям добавляли 14.5 мл (23.24 ммоль) раствора трет-бутиллития в пентане (с=1.6 моль/л). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 3 ч и затем гасили 5 мл метанола и 15 мл насыщенного раствора хлорида аммония. При перемешивании реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры (приблизительно 30 мин.). Смесь экстрагировали этилацетатом и органическую фазу экстрагировали насыщенным раствором хлорида натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки.

Остаток вносили в 30 мл ТГФ и 6 мл метанола, добавляли 6 мл (24.00 ммоль) 4 н. раствора хлороводорода в диоксане и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляли 15 мл насыщенного раствора карбоната натрия, и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу отделяли, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению двух фракций целевого соединения. Первая фракция давала 1.31 г (72% от теории, ЖХ/МС чистота = 97%) и вторая - 0.37 г (17% от теории, ЖХ/МС чистота = 83%) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=356 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.91 (s, 9Н), 1.71 (s, 2Н), 3.59 (s, 1Н), 3.87 (s, 2Н), 7.17-7.32 (m, 6Н), 7.45-7.51 (m, 1Н), 7.61-7.65 (m, 1Н), 7.84 (s br, 1Н).

Промежуточное соединение С48

трет-Бутил (2S)-4-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноат

1.28 г (3.35 ммоль, ЖХ/МС чистота 93%) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина растворяли в 100 мл абсолютного дихлорметана, и при комнатной температуре добавляли 261 мг (4.35 ммоль, 250 мкл) уксусной кислоты и 1.14 г (4.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия с последующим добавлением после 5 мин перемешивания 1.19 г (4.35 ммоль) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, концентрировали на роторном испарителе, вносили в ацетонитрил и воду и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 1.64 г (80% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=613 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 1.01 (s, 9Н), 1.32 (s, 9Н), 1.35 (s, 9Н), 1.80-1.89 (m, 1Н), 2.01-2.11 (m, 1Н), 2.54-2.71 (m, 2Н), 3.75-3.81 (m, 1H), 3.90 (s, 2Н), 4.18 (d, 1Н), 7.13 (d, 1Н), 7.20-7.24 (m, 1Н), 7.28-7.34 (m, 5Н), 7.52-7.58 (m, 1Н), 7.76-7.80 (m, 1Н), 8.10 (s br, 1Н), 8.23 (s br, 1H).

Промежуточное соединение C49

(2S)-4-[{(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

225 мг (0.37 ммоль) трет-бутил (2S)-4-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноата растворяли в 10 мл абсолютного дихлорметана и добавляли 156 мг (1.54 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 125 мг (0.92 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 251 мг (1.84 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и 186 мг (1.84 ммоль) триэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли небольшое количество дихлорметана и смесь промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 10 мл этанола, добавляли 0.91 мл (12.67 ммоль) водного раствора метиламина 40% концентрации и смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе, остаток вносили в дихлорметан и органическую фазу два раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 2 мл дихлорметана, добавляли 2 мл (25.96 ммоль) трифторуксусной кислоты и смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 10 мл абсолютного дихлорметана, добавляли 298 мг (2.95 ммоль) триэтиламина и 429 мг (1.97 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 62 мг (27% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=615 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.91 (s, 9Н), 1.32 (s, 9Н), 2.64-2.72 (m, 4Н), 3.50-3.58 (m, 1Н), 3.72 (dd, 2Н), 4.07-4.22 (m, 2Н), 4.47-4.54 (m, 1Н), 5.75 (s, 1Н), 6.84-6.89 (m, 1Н), 7.15-7.30 (m, 6Н), 7.47-7.53 (m, 1Н), 7.70-7.75 (m, 1Н), 8.09-8.13 (m, 1Н), 11.66 (s br, 1Н).

Промежуточное соединение С50

трет-Бутил [(2S)-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]карбамат

60 мг (0.1 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты растворяли в 10 мл абсолютного ДМФА и добавляли 74 мг (0.20 ммоль) HATU. Отдельно в 2 мл абсолютного ДМФА растворяли 74 мг (0.29 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1), добавляли 38 мг (0.29 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и полученную смесь по каплям добавляли к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 д. Смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 9.3 мг (13% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С51

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}-бета-аланин

Прежде всего Промежуточное соединение С47 подвергали восстановительному алкилированию бензил N-{(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноил}-бета-аланинатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Получали 23 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=686 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С52

(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин

10.00 г (49.01 ммоль) метил 4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в 100.0 мл ДМФА и добавляли 20.76 г (63.72 ммоль) карбоната цезия и 9.22 г (53.91 ммоль) бензилбромида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Реакцию повторяли с 90.0 г метил 4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

Две объединенные реакционные смеси очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Daiso 300×100; 10 мк, скорость потока: 250 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 125.15 г (87% от теории) соединения метил 1-бензил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.18 мин; МС (ESI положит.): m/z=295 [М+Н]⁺.

В атмосфере аргона 4.80 г (16.32 ммоль) метил 1-бензил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в ДМФА и добавляли 3.61 г (22.85 ммоль) (2,5-дифторфенил)бороновой кислоты, 19.20 мл насыщенного раствора карбоната натрия и 1.33 г (1.63 ммоль) соединения [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]-дихлорпалладий(II):дихлорметан. Реакционную смесь перемешивали при 85°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Органическую фазу экстрагировали водой и затем промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 100:3). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 3.60 г (67% от теории) соединения метил 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.59 мин; МС (ESI положит.): m/z=328 [М+Н]⁺.

3.60 г (11.00 ммоль) метил 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в 90.0 мл ТГФ, и при 0°С добавляли 1.04 г (27.50 ммоль) алюмогидрида лития (2.4 М в ТГФ). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут. При 0°С добавляли насыщенный раствор тартрата калия-натрия, и к реакционной смеси добавляли этилацетат. Органическую фазу три раза экстрагировали насыщенным раствором тартрата калия-натрия. Органическую фазу один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в 30.0 мл дихлорметана. Добавляли 3.38 г (32.99 ммоль) оксида марганца(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч. Добавляли еще 2.20 г (21.47 ммоль) оксида марганца(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток, 2.80 г (1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида), использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=298 [М+Н]⁺.

28.21 г (94.88 ммоль) 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида вместе с 23.00 г (189.77 ммоль) (R)-2-метилпропан-2-сульфинамида сначала загружали в 403.0 мл абсолютного ТГФ, добавляли 67.42 г (237.21 ммоль) изопропилата титана(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 500.0 мл насыщенного раствора NaCl и 1000.0 мл этилацетата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь фильтровали через кизельгур и фильтрат два раза промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 1500+340 г SNAP, скорость потока 200 мл/мин, этилацетат/циклогексан 1:10).

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.63 мин; МС (ESI положит.): m/z=401 [М+Н]⁺.

25.00 г (62.42 ммоль) (R)-N-{(Е/Z)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]метилен}-2-метилпропан-2-сульфинамида в атмосфере аргона сначала загружали в абсолютный ТГФ и охлаждали до -78°С. Затем при -78°С добавляли 12.00 г (187.27 ммоль) трет-бутиллития (1.7 М раствор в пентане), и смесь перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. Затем при -78°С добавляли последовательно 71.4 мл метанола и 214.3 мл насыщенного раствора хлорида аммония, и реакционной смеси давали нагреться до КТ и перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток, (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамид, использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=459 [М+Н]⁺.

28.00 г (61.05 ммоль) (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамида сначала загружали в 186.7 мл 1,4-диоксана, и затем добавляли 45.8 мл раствора HCl в 1,4-диоксане (4.0 М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: (колонка: Kinetix 100×30; скорость потока: 60 мл/мин, смесь MeCN/вода). Ацетонитрил упаривали при пониженном давлении и к водному остатку добавляли дихлорметан. Органическую фазу промывали раствором бикарбоната натрия и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 16.2 г (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=338 [M-NH₂]⁺, 709 [2М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.87 (s, 9Н), 1.53 (s, 2Н), 3.59 (s, 1Н), 5.24 (d, 2Н), 6.56 (s, 1Н), 6.94 (m, 1Н), 7.10 (d, 2Н), 7.20 (m, 1Н), 7.26 (m, 2Н), 7.34 (m, 2Н), 7.46 (m, 1Н).

Промежуточное соединение С53

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Прежде всего промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Полученное таким путем промежуточное соединение растворяли в этаноле, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=734 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С54

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутаноил]-бета-аланин

Прежде всего Промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил N-[(2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноил]-бета-аланинатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27. Полученное таким путем промежуточное соединение растворяли в метаноле, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Сложноэфирную группу затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина. Получали 48 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=807 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С55

2-[3-({(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-дион

340 мг (0.96 ммоль) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина растворяли в 7 мл абсолютного ДХМ, и при КТ добавляли 69 мг (1.15 ммоль, 60 мкл) уксусной кислоты и 284 мг (1.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия. Смесь перемешивали в течение 15 мин, и затем добавляли 233 мг (1.15 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя. Смесь перемешивали при КТ в течение 4.5 ч. Добавляли еще 233 мг (1.15 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя, 69 мг (1.15 ммоль, 60 мкл) уксусной кислоты и 284 мг (1.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при КТ в течение 7 ч. Добавляли этилацетат и реакционную смесь промывали насыщенным раствором карбоната натрия. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали два раза с помощью препаративной ВЭЖХ [1.) подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент; 2.) подвижная фаза: ACN/вода + 1% ТФУ + 1.0% NEt₃)]. Это приводило к получению 108 мг (21% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=543 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С56

2-({(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетат

102 мг (0.19 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона сначала загружали в 2 мл абсолютного ДХМ, и при КТ добавляли 44 мг (0.43 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 31 мг (0.23 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата, растворенного в 1 мл абсолютного ДХМ. Смесь перемешивали при КТ в течение 40 мин. Добавляли еще 26 мг 2-хлор-2-оксоэтилацетата, растворенного в 0.5 мл абсолютного ДХМ, и 19 мг (0.19 ммоль) триэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение 60 мин.

Добавляли воду, смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 106 мг (88% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С57

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии со стандартными методами путем сочетания Промежуточного соединения С49 с 9Н-флуорен-9-илметил (2-аминоэтил)карбаматом в присутствии HATU и последующего удаления Fmoc защитной группы пиперидином. Это приводило к получению 14 мг указанного в заголовке соединения (40% от теории за 2 стадии).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С58

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановая кислота

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 8.99 г (24.5 ммоль) Промежуточного соединения L57, растворенного в 175 мл ДХМ, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 300 мл ДХМ и два раза промывали 100 мл раствора бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток затем очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex С18). После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.6 г (61% от теории) метил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

2.06 г (3.36 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 76 мл ДХМ и ацилировали 0.81 мл (7.17 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата в присутствии 2.1 мл триэтиламина. После 20 ч перемешивания при КТ, добавляли 0.36 мл 2-хлор-2-оксоэтилацетата и 0.94 мл триэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 15 мин. Смесь затем разбавляли 500 мл этилацетата и последовательно два раза экстрагировали 300 мл раствора лимонной кислоты 5% концентрации, два раза - 300 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и один раз - 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия, и затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 2.17 г (79% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

2.17 мг (2.64 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 54 мл ТГФ и 27 мл воды и добавляли 26 мл 2-молярного раствора гидроксида лития. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем доводили до рН между 3 и 4, используя 1.4 мл ТФУ. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Когда большая часть ТГФ была отогнана, водный раствор два раза экстрагировали ДХМ и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка: Chromatorex С18). После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 1.1 г (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=656 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.03 (s, 9Н), 0.58 (m, 1H), 0.74-0.92 (m, 11Н), 1.40 (m, 1Н), 3.3 (m, 2Н), 3.7 (m, 1Н), 3.8-4.0 (m, 2Н), 4.15 (q, 2Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 5.61 (s, 1Н), 6.94 (m, 2Н), 7.13-7.38 (m, 7Н), 7.48 (s, 1Н), 7.60 (m, 1Н), 12.35 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С59

(2S)-4-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-метоксипропаноил]амино)-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Сначала вторичную аминогруппу бензил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}бутаноата ацилировали (2S)-2-метоксипропаноил хлоридом (промежуточное соединение Промежуточного соединения С53) в присутствии триэтиламина, как описано для Промежуточного соединения С53. Полученное промежуточное соединение вносили в этанол, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=764 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С60

(2S)-4-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-метоксипропаноил]амино)-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Синтез проводили аналогично Промежуточному соединению С53.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=750 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С61

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-бета-аланин

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 60 мг (0.091 ммоль) Промежуточного соединения С58 с метил β-аланинатом, с последующим расщеплением сложного эфира 2М раствором гидроксида лития. Это приводило к получению 67 мг (61% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.29 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С62

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-D-аланин

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению С61 из Промежуточного соединения С58 и метил D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С63

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Синтез этого промежуточного соединения начинали на первой стадии с сочетания 50 мг (0.075 ммоль) Промежуточного соединения С3 с 26.2 мг (0.082 ммоль) гидрохлорида 9Н-флуорен-9-илметил (2-аминоэтил)карбамата (1:1) в присутствии 28.7 мг (0.15 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 22.9 мг (0.15 ммоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 39 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 18 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 45 мг (65% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (ESI положит.): m/z=921 (М+Н)⁺.

45 мг (0.049 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 10 мл этанола и добавляли 176 мкл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С с добавлением такого же количества раствора метанамина спустя 6 ч и спустя 9 ч. После перемешивания в течение еще 14 ч при 50°С, добавляли еще 700 мкл раствора метанамина, и после дополнительных 20 ч перемешивания смесь в заключение концентрировали. Остаток вносили в ДХМ и промывали водой. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 32 мг (99% от теории) трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С64

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С58 аналогично Промежуточному соединению С63.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=700 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С65

(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-овая кислота

215 мг (0.59 ммоль) Промежуточного соединения L66 сначала загружали в 25 мл дихлорметана и добавляли 377 мг (0.89 ммоль) периодинана Десса-Мартина и 144 мкл (1.78 ммоль) пиридина. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 300 мл дихлорметана и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации, раствором лимонной кислоты 10% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Это приводило к получению 305 мг альдегида, который подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

175 мг (0.49 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 50 мл дихлорметана и добавляли 147 мг (0.69 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 32.5 мкл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 214 мг (0.593 ммоль) альдегида, описанного выше, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. В данном случае, вместо ожидаемого продукта, образовывался 2-(триметилсилил)этил [(2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)бутан-2-ил]карбамат. Поскольку этот имид также можно превратить в указанное в заголовке соединение, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После объединения соответствующих имидсодержащих фракций, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 195 мг (58%) вышеуказанного имида.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=667 (М+Н)⁺.

65 мг (97.5 мкмоль) этого имида вносили в 15 мл дихлорметана и добавляли 367 мкл (3.4 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и 595 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 30 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали без нагревания при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли с получением после упаривания растворителей и сушки в высоком вакууме 28 мг (37% от теории) (8S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил ацетата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=767 (М+Н)⁺.

28 мг (37 мкмоль) этого промежуточного соединения растворяли в 3 мл метанола и добавляли 548 мкл 2М раствора гидроксида лития. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь доводили до рН 4 с помощью трифторуксусной кислоты и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли, растворитель упаривали и остаток сушили в высоком вакууме, получая 26 мг (96% от теории) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=743 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С66

2-(Триметилсилил)этил [(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(глициламино)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]карбамат

Прежде всего из N-[(бензилокси)карбонил]глицина и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата получали соединение трифторуксусная кислота / бензил {2-[(2-аминоэтил)амино]-2-оксоэтил}карбамат (1:1) в соответствии с классическими методами химии пептидов (HATU сочетание и удаление Boc).

13 мг (0.036 ммоль) этого промежуточного соединения и 25 мг (0.033 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 3 мл ДМФА и добавляли 19 мг (0.05 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 10 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 17.8 мг (60% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=891 (М+Н)⁺.

17 мг (0.019 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 10 мл этанола, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывали, растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=757 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С67

9Н-Флуорен-9-илметил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

605.3 мг (1.71 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (Промежуточное соединение С52) сначала загружали в 10.0 мл дихлорметана, добавляли 506.7 мг (2.39 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 117.9 мг (1.96 ммоль) уксусной кислоты и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 580.0 мг (1.96 ммоль) 9Н-флуорен-9-илметил (3-оксопропил)карбамата (Промежуточное соединение L70), растворенного в 10.0 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 514.7 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=634 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С68

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

Синтез проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения С67.

1000.0 мг (2.81 ммоль) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1 -амина (Промежуточное соединение С47),

835.0 мг (3.94 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия,

194.0 мг (3.24 ммоль) уксусной кислоты,

560.0 мг (3.24 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата.

Это приводило к получению 695.8 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=513 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С69

11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овая кислота

117.0 мг (0.19 ммоль) (2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70) и 21.6 мг (0.20 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты сначала загружали в 3.0 мл метанола, добавляли 89.5 мг (0.65 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза. Это приводило к получению 106.1 мг (73% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=700 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С70

(2-(Триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамат

908.1 мг (1.63 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (см. синтез Промежуточного соединения С11) и 545.6 мг (5.39 ммоль) триэтиламина сначала загружали в 10.0 мл дихлорметана, и смесь охлаждали до 0°С. При этой температуре добавляли 590.5 мг (5.23 ммоль) хлорацетилхлорида и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае три раза, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 673.8 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=676 (М+НСОО^-)^-.

Промежуточное соединение С71

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

536.6 мг (4.43 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.5 мл воды вместе с 531.5 мг (6.33 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 400.0 мг (0.63 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70), растворенного в 25.0 мл изопропанола, и 1.16 г (7.59 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 449.5 мг (86% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.20 мин; МС (ESI положит.): m/z=717 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С72

(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-овая кислота

90 мг (0.212 ммоль) Промежуточного соединения L72 сначала загружали в 6 мл дихлорметана и добавляли 86 мкл (1.06 ммоль) пиридина и 135 мг (0.318 ммоль) периодинана Десса-Мартина. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 30 мл дихлорметана и органическую фазу два раза промывали раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации и один раз - раствором лимонной кислоты 5% концентрации. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный таким путем альдегид подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

63 мг (0.177 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 15 мл дихлорметана и добавляли 52.4 мг (0.247 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 20.2 мкл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 89.6 мг (0.212 ммоль) альдегида, описанного выше, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 20 мин. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 71 мг (53% от теории за 2 стадии) бензил (9R)-9-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=761 (М+Н)⁺.

70 мг (92 мкмоль) этого промежуточного соединения вносили в 15 мл дихлорметана, смесь охлаждали до 10°С и добавляли 54 мкл триэтиламина и 25.5 мкл (0.23 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Такие же количества хлорангидрида кислоты и триэтиламина добавляли после 1 ч перемешивания при КТ и еще раз после дополнительного часа перемешивания при КТ. Реакционную смесь затем перемешивали при КТ в течение дополнительных 30 мин и затем концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли с получением после упаривания растворителей и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода 46.5 мг (59% от теории) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=861 (М+Н)⁺.

46 мг (53 мкмоль) этого промежуточного соединения растворяли в 5 мл метанола и добавляли 2.7 мл 2М раствора гидроксида лития. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь доводили до рН 3-4 с помощью уксусной кислоты и затем разбавляли 15 мл воды. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода с получением после сушки остатка в высоком вакууме 37 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С73

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[3-(триметилсилил)пропаноил]-L-цистеин

619 мг (0.86 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) сначала загружали в 8.8 мл дихлорметана и добавляли 87 мг (0.86 ммоль) триэтиламина и 224 мг (0.86 ммоль) N-[2-(триметилсилил)этоксикарбонилокси]пирролидин-2,5-диона. Спустя 1 час добавляли 45 мг (0.17 ммоль) N-[2-(триметилсилил)этоксикарбонилокси]пирролидин-2,5-диона. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении, остаток вносили в дихлорметан и органическую фазу затем два раза промывали водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 602 мг (71%, чистота 87%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=861 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С74

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-D-аланинат (1:1)

75 мг (0.114 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 12.5 мл ДМФА и сочетали с 78 мг (0.171 ммоль) Промежуточного соединения L75 в присутствии 65 мг (0.11 ммоль) HATU и 79 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в 20 мл этанола и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводила к получению 63 мг (64% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.16 мин; МС (EI положит.): m/z=844 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С75

Метил (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата (полученного из (3S)-3-амино-4-метокси-4-оксобутановой кислоты классическими методами), растворенного в 175 мл ДХМ, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Смесь затем разбавляли ДХМ и два раза экстрагировали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций, концентрирования и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 4.6 г (61% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614.32 (М+Н)⁺.

200 мг (0.33 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 10 мл ДХМ, и затем добавляли 105 мкл триэтиламина и 77 мкл (0.717 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и два раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и затем концентрировали. Это приводило к получению 213 мг (75%) указанного в заголовке соединения в виде бежевой пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С76

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С75 в соответствии с классическими методами химии пептидов (удаление Теос защитной группы хлоридом цинка, ацилирование N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и расщепление сложного эфира гидроксидом лития в смеси ТГФ/вода).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.23 мин; МС (ESI положит.): m/z=818 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С77

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеин

4-трет-Бутокси-4-оксобутановую кислоту (8.39 мг, 48.1 мкмоль) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли 7.37 мг (48.1 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата, 15.5 мг ((48.1 мкмоль) фторбората (бензотриазол-1-илокси)бисдиметиламинометилия и 8.60 мкл (48.1 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Также вначале 40.0 мг (0.048 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин (1:1) (Промежуточное соединение С71) загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли 25.4 мкл (141.9 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина, и полученную смесь добавляли к реакционной смеси, которую перемешивали при КТ в течение 4 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 35.0 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.76 мин; МС (ESI положит.): m/z=873 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С78

11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-овая кислота

197 мг (0.354 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (см. синтез Промежуточного соединения С11) сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана, и смесь нагревали до 40°С. При этой температуре добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу экстрагировали, в каждом случае три раза, раствором KHSO₄ 5% концентрации. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 74.1 мг (31% от теории) метил 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=670 [М+Н]⁺.

78.3 мг (117 мкмоль) метил 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-оата сначала загружали в 4.0 мл ТГФ и добавляли 800 мкл метанола, 160 мкл воды и 230 мкл (230 мкмоль) водного раствора LiOH (1М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 64.8 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.61 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=654 [М-Н]^-

Промежуточное соединение С79

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-D-аланинат (1:1)

57.4 мг (81.8 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали в 5.7 мл ДМФА, добавляли 74.0 мг (164 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1) (Промежуточное соединение L75), 43 мкл (250 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 62.2 мг (164 мкмоль) HATU, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 52.4 мг (63% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=1022 [М]⁺

В атмосфере аргона 6.23 мг (27.7 мкмоль) ацетата палладия (II) сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана, добавляли 12 мкл (83 мкмоль) триэтиламина и 89 мкл (550 мкмоль) триэтилсилана и смесь перемешивали в течение 5 минут. Затем добавляли 56.7 мг (55.5 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланината в 3.0 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь концентрировали почти досуха, добавляли смесь ацетонитрил/вода, и реакционную смесь фильтровали и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 37.4 мг (67% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12):): R_t=2.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=888 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С80

S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-(глициламино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 43.4 мг (95.1 мкмоль) 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты (Промежуточное соединение L90) сначала загружали в 2.5 мл ДМФА, добавляли 14.6 мг (95.1 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата, 30.5 мг (95.1 мкмоль) фторбората (бензотриазол-1-илокси)бисдиметиламинометилия и 16.5 мкл (95.1 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали в течение 10 мин. 79.0 мг (95.1 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) растворяли в 2.5 мл ДМФА, добавляли 49.5 мкл (285.3 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и полученную смесь добавляли к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 44.2 мг (40% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=1156 [М+Н]⁺.

60.2 мг (52.1 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина суспендировали в 3.0 мл этанола, добавляли 6.0 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Дважды добавляли еще по 6.0 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и реакционную смесь освобождали от растворителя при пониженном давлении и сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 29.4 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=1021 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С81

(R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-циклогексилметанамин

В атмосфере аргона и при -78°С 18.7 мл (37.45 ммоль) хлорида циклогексилмагния в диэтиловом эфире (2М) добавляли к раствору 3.12 мл (6.24 ммоль) диметилцинка в толуоле (2.0 М), и смесь перемешивали при -78°С в течение 30 минут. Затем при -78°С добавляли раствор 5.0 г (12.48 ммоль) (R)-N-{(Е/Z)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]метилен}-2-метилпропан-2-сульфинамида в ТГФ, и реакционную смесь перемешивали при этой температуре в течение 1 ч и затем при КТ в течение 4 ч. Затем при -78°С добавляли мл насыщенного раствора хлорида аммония и реакционной смеси давали нагреться до КТ. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, этилацетат/циклогексан 25:75). Это приводило к получению 1.59 г (26% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.76 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=483 [М-Н]^-

В атмосфере аргона 264.0 мг (0.54 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 0.5 мл 1,4-диоксана, и затем добавляли раствор 1.36 мл HCl в 1,4-диоксане (4.0 М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли дихлорметан, и реакционную смесь промывали 1М водным раствором гидроксида натрия. Органическую фазу сушили сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, метанол/дихлорметан 98:2). Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в дихлорметане, промывали раствором бикарбоната натрия и сушили над сульфатом натрия. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 148 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 13): R_t=2.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=364 [M-NH₂]⁺

Промежуточное соединение С82

2-(Триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]амино}пропил)карбамат

В атмосфере аргона 392.2 мг (1.85 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 91.29 мг (1.52 ммоль) уксусной кислоты добавляли к раствору 503.0 мг (1.32 ммоль) 1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-циклогексилметанамина (Промежуточное соединение С81) в 1.4 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 574.6 (2.38 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата в дихлорметане, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. После добавления 143 мг (0.66 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 488 г (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=582 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С83

2-(Триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамат

280.0 мг (2.77 ммоль) триэтиламина и 397.8 мг (3.52 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к раствору 487.9 мг (0.84 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С82) в 8.40 мл дихлорметана с 4 молекулярным ситом, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 6 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 470 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=680 (M+Na)⁺.

Промежуточное соединение С84

S-{11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-L-цистеин

322.1 мг (2.66 ммоль) L-цистеина суспендировали в 0.19 мл воды вместе с 319.0 мг (3.80 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 250.0 мг (0.38 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С83), растворенного в 1.90 мл изо-пропанола, и 693.8 г (4.56 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 276 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=744 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С85

S-{11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин

34.8 мг (0.27 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 100 мг (0.13 ммоль) S-{11-[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-L-цистеина (Промежуточное соединение С84) и 41.5 мг (0.13 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) в 4.0 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 88 мг (70% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=936 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С86

11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овая кислота

161.65 мг (1.17 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 220.0 мг (0.33 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С83) и 39.02 мг (0.37 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 7.45 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 201 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.72 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=726 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С87

2-(Триметилсилил)этил {13-[R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил}карбамат

54.18 мг (0.28 ммоль) N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамида (Промежуточное соединение L1), 71.01 мг (0.50 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, 104.46 мг (0.27 ммоль) HATU и 0.23 мл (0.14 ммоль) 0.5 М 1-гидрокси-7-азабензотриазола в ДМФА добавляли к раствору 100 мг (0.14 ммоль) 11-[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С86) в 1.37 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 ч. Без дополнительной обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 41 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t = 2.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С88

трет-Бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат / трифторуксусная кислота (1:1)

Смесь стереоизомеров

1.71 г (8.05 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 0.40 г (6.61 ммоль) уксусной кислоты добавляли к раствору 2.04 мг (5.75 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (Промежуточное соединение С52) в 51 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 минут. Затем добавляли раствор 1.32 г (6.61 ммоль) трет-бутил 3-формилпирролидин-1-карбоксилата в 20 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.86 г (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=538 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение С89

трет-Бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат

1.36 г (13.42 ммоль) триэтиламина и 2.13 г (18.87 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к раствору 2.89 г (4.19 ммоль, чистота 80%) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С88) в 42 мл дихлорметана с 4 молекулярным ситом. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 449 мг (17% от теории) Изомера 1 и 442 мг (17% от теории) Изомера 2 указанного в заголовке соединения.

Изомер 1 ЖХ-МС (Метод 1): R_t=2.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

Изомер 2 ЖХ-МС (Метод 1): R_t=2.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С90

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин (Изомер 1)

357.3 мг (0.58 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.3 мл воды вместе с 488.7 мг (4.07 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 357.0 мг (0.58 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Изомер 1) (Промежуточное соединение С89, Изомер 1), растворенного в 23.0 мл изопропанола, и 1.06 г (6.98 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 255.0 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=699 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С91

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин (Изомер 2)

453.5 мг (3.74 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.1 мл воды вместе с 449.2 мг (5.35 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 3287.4 мг (0.54 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 2), растворенного в 21.1 мл изопропанола, и 0.98 г (6.42 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 221.0 мг (59% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.12 мин; МС (ESI положит.): m/z=699 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С92

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин (Изомер 1)

18.49 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С90) и 22.06 мг (0.07 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.3 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 45 минут. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 65 мг (100% от теории, чистота 71%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=892 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С93

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин (Изомер 2)

18.49 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50.0 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С91) и 22.06 мг (0.07 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.0 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 90 минут. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 63 мг (98% от теории, чистота 73%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=892 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С94

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеин (Изомер 1)

18.5 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50.0 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С90) и 18.0 мг (0.07 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.3 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором NH₄Cl и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 57 мг (81% от теории, чистота 85%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=836 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С95

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота (Изомер 1)

302.5 мг (2.19 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 384.0 мг (0.62 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 1) и 73.0 мг (0.69 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 14 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 358.0 мг (84% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=684 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С96

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота (Изомер 2)

226.0 мг (1.64 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 287.0 мг (0.45 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 2) и 54.6 мг (0.51 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 14 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 318.7 мг (88% от теории, чистота 88%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=684 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С97

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-14-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазатетрадец-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 22.75 мг (0.07 ммоль) соединения N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L1) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 26 мг (84% от теории) указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=863 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С98

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазаоктадец-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 37.30 мг (0.07 ммоль) соединения N-(2-аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 22 мг (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.54 мин; МС (ESI положит.): m/z=919 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С99

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-24-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,19-триоксо-12,15-диокса-5-тиа-2,9,18-триазатетракоз-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 35.05 мг (0.07 ммоль) соединения N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L82) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 25 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=4.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=1007 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С100

2-(Триметилсилил)этил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат

22.2 мг (0.068 ммоль) соединения (2R)-N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропанамид / трифторуксусная кислота (1:1) добавляли к раствору 45 мг (0.068 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты (Промежуточное соединение С58) в 5.8 мл ДМФА. После 30 минут перемешивания при КТ к смеси добавляли 39 мг (0.10 ммоль) HATU и 36 мг (0.27 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 7 мг (12% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z 851 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С101

Трифторуксусная кислота / метил (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-аминобутаноат (1:1)

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата (полученного из (3S)-3-амино-4-метокси-4-оксобутановой кислоты классическими методами), растворенного в 175 мл ДХМ, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Смесь затем разбавляли ДХМ и два раза экстрагировали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций, концентрирования и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 4.6 г (61% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614.32 (М+Н)⁺.

2.06 г (3.36 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 76 мл ДХМ и ацилировали 0.81 мл (7.17 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата в присутствии 2.1 мл триэтиламина. После 20 ч перемешивания при КТ, добавляли 0.36 мл 2-хлор-2-оксоэтилацетата и 0.94 мл триэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 15 мин. Смесь затем разбавляли 500 мл этилацетата и последовательно экстрагировали два раза 300 мл раствора лимонной кислоты 5% концентрации, два раза 300 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и один раз 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия, и затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 2.17 г (79% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

321 мг (0.342 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 7 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 279.5 мг (2.05 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 599 мг (2.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора трифторуксусной кислоты концентрации 0.1% в воде, и смесь затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 60 мг (26% от теории) указанного в заголовке соединения, которое все еще содержало часть деацетилированного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин и 0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=528 и 570 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С102

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Прежде всего промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=646 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С103

2-(Триметилсилил)этил N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-N2-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-глутаминат

Сначала получали указанное в заголовке соединение путем сочетания 151 мг (0.23 ммоль) Промежуточного соединения С102 с 128 г (0.234 ммоль) Промежуточного соединения L98 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 30 минут, получая указанное в заголовке соединение.

Выход: 30% от теории за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.14 мин; МС (ESI положит.): m/z=929 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С104

2-(Триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилат

К раствору 2.24 г (6.31 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина в 56.0 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом добавляли 1.87 г (8.84 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавляли 2.20 г (7.58 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4S)-3-фтор-4-формилпирролидин-1-карбоксилата (см. WO 2014/151030 А1), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3.5 ч. Смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и водой. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 1.39 г (24% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=600 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С105

2-(Триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилат

К раствору 692.8 мг (0.88 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С104) в 8.7 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом добавляли 295.0 мг (2.91 ммоль) триэтиламина и 418.9 мг (3.71 ммоль) хлорацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2.5 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток снова растворяли в 8.7 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом и добавляли 295.0 мг (2.91 ммоль) триэтиламина и 418.9 мг (3.71 ммоль) хлорацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали и использовали далее без очистки. Это приводило к получению 691 мг (74% от теории, чистота 64%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=676 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С106

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота

К смеси 691.0 мг (0.65 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С105) и 76.3 мг (0.72 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 15 мл метанола и нескольких каплях воды добавляли 316 мг (2.29 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 502 мг (67% от теории, чистота 65%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=744 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С107

S-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин

203.6 мг (1.68 ммоль) L-цистеина суспендировали в 0.95 мл воды вместе с 201.7 мг (2.40 ммоль) бикарбоната натрия. К суспензии добавляли 170.0 мг (0.24 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение 105), растворенного в 9.5 мл изо-пропанола, и 438.5 г (2.40 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 152 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=762 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С108

2-(Триметилсилил)этил N⁶-(N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизинат

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 103 мг (0.16 ммоль) Промежуточного соединения С102 с 110 мг (0.175 ммоль) 2-(триметилсилил)этил N⁶-бета-аланил-N²-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизината в ДМФА в присутствии EDCI, НОВТ и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси дихлорметан/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа, получая указанное в заголовке соединение с получением 113 мг (75% от теории за 2 стадии).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=957 (М+Н)⁺.

Использованное в данном случае промежуточное соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина и 2-(триметилсилил)этил N²-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината в присутствии HATU, гидрогенолитического отщепления защитной группы Z, введения триметилсилилэтилоксикарбонильной (Теос) защитной группы с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и заключительного мягкого отщепления Boc защитной группы путем перемешивания в 7.5% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане в течение 45 минут.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=462 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С109

Ди-трет-бутил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-глутамат

Прежде всего, дипептидное производное ди-трет-бутил бета-аланил-L-глутамат получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-бета-аланина и гидрохлорида ди-трет-бутил L-глутамата (1:1) в присутствии HATU и последующего гидрогенолитического отщепления защитной группы Z. Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания этого промежуточного соединения с Промежуточным соединением С102 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 45 минут.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С110

Дибензил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-глутамат

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания дибензил L-глутамата, который был высвобожден заранее из его соли с n-толуолсульфоновой кислотой с помощью распределения между этилацетатом и 5% раствором гидрокарбоната натрия, с Промежуточным соединением С61 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления Теос защитной группы хлоридом цинка в трифторэтаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=894 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С111

Ди-трет-бутил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутамат

Указанное в заголовке соединение синтезировали аналогично Промежуточному соединению С109.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.06 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С112

N²-Ацетил-N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали путем HATU сочетания Промежуточного соединения С102 и Промежуточного соединения L108 в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле при нормальном давлении.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С113

Трифторуксусная кислота / бензил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1)

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / бензил-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1) получали исходя из коммерчески доступного 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланина путем этерификации бензиловым спиртом в присутствии EDC/DMAP с последующей элиминацией Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты. Эту аминокислотную единицу затем сочетали с Промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина в ДМФА. На последней стадии путем перемешивания при 50°С в трифторэтаноле с 6 эквивалентами хлорида цинка в течение 2 часов и очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 мин; МС (ESI положит.): m/z=824 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С114

Трифторуксусная кислота / трет-бутил 4-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)бутаноат (1:1)

Прежде всего, Промежуточное соединение С102 сочетали с гидрохлоридом трет-бутил 4-аминобутаноата (1:1) в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, путем гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.0 мин; МС (ESI положит.): m/z=655 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С115

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид (1:1)

Прежде всего, Промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом по аналогии с Промежуточным соединением С2. Затем, вторичную аминогруппу ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27.

190 мг (0.244 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 7.5 мл этанола и добавляли 0.35 мл 40% раствора метанамина в воде. Смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч и затем такое же количество метанамина добавляли снова. После перемешивания при 50°С в течение еще 5 ч, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Получали 78 мг (48% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (EI положит.): m/z=661 [М+Н]⁺.

78 мг (0.118 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 8 мл этанола и, после добавления 15 мг 10% палладия на активированном угле, гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 3 ч. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода получали 33 мг (44% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=527 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.1 (m, 1Н), 8.0 (m, 3Н), 7.9 (m, 1Н), 7.65 (m, 1Н), 7.5 (s, 1Н), 7.15-7.35 (m, 5Н) 7.0 (m, 1Н), 6.85 (m, 1Н), 5.6 (s, 1Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 4.02 и 4.22 (2d, 2Н), 3.2-3.5 (m, 6Н), 0.7 и 1.46 (2 m, 2Н), 0.8 (s, 9Н).

Промежуточное соединение С116

Трифторуксусная кислота / N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид (1:1)

Соединение трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1) (81.0 мг, 100 мкмоль) (Промежуточное соединение F104) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагинат (43.0 мг, 131 мкмоль) растворяли в 5.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали с N,N-диизопропилэтиламином (61 мкл, 350 мкмоль) при КТ в течение 1 ч, и затем незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 84 мг (88% от теории) соединения трет-бутил [(2S)-4-амино-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}амино)-1,4-диоксобутан-2-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 [М+Н]⁺.

трет-Бутил [(2S)-4-амино-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}амино)-1,4-диоксобутан-2-ил]карбамат (83.0 мг, 91.5 мкмоль) растворяли в 5.0 мл трифторэтанола. К реакционной смеси добавляли хлорид цинка (74.8 мг, 549 мкмоль) и перемешивали при 50°С в течение дополнительных 15 мин. К смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (160 мг, 549 мкмоль) и разбавляли 5.0 мл смеси ацетонитрил/вода, добавляли ТФУ (20 мкл) и смесь перемешивали в течение 10 мин. Смесь фильтровали через шприцевой фильтр и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 50 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=807 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L1

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=198 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L2

Трифторуксусная кислота / rel-(1R,2S)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.214 ммоль) коммерчески доступной цис-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-циклопентанкарбоновой кислоты и 60 мг (0.235 ммоль) также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 36 мг (38% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L3

Трифторуксусная кислота / (1S,2R)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.214 ммоль) коммерчески доступной (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и 72 мг (0.283 ммоль) также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 13 мг (16% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.2 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L4

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)циклогексанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-[(4-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}циклогексил)метил]-1Н-пиррол-2,5-диона и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.26 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=280 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L5

Трифторуксусная кислота N{-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-бета-аланинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона и N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.22 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.22 мин; МС (ESI положит.): m/z=260 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L6

Трифторуксусная кислота / трет-бутил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали сперва путем сочетания в присутствии EDC/HOBT коммерчески доступной 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты с частично защищенным пептидом трет-бутил-L-валил-L-аланил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинатом, полученным классическими методами химии пептидов. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ, что приводило к получению указанного в заголовке соединения с выходом 37%.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.29 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.62 мин; МС (ESI положит.): m/z=566 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L7

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N2-(трет-бутоксикарбонил)-N5-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валинатом, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 32 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.31 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=516 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L8

Трифторуксусная кислота / L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 171 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.23 мин;

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=0.3 мин; МС (ESI положит.): m/z=417 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L9

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L7 из коммерчески доступного метил (4-аминофенил)ацетата. Получали 320 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=493 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L10

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-rel-N⁶-{[(1R,2S)-2-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизин трифторуксусная кислота (1:2)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения L6 путем сочетания с цис-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-циклопентанкарбоновой кислотой с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 12 мг (52% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L11

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1S,2R)-2-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:2)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения L6 путем сочетания с (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислотой с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 11 мг (39% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L12

Трифторуксусная кислота / 1-[2-(2-аминоэтокси)этил]-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

381 мг (2.46 ммоль) метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-карбоксилата добавляли к 228 мг (1.12 ммоль) трет-бутил [2-(2-аминоэтокси)этил]карбамата, растворенного в 7 мл смеси диоксан/вода 1:1. Затем добавляли 1.2 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и реакционную смесь перемешивали при КТ. После перемешивания в общей сложности в течение 5 дней и 2-х дополнительных добавлений таких же количеств раствора бикарбоната натрия, реакционную смесь обрабатывали посредством подкисления трифторуксусной кислотой, концентрирования на роторном испарителе и очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли, растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1.

Остаток вносили в 3 мл дихлорметана и добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты. После 15 мин перемешивания при КТ, растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Это приводило к получению 70 мг (67% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения в виде смолистого остатка.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.18 мин; МС (ESI положит.): m/z=185 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L13

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N2-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты с гидрохлоридом трет-бутил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизината (1:1) в присутствии EDC/HOBT и последующего мягкого удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы аналогично Промежуточному соединению L6.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.42 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=340 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L14

Трифторуксусная кислота / 1-[2-(4-аминопиперазин-1-ил)-2-оксоэтил]-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L2 за 2 стадии из трет-бутил пиперазин-1-илкарбамата и (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=239 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L15

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропанамид (1:1)

2.93 г (10.58 ммоль) трет-бутил 3-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}пропаноата растворяли в 100 мл смеси диоксан/вода 1:1 и добавляли 3.28 г (21.15 ммоль) метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-карбоксилата и насыщенного раствора бикарбоната натрия до достижения значения рН 6-7. Раствор перемешивали при КТ в течение 30 мин и 1,4-диоксан затем упаривали при пониженном давлении. Затем добавляли 200 мл воды, и смесь три раза экстрагировали этилацетатом, в каждом случае порциями по 300 мл. Органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом магния и фильтровали. Концентрирование приводило к получению трет-бутил 3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропаноата в виде коричневого масла, которое затем сушили в высоком вакууме.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=375 (M+NH₄)⁺.

Это промежуточное соединение превращали стандартными методами (снятие защиты с помощью ТФУ, сочетание с трет-бутил (2-аминоэтил)карбаматом и еще одно снятие защиты с помощью ТФУ) в указанное в заголовке соединение.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=344 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L16

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитин

535 мг (1.73 ммоль) коммерчески доступного 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона и 930 мл N,N-диизопропилэтиламина добавляли к раствору 266 мг (1.33 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина в 24 мл ДМФА. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 24 ч и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и получали, после концентрирования соответствующих фракций и сушки остатка в высоком вакууме, 337 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=468 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L17

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали сперва путем сочетания 172 мг (0.37 ммоль) Промежуточного соединения L16 и 125 мг (0.37 ммоль) гидрохлорида трет-бутил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизината (1:1) в присутствии EDC/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 2 ч в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 194 мг (49% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.1 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=652 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L18

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из метил (4-аминофенил)ацетата аналогично Промежуточному соединению L7 в соответствии с классическими методами химии пептидов путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 330 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.29 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=465 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L19

Трифторуксусная кислота / L-аланил-N5-карбамоил-N-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}фенил)-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 1,4-фенилендиамина в соответствии с классическими методами химии пептидов. На первой стадии 942 мг (8.72 ммоль) 1,4-фенилендиамина моноацилировали 0.8 г (2.9 ммоль) N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитина в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На второй стадии, аналогичным образом, вторую анилиновую аминогруппу ацилировали (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Выполнение снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ затем давало, за 3 дополнительные стадии синтеза, указанное в заголовке соединение, причем этим путем получали 148 мг данного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=0.2 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L20

Трифторуксусная кислота / L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов аналогично Промежуточному соединению L8 из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 171 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.28 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=445 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L21

L-Валил-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 0.42 г (2.56 ммоль) метил (4-аминофенил)ацетата путем последовательного сочетания с N6-(трет-бутоксикарбонил)-N2-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, снятия защиты пиперидином, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валинатом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и следующего гидрогенолитического удаления бензилоксикарбонильной защитной группы над 10% палладием на активированном угле. Получали 360 мг (32% от теории за 4 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=493 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L22

Трифторуксусная кислота / N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N-{4-[(2S)-2-амино-3-метокси-3-оксопропил]фенил}-N⁵-карбамоил-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из N-(трет-бутоксикарбонил)-4-нитро-L-фенилаланина в соответствии с классическими методами химии пептидов. 2.5 г (8.06 ммоль) этого исходного вещества на первой стадии сначала превращали в соль цезия и затем с помощью йодметана в ДМФА в сложный метиловый эфир.

Затем гидрогенолитически в метаноле над 10% палладием на активированном угле нитрогруппу превращали в аминогруппу.

Образованную таким путем аминогруппу затем ацилировали N5-карбамоил-N2-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-орнитином в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Fmoc группу удаляли с помощью пиперидина в ДМФА.

Затем проводили сочетание в ДМФА с N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валином в присутствии гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и N-диизопропилэтиламина, и в заключение удаление трет-бутоксикарбонильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.6 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L23

Трифторуксусная кислота / N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]-бета-аланинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланином в присутствии EDCI/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин.

Промежуточное соединение L24

Трифторуксусная кислота / 1-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил] циклопропанкарбоксамид (1:1)

114 мг (0.67 ммоль) коммерчески доступной 1-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопропанкарбоновой кислоты растворяли в 25 мл ДХМ, добавляли 110 мг (0.623 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) и 395 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь охлаждали до -10°C. Затем добавляли 217 мг (0.793 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния, и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь затем разбавляли этилацетатом и последовательно экстрагировали лимонной кислотой 10% концентрации, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия, затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 152 мг защищенного промежуточного соединения.

Затем его вносили в 10 мл ДХМ и защиту удаляли с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 158 мг (71% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=224 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L25

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-аланин

31.4 мг (0.17 ммоль) валил-L-аланина растворяли в 3.0 мл ДМФА и добавляли 115.0 мг (0.17 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 33.7 мг (0.33 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 74.1 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=763 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L26

L-Валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600.0 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина суспендировали в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывали и растворители упаривали при пониженном давлении. Полученное соединение использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Затем добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционный раствор незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина сначала загружали в 20.0 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1) и добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле. Смесь гидрировали водородом при КТ и нормальном давлении в течение 5 ч. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Указанное в заголовке соединение (182 мг, 72% от теории) использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L27

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

30 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина (Промежуточное соединение L26) и 46.1 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида сначала загружали в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционный раствор перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 55.6 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=920 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L28

трет-Бутил 3-формил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилат

461.7 мг (1.15 ммоль) 1-трет-бутил 3-этил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1,3-дикарбоксилата (это соединение получали в соответствии с литературной методикой WO 2006/066896) сначала загружали в 5.0 мл абсолютного дихлорметана и смесь охлаждали до -78°С. Затем медленно по каплям добавляли 326.2 мг (2.29 ммоль) раствора гидрида диизобутилалюминия (1 М в ТГФ) и смесь перемешивали при -78°С в течение 2 ч (контроль осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (петролейный эфир/этилацетат = 3:1). По каплям добавляли 1.3 г (4.59 ммоль) тартрата калия-натрия, растворенного в 60 мл воды, и реакционной смеси давали нагреться до КТ. К реакционной смеси добавляли этилацетат и водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 629.0 мг указанного в заголовке соединения в виде сырого продукта, который немедленно использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L29

трет-Бутил 3-формил-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат

Смесь диастереомеров.

807.1 мг (2.34 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (полученного в соответствии с литературной методикой WO 2006/100036) сначала загружали в 8.0 мл дихлорметана и добавляли 236.4 мг (2.34 ммоль) триэтиламина. При 0°С по каплям добавляли 267.6 мг (2.34 ммоль) метансульфонилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли еще 133.8 мг (1.17 ммоль) метансульфонилхлорида и 118.2 мг (1.17 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, насыщенным раствором бикарбоната натрия, раствором гидросульфата калия 5% концентрации и насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 66 мл/мин, циклогексан/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 402.0 мг (41% от теории) соединения трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-{[(метилсульфонил)окси]метил}пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=424 [М+Н]⁺.

400.0 мг (0.94 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-{[(метилсульфонил)окси]метил}пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 5.0 мл ДМФА и добавляли 98.2 мг (1.51 ммоль) азида натрия. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 10 ч. Затем добавляли еще 30.7 мг (0.47 ммоль) азида натрия, и смесь перемешивали при 40°С в течение дополнительных 10 ч. Добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой. После сушки органической фазы над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 309.5 мг (89% от теории) соединения трет-бутил 3-(азидометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.50 мин; МС (ESI положит.): m/z=371 [М+Н]⁺.

250 мг (0.68 ммоль) трет-бутил 3-(азидометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 10.0 мл смеси этилацетат/этанол (1:1) и добавляли 25.0 мг палладия на активированном угле (10%). Смесь гидрировали водородом при КТ и нормальном давлении в течение 8 ч. Реакционную смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали этилацетатом. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 226.2 мг (82% от теории) соединения трет-бутил 3-(аминометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=345 [М+Н]⁺.

715.0 мг (2.08 ммоль) трет-бутил 3-(аминометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 15.0 мл ТГФ и добавляли 2.28 мл (2.28 ммоль) раствора TBAF (1M в ТГФ). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток (1.54 г) использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=231 [М+Н]⁺.

1.54 г (4.88 ммоль) трет-бутил 3-(аминометил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 1,4-диоксан и добавляли 541.8 мг (4.88 ммоль) хлорида кальция (безводного) и 488.6 мг (4.88 ммоль) карбоната кальция и смесь энергично перемешивали. Затем добавляли 592.8 мг (5.86 ммоль) триэтиламина и 1.52 г (5.86 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 644.9 мг (10.7 ммоль) НОАс и этилацетат. Органическую фазу два раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 346.9 мг (19% от теории) соединения трет-бутил 3-(гидроксиметил)-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=375 [М+Н]⁺.

804.0 мг (2.15 ммоль) трет-бутил 3-(гидроксиметил)-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 20.0 мл хлороформа и 20.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 59.7 мг (0.22 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 429.9 мг (3.22 ммоль) N-хлорсукцинимида и 33.5 мг (0.22 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Органическую фазу отделяли и освобождали от растворителя при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Это приводило к получению 517.0 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=373 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L30

трет-Бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-формилпирролидин-1-карбоксилат

Смесь стереоизомеров

250.0 мг (0.72 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (соединение получали в соответствии с литературной методикой WO 2006/100036) сначала загружали в 12.5 мл смеси дихлорметан/ДМСО (4:1) и добавляли 219.6 мг (2.17 ммоль) триэтиламина. При 2°С небольшими порциями добавляли 345.5 мг (2.17 ммоль) комплекса триоксид серы-пиридин и смесь перемешивали при 2°С в течение 3 ч. Небольшими порциями добавляли еще 345.5 мг (2.17 ммоль) комплекса триоксид серы-пиридин и смесь перемешивали при КТ в течение 17 ч. Реакционную смесь распределяли между дихлорметаном и водой. Водную фазу три раза экстрагировали дихлорметаном и объединенные органические фазы промывали один раз водой и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза (тонкослойная хроматография: петролейный эфир/этилацетат 7:3).

Промежуточное соединение L31

Ди-трет-бутил {[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил }малонат

57.2 г (488.27 ммоль) трет-бутил карбамата, 51.2 мл (683.57 ммоль) раствора 37% концентрации формальдегида в воде и 25.9 г (244.13 ммоль) карбоната натрия добавляли к 600 мл воды. Смесь нагревали до тех пор, пока не образовывался раствор, и затем перемешивали при КТ в течение 16 ч. Образовавшуюся суспензию экстрагировали 500 мл дихлорметана и органическую фазу отделяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом натрия. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме, получая кристаллическое твердое вещество. Остаток вносили в 1000 мл абсолютного ТГФ, и по каплям добавляли смесь 322 мл (3.414 моль) ангидрида уксусной кислоты и 138 мл (1.707 моль) пиридина при КТ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и затем концентрировали на роторном испарителе с водяной баней при комнатной температуре. Остаток вносили в диэтиловый эфир и три раза промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме в течение 2 дней. Остаток вносили в 2000 мл абсолютного ТГФ и добавляли 456 мл (456.52 ммоль) 1 М раствора трет-бутилата калия в ТГФ при охлаждении льдом. Смесь перемешивали при 0°С в течение 20 мин, и затем по каплям добавляли 100.8 г (456.52 ммоль) ди-трет-бутил малоната, растворенного в 200 мл абсолютного ТГФ. Смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч, и затем добавляли воду. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и вносили в 500 мл этилацетата. Смесь промывали 500 мл воды и 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия и органическую фазу сушили над сульфатом натрия. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью фильтрования через силикагель (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат, градиент = 30:1→5:1). Это приводило к получению 37.07 г (22% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L32

трет-Бутил [3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамат

37.0 г (107.11 ммоль) ди-трет-бутил (ацетоксиметил)малоната растворяли в 1000 мл абсолютного ТГФ, и при охлаждении льдом по каплям добавляли 535.5 мл (1071.10 ммоль) 2 М раствора борогидрида лития в ТГФ. По каплям добавляли 19.3 мл (1071.10 ммоль) воды и смесь перемешивали при КТ в течение 4.5 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 1500 мл этилацетата, добавляли 100 мл воды и смесь перемешивали при охлаждении водой (слегка экзотермическая реакция) в течение 30 мин. Органическую фазу отделяли и водную фазу два раза экстрагировали 500 мл этилацетата. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 20.7 г (94% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.49 мин; МС (EI положит.): m/z=106 [M-C₅H₈O₂]⁺.

Промежуточное соединение L33

трет-Бутил [3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(гидроксиметил)пропил]карбамат

20.00 г (97.44 ммоль) трет-бутил [3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамата растворяли в 1000 мл абсолютного дихлорметана и добавляли 6.63 г (97.44 ммоль) имидазола и 16.16 г (107.18 ммоль) трет-бутил(хлор)диметилсилана при КТ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и промывали полуконцентрированным раствором хлорида натрия. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 28.50 г (92% от теории) целевого соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, скрыт)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H).

Промежуточное соединение L34

трет-Бутил (3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-формилпропил)карбамат

12.65 г (39.591 ммоль) трет-бутил [3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(гидроксиметил)пропил]карбамата растворяли в 200 мл дихлорметана, и при КТ по каплям добавляли 19.31 г (45.53 ммоль) периодинана Десса-Мартина, растворенного в 150 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляли 250 мл полуконцентрированного раствора бикарбоната натрия и 250 мл раствора тиосульфата натрия 10% концентрации и смесь перемешивали в течение 20 мин. Органическую фазу отделяли и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали 300 мл воды, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.35 г (90% от теории) целевого соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.02 (s, 6H), 0.84 (s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, (1H, скрыт)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81-3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, 1H).

Промежуточное соединение L35

трет-Бутил (3-оксопропил)карбамат

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с методом, известным из литературы (например, Jean Bastide и др. J. Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545).

Промежуточное соединение L36

N-(Бензилокси)карбонил-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

100 мг (0.57 ммоль) N5-карбамоил-L-орнитина вносили в 4.0 мл ДМФА и добавляли 0.08 мл (0.57 ммоль) триэтиламина. Затем добавляли 199.0 мг (0.57 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валина и 0.08 мл (0.57 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода с 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 75.7 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.69 мин; МС (ESI положит.): m/z=409 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L37

L-Валил-N5-карбамоил-L-орнитин

75.7 мг (0.19 ммоль) Промежуточного соединения L36 суспендировали в 25 мл смеси воды/этанол/ТГФ, добавляли 7.5 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 4.5 ч. Катализатор отфильтровывали и реакционную смесь освобождали от растворителя при пониженном давлении и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Это приводило к получению 64.9 мг (93% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=275 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L38

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

38.3 мг (0.14 ммоль) Промежуточного соединения L37 сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 96.4 мг (0.14 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 39.0 мкл (0.28 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Затем добавляли 16.0 мкл (0.28 ммоль) НОАс, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 58.9 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=849 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение L39

2-(Триметилсилил)этил (2-сульфанилэтил)карбамат

300 мг (2.64 ммоль) гидрохлорида 2-аминоэтантиола (1:1) сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 668.0 мг (6.60 ммоль) триэтиламина и 719.1 мг (2.77 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона. Смесь перемешивали при КТ в течение 2 дней (контроль осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии: дихлорметан/метанол = 100:1.5). Добавляли этилацетат и реакционную смесь три раза промывали водой. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L40

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина гидрировали водородом в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), используя палладий на угле (10%) при КТ и нормальном давлении. Соединение N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180.0 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-( трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 20 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1), добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле и смесь гидрировали водородом при нормальном давлении и при КТ. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 182.0 мг (72% от теории) соединения L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина и 46.1 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 55.6 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=920 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L41

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина гидрировали водородом в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), используя палладий на угле (10%) при КТ и нормальном давлении. Соединение N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180.0 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 20.0 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1), добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле и смесь гидрировали водородом при нормальном давлении и при КТ. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 182.0 мг (72% от теории) соединения L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина и 34.3 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 40.6 мг (82% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=744 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение L42

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

50.0 мг (0.18 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L37) сначала загружали в ДМФА и добавляли 93.6 мг (0.18 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида и 36.9 мг (0.37 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 21.9 мг (0.37 ммоль) НОАс и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 20.6 мг (14% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L43

N-[67-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-65-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-икосаокса-64-азагептагексаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

11.3 мг (0.04 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L37) сначала загружали в ДМФА и добавляли 50.0 мг (0.04 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{63-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-63-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-икосаоксатригексаконт-1-ил}пропанамида и 8.3 мг (0.08 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 4.9 мг (0.08 ммоль) НОАс и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.8 мг (20% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=1377 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L44

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланин

73.3 мг (0.39 ммоль) L-валил-L-аланина растворяли в 7.0 мл ДМФА и добавляли 200.0 мг (0.39 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида и 78.8 мг (0.78 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 103.3 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=587 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L45

трет-Бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноат

2.00 г (7.26 ммоль) трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-гомосерината растворяли в 90 мл дихлорметана и 1.76 мл пиридина и затем добавляли 4.62 г (10.90 ммоль) 1,1,1-триацетокси-1лямбда⁵,2-бензйодоксол-3(1Н)-она (периодинан Десса-Мартина). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и затем разбавляли 200 мл дихлорметана и два раза экстрагировали раствором тиосульфата натрия 10% концентрации и затем последовательно два раза раствором лимонной кислоты 5% концентрации и два раза насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли 100 мл диэтилового эфира и циклогексан (об./об. = 1:1), что приводило к образованию белого осадка. Осадок отфильтровывали с отсасыванием. Фильтрат концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме, получая 1.74 г (88% от теории) целевого соединения в виде светло-желтого масла.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=274 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H).

Промежуточное соединение L46

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]-L-глутаминат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания 200 мг (0.79 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) с 263 мг (0.87 ммоль) соединения (4S)-5-трет-бутокси-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1) в присутствии EDC/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 1 ч в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 85 мг (20% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=326 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L47

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-аланил-N5-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания Промежуточного соединения L8 с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=488 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L48

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты аналогично Промежуточному соединению L2.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L49

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-(бромацетил)-L-валил-L-аланил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания коммерчески доступного ангидрида бромуксусной кислоты с частично защищенным пептидом трет-бутил L-валил-L-аланил-N⁶-трет-бутоксикарбонил)-L-лизинатом, полученным в соответствии с классическими методами химии пептидов, в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в дихлорметане. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ, получая указанное в заголовке соединение с выходом 49% за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=593 и 595 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L50

Трифторуксусная кислота / (1S,3R)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1S,3R)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L51

Трифторуксусная кислота / (1R,3R)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,3R)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=250 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L52

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-бромацетамид (1:1)

420 мг (2.62 ммоль) трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата вносили в 50 мл дихлорметана и добавляли 817 мг (3.15 ммоль) ангидрида бромуксусной кислоты и 913 мкл (5.24 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Это приводило к получению 577 мг защищенного промежуточного соединения, которое затем вносили в 50 мл дихлорметана и добавляли 10 мл трифторуксусной кислоты. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 705 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=181 и 183 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L53

Трифторуксусная кислота / (1S,3S)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1S,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=250 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L54

Трифторуксусная кислота / (1R,3S)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L55

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N⁶-D-аланил-N²-{N-[6-2,5-оксо-(2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)-гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания Промежуточного соединения L6 с N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланином в присутствии HATU, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 90 минут в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.35 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.67 мин; МС (ESI положит.): m/z=637 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L56

Трифторуксусная кислота / трет-бутил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,3S)-3-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания Промежуточного соединения L6 с (1R,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислотой в присутствии HATU, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 15 минут в трифторуксусной кислоте 25% концентрации в ДХМ при КТ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.7 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L57

Метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат

500.0 мг (2.72 ммоль) гидрохлорида метил L-аспарагината и 706.3 мг (2.72 ммоль) 2-(триметилсилил)этил 2,5-диоксопирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 5.0 мл 1,4-диоксана и добавляли 826.8 мг (8.17 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 583.9 мг (74% от теории) соединения (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=290 (М-Н)^-.

592.9 мг (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты сначала загружали в 10.0 мл 1,2-диметоксиэтана, смесь охлаждали до -15°С и добавляли 205.8 мг (2.04 ммоль) 4-метилморфолина и 277.9 мг (2.04 ммоль) изобутил хлорформиата. Спустя 15 мин осадок отфильтровывали с отсасыванием, и два раза с 1,2-диметоксиэтаном, в каждом случае с порциями по 10.0 мл. Фильтрат охлаждали до -10°С, и при энергичном перемешивании добавляли 115.5 мг (3.05 ммоль) борогидрида натрия, растворенного в 10 мл воды. Фазы разделяли и органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 515.9 мг (91% от теории) соединения метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосерината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=278 (М+Н)⁺.

554.9 мг (2.00 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосерината сначала загружали в 30.0 мл дихлорметана и добавляли 1.27 г (3.0 ммоль) периодинана Десса-Мартина и 474.7 мг (6.00 ммоль) пиридина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Спустя 4 ч реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае три раза, раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации, раствором лимонной кислоты 10% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Это приводило к получению 565.7 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).

Промежуточное соединение L58

2-(Триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамат

434.4 мг (5.78 ммоль) 3-амино-1-пропанола и 1.50 г (5.78 ммоль) 2-(триметилсилил)этил 2,5-диоксопирролидин-1-карбоксилата растворяли в 10.0 мл дихлорметана, добавляли 585.3 мг (5.78 ммоль) триэтиламина и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток - 2-(триметилсилил)этил (3-гидроксипропил)карбамат (996.4 мг, 79% от теории) сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

807.0 мг (3.68 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-гидроксипропил)карбамата сначала загружали в 15.0 мл хлороформа и 15.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 102.2 мг (0.37 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 736.9 мг (5.52 ммоль) N-хлорсукцинимида и 57.5 мг (0.37 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза (890.3 мг).

Промежуточное соединение L59

Трифторуксусная кислота / 1-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

300.0 мг (0.91 ммоль) трет-бутил (2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этил)карбамата сначала загружали в дихлорметан, добавляли 4.2 г (36.54 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч (контроль осуществляли с помощью ТСХ: дихлорметан/метанол 10:1). Летучие компоненты упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли четыре раза совместно с дихлорметаном. Остаток сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.19 мин; МС (ESI положит.): m/z=229 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L60

6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил хлорид

200.0 мг (0.95 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты растворяли в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 338.0 мг (2.84 ммоль) тионилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч, и затем добавляли 1 каплю ДМФА. Смесь перемешивали в течение еще 1 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с дихлорметаном. Сырой продукт использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L61

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-аланил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего трипептидное производное 2-(триметилсилил)этил L-валил-L-аланил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолиз, сочетание с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и еще один гидрогенолиз). Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого частично защищенного пептидного производного с коммерчески доступной 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 2.5 часов в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ с сохранением сложноэфирной защитной группы. Обработка реакционной смеси и очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 438 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.69 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=610 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L62

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-карбамоил-L-орнитил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего 2-(триметилсилил)этил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов. 148 мг (0.43 ммоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в присутствии 195 мг (0.51 ммоль) HATU и 149 мкл N,N-диизопропилэтиламина с 200 мг (0.43 ммоль) Промежуточного соединения L16. После концентрирования и очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ, защищенное промежуточное соединение вносили в 20 мл ДХМ и трет-бутоксикарбонильную защитную группу удаляли путем добавления 2 мл трифторуксусной кислоты и 1 ч перемешивания при КТ. Концентрирование и лиофилизация остатка из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 254 мг (63% от теории за 2 стадии) продукта.

ВЭЖХ (Метод 11):R_t=1.51 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.68 мин; МС (ESI положит.): m/z=696 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L63

(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановая кислота

Прежде всего трипептидное производное (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановую кислоту получали из (2S)-5-(бензилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты, сочетание с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и гидрогенолиз в метаноле над 10% палладием на активированном угле). Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого частично защищенного пептидного производного с коммерчески доступным 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дионом. Обработка реакционной смеси и очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 601 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=611 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L64

(4S)-4-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановая кислота

Указанное в заголовке соединение получали из (2S)-5-(бензилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилилэтанолом с использованием EDCI/DMAP, удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты, гидрогенолитическое расщепление сложного бензилового эфира в метаноле над 10% палладием на активированном угле и сочетание с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламином).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=385 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L65

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-L-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 373 мг (79% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.72 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L66

Метил (8S)-8-(2-гидроксиэтил)-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-оат

1000 мг (2.84 ммоль) (3S)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты сначала загружали в 10.0 мл 1,2-диметоксиэтана и добавляли 344.4 мг (3.4 ммоль) 4-метилморфолина и 504 мг (3.69 ммоль) изобутил хлорформиата. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь охлаждали до 5°С и при энергичном перемешивании небольшими порциями добавляли 161 мг (4.26 ммоль) борогидрида натрия, растворенного в 3 мл воды. Спустя 1 час такое же количество борогидрида натрия добавляли снова и реакционную смесь затем медленно нагревали до КТ. Добавляли 170 мл воды и реакционную смесь затем четыре раза экстрагировали этилацетатом, в каждом случае порциями по 200 мл. Фазы разделяли и органическую фазу один раз промывали лимонной кислотой и затем насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 760 мг (78% от теории) соединения бензил трет-бутил [(2S)-4-гидроксибутан-1,2-диил]бискарбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

760 мг (2.16 ммоль) этого промежуточного соединения, растворенного в 13 мл хлороводорода в диоксане, перемешивали при КТ в течение 20 мин. Реакционную смесь затем концентрировали до 5 мл и добавляли диэтиловый эфир. Осадок отфильтровывали и лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1.

Полученный таким путем продукт растворяли в 132 мл ДМФА и добавляли 345.5 мг (2.35 ммоль) 4-метокси-4-оксобутановой кислоты, 970 мг (2.55 ммоль) HATU и 1025 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли и ацетонитрил упаривали при пониженном давлении. Водную фазу, которая осталась, два раза экстрагировали этилацетатом, и органическую фазу затем концентрировали и сушили в высоком вакууме.

Полученное таким путем промежуточное соединение вносили в метанол и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении.

247 мг этого соединение со снятой защитой вносили в 20 мл ДМФА и добавляли 352 мг (1.36 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и 592 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению, в ходе этих 5 стадий синтеза, 218 мг указанного в заголовке соединения с общим выходом 21%.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=363 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L67

Трифторуксусная кислота / 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил-бета-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.354 ммоль) коммерчески доступного 1-(2-гидроксиэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем сочетания с 134 мг (0.71 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина в 10 мл дихлорметана в присутствии 1.5 эквивалентов EDCI и 0.1 эквивалента 4-N,N-диметиламинопиридина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

Выход: 56 мг (48% от теории за 2 стадии)

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=213 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L68

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L1 в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропановой кислоты и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=212 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L69

Трифторуксусная кислота / 1-[(бензилокси)карбонил]пиперидин-4-ил-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного бензил 4-гидроксипиперидин-1-карбоксилата путем этерификации N2-(трет-бутоксикарбонил)-N5-карбамоил-L-орнитином с использованием EDCI/DMAP, последующего удаления Boc с помощью ТФУ, следующего за этим сочетания с N-[(трет-бутокси)карбонил]-L-валином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение еще одного удаления Вое с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.62 мин; МС (ESI положит.): m/z=492 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L70

9Н-Флуорен-9-илметил (3-оксопропил)карбамат

1000.0 мг (3.36 ммоль) 9Н-флуорен-9-илметил (3-гидроксипропил)карбамата сначала загружали в 15.0 мл хлороформа и 15.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 93.5 мг (0.34 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 673.6 мг (5.04 ммоль) N-хлорсукцинимида и 52.5 мг (0.34 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток сушили в высоком вакууме и очищали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат 3:1-1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 589.4 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=296 (М-Н)⁺.

Промежуточное соединение L71

трет-Бутил [4-(хлоркарбонил)фенил]карбамат

100.0 мг (0.42 ммоль) 4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бензойной кислоты сначала загружали в 2.0 мл дихлорметана и добавляли 64.2 мг (0.51 ммоль) оксалилдихлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин (контроль осуществляли с помощью ТСХ: дихлорметан/метанол). Затем добавляли еще 192.6 мг (1.53 ммоль) оксалилдихлорида и 1 каплю ДМФА и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток несколько раз перегоняли совместно с дихлорметаном. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L72

Бензил (9S)-9-(гидроксиметил)-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетоадекан-14-оат

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного бензил трет-бутил [(2S)-3-гидроксипропан-1,2-диил]бискарбамата в соответствии с классическими методами химии пептидов путем гидрогенолитического удаления защитной группы Z, последующего сочетания с 4-(бензилокси)-4-оксобутановой кислотой в присутствии EDCI/HOBT, следующего за этим удаления Boc защитной группы с помощью ТФУ, и в заключение реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в присутствии триэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=425 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L73

N-(2-Аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид

395.5 мг (1.87 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты, 1.21 г (9.36 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 854.3 мг (2.25 ммоль) HATU добавляли к раствору 300 мг (1.87 ммоль) трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата в 20 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 минут. После концентрирования смеси, остаток вносили в ДХМ и промывали водой. Органическую фазу промывали солевым раствором, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Это приводило к получению 408 мг (33%, чистота 53%) указанного в заголовке соединения, которое использовали без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=354 (М+Н)⁺.

1 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил (2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этил)карбамата (408 мг, 0.365 ммоль) в 7 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 0.5 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток перегоняли два раза совместно с дихлорметаном. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 384 мг (94%, чистота 57%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=254 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L74

3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-Диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропановая кислота

107 мг (0.335 ммоль) трет-бутил 3-[2-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]этокси]пропаноата и 93 мг (0.369 ммоль) (2,5-диоксопирролидин-1-ил) 2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетата растворяли в 5 мл диметилформамида и добавляли 0.074 мл (0.671 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 133 мг (86%, чистота 100%) трет-бутил 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=459 (М+Н)⁺.

0.5 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (130 мг, 0.284 ммоль) в 5 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 102 мг (90%, чистота 100%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=402 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L75

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты). Это приводило к получению 405 мг (58% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1); R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L76

(2S)-2-Бром-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановая кислота

Прежде всего соответствующим образом защищенное производное аспарагиновой кислоты получали из (3S)-4-(бензилокси)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и гидрогенолитическое удаление защитной группы Z и расщепление сложного бензилового эфира).

470 мг (1.8 ммоль) полученной таким путем (2S)-2-амино-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановой кислоты суспендировали в 10 мл воды и добавляли 1.8 мл 1 молярной хлористоводородной кислоты и 0.5 мл концентрированной серной кислоты, с последующим добавлением 863 мг (7.25 ммоль) бромида калия. Затем при 10°С по каплям добавляли раствор 150 мг (2.175 ммоль) нитрита натрия в 1 мл воды в течение периода 30 мин, и смесь перемешивали при 10-15°С в течение 2 ч. Смесь затем экстрагировали 50 мл этилацетата. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния. Осуществление упаривания растворителя и очистки продукта с помощью препаративной ВЭЖХ приводило к получению 260 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=295 и 297 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ [м.д.]=0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 и 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).

Промежуточное соединение L77

Трифторуксусная кислота / N-[2-(2-аминоэтокси)этил]-2-бромацетамид (1:1)

418 мг (2.05 ммоль) трет-бутил [2-(2-аминоэтокси)этил]карбамата сначала подвергали реакции с 638 мг (2.46 ммоль) ангидрида бромуксусной кислоты и Boc защитную группу затем удаляли трифторуксусной кислотой. Это приводило к получению 551 мг (63% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод): R_t=0.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=227 и 225 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение L78

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланин

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты путем сочетания с гидрохлоридом трет-бутил бета-аланината (1:1) в присутствии EDCI/HOBt и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=227 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L79

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланин

64.8 мг (0.357 ммоль) гидрохлорида трет-бутил бета-аланината (1:1) и 100 мг (0.324 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4 мл диметилформамида и добавляли 65.6 мг (0.649 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 84.5 мг (77%, чистота 100%) трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

1.62 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланината (82.8 мг, 0.244 ммоль) в 8 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 62.7 мг (87%, чистота 95%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=283 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L80

2-(Триметилсилил)этил 3-[(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил)амино]-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланинат

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного соединения 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланин / N-циклогексилциклогексанамин (1:1) в соответствии с классическими методами химии пептидов (высвобождение из соли и этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолитическое удаление защитной группы Z, сочетание с коммерчески доступной 3-оксо-1-фенил-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19-овой кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и еще одно гидрогенолитическое удаление защитной группы Z).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.70 мин; МС (ESI положит.): m/z=552 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L81

Трифторуксусная кислота / бензил {2-[(2-аминоэтил)сульфонил]этил}карбамат (1:1)

250 мг (1.11 ммоль) 2,2'-сульфонилдиэтанамина сочетали с 92.3 мг (0.37 ммоль) 1-{[(бензилокси)карбонил]окси}пирролидин-2,5-диона в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в ДМФА. Последующая очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 70 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=0.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=257.11 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L82

Трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

88.6 мг (0.357 ммоль) N-Вос-2,2'-(этилендиокси)диэтиламина и 100 мг (0.324 ммоль) N-сукцинимидил 6-малеимидогексаноата растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.071 мл (0.650 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 127 мг (81% от теории) трет-бутил {2-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=442 (М+Н)⁺.

2.0 мл ТФУ добавляли к раствору 123 мг (225 мкмоль) трет-бутил {2-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата в 7.5 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 111 мг (100% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=342 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.17 (m, 2Н), 1.47 (m, 4Н), 2.04 (m, 2Н), 2.98 (m, 2Н), 3.19 (m, 2Н), 3.39 (m, 4Н), 3,56 (m, 6Н), 7.01 (s, 2Н), 7.72 (bs, 3Н), 7.80 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L83

Трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

200 мг (0.805 ммоль) трет-бутил {2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}карбамата, 150 мг (0.966 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и 560 мкл (3.2 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина растворяли в 10 мл диметилформамида и добавляли 459 мг (1.21 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в дихлорметане. Органическую фазу два раза промывали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, дихлорметан : метанол 98:2). Это приводило к получению 276 мг (89% от теории) трет-бутил (2-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.67 мин; МС (ESI положит.): m/z=386 (М+Н)⁺.

4 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил {2-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата (275 мг, 714 мкмоль) в 15 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 281 мг (99% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=286 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L84

Трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

200 мг (0.594 ммоль) трет-бутил (14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)карбамата и 202 мг (0.654 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.130 мл (1.2 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.085 мл (1.5 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 275 мг (73% от теории) трет-бутил [21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагеникоз-1-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=530 (М+Н)⁺.

780 мкл (10 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил [21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагеникоз-1-ил]карбамата (268 мг, 505 мкмоль) в 5.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 266 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=430 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.17 (m, 2Н), 1.47 (m, 4Н), 2.03 (m, 2Н), 2.99 (m, 2Н), 3.18 (m, 2Н), 3.38 (m, 4Н), 3,52 (m, 8Н), 3,58 (m, 6Н), 7.01 (s, 2Н), 7.73 (bs, 3Н), 7.80 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L85

Трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

200 мг (0.594 ммоль) трет-бутил (14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)карбамата, 111 мг (0.713 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и 410 мкл (2.4 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина растворяли в 6 мл диметилформамида и добавляли 339 мг (0.892 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 130 мг (43% от теории) трет-бутил [17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагептадец-1-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

410 мкл (5.3 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил [17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагептадец-1-ил]карбамата (126 мг, 267 мкмоль) в 4.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 124 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 13): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=374 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=2.99 (m, 2Н), 3.22 (m, 2Н), 3.41 (m, 2Н), 3,53 (m, 8Н), 3,58 (m, 6Н), 4.02 (s, 2Н), 7.09 (s, 2Н), 7.73 (bs, 3Н), 8.21 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L86

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланин

100 мг (0.531 ммоль) L-валил-L-аланина и 134 мг (0.531 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 3 мл диметилформамида и добавляли 0.150 мл (1.1 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 8 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 71.5 мг (41% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=326 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L87

3-[2-(2-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропановая кислота

250 мг (1.07 ммоль) трет-бутил 3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноата, 151 мг (0.974 ммоль) 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты, 224 мг (1.46 ммоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 224 мг (1.17 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида растворяли в 5.0 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли этилацетат и смесь два раза экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 267 мг (64% от теории) трет-бутил 3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=371 (М+Н)⁺.

1.1 мл (14 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил 3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноата (263 мг, 710 мкмоль) в 10 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 240 мг (94% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=0.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=315 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L88

2,5-Диоксопирролидин-1-ил N[-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланинат

150 мг (0.797 ммоль) L-валил-L-аланина и 246 мг (0.797 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.220 мл (1.6 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 302 мг (97% от теории) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=382 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.82 (dd, 6Н), 1.17 (m, 2Н), 1.27 (d, 3Н), 1.48 (m, 4Н), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2Н), 3.38 (t, 2Н), 4.17 (m, 2Н), 7.00 (s, 2Н), 7.75 (d, 1Н), 8.19 (d, 1Н).

130 мг (0.531 ммоль) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланина растворяли в 6.5 мл дихлорметана и добавляли 58.8 мг (0.511 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона и 78.4 мг (0.409 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида. Добавляли еще 58.8 мг (0.511 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона и 78.4 мг (0.409 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида. Добавляли дихлорметан и смесь три раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 172 мг (87% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.28 мин; МС (ESI положит.): m/z=479 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L89

Гидрохлорид 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-L-глутамата (1:1)

1.00 г (2.96 ммоль) (4S)-5-(бензилокси)-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты сначала загружали в 13.0 мл ТГФ и добавляли 510 мкл (3.6 ммоль) 2-(триметилсилил)этанола и 109 мг (889 мкмоль) 4-диметиламинопиридина. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и добавляли 682 мг (3.56 ммоль) гидрохлорида N-этил-N'-3-(диметиламинопропил)карбодиимида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в этилацетате. Органическую фазу два раза промывали 0.1 н. раствором HCl и насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, циклогексан : этилацетат 80:20). Это приводило к получению 649 мг (50% от теории) соединения 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=4.6 мин; МС (ESI положит.): m/z=438 (М+Н)⁺.

649 мг (1.48 ммоль) 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата растворяли в 7.0 мл диоксана и, при охлаждении на бане со льдом, добавляли 14 мл (59 ммоль) 4 н. HCl в диоксане. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме и очищали с помощью Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, дихлорметан : метанол 90:10). Это приводило к получению 320 мг (57% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=338 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L90

1-({N-[(Бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овая кислота

118 мг (566 мкмоль) N-[(бензилокси)карбонил]глицина сначала загружали в 5.0 мл ДМФА, добавляли 200 мг (622 мкмоль) трет-бутил 1-амино-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата, 130 мг (849 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 130 мг (679 мкмоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли этилацетат и смесь два раза экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 274 мг (95% от теории) трет-бутил 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата.

ЖХ-МС (Метод 12): Rt=1.69 мин; МС (ESI положит.): m/z=513 (М+Н)⁺.

820 мкл (11 ммоль) ТФУ добавляли к раствору 274 мг (535 мкмоль) трет-бутил 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата в 5.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 262 мг (100% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.12 мин; МС (ESI положит.): m/z=457 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L91

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 1-{[3-амино-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланил]амино}-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной 3-оксо-1-фенил-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19-овой кислоты классическими методами химии пептидов (этерификация 2-триметилсилилэтанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолитическое удаление защитной группы Z, сочетание с коммерчески доступным N-(трет-бутоксикарбонил)-3-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}-D-аланином и удаление Fmoc защитной группы).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=552 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L92

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом и последующего снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.5 мин; МС (ESI положит.): m/z=409 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L93

N-Ацетил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом, последующего снятия защиты - защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол над 10% палладием на активированном угле, и последующего ацилирования уксусной кислотой в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.16 мин; МС (ESI положит.): m/z=317 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.19 (2d, 6Н), 1.82 (s, 3Н), 2.5 (m, 2Н), 4.26 (m, 2Н), 4.48 (q, 1Н), 6.9 (s, 1Н), 7.36 (s, 1Н), 8.0 (m, 3Н), 12.54 (s, 1Н).

Промежуточное соединение L94

N-{4-Оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутаноил}-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Прежде всего, 4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановую кислоту получали по реакции 4-(бензилокси)-4-оксобутановой кислоты с 2-(триметилсилил)этанолом в присутствии EDCI/DMAP в ДХМ с последующим гидрогенолитическим расщеплением сложного бензилового эфира.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=217 (М-Н)^-.

Кроме того, соединение трифторуксусная кислота / 4-нитробензил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагинат (1:1) получали путем сочетания N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланил-L-аланина с гидробромидом 4-нитробензил L-аспарагината (1:1) в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты с аминогруппы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=410 (М+Н)⁺.

Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания этих двух промежуточных соединений в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем снятия защиты - расщепления сложного n-нитробензилового эфира путем гидрирования в смеси ДХМ-метанол 1:9 над 10% палладием на активированном угле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=475 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L95

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланин

Это промежуточное соединение получали исходя из N-[(бензилокси)карбонил]-L-валина и гидрохлорида трет-бутил L-аланината (1:1) общепринятыми методами химии пептидов.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=323.16 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L96

N-Ацетил-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитинамид

Это промежуточное соединение получали общепринятыми методами химии пептидов, начиная с сочетания 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината с N⁵-карбамоил-L-орнитином с последующим гидрогенолитическим отщеплением защитной группы Z над 10% палладием на активированном угле в этаноле и в заключение реакцией полученного дипептида с 1-ацетоксипирролидин-2,5-дионом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=317 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L97

1-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-овая кислота

трет-Бутил 1-амино-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакозан-27-оат (100 мг, 201 мкмоль) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусную кислоту (46.8 мг, 301 мкмоль), 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрат (76.9 мг, 502 мкмоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (77.0 мг, 402 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли этилацетат. Органическую фазу два раза промывали 5% раствором лимонной кислоты, насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и один раз насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.1 мг (13% от теории) трет-бутил 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=635 [М+Н]⁺.

К раствору трет-бутил 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-оата (19.1 мг, 30.1 мкмоль) в 1.0 мл ДХМ добавляли ТФУ (62 мкл, 600 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 10.8 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.55 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=577 [М-Н]^-.

Промежуточное соединение L98

2,2-Диметилпропановая кислота / 2-(триметилсилил)этил N-(2-аминоэтил)-N²-{[2-(триметилсилил) этокси]карбонил}-L-глутаминат (1:1)

Прежде всего (4S)-5-трет-бутокси-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановую кислоту сочетали в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с бензил (2-аминоэтил)карбаматом. Затем, с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ отщепляли Вое защитную группу и расщепляли сложный трет-бутиловый эфир. Затем, первую аминогруппу повторно защищали по реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, и затем карбоксильную группу - по реакции с 2-(триметилсилил)этанолом в ДХМ в присутствии EDCI/DMAP. На последней стадии снимали защиту с концевой аминогруппы с помощью гидрогенолиза над 10% палладием на активированном угле в этаноле при нормальном давлении. После удаления катализатора путем фильтрования, концентрирования, очистки с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=434 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L99

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-бета-аланил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего, 2-(триметилсилил)этил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов. Это промежуточное соединение затем сочетали в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с трипептидной единицей N[-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланил-бета-аланином, полученным с помощью стандартных методов. Защитную группу Z затем удаляли с помощью гидрогенолиза в метаноле и полученное промежуточное соединение сочетали с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N диизопропилэтиламина. На последней стадии с аминогруппы боковой цепи снимали защиту в мягких условиях путем перемешивания в 10% трифторуксусной кислоте в ДМФА при КТ в течение 1 ч. После концентрирования и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=625 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L100

3-[5-(2-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановая кислота

К раствору метил 3-цианопропаноата (4 г, 35.4 ммоль) в 120 мл этанола добавляли 3.69 г (53 ммоль) гидрохлорида гидроксиламина и 15 мл (110 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате и затем промывали водой и солевым раствором. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 5 г (97% от теории) метил (4Z)-4-амино-4-(гидроксиимино)бутаноата.

К раствору метил (4Z)-4-амино-4-(гидроксиимино)бутаноата (4.85 г, 33.19 ммоль) в 120.0 мл диоксана добавляли 6.91 г (36.50 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина и 8.22 г (39.82 ммоль) 1,3-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь концентрировали и остаток растворяли в воде и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии. Это приводило к получению 6.0 г (57% от теории) метил (4E)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата.

Раствор метил (4Е)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата (6.0 г, 18.9 ммоль) в 100 мл ДМФА перемешивали при 120°С в течение 5 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 4 г (71% от теории) метил 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропаноата.

К раствору метил (4Е)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата (4.00 г, 13.4 ммоль) в 60 мл ТГФ добавляли раствор LiOH (1.60 г, 66.8 ммоль) в 10 мл воды. Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. К смеси примешивали воду и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 3.60 г (87% от теории) 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропановой кислоты.

К раствору 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропановой кислоты (2.0 г, 7.01 ммоль) в 30 мл дихлорметана добавляли 2.0 мл (26 ммоль) трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 1.50 г (72% от теории) соединения 3-[5-(2-аминоэтил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановая кислота/трифторуксусная кислота (1:1).

К раствору 3-[5-(2-аминоэтил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановой кислоты (1.5 г, 5.01 ммоль) в 25 мл ДМФА добавляли 1.30 г (5.52 ммоль) 1-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2-оксоэтил]-1Н-пиррол-2,5-диона и 1.52 г (15.04 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 774 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=2.67 (t, 2Н), 2.91 (t, 2Н), 3.03 (t, 2Н), 3.46 (q, 2Н), 4.28 (s, 2Н), 7.01 (s, 2Н), 8.37 (t, 1Н), 12.28 (bs, 1Н).

Промежуточное соединение L101

трет-Бутил L-аланил-L-аланил-L-аспарагинат

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с гидрохлоридом трет-бутил L-аспарагината с последующим гидрогенолитическим отщеплением защитной группы Z над 10% палладием на активированном угле в метаноле.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=0.23 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=329 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L102

N-(38-Оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-ил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

215 мг 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-овой кислоты (365 мкмоль) и 133 мг Промежуточного соединения L101 (402 мкмоль) сначала загружали в 1.4 мл ДМФА, добавляли 146 мг HATU (384 мкмоль) и 160 мкл N,N-диизопропилэтиламина (910 мкмоль) и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли воду (1.5 мл) и ACN (0.5 мл). Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент = 1:9→3:2) с последующим отщеплением бутоксикарбонильной защитной группы с помощью 2 мл ТФУ в 2 мл ДХМ (путем перемешивания при КТ в течение 3 ч).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.56 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=844.5 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L103

Трифторацетат N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов начиная с сочетания 4-пиридинуксусной кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты, сочетанием с трет-бутил L-аспарагинатом и последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=394 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L104

Трифторацетат N-изоникотиноил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали по аналогии с промежуточным соединением L103, начиная с сочетания изоникотиновой кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=380 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L105

Трифторацетат трет-бутил N-{[2-(2-метоксиэтокси)этокси]ацетил}-L-аланил-L-аланил-L-аспарагината (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали по аналогии с промежуточным соединением L103, начиная с сочетания [2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=380 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L106

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с 1-трет-бутил 4-[2-(триметилсилил)этил]-L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Эту аминокислотную единицу получали из (3S)-4-трет-бутокси-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутановой кислоты путем этерификации 2-(триметилсилил)этанолом в присутствии EDCI и DMAP и последующего мягкого удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы с помощью 5% трифторуксусной кислоты в ДХМ. Затем, 745 мг (1.317 ммоль) полностью защищенного промежуточного соединения растворяли в 43.5 мл ДХМ и сложный трет-бутиловый эфир мягко гидролизовали путем добавления 3.5 мл трифторуксусной кислоты и перемешивания при КТ в течение 5 часов. Из полученной смеси продуктов после очистки с помощью препаративной ВЭЖХ выделяли 168 мг (25% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=510 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L107

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, последующего снятия защиты - защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол над 10% палладием на активированном угле, и последующего ацилирования 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и в заключение снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.35 мин; МС (ESI положит.): m/z=412 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L108

N²-Ацетил-N-(2-аминоэтил)-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания коммерчески доступного N²-ацетил-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина с гидрохлоридом бензил (2-аминоэтил)карбамата (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=331 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L109

N²-Ацетил-N⁶-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизин

Это промежуточное соединение получали по реакции коммерчески доступного N²-ацетил-L-лизина с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода 1:1 в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=333 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L110

N²-Ацетил-N⁶-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Синтез указанного в заголовке соединения начинали с сочетания N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина и трет-бутил L-аспарагината в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при нормальном давлении. Затем, промежуточное соединение со снятой защитой сочетали с Промежуточным соединением L109 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Вслед за этим выполняли полное снятие защиты путем перемешивания в 7.5% растворе трифторуксусной кислоты в ДХМ в течение 1 ч. На последней стадии указанное в заголовке соединение получали путем повторной защиты свободной аминогруппы по реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода 1:1 в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=589 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L111

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение синтезировали классическими методами химии пептидов начиная с HATU сочетания N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланина с гидрохлоридом трет-бутил N-метил-L-аланината (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. Вслед за этим выполняли сочетание с трет-бутил L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем гидролитическое отщепление защитной группы Z в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода. В заключение, полученное промежуточное соединение превращали в указанное в заголовке соединение путем сочетания с 4-пиридинуксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.16 мин; МС (ESI положит.): m/z=408 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L112

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение синтезировали классическими методами химии пептидов начиная с HATU сочетания N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланина с гидрохлоридом трет-бутил N-метил-L-аланината (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. Вслед за этим выполняли сочетание с трет-бутил L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем гидролитическое отщепление защитной группы Z в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода. В заключение, полученное промежуточное соединение превращали в указанное в заголовке соединение путем сочетания с 1-ацетоксипирролидин-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.16 мин; МС (ESI положит.): m/z=331 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L113

N-Метил-N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение синтезировали классическими методами химии пептидов начиная с HATU сочетания пиридин-4-илуксусной кислоты с гидрохлоридом трет-бутил N-метил-L-аланината (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. Вслед за этим выполняли сочетание с трет-бутил L-аланинатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и повторное снятие защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. Затем осуществляли сочетание с трет-бутил L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение снятие защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. После ВЭЖХ очистки получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.16 мин; МС (ESI положит.): m/z=408 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L114

N-{[2-(2-Метоксиэтокси)этокси]ацетил}-L-аланил-N-метил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение синтезировали классическими методами химии пептидов начиная с HATU сочетания N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланина с гидрохлоридом трет-бутил N-метил-L-аланината (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ. Вслед за этим выполняли сочетание с трет-бутил L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем гидролитическое отщепление защитной группы Z в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода. В заключение, полученное промежуточное соединение превращали в указанное в заголовке соединение путем сочетания с [2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=449 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L115

Трифторуксусная кислота / дибензил бета-аланил-L-глутамат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали исходя из коммерчески доступного соединения 4-метилбензолсульфоновая кислота / дибензил L-глутамат (1:1) классическими методами химии пептидов путем сочетания с N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланином в присутствии HATU, и в заключение отщепления Boc защитной группы с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.72 мин; МС (ESI положит.): m/z=399 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F2

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]бутанамид (1:1)

55 мг (0.089 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты (Промежуточное соединение С5) вносили в 12 мл ДМФА, и последовательно добавляли 68 мг (0.268 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1), 34.3 мг (0.18 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 27.4 мг (0.18 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 47 мкл (0.27 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали с получением после лиофилизации из 1,4-диоксана 20 мг (30% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.48 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.29 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

20 мг (0.027 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 5 мл дихлорметана, добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь затем концентрировали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Таким путем получали 19 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=637 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.28 (t, 1Н), 7.9-8.1 (m, 3Н), 7.7-7.8 (m, 2Н), 7.2-7.4 (m, 6Н) 7.0-7.1 (m, 3Н), 5.7 (s, 1Н), 5.0 и 5.3 (2d, 2Н), 4.08 и 4.25 (2d, 2Н), 3.3-3.65 (m, 5Н), 3.1-3.25 (m, 2Н), 0.75 и 1.45 (2m, 2Н), 0.9 (s, 9Н).

Промежуточное соединение F3

Трифторуксусная кислота / N-[(3S)-3-амино-4-{2-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]гидразино}-4-оксобутил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

13 мг (0.021 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты (Промежуточное соединение С5) вносили в 5 мл ДМФА, и затем добавляли 33 мг (86 мкмоль) гексафторфосфата O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония, 15 мкл N,N-диизопропилэтиламина и 22 мг (64 мкмоль) коммерчески доступного 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексангидразида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь затем концентрировали в высоком вакууме и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 9.5 мг (53% от теории) защищенного промежуточного соединения в виде бесцветной пены.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.1 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=822 (М+Н)⁺.

9.5 мг (0.011 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 3 мл дихлорметана, добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Реакционную смесь затем концентрировали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Таким путем получали 7 мг (70% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.75 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=722 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F4

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(6-{[(2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}гексил)бутанамид (1:1)

Прежде всего 30 мг (0.049 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты (Промежуточное соединение С5) сочетали аналогично Промежуточному соединению F3 с соединением трифторуксусная кислота / 9Н-флуорен-9-илметил-(6-аминогексил)карбамат (1:1) в присутствии HATU. Затем Fmoc защитную группу удаляли с помощью пиперидина в соответствии со стандартными методами. Этот аминный компонент затем, в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, сочетали с (2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил хлоридом, который был получен из свободной кислоты с использованием тионилхлорида. На последней стадии Вое защитную группу удаляли трифторуксусной кислотой в ДХМ. Это приводило к получению 1.1 мг (3% за 4 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.83 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=764 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F5

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(пропионил)амино]-N-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этил}бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 16 мг (0.026 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 8.5 мг (0.03 ммоль) Промежуточного соединения L12. Это приводило к получению 3 мг (13% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=681 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F6

Трифторуксусная кислота / N-[(16S)-16-амино-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-12,15-диоксо-3,6,9-триокса-13,14-диазаоктадекан-18-ил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

8 мг (12.7 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-гидразино-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1) (Промежуточное соединение С6) вносили в 8 мл ДМФА и добавляли 6 мг (19 мкмоль) коммерчески доступной 3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропановой кислоты, 5.8 мг (15 мкмоль) гексафторфосфата O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония (HATU) и 7 мкл (38 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 15 мин. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении и остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 1:1 и доводили до рН 2 с помощью трифторуксусной кислоты. Очистку осуществляли с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций, концентрирования и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводило к получению 5 мг (41% от теории) Вос-защищенного промежуточного соединения. Удаление Boc группы с помощью трифторуксусной кислоты приводило к получению 4 мг (32% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.89 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=812 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F7

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 25 мг (0.037 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 35 мг (0,112 ммоль) Промежуточного соединения L1. Это приводило к получению 14.4 мг (29% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=694 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.2 (m, 1Н), 7.9-8.1 (m, 3Н), 7.7-7.8 (m, 2Н), 7.2-7.4 (m, 6Н), 7.0-7.12 (m, 3Н), 5.7 (m, 1H), 4.95 и 5.3 (2d, 2Н), 4.1 и 4.25 (2d, 2Н), 4.0 (s, 2Н), 3.3-3.65 (m, 5Н), 3.0-3.15 (m, 2Н), 0.7 и 1.45 (2m, 2Н), 0.88 (s, 9Н).

Промежуточное соединение F8

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N6-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 10 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 13 мг (0.018 ммоль) Промежуточного соединения L6. Это приводило к получению 10 мг (49% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.97 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=1006 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F9

Трифторуксусная кислота / N-{(3S)-3-амино-4-[1-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)гидразино]-4-оксобутил }-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 1.5 мг (0.002 ммоль) Промежуточного соединения С7 и 0.95 мг (0.004 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1). Это приводило к получению 1.1 мг (52% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t - 0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=709 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F10

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]амино}-3-оксопропил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 14 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 10 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения L5. Это приводило к получению 4.5 мг (22% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=756 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F11

Трифторуксусная кислота / N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)циклогексанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 12 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 10 мг (0.021 ммоль) Промежуточного соединения L4. Это приводило к получению 7 мг (38% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.04 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=776 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F12

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 43 мг (0.071 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 30 мг (0.071 ммоль) Промежуточного соединения L2. На стадии Вос-защищенного промежуточного соединения образованные диастереомеры разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (Chromatorex С18-10 / 125×30 / 12 мл/мин). Стереохимию разделенных диастереомеров устанавливали путем сравнения с индивидуальным диастереомером, полученным аналогичным образом из коммерчески доступной (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты:

Фракция 1: 1S2R диастереомер

Выход: 13 мг (22%)

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.52 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=848 (М+Н)⁺.

Фракция 2: 1R2S диастереомер

Выход: 10 мг (17%)

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.56 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=848 (М+Н)⁺.

Снятие защиты с 10 мг (0.011 ммоль) 1R2S диастереомера с помощью ТФУ затем приводило к получению 8 мг (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.04 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (ESI положит.): m/z=748 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F13

Трифторуксусная кислота / (1S,2R)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Синтез проводили аналогично Промежуточному соединению F13 и указанное в заголовке соединение получали путем снятия защиты с 1S2R диастереомера.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.1 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=748 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F14

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 20 мг (0.028 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 18 мг (0.028 ммоль) Промежуточного соединения L7 в присутствии HATU и последующего деблокирования с помощью ТФУ. Это приводило к получению 15 мг (49% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.97 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=1012 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F15

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-аланил-N5-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали путем сочетания 15 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения С8 и 14 мг (0.026 ммоль) Промежуточного соединения L8 в присутствии HATU и последующего деблокирования с помощью ТФУ. Это приводило к получению 7 мг (27% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.85 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=984 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F16

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-N5-карбамоил-N-[4-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Прежде всего 20 мг (0.03 ммоль) Промежуточного соединения С3 сочетали аналогично Промежуточному соединению F3 с соединением трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-валил-N5-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1) (Промежуточное соединение L9) в присутствии HATU (выход: 15 мг (44% от теории).

26 мг (0.023 ммоль) этого промежуточного соединения N-{(2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-N5-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамида растворяли в 5 мл метанола, добавляли 1 мл 2М раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 90 мин. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении, остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода и смесь доводили до рН 2, используя ТФУ. Смесь затем концентрировали снова с получением после очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ 20 мг (81%) карбоксильного соединения.

Это промежуточное соединение затем вносили в 5 мл ДМФА и сочетали с 6 мг (0.022 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 8.4 мг (0.022 ммоль) HATU и 16 мкл Ы,]ч[-диизопропилэтиламина. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 17 мг (76% от теории) защищенного промежуточного соединения. Его вносили в 3 мл ДХМ и добавляли 1 мл ТФУ. После 45 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток дигерировали с диэтиловым эфиром. Осуществление фильтрования с отсасыванием и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 15 мг (81%) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=1097 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F17

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин/трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F12 из 6 мг (0.01 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 8 мг (0.01 ммоль) Промежуточного соединения L10. На стадии Вос-защищенного промежуточного соединения образованные диастереомеры разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (Chromatorex С18-10 / 125×30 / 12 мл/мин). Стереохимию разделенных диастереомеров устанавливали путем сравнения с индивидуальным диастереомером, полученным аналогичным образом из коммерчески доступной (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты:

Фракция 1: 1S2R диастереомер

Выход: 1 мг

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.73 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=1274 (М+Н)⁺.

Фракция 2: 1R2S диастереомер

Выход: 0.7 мг

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.81 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=1274 (М+Н)⁺.

Полного снятия защиты с 0.7 мг (0.001 ммоль) 1R2S диастереомера добивались с помощью растворения в 1 мл ДХМ, добавления 1 мл ТФУ и 1 ч перемешивания при КТ. Осуществление концентрирования при пониженном давлении и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 0.68 мг (94% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.1 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=1117 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F18

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1S,2R)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин/трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F17 из 8.9 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения С5 и 13 мг (0,014 ммоль) Промежуточного соединения L11.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=1117 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F19

N⁶-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-N²-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-лизин/трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 путем сочетания 25 мг (0.041 ммоль) Промежуточного соединения С5 с 55 мг (0.122 ммоль) Промежуточного соединения L13 и последующего снятия защиты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.84 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=780 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F20

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{4-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]пиперазин-1-ил}бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 путем сочетания 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С5 с 55 мг (0.122 ммоль) Промежуточного соединения L14 и последующего снятия защиты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=735 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F21

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-12-оксо-3,6,9-триокса-13-азапентадекан-15-ил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 путем сочетания 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С5 с 7 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения L15 и последующего снятия защиты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=840 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F22

Трифторуксусная кислота / N-[(3S)-3-амино-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-2-оксоэтил}гидразино)-4-оксобутил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F9 путем сочетания 13.7 мг (0.017 ммоль) Промежуточного соединения С7 с 5.9 мг (0.017 ммоль) Промежуточного соединения L1 и последующего снятия защиты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.3 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.2 мин; МС (ESI положит.): m/z=866 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F23

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-N⁶-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин/трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 путем сочетания 10 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С5 с 16.8 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения L17 в присутствии EDC/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=1092 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F24

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Получение указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F16:

Прежде всего 30 мг (0.046 ммоль) Промежуточного соединения С3 сочетали аналогично Промежуточному соединению F3 с Промежуточным соединением L18 в присутствии HATU (выход: 25 мг (47% от теории)).

27 мг (0.024 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 5 мл метанола, добавляли 1 мл 2М раствора гидроксида лития и смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, что приводило к расщеплению обеих групп - группы сложного метилового эфира и ацетильной группы. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении, остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода и смесь доводили до рН 2, используя ТФУ. Смесь затем концентрировали снова с получением после очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ 15 мг (58%) карбоксильного соединения.

Это промежуточное соединение затем вносили в 3 мл ДМФА и сочетали с 4.4 мг (0.017 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 6.5 мг (0.017 ммоль) HATU и 12 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 12 мг (72% от теории) защищенного промежуточного соединения. Его вносили в 2 мл ДХМ и добавляли 1 мл ТФУ. После 30 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Сушка остатка в высоком вакууме приводила к получению 11 мг (91%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=1069 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F25

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}фенил)-L-орнитинамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали путем сочетания 9.6 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения С8 с 10.8 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения L19 в присутствии 6.4 мг (0.017 ммоль) HATU и 72 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего деблокирования с помощью ТФУ. Это приводило к получению 5 мг (31% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.8 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=1041 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F26

Трифторуксусная кислота / N-{(15S,19R)-15-амино-19-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-18-гликолоил-20,20-диметил-14-оксо-4,7,10-триокса-13,18-диазагеникозан-1-оил}-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали путем сочетания 16.4 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения С9 с 11.2 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения L20 в присутствии 8 мг (0.04 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 6 мг (0.04 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 11 мкл (0.06 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и последующего деблокирования с помощью ТФУ. Это приводило к получению 10 мг (37% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=1144 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F27

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-N-[4-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)фенил]-L-лизинамид (2:1)

Это промежуточное соединение получали за 4 стадии:

На первой стадии 20 мг (0.028 ммоль) Промежуточного соединения С8 сочетали с 16.7 мг (0.031 ммоль) Промежуточного соединения L21 в присутствии 11 мг (0.057 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 8.7 мг (0.057 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 15 мкл (0.085 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА. После 4 дней перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 18 мг (54.5% от теории).

18 мг (0.016 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 4 мл метанола, добавляли 194 мкл 2М раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Затем добавляли еще 116 мкл раствора гидроксида лития, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 4 ч. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении, остаток вносили в воду и реакционную смесь затем доводили до рН 5 с помощью раствора лимонной кислоты 5% концентрации. Смесь два раза экстрагировали дихлорметаном и органическую фазу сушили над сульфатом натрия. Органическую фазу затем фильтровали и концентрировали и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.5 мг (58%) карбоксильного соединения.

10.5 мг (0.009 ммоль) этого промежуточного соединения затем вносили в 4 мл ДМФА и сочетали с 3 мг (0.012 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 3.5 мг (0.018 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 2.8 мг (0.018 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 6 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания в течение ночи, такое же количество реагентов сочетания добавляли снова и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 3 дней. Смесь затем концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 6 мг (52% от теории).

С 6 мг (0.005 ммоль) этого промежуточного соединения затем снимали защиту в 3 мл ДХМ с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 6 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.84 мин;

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=1068 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F28

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил}амино)-L-фенилаланин/трифторуксусная кислота (1:1)

Это промежуточное соединение получали за 5 стадий:

На первой стадии 40 мг (0.058 ммоль) Промежуточного соединения С8 сочетали с 46 мг (0.058 ммоль) Промежуточного соединения L22 в присутствии 44.3 мг (0.117 ммоль) HATU и 30 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 53 мг (62.5% от теории).

На следующей стадии Fmoc группу удаляли с помощью 0.6 мл пиперидина в 3 мл ДМФА. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 42 мг (82%) от теории).

Для расщепления сложного метилового эфира, 42 мг (0.033 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 2 мл ТГФ и 1 мл воды, добавляли 330 мкл 2М раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь затем нейтрализовали с помощью ТФУ и концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 32 мг (78%) карбоксильного соединения.

32 мг (0.026 ммоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в 2.3 мл ДМФА с 14.6 мг (0.047 ммоль) коммерчески доступного 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1H-пиррол-2,5-диона в присутствии 18 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 4-часовой обработки в ультразвуковой бане, реакционную смесь концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 20.4 мг (60% от теории).

На последней стадии с этого промежуточного соединения массой 20.4 мг (0.016 ммоль) в ДХМ снимали защиту с помощью трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 20 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-MC (Метод 5): R_t=2.84 мин; MC (ESI положит.): m/z=1197 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F29

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}амино)-L-фенилаланин / трифторуксусная кислота (1:1)

Получение указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F28.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.0 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.92 мин; MC (ESI положит.): m/z=1111 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F30

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)сульфинил]этил}бутанамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали за 4 стадии:

На первой стадии 37.5 мг (0.055 ммоль) Промежуточного соединения C3 сочетали с 15 мг (0.066 ммоль) коммерчески доступного гидрохлорида метил 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]пропаноата (1:1) в ДМФА в присутствии 25 мг (0.066 ммоль) HATU и 29 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 15 мин перемешивания при КТ, реагенты сочетания добавляли снова. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение еще 15 мин и затем концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Выход: 21 мг (48% от теории).

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.41 мин; MC (ESI положит.): m/z=802 (M+H)⁺.

Для расщепления сложного метилового эфира, 21 мг (0.026 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 5 мл метанола, добавляли 655 мкл 2М раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. В течение этого времени имело место частичное окисление атома серы. Реакционную смесь концентрировали и остаток вносили в воду и затем доводили до pH 3 с помощью уксусной кислоты. Смесь два раза экстрагировали 50 мл этилацетата и органическую фазу затем сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Смесь, полученную после сушки остатка в высоком вакууме, использовали без дополнительной очистки на следующей стадии для сочетания с 8.4 мг (0.033 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 11.6 мг (0.031 ммоль) HATU и 22 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин и затем концентрировали. Остаток вносили в этилацетат и раствор экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и затем водой. Органическую фазу затем сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Смесь, полученную после сушки остатка в высоком вакууме, использовали без дополнительной очистки на следующей стадии.

22 мг этого сырого вещества затем растворяли в 2 мл ДХМ и защиту удаляли с помощью 0.5 мл трифторуксусной кислоты. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 2.1 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.8 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.83 мин; MC (ESI положит.): m/z=784 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F31

Трифторуксусная кислота / N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-(3-{[2-{(1R)-1-[(3-аминопропил)(гликолоил)амино]-2,2-диметилпропил}-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-1-ил]метил}фенил)-L-аланинамид (1:1)

Это промежуточное соединение синтезировали из Промежуточного соединения C10 за 6 стадий, используя классические методы химии пептидов.

На первой стадии 42 мг (0.066 ммоль) Промежуточного соединения C10 сочетали с 20.7 мг (0.066 ммоль) N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-аланина в 5 мл ДМФА в присутствии 100 мг (0.266 ммоль) HATU и 46 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 16 мг (27% от теории) N-ацилированного соединения и 9 мг (12% от теории) N-, O-бисацилированного соединения.

Снятие защиты N-ацилированного соединения проводили в ДМФА с помощью пиперидина. Бисацилированное соединение обрабатывали в этаноле как пиперидином, так и водным раствором метиламина. В обоих случаях образовывался трет-бутил (3-{[(1R)-1-{1-[3-(L-аланиламино)бензил]-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил}-2,2-диметилпропил](гликолоил)амино}пропил)карбамат, и очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 13 мг продукта с чистотой 95%.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.95 мин; MC (ESI положит.): m/z=657 (M+H)⁺.

13 мг (0.019 ммоль) этого промежуточного соединения в 2 мл ДМФА сочетали с 9.1 мг (0.021 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валината в присутствии 7 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 20 ч, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси 1,4-диоксан/вода приводила к получению 10 мг (54% от теории) продукта.

Последующее удаление Fmoc защитной группы с помощью пиперидина в ДМФА приводило к получению 9 мг (колич.) промежуточного соединения с частично снятой защитой.

9 мг (0.01 ммоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в 2 мл ДМФА с 3.2 мг (0.01 ммоль) коммерчески доступного 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1H-пиррол-2,5-диона в присутствии 5 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение ночи, реакционную смесь концентрировали и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода и нескольких капель 1,4-диоксана приводила к получению 3 мг (32% от теории) продукта, с которого на последней стадии снимали защиту в 2 мл ДХМ с помощью 0.5 мл трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 3.8 мг (колич.) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.89 мин; MC (ESI положит.): m/z=849 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F32

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)бутанамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали путем сочетания 15 мг (0,041 ммоль) Промежуточного соединения C5 с 16.8 мг (0.027 ммоль) Промежуточного соединения L23 в присутствии 10.5 мг (0.055 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 8.4 мг (0,055 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазол гидрата и 14 мкл (0.08 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и последующего деблокирования с помощью ТФУ. Это приводило к получению 3.4 мг (15% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.85 мин; MC (ESI положит.): m/z=708 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F33

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[(бромацетил)амино]этил}бутанамид (1:1)

Синтез этого промежуточного соединения начинали на первой стадии с сочетания 50 мг (0.075 ммоль) Промежуточного соединения C3 с 26.2 мг (0.082 ммоль) гидрохлорида 9H-флуорен-9-илметил (2-аминоэтил)карбамата (1:1) в присутствии 28.7 мг (0.15 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 22.9 мг (0.15 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 39 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 18 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 45 мг (65% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.51 мин; MC (ESI положит.): m/z=921 (M+H)⁺.

45 мг (0.049 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 10 мл этанола и добавляли 176 мкл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°C с добавлением такого же количества раствора метанамина спустя 6 ч и спустя 9 ч. После перемешивания в течение еще 14 ч при 50°C, добавляли еще 700 мкл раствора метанамина, и после дополнительных 20 ч перемешивания смесь в заключение концентрировали. Остаток вносили в ДХМ и промывали водой. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 32 мг (99% от теории) трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.95 мин; MC (ESI положит.): m/z=657 (M+H)⁺.

8.3 мг (0.013 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 4 мл дихлорметана и добавляли 3.3 мг (0.013 ммоль) ангидрида бромуксусной кислоты и 2 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Остаток вносили в 1 мл дихлорметана и защиту удаляли с помощью 0.5 мл трифторуксусной кислоты. Осуществление концентрирования и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 1.1 мг (9% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.88 мин; MC (ESI положит.): m/z=677/679 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F34

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Это промежуточное соединение получали путем сочетания 14 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения C5 с 12.7 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L8 в присутствии 9.9 мг (0.026 ммоль) HATU и 19 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и затем лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода.

Полученное промежуточное соединение вносили в 3 мл дихлорметана и деблокировали с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты. После 30 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 8.2 мг (36% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.8 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.87 мин; MC (ESI положит.): m/z=913 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F35

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид

В атмосфере аргона и при 0°C 57.3 мг (0.07 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L38), 9.2 мг (0.07 ммоль) HOAt и 32 мг (0.08 ммоль) HATU добавляли к 31.8 мг (0.07 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40) в 4.0 мл ДМФА. Затем добавляли 23.5 мкл (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 7.7 мкл HOAc, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 33.4 мг (38% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.12 мин; MC (ESI положит.): m/z=651 [M+2H]²⁺.

Промежуточное соединение F36

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично получению Промежуточного соединения F35.

15.4 мг (0.03 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40).

25.0 мг (0.03 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L25).

Это приводило к получению 10.7 мг (27% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.13 мин; MC (ESI положит.): m/z=1215 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F37

Трифторуксусная кислота / N-(4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-3-ил)-31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-амид (1:1)

Смесь диастереомеров.

Соединение трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-{[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]амино}пирролидин-1-карбоксилат получали аналогично синтезу Промежуточного соединения C21.

8.0 (0.01 ммоль) и 13.0 мг (0.02 ммоль), соответственно, трет-бутил 3-амино-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение C23).

9.0 мг (0.01 ммоль) и 14.7 мг (0.02 ммоль), соответственно, 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-]-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида.

Выход (объединенный для обеих реакций):

10.5 мг (42%) диастереомера 1

11.6 мг (46%) диастереомера 2

Указанное в заголовке соединение получали аналогично синтезу Промежуточного соединения F38.

10.5 мг (0.01 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-{[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]амино}пирролидин-1-карбоксилата (Диастереомер 1).

60.6 мг (0.54 ммоль) ТФУ.

Это приводило к получению 7.4 мг (70% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.09 мин; MC (ESI положит.): m/z=1086 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F38

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-7,35-диоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3-тиа-6,34-диазагептатриаконтан-1-амид (1:1)

24.8 мг (0.02 ммоль) трет-бутил [38-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,31,37-триоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-35-тиа-4,32,38-триазагентетраконтан-41-ил]карбамата (Промежуточное соединение C21) сначала загружали в 1.0 мл дихлорметана и добавляли 85.8 мг (0.75 ммоль) ТФУ. Смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 23.0 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.96 мин; MC (ESI положит.): m/z=1104 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F39

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали аналогично синтезу Промежуточного соединения F35.

56.1 мг (0.10 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L44).

45.0 мг (0.10 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40).

Это приводило к получению 20.9 мг (21% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.16 мин; MC (ESI положит.): m/z=1040 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F40

Трифторуксусная кислота / N-[(4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-3-ил)метил]-31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-амид (1:1)

трет-Бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-[33-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,31-диоксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-2,30-диазатритриаконт-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат получали аналогично синтезу Промежуточного соединения C21.

25.0 мг (0.04 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-(аминометил)-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат (1:1) (Промежуточное соединение C24).

27.6 мг (0.04 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида.

Выход: 20.6 мг (39% от теории)

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.23 мин; MC (ESI положит.): m/z=1200 [M+H]⁺.

Указанное в заголовке соединение получали аналогично синтезу Промежуточного соединения F37.

26.1 мг (0.02 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-[33-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,31-диоксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-2,30-диазатритриаконт-1-ил]пирролидин-1-карбоксилата.

90.6 мг (0.80 ммоль) ТФУ.

Это приводило к получению 22.9 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.91 и 0.92 мин; MC (ESI положит.): m/z=1100 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F41

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-37-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-7,35-диоксо-10,13,16,19,22,25,28,31-октаокса-3-тиа-6,34-диазагептатриаконтан-1-амид 3-оксид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F38 из 15.5 мг (0.01 ммоль) Промежуточного соединения C22. Это приводило к получению 4.0 мг (27% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.90 мин; MC (ESI положит.): m/z=1120 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F42

Трифторуксусная кислота / 4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]пирролидин-3-карбоксамид (1:1)

40.5 мг (0.06 ммоль) 4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-карбоновой кислоты (Промежуточное соединение C25) и 14.5 мг (0.08 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 1.0 мл ацетонитрила и добавляли 64.4 мг (0.51 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 50.0 мг (0.08 ммоль) T3P, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Такое же количество гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-диона (1:1), N,N-диизопропилэтиламина и T3P добавляли снова, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 4 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.2 мг (15% от теории) соединения трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]карбамоил}пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.30 мин; MC (ESI положит.): m/z=763 [M+H]⁺.

7.2 мг (0.01 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]карбамоил}пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 1.0 мл дихлорметана и добавляли 43.0 мг (0.38 ммоль) ТФУ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.5 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.92 мин; MC (ESI положит.): m/z=663 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F43

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид

22.4 мг (0.03 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L42) растворяли в 2.0 мл ДМФА и добавляли 4.5 мг (0.03 ммоль) HOAt, 15.8 мг (0.04 ммоль) HATU и 15.7 мг (0.03 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40). Добавляли 8.6 мг (0.07 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 16.7 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 4): R_t=1.34 мин; MC (ESI положит.): m/z=1125 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F44

Трифторуксусная кислота / N-[(4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-3-ил)метил]-19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-амид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично синтезу Промежуточного соединения F40.

25.0 мг (0.04 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-(аминометил)-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат (1:1) (Промежуточное соединение C24).

20.5 мг (0.04 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида.

Это приводило к получению 21.8 мг (48% от теории) соединения трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-[21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,19-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-2,18-диазагеникоз-1-ил]пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.22 мин; MC (ESI положит.): m/z=1025 [M+H]⁺.

21.0 мг (0.02 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-4-[21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,19-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-2,18-диазагеникоз-1-ил]пирролидин-1-карбоксилата.

168.3 мг (1.48 ммоль) ТФУ.

Это приводило к получению 17.3 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.92 и 0.94 мин; MC (ESI положит.): m/z=924 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F45

Трифторуксусная кислота / N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-лизинамид (1:1)

Синтез проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения F46.

22.9 мг (0.05 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40).

36.2 мг (0.05 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина (Промежуточное соединение L41).

Это приводило к получению 19.8 мг (34%) соединения N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамида.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.20 мин; MC (ESI положит.): m/z=1196 [M+H]⁺.

17.0 мг (0.01 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамида.

Это приводило к получению 13.6 мг (79% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.94 мин; MC (ESI положит.): m/z=1096 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F46

Трифторуксусная кислота / N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-лизинамид (1:1)

В атмосфере аргона и при 0°C 49.0 мг (0.05 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина (Промежуточное соединение L40), 7.3 мг (0.05 ммоль) HOAt и 25.3 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к 25.1 мг (0.05 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40) в 2.0 мл ДМФА. Затем добавляли 18.6 мкл (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 29.2 мг (37% от теории) соединения N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-(3-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамида.

ЖХ-MC (Метод 4): R_t=1.51 мин; MC (ESI положит.): m/z=1372 [M+H]⁺.

25.2 мг (0.02 ммоль) N-{-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамида сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 83.7 мг (0.73 ммоль) ТФУ. Реакционный раствор перемешивали при КТ в течение 48 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 24.5 мг (96% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.95 мин; MC (ESI положит.): m/z=1272 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F47

N-[67-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-65-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-икосаокса-64-азагептагексаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид

15.2 мг (0.01 ммоль) N-[67-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-65-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-икосаокса-64-азагептагексаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L43) растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 1.5 мг (0.01 ммоль) HOAt, 5.2 мг (0.01 ммоль) HATU и 5.2 мг (0.01 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение C40). Добавляли 2.9 мг (0.02 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 6.8 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 4): R_t=1.37 мин; MC (ESI положит.): m/z=1831 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F48

Трифторуксусная кислота / N1-(3-аминопропил)-N1-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-N18-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-6,9,12,15-тетраокса-3-тиаоктадекан-1,18-диамид (1:1)

16.1 мг (0.02 ммоль) трет-бутил [22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазапентакозан-25-ил]карбамата (Промежуточное соединение C18) сначала загружали в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 26 мкл (0.34 ммоль) ТФУ. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли еще 26 мкл (0.34 ммоль) ТФУ. Смесь снова перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 10.8 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.98 мин; MC (ESI положит.): m/z=857 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F49

(25S)-25-Амино-22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазагексакозан-26-овая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез соединения трет-бутил (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноата проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения C16.

50.0 мг (0.08 ммоль) Промежуточного соединения C2.

20.3 мг (0.18 ммоль) хлорацетилхлорида.

19.0 мг (0.19 ммоль) триэтиламина.

Это приводило к получению 43.1 мг (77% от теории) соединения трет-бутил (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.55 мин; MC (ESI положит.): m/z=689 [M+H]⁺.

Синтез соединения (6S)-9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-6-(трет-бутоксикарбонил)-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овой кислоты проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения C17.

38.8 мг (0.06 ммоль) трет-бутил (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноата.

19.1 мг (0.07 ммоль) 1-сульфанил-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты.

45.9 мг (0.14 ммоль) карбоната цезия.

Это приводило к получению 40.7 мг (77% от теории) соединения (6S)-9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-6-(трет-бутоксикарбонил)-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овой кислоты.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.45 мин; MC (ESI положит.): m/z=935 [M+H]⁺.

Синтез соединения трет-бутил (25S)-22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-25-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазагексакозан-26-оата проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения C18.

37.4 мг (0.04 ммоль) (6S)-9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-6-(трет-бутоксикарбонил)-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овой кислоты.

9.2 мг (0.05 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-диона (1:1).

Это приводило к получению 23.4 мг (49% от теории) соединения трет-бутил (25S)-22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-25-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазагексакозан-26-оата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.47 мин; MC (ESI положит.): m/z=1057 [M+H]⁺.

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения F38.

20.8 мг (0.02 ммоль) трет-бутил (25S)-22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-25-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазагексакозан-26-оата.

157.0 мг (1.37 ммоль) ТФУ.

Это приводило к получению 13.0 мг (65%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.93 мин; MC (ESI положит.): m/z=901 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F50

Трифторуксусная кислота / 1-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопропанкарбоксамид (1:1)

15 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения C5 растворяли в 6.5 мл ДХМ и добавляли 19 мг (0.049 ммоль) Промежуточного соединения L24, 13 мкл N,N-диизопропилэтиламина и 10 мг (0.037 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ, получая 2.4 мг защищенного промежуточного соединения.

Затем его вносили в 1 мл ДХМ и защиту удаляли с помощью 0.1 мл трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 2.6 мг (11% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.4 мин.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.25 мин; MC (ESI положит.): m/z=819 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F51

3-{3-[(3-Амино-2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропил)сульфанил]-2,5-диоксопирролидин-1-ил}-N-[17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азагептадец-1-ил]пропанамид (Изомер 1)

10.0 мг (18.079 мкмоль) гидрохлорида N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 1) сначала загружали в 100 мкл буфера PBS (Sigma D8537) и 200 мкл ACN. Добавляли 17.1 мг (32.543 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-[17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азагептадец-1-ил]пропанамида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 14.0 мг (75% от теории) целевого соединения.

Изомер 1

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.94 мин; MC (ESI положит.): m/z=1039 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F52

3-{3-[(3-Амино-2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропил)сульфанил]-2,5-диоксопирролидин-1-ил}-N-[17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азагептадец-1-ил]пропанамид (Изомер 2)

6.5 мг (10.694 мкмоль, ЖХ/MC чистота = 91%) гидрохлорида N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 2) сначала загружали в 100 мкл буфера PBS (Sigma D8537) и 200 мкл ACN. Добавляли 10.1 мг (19.249 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-[17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-15-оксо-4,7,10-триокса-14-азагептадец-1-ил]пропанамида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 5.0 мг (45% от теории) целевого соединения.

Изомер 2

ЖХ-MC (Метод 5): R_t=2.87 мин; MC (ESI положит.): m/z=1039 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F53

N-{3-Амино-2-[({1-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бутил]-2,5-диоксопирролидин-3-ил}сульфанил)метил]пропил}-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (Изомер 1)

10.0 мг (18.079 мкмоль) гидрохлорида N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 1) сначала загружали в 200 мкл буфера PBS (Sigma D8537) и 400 мкл ACN. Добавляли 8.1 мг (32.543 мкмоль) 1,1'-бутан-1,4-диилбис(1Н-пиррол-2,5-диона), и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 300 мкл ДМФА, и смесь перемешивали в течение дополнительных 1.5 ч. Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 4.0 мг (29% от теории) целевого соединения.

Изомер 1

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.97 мин; MC (ESI положит.): m/z=765 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F54

N-{3-Амино-2-[({1-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)бутил]-2,5-диоксопирролидин-3-ил}сульфанил)метил]пропил}-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (Изомер 2)

5.0 мг (9.040 мкмоль) гидрохлорида N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 2) сначала загружали в 500 мкл ДМФА. Добавляли 4.0 мг (16.271 мкмоль) 1,1'-бутан-1,4-диилбис(1Н-пиррол-2,5-диона), и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 1.1 мг (16% от теории) целевого соединения.

Изомер 2

ЖХ-MC (Метод 6): R_t=2.41 мин; MC (ESI положит.): m/z=765 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F55

N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{4-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}карбамоил]фенил}-L-аланинамид

6.5 мг (4.5 мкмоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}карбамоил)фенил]-L-аланинамида растворяли в 441 мкл дихлорметана и добавляли 44 мкл (573.1 мкмоль) трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе при КТ, вносили в воду и ACN и лиофилизировали. Это приводило к получению 5.6 мг (94% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/MC=92%) целевого соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.01 мин; MC (ESI положит.): m/z=1100.6 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F56

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[(2S)-1-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-1-оксопропан-2-ил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F50.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.9 мин; MC (EI положит.): m/z=708 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F57

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[(2R)-1-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-1-оксопропан-2-ил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F56.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.91 мин; MC (EI положит.): m/z=708 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F58

N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

16.2 мг (0.02 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1) (Промежуточное соединение C41) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 8.3 мг (0.06 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 12.6 мг (0.04 ммоль) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-диона. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.0 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.18 мин; MC (ESI положит.): m/z=852 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F82

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-{3-[{1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения F83. Используемые рацемические промежуточные соединения получали аналогично соответствующим R-изомерным промежуточным соединениям.

ЖХ-MC (Метод 2): R_t=7.07 мин; MC (EI положит.): m/z=1236 [M+Na]⁺.

Промежуточное соединение F83

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

30.0 мг (0.06 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Пример 98) и 26.1 мг (0.06 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-аланината сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 19.4 мг (0.19 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и добавляли 11.5 мг (0.19 ммоль) HOAc. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 41.9 мг (79% от теории) соединения 9H-флуорен-9-илметил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.44 мин; MC (ESI положит.): m/z=763 [M+H]⁺.

37.2 мг (0.05 ммоль) 9H-флуорен-9-илметил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 124.6 мг (1.46 ммоль) 2-аминоэтанола. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой и органическую фазу два раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 10:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 14.2 мг (50% от теории) соединения N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.92 мин; MC (ESI положит.): m/z=541 [M+H]⁺.

14.1 мг (0.03 ммоль) N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида и 11.4 мг (0.03 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валината растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 7.9 мг (0.08 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и добавляли 4.7 мг (0.08 ммоль) HOAc. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.9 мг (71% от теории) соединения N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.46 мин; MC (ESI положит.): m/z=862 (M+H)⁺.

14.9 мг (0.02 ммоль) N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 44.2 мг (0.52 ммоль) 2-аминоэтанола. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь распределяли между этилацетатом и водой и органическую фазу два раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 10:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.7 мг (52% от теории) соединения L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.92 мин; MC (ESI положит.): m/z=640 (M+H)⁺.

5.5 мг (8.6 мкмоль) L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида и 6.5 мг (6.5 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 0.9 мг (8.6 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и добавляли 0.8 мг (0.01 ммоль) HOAc. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.7 мг (74% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.10 мин; MC (ESI положит.): m/z - 1214 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F84

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)бутанамид (1:1)

Прежде всего 16.5 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения C54 вносили в 5 мл ДМФА и подвергали реакции с 10.4 мг (0.041 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 11.7 мг (0.03 ммоль) HATU и 18 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 5 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 1:1. Значение pH доводили до 2 с помощью трифторуксусной кислоты и реакционную смесь концентрировали снова. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 8 мг (42% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.38 мин; MC (EI положит.): m/z=929 [M+H]⁺.

7.6 мг (0.008 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 3 мл ДМФА и добавляли 92 мг (0.82 ммоль) 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 1 ч. Затем добавляли 31 мкл уксусной кислоты и реакционную смесь концентрировали в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 3 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.86 мин; MC (EI положит.): m/z=707 [M+H]⁺.

¹H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.15 (t, 1H), 7.9-8.1 (m, 4H), 7.6 (m, 1H), 7.5 (s, 1Н), 7.15-7.35 (m, 6Н), 6.9-7.0 (m, 3H), 6.85 (s, 1Н), 5.6 (s, 1Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2H), 4.05 и 4.2 (2d, 2H), 3.1-3.2 (m, 4H), 2.15 (m, 2H), 0.7 и 1.45 (2m, 2H), 0.8 (s, 9H).

Промежуточное соединение F85

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]бутанамид (1:1)

Прежде всего 10 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения C53 вносили в 3.4 мл ДМФА и подвергали реакции с 7 мг (0.027 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 7.8 мг (0.02 ммоль) HATU и 12 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 15 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 6.6 мг (57% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.4 мин; MC (EI положит.): m/z=858 [M+H]⁺.

6.6 мг (0.008 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 2 мл ДМФА и добавляли 86 мг (0.77 ммоль) 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 2 ч. Затем добавляли 44 мкл уксусной кислоты и реакционную смесь концентрировали в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 3.3 мг (53% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.88 мин; MC (EI положит.): m/z=636 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F86

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 8 мг (0.012 ммоль) Промежуточного соединения C51 по реакции с 4.5 мг (0.017 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 5.8 мг (0.015 ммоль) HATU и 10 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 7 мг (78% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.83 мин; MC (EI положит.): m/z=708 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F87

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 16 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения C49 по реакции с 24 мг (0.076 ммоль) Промежуточного соединения L1 в присутствии EDCI/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 3 мг указанного в заголовке соединения (14% от теории за 2 стадии).

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.88 мин; MC (EI положит.): m/z=694 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F88

Соединение получали аналогично Промежуточному соединению F8.

ЖХ-MC (Метод 5): R_t=2.97 мин; MC (EI положит.): m/z=1006 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F89

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 8 мг (0.012 ммоль) Промежуточного соединения C51 по реакции с 7.4 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения L8 в присутствии 5.8 мг (0.015 ммоль) HATU и 10 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 10 мг (78% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.87 мин; MC (EI положит.): m/z=984 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F90

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-N⁶-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 11 мг (0.018 ммоль) Промежуточного соединения C49 по реакции с 13.7 мг (0.018 ммоль)

Промежуточного соединения L17 в присутствии 34 мг (0.089 ммоль) HATU и 19 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 7.5 мг (35% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 8): R_t=6.78 мин; MC (EI положит.): m/z=1092 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F91

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]бутанамид (1:1)

9.3 мг (0.01 ммоль) трет-бутил [(2S)-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]карбамата растворяли в 2 мл дихлорметана и добавляли 740 мг (6.49 ммоль, 0.50 мл) трифторуксусной кислоты и смесь перемешивали при КТ в течение 1.5 ч. Реакционную смесь затем концентрировали и остаток вносили в ацетонитрил и воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 9.2 мг (96% от теории) целевого соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.88 мин; MC (EI положит.): m/z=637 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F103

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-(3-{[(1R)-1-(3-бензил-7-хлор-4-оксо-3,4-дигидрохиназолин-2-ил)-2-метилпропил](4-метилбензоил)амино}пропил)-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.019 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-[(1R)-1-(3-бензил-7-хлор-4-оксо-3,4-дигидрохиназолин-2-ил)-2-метилпропил]-4-метилбензамида по реакции с 11.3 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения L44 в присутствии 8.8 мг (0.023 ммоль) HATU и 10 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Очистку осуществляли с помощью препаративной ВЭЖХ.

Выход: 8.5 мг (35% от теории)

ЖХ-MC (Метод 5): R_t=3.82 мин; MC (EI положит.): m/z=1085 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F104

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1)

15 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения C58 сначала подвергали реакции с 11 мг (0.036 ммоль) Промежуточного соединения L1 в присутствии 13 мг (0.034 ммоль) HATU и 10 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 60 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 12.3 мг (63% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.3 мин; MC (EI положит.): m/z=837 [M+H]⁺.

На второй стадии, это промежуточное соединение растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 12 мг (0.088 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 2 ч. Затем добавляли 26 мг (0.088 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора трифторуксусной кислоты 0.1% концентрации. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 8.1 мг (68% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.89 мин; MC (ESI положит.): m/z=693 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F105

N²-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F32 из Промежуточного соединения C5 и Промежуточного соединения L46.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.82 мин; MC (EI положит.): m/z=766 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F106

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-аланил-N5-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F104 из Промежуточного соединения C53 и Промежуточного соединения L47.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.85 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.86 мин; MC (ESI положит.): m/z=983 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F107

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения C49 по реакции с 22.3 мг (0.049 ммоль) Промежуточного соединения L48 в присутствии 14 мг (0.037 ммоль) HATU и 21 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 13 мг (60% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.9 мин; MC (EI положит.): m/z=748 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F108

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F104 из 20 мг (0.027 ммоль) Промежуточного соединения C53 и 24 мг (0.054 ммоль) Промежуточного соединения L48. Это приводило к получению 3 мг (14% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.93 мин; MC (EI положит.): m/z=747 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F109

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[(бромацетил)амино]этил}бутанамид (1:1)

17 мг (0.026 ммоль) Промежуточного соединения C57 вносили в 3 мл ДМФА и подвергали реакции с 7 мг (0.027 ммоль) коммерчески доступного 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-диона в присутствии 14 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 15 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 7 мг (33% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=1.29 мин; MC (ESI положит.): m/z=777 и 779 (M+H)⁺.

Это промежуточное соединение вносили в 1 мл дихлорметана и защиту удаляли с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты. После концентрирования и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода, получали 6 мг (88% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.86 мин; MC (ESI положит.): m/z=677/679 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F110

N-(Бромацетил)-L-валил-L-аланил-N6-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F109 из 16 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения C5 и 17 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения L49. Это приводило к получению 6 мг (24% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.93 мин;

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.88 мин; MC (ESI положит.): m/z=933 и 935 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение F111

Трифторуксусная кислота / (1S,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения C5 по реакции с 16 мг (0.044 ммоль) Промежуточного соединения L50 в присутствии 12.5 мг (0.032 ммоль) HATU и 19 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 13 мг (67% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.89 мин; MC (EI положит.): m/z=748 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F112

Трифторуксусная кислота / (1S,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения C49 по реакции с 18 мг (0.049 ммоль) Промежуточного соединения L50 в присутствии 14 мг (0.037 ммоль) HATU и 21 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 12 мг (51% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.89 мин; MC (EI положит.): m/z=748 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F113

Трифторуксусная кислота / (1S,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения C53 по реакции с 14 мг (0.038 ммоль) Промежуточного соединения L50 в присутствии 11 мг (0.029 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью 133 мг DABCO в 2 мл ДМФА. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 4 мг (24% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 5): R_t=2.77 мин; MC (EI положит.): m/z=747 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F114

Трифторуксусная кислота / (1R,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил] циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения C5 по реакции с 16 мг (0.044 ммоль) Промежуточного соединения L51 в присутствии 12.6 мг (0.032 ммоль) HATU и 19 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 11 мг (53% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-MC (Метод 1): R_t=0.89 мин; MC (EI положит.): m/z=748 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение F115

Трифторуксусная кислота / (1R,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1H-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения С49 по реакции с 18 мг (0.047 ммоль) Промежуточного соединения L51 в присутствии 13 мг (0.035 ммоль) HATU и 21 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 12 мг (51% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (EI положит.): m/z=748 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F116

Трифторуксусная кислота / (1R,3R)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 11 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения С53 по реакции с 11 мг (0.028 ммоль) Промежуточного соединения L51 в присутствии 8 мг (0.021 ммоль) HATU и 12 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью 87 мг DABCO в 2 мл ДМФА. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 3.3 мг (28% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (EI положит.): m/z=747 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F117

Трифторуксусная кислота / N-[(3S)-3-амино-4-{2-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]гидразино}-4-оксобутил]-N-{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из Промежуточного соединения С49. Прежде всего С49 сочетали с 9Н-флуорен-9-илметил гидразинкарбоксилатом в присутствии HATU. Fmoc защитную группу затем удаляли с помощью пиперидина в ДМФА и полученный гидразид сочетали с 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислотой в присутствии HATU. На последней стадии Boc защитную группу удаляли с помощью ТФУ в дихлорметане.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (EI положит.): m/z=722 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F118

Трифторуксусная кислота / N-[(3S)-3-амино-4-{2-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]гидразино}-4-оксобутил]-Н-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид (1:1)

На первой стадии указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F3 из 15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения С53 путем сочетания с коммерчески доступным 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексангидразидом в присутствии HATU. Fmoc защитную группу затем удаляли с помощью 142 мг DABCO в ДМФА. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 3 мг (19% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.90 мин; МС (EI положит.): m/z=721 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F119

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[(бромацетил)амино]этил}бутанамид (1:1)

29 мг (0.044 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 3.4 мл ДМФА и добавляли 36 мг (0.087 ммоль) Промежуточного соединения L52, 25 мг (0.065 ммоль) HATU и 19 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 60 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 26.4 мг (73% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=820 и 822 (М+Н)⁺.

Это промежуточное соединение растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 6.5 мг (0,048 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли 13.9 мг (0.048 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора трифторуксусной кислоты 0.1% концентрации. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 14.4 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=676 и 678 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F120

Трифторуксусная кислота / (1S,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С5 по реакции с 11 мг (0.03 ммоль) Промежуточного соединения L53 в присутствии 8.4 мг (0.022 ммоль) HATU и 13 мкл N,N-диизопропилзтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 7.5 мг (59% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (EI положит.): m/z=748 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F121

Трифторуксусная кислота / (1S,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С49 по реакции с 11.5 мг (0,031 ммоль) Промежуточного соединения L53 в присутствии 9 мг (0.024 ммоль) HATU и 14 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 9 мг (61% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (EI положит.): m/z=748 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F122

Трифторуксусная кислота / (1S,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения С53 по реакции с 14 мг (0.038 ммоль) Промежуточного соединения L53 в присутствии 11 мг (0.029 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью 202 мг DABCO в 3 мл ДМФА. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 4 мг (24% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (EI положит.): m/z=747 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F123

Трифторуксусная кислота / (1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С5 по реакции с 11 мг (0.030 ммоль) Промежуточного соединения L54 в присутствии 8.4 мг (0.022 ммоль) HATU и 13 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 4 мг (31% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (EI положит.): m/z-748 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F124

Трифторуксусная кислота / (1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С49 по реакции с 11.5 мг (0.031 ммоль) Промежуточного соединения L54 в присутствии 9 мг (0.024 ммоль) HATU и 14 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 9 мг (66% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (EI положит.): m/z=748 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F125

Трифторуксусная кислота / (1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения С53 по реакции с 14 мг (0.038 ммоль) Промежуточного соединения L54 в присутствии 11 мг (0.029 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью 127 мг DABCO в 3 мл ДМФА. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 3 мг (17% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.08 мин; МС (EI положит.): m/z=769 [M+Na]⁺.

Промежуточное соединение F126

N-(Бромацетил)-L-валил-L-аланил-N⁶-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F110 из 18 мг (0.027 ммоль) Промежуточного соединения С49 и 21 мг (0.027 ммоль) Промежуточного соединения L49. Это приводило к получению 8.7 мг (30% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.94 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=933 и 935 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F127

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-метоксипропаноил]амино)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1)

12 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С59 растворяли в 2.4 мл ДМФА и добавляли 14.6 мг (0.046 ммоль) Промежуточного соединения L1, 6 мг (0.031 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 5.9 мг (0.039 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 8 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 11 мг (70% от теории) данного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=942 (М+Н)⁺.

11 мг (0.011 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 2 мл ДМФА и добавляли 123 мг (1.1 ммоль) 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 2 ч. Затем добавляли 63 мкл уксусной кислоты и реакционную смесь концентрировали в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 2 мг (22% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (EI положит.): m/z=721 [М+Н]⁺.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.95 мин.

Промежуточное соединение F128

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-D-аланил)-N²-{N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 3 мг (0.005 ммоль) Промежуточного соединения С5 по реакции с 2.5 мг (0.003 ммоль) Промежуточного соединения L55 в присутствии 2.5 мг (0.007 ммоль) HATU и 3 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятие защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 1.4 мг (32% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (EI положит.): m/z=1077 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F129

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F128 из 10 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С49 по реакции с 19 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L56 в присутствии 12 мг (0.031 ммоль) HATU и 14 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 13.5 мг (70% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (EI положит.): m/z=1117 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F142

R/S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

20.0 мг (23.7 мкмоль) соединения R/S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1) и 13.4 мг (26.04 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 4.8 мг (47.34 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 3.6 мг (0.06 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 12.4 мг (44% от теории) соединения R/S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.30 мин; МС (ESI положит.): m/z=1129 (М+Н)⁺.

10.0 мг (8.85 мкмоль) R/S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-гомоцистеина растворяли в трифторэтаноле и добавляли 3.1 мг (22.71 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 3.9 мг (0.01 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь в течение короткого периода перемешивали и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали с небольшим количеством воды. Это приводило к получению 7.6 мг (78% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=983 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.50 (m, 1Н), 0.81 (s, 9Н), 1.49 (m, 1Н), 1.89 (m, 1Н), 2.05 (m, 1Н), 2.29-2.43 (m, 4Н), 2.45-2.55 (m, 2Н), 2.58-2.74 (m, 2Н), 3.10-3.20 (m, 2Н), 3.21-3.40 (m, 2Н), 3.42-3.54 (m, 16Н), 3.55-3.65 (m, 4Н), 4.28 (m, 1Н), 4.91 (dd, 1Н), 5.18 (dd, 1Н), 5.60 (s, 1Н), 6.95 (m, 1Н), 7.00 (s, 2Н), 7.15-7.38 (m, 7Н), 7.53 (s, 1Н), 7.68 (m, 1Н), 8.00 (m, 2Н).

Промежуточное соединение F143

Трифторуксусная кислота / 6-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-R-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]гексанамид (1:1)

30.0 мг (0.05 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата и 13.5 мг (0.07 ммоль) 6-(ацетилсульфанил)гексановой кислоты сначала загружали в 2.0 мл метанола с каплей воды. Добавляли 23.0 мг (0.17 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 54.2 мг (90% от теории) соединения 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силаэйкозан-20-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=1106 (М+Н)⁺.

54.0 мг (0.07 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силаэйкозан-20-овой кислоты и 16.7 мг (0.09 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 3.0 мл ацетонитрила и добавляли 75.0 мг (0.58 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Добавляли 60.0 мг (0.09 ммоль) Т3Р (50% в ацетонитриле) и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакцию гасили водой и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 42.8 мг (68% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(6-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-6-оксогексил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=866 (М+Н)⁺.

20.0 мг (0.02 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(6-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-6-оксогексил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 4.7 мг (0.04 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи, и затем добавляли 10.1 мг (0.04 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и смесь перемешивали в течение 10 мин. Добавляли воду (0.1% ТФУ) и реакционную смесь очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9.2 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=722 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F144

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

50.0 мг (0.1 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (Промежуточное соединение С15) сначала загружали в 2.0 мл дихлорметана и добавляли 22.7 мг (0.22 ммоль) триэтиламина и 49.3 мг (0.22 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил хлорида (Промежуточное соединение L60) WISV1648-1-1.

Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Каждые 2 ч (три раза) добавляли 1 эквивалент Промежуточного соединения L60 и 1.2 эквивалента триэтиламина, и смесь затем перемешивали при КТ в течение ночи. Эту процедуру повторяли еще два раза. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 30.9 мг (43% от теории) соединения трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (ESI положит.): m/z=706 (М+Н)⁺.

24.6 мг (0.04 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино)пропил]карбамата растворяли в 3.0 мл дихлорметана, добавляли 79.5 мг (0.7 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение 6 ч. Добавляли еще 79.5 мг (0.7 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с дихлорметаном. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 24.2 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=606 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F145

Трифторуксусная кислота / 6-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]гексанамид

90.0 мг (0.15 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата, Промежуточное соединение С16, и 43.6 мг (0.23 ммоль) 6-(ацетилсульфанил)гексановой кислоты сначала загружали в 9.0 мл метанола с каплей воды и добавляли 73.9 мг (0.54 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч, и затем добавляли этилацетат. Органическую фазу промывали смесью вода/насыщенный раствор NaCl и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворители упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 100:2). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 98.7 мг (83% от теории) соединения 9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазаоктадекан-18-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=701 (М+Н)⁺.

20.0 мг (0.03 ммоль) 9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазаоктадекан-18-овой кислоты и 6.5 (0.04 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 1.5 мл ацетонитрила и добавляли 23.6 мг (0.04 ммоль) Т3Р и 29.5 мг (0.23 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли воду. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 16.7 мг (99% от теории) соединения трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(6-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-6-оксогексил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.40 мин; МС (ESI положит.): m/z=823 (М+Н)⁺.

14.8 мг (0.02 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(6-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-6-оксогексил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата растворяли в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 41.0 мг (0.36 ммоль) ТФУ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи.

Затем еще два раза добавляли ТФУ, в каждом случае по 41.0 мг (0.36 ммоль), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью преп. ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в 1,4-диоксан и воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 2.9 мг (19% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=723 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F146

R/S-[2-([(3S)-3-Амино-3-карбоксипропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтил]-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

25.0 мг (28.12 мкмоль) R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-карбокси-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил]гомоцистеина (Промежуточное соединение С12) и 15.9 мг (30.93 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида растворяли в 2.0 мл ДМФА и добавляли 11.4 мг (112.48 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 7.6 мг (0.13 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 23.9 мг (59% от теории) соединения R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-карбокси-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил]-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=1173 (М+Н)⁺.

11.8 мг (8.23 мкмоль) R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-карбокси-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил]-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеина растворяли в трифторэтаноле и добавляли 1.7 мг (12.35 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 3.6 мг (0.01 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь в течение короткого периода перемешивали и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.8 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.20 мин; МС (ESI положит.): m/z=1029 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F147

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10-оксо-3,6-диокса-16-тиа-9-азаоктадекан-18-амид (1:1)

15.0 мг (0.03 ммоль) 9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазаоктадекан-18-овой кислоты (Промежуточное соединение С13) сначала загружали в 1.5 мл ацетонитрила и добавляли 22.1 мг (0.17 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и затем 17.7 мг (0.03 ммоль) Т3Р. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин, и затем добавляли 9.5 мг соединения (0.03 ммоль) трифторуксусная кислота / 1-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) (Промежуточное соединение L59). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и гасили водой. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 14.8 мг (57% от теории) соединения трет-бутил [19-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10,18-диоксо-3,6-диокса-16-тиа-9,19-диазадокозан-22-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.40 мин; МС (ESI положит.): m/z=911 (М+Н)⁺.

14.2 мг (0.02 ммоль) трет-бутил [19-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10,18-диоксо-3,6-диокса-16-тиа-9,19-диазадокозан-22-ил]карбамата растворяли в 1.5 мл дихлорметана, добавляли 35.5 мг (0.31 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли еще 71.0 мг (0.62 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в небольшое количество воды и лиофилизировали. Это приводило к получению 14.0 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=811 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F148

Трифторуксусная кислота / 6-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфинил)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]гексанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение образовалось в качестве побочного продукта в синтезе Промежуточного соединения F145. Это приводило к получению 8.1 мг (53% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=739 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F149

Трифторуксусная кислота / R/S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеин (1:1)

20.0 мг (24.94 мкмоль) R/S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}амино)-2-оксоэтил]гомоцистеина (Промежуточное соединение С14) и 14.1 мг (27.44 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 5.1 мг (49.88 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли 3.7 мг (0.06 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 18.2 мг (67% от теории) соединения R/S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}амино)-2-оксоэтил]-Ы-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.23 мин; МС (ESI положит.): m/z=1086 (М+Н)⁺.

17.6 мг (0.02 ммоль) R/S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}амино)-2-оксоэтил]-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]гомоцистеина растворяли в 1.5 мл дихлорметана, добавляли 37.0 мг (0.32 ммоль) ТФУ, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли еще 74.0 мг (0.64 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в небольшое количество воды и лиофилизировали. Это приводило к получению 16.0 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (ESI положит.): m/z=986 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F150

Трифторуксусная кислота / N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-[2-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)этил]-L-аланинамид (1:1)

В атмосфере аргона и при 0°С 10.0 мг (0.02 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил [3-({[(2-аминоэтил)сульфанил]ацетил}{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат (Промежуточное соединение С20) в 1.0 мл ДМФА обрабатывали 12.1 мг (0.02 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L25), 2.2 мг (0.02 ммоль) HOAt и 7.6 мг (0.02 ммоль) HATU. Затем добавляли 5.5 мкл (0.03 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 1.8 мкл НОАс, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.4 мг (48% от теории) соединения N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-(9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазатетрадекан-14-ил)-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.60 мин; МС (ESI положит.): m/z=687.5 [М+2Н]²⁺.

9.5 мг (0.01 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-(9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазатетрадекан-14-ил)-L-аланинамида сначала загружали в 1.0 мл дихлорметана, добавляли 15.8 мг (0.14 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли еще 31.6 мг (0.28 ммоль) ТФУ, и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в небольшое количество воды и лиофилизировали. Это приводило к получению 10.2 мг (98% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=637.5 [М+2Н]²⁺.

Промежуточное соединение F151

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-(3-{(2S)-5-(2,5-дифторфенил)-3-[метокси(метил)карбамоил]-2-фенил-2,3-дигидро-1,3,4-тиадиазол-2-ил}пропил)-L-аланинамид

5.0 мг (0.01 ммоль) (2S)-2-(3-аминопропил)-5-(2,5-дифторфенил)-N-метокси-N-метил-2-фенил-1,3,4-тиадиазол-3(2Н)-карбоксамида сначала загружали в 1.0 мл ацетонитрила и добавляли 7.7 мг (0.06 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 9.8 (0.02 ммоль) Т3Р. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин, и затем добавляли 9.1 мг (0.02 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L44). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.3 мг (35% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=989 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F152

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N-(3-{(2S)-5-(2,5-дифторфенил)-3-[метокси(метил)карбамоил]-2-фенил-2,3-дигидро-1,3,4-тиадиазол-2-ил}пропил)-L-аланинамид

5.0 мг (0.01 ммоль) (2S)-2-(3-аминопропил)-5-(2,5-дифторфенил)-N-метокси-]-N-метил-2-фенил-1,3,4-тиадиазол-3(2Н)-карбоксамида сначала загружали в 1.0 мл ацетонитрила и добавляли 7.7 мг (0.06 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 9.8 (0.02 ммоль) Т3Р. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин, и затем добавляли 11.8 мг (0.02 ммоль) N-[31-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L25). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.7 мг (34% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=1165 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F153

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-гидроксипропаноил]амино)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1)

Синтез проводили аналогично Промежуточному соединению F104 из Промежуточного соединения С60.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.1 мин; МС (ESI положит.): m/z=707 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F154

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F2 из 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С8 и 15 мг (0.022 ммоль) Промежуточного соединения L6.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.91 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=1077 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F155

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 14 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения С61 с 15 мг (0.021 ммоль) Промежуточного соединения L61 в присутствии 8.7 мг (0.023 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 13 мг (59% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=1076 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F156

N-(Бромацетил)-L-валил-L-аланил-N⁶-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего трипептидное производное 2-(триметилсилил)этил L-валил-L-аланил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолиз, сочетание с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и еще один гидрогенолиз).

84 мг (0.163 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 2.5 мл ДМФА и добавляли 58 мг (0.244 ммоль) 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-диона. После 10 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали, остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 1:1 и смесь доводили до рН 2 с помощью трифторуксусной кислоты и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После концентрирования соответствующих фракций, остаток вносили в 15 мл раствора трифторуксусной кислоты 5% концентрации в ДХМ и перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь затем концентрировали при несильном охлаждении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. За 2 стадии получали 53 мг (50% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.72 мин; МС (ESI положит.): m/z=537 и 539 (М+Н)⁺.

Для синтеза указанного в заголовке соединения 18 мг (0.027 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 4 мл ДМФА и добавляли 16 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения С61 и 19 мг HATU и 9 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли несколько капель трифторуксусной кислоты и реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода 1:1, полученное промежуточное соединение растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. После добавления 4.8 мг (0.035 ммоль) хлорида цинка, реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. Затем добавляли 10 мг (0.035 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и реакционную смесь разбавляли смесью ацетонитрил/вода и фильтровали. Очистку проводили с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 3.2 мг (13% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.94 мин;

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=932 и 934 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F163

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N6-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 37 мг (0.056 ммоль) Промежуточного соединения С58 и 41 мг (0.056 ммоль) Промежуточного соединения L61 в присутствии HATU и последующего деблокирования хлоридом цинка, как описано для Промежуточного соединения F119. Это приводило к получению 12 мг (19% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.49 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=1005 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F164

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-Н5-карбамоил-L-орнитил-N6-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F155 путем сочетания 20 мг (0.030 ммоль) Промежуточного соединения С58 с 27 мг (0.033 ммоль) Промежуточного соединения L62 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.92 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=1091 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F165

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F155 путем сочетания 15 мг (0.021 ммоль) Промежуточного соединения С61 с 18 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения L62 в присутствии HATU и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=1162 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F166

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-N⁶-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / бензил (1R,3S)-3-аминоциклопентанкарбоксилат (1:1) получали из коммерчески доступной (1R,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов путем этерификации бензиловым спиртом с использованием EDCI/DMAP и последующего удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы с помощью ТФУ в ДХМ.

51 мг (0.076 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 6 мл ДМФА и сочетали с 50 мг (0.076 ммоль) Промежуточного соединения С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в метанол и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 2 ч. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из диоксана приводила к получению 21 мг (34% от теории за 2 стадии) (1R,3S)-3-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]амино}циклопентан-карбоновой кислоты.

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F155 путем сочетания 10.5 мг (0.013 ммоль) этого промежуточного соединения с 11.4 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения L62 в присутствии HATU и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8.6 мг (48% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=1203 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F167

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F129 из 11 мг (0.016 ммоль) Промежуточного соединения С5 по реакции с 20 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L56 в присутствии 12 мг (0.032 ммоль) HATU и 14 мкл N,N-диизопропилэтиламина и с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 11 мг (46% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.13 мин; МС (EI положит.): m/z=1117 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F168

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / бензил (1R,2S)-2-аминоциклопентанкарбоксилат (1:1) получали из коммерчески доступной (1R,2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов путем этерификации бензиловым спиртом с использованием EDCI/DMAP и последующего удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы с помощью ТФУ в ДХМ.

102 мг (0.305 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 12 мл ДМФА и сочетали с 100 мг (0.152 ммоль) Промежуточного соединения С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в метанол и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 2 ч. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводила к получению 70 мг (59% от теории за 2 стадии) (1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]амино}циклопентан-карбоновой кислоты.

Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания 20 мг (0.013 ммоль) этого промежуточного соединения с 16.6 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения L61 в присутствии 9.5 мг (0.025 ммоль) HATU и 18 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 9.3 мг (30% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=1116 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F169

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-N⁶-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)циклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F168 из Промежуточных соединений С58 и L62.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=1202 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F170

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-N⁶-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-D-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали по аналогии с его диастереомерным Промежуточным соединением F23.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=1092 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F171

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-D-аланил)-N²-{N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F155 из Промежуточных соединений С62 и L61.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=1076 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F172

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-L-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 10 мг (0.013 ммоль) Промежуточного соединения С63 путем сочетания с 9 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения L63 в присутствии 5.5 мг (0.014 ммоль) HATU и 11 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты путем перемешивания в растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане 1:1 в течение 2.5 часов. Это приводило к получению 11 мг (72% от теории за 2 стадии) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (EI положит.): m/z=1049 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F173

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 15 мг (0.018 ммоль) Промежуточного соединения С64 путем сочетания с 12 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения L63 в присутствии 7.7 мг (0.02 ммоль) HATU и 16 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 12 мг (58% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (EI положит.): m/z=1048 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F174

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F172 из Промежуточных соединений С57 и L63.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (EI положит.): m/z=1049 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F175

Трифторуксусная кислота / N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 11 мг (0.013 ммоль) Промежуточного соединения С64 с 3.4 мг (0.016 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты в присутствии 6.7 мг (0.018 ммоль) HATU и 9 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8 мг (69% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (EI положит.): m/z=893 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F176

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-12-оксо-3,6,9-триокса-13-азапентадекан-15-ил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 5 мг (0.006 ммоль) Промежуточного соединения С64 с 2 мг (0.007 ммоль) 3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропановой кислоты, получение которой описано в методике Промежуточного соединения L15, в присутствии 3.5 мг (0.009 ммоль) HATU и 4 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 2 мг (35% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (EI положит.): m/z=839 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F177

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F168, используя взамен Промежуточного соединения L61 Промежуточное соединение L1.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (EI положит.): m/z=804 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F178

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-N-{2-[(бромацетил)амино]этил}циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F177, используя взамен Промежуточного соединения L1 Промежуточное соединение L52.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (EI положит.): m/z=787 и 789 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F179

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол- 1-ил)гексил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 15 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения С58 с 6 мг (0.025 ммоль) 1-(6-аминогексил)-1Н-пиррол-2,5-диона в присутствии 13 мг (0.034 ммоль) HATU и 16 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8.5 мг (46% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.22 мин; МС (EI положит.): m/z=692 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F180

Н-[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-N2-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 9.6 мг (0.012 ммоль) Промежуточного соединения С64 с 5 мг (0.013 ммоль) Промежуточного соединения L64 в присутствии 7 мг (0.018 ммоль) HATU и 6 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 3.1 мг (28% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (EI положит.): m/z=822 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F192

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-L-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

60 мг (0.091 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 8 мл ДМФА и сочетали с 45 мг (0.100 ммоль) Промежуточного соединения L65 в присутствии 42 мг (0.11 ммоль) HATU и 64 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в 10 мл этанола и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 45 мин. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводила к получению 24.5 мг (31% от теории за 2 стадии) 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-L-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (EI положит.): m/z=844 [М+Н]⁺.

Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания 10 мг (0.012 ммоль) этого промежуточного соединения с 2 мг (0.013 ммоль) коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии 5.4 мг (0.014 ммоль) HATU и 8 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 3.5 мг (33% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F193

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F192 из соединения 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланин / N-циклогексилциклогексанамин (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F194

N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали из Примера 98, сперва путем сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли путем гидрирования в течение 1 часа над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода, и затем превращали промежуточное соединение со снятой защитой, как описано для Промежуточного соединения F58, по реакции с 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дионом в указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.19 мин; МС (ESI положит.): m/z=851 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F195

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутил}-N'-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]сукцинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 26 мг (0.035 ммоль) Промежуточного соединения С65 с 18 мг (0.07 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) в 8 мл ДМФА в присутствии 40 мг (0.1054 ммоль) HATU и 61 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 16 мг (43% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=721 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.99 (t, 1Н), 7.95 (t, 1Н), 7.6-7.75 (m, 4Н), 7.5 (s, 1Н) 7.2-7.4 (m, 6Н), 6.8-7.0 (m, 4Н), 5.63 (s, 1Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 4.26 и 4.0 (2d, 2Н), 3.3-3.6 (m, 4Н), 3.15-3.25 (m, 3Н), 2.85-3.0 (m, 2Н), 2.2-2.3 (m, 4Н), 0.64 и 1,49 (2m, 2Н), 0.81 (s, 9Н).

Промежуточное соединение F196

Трифторуксусная кислота / 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил-N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланинат (1:1)

Прежде всего 15 мг (0.023 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 4 мл ДМФА и подвергали реакции с 8.2 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения L67 в присутствии 13.0 мг (0.034 ммоль) HATU и 16 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 30 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После объединения соответствующих фракций и упаривания растворителя, остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Это приводило к получению 4.3 мг (20% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (EI положит.): m/z=852 [М+Н]⁺.

4.3 мг (4.5 мкмоль) промежуточного соединения растворяли в 1 мл трифторэтанола и защиту удаляли с помощью 3.65 мг (27 мкмоль) хлорида цинка, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 1 мг (25% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=708 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F204

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этил)бутанамид (1:1)

25 мг (0.038 ммоль) Промежуточного соединения С58 сначала подвергали реакции с 16.5 мг (чистота 75%) (0.038 ммоль) Промежуточного соединения L68 в присутствии 17 мг (0.046 ммоль) HATU и 20 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 60 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 18.3 мг (56% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (EI положит.): m/z=851 [М+Н]⁺.

На второй стадии это промежуточное соединение растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 12 мг (0.086 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 25 мг (0.086 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора трифторуксусной кислоты 0.1% концентрации. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 11 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=707 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F205

Трифторуксусная кислота / 1-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]пиперидин-4-ил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитинат (1:1)

Синтез проводили путем сочетания 25 мг (0.034 ммоль) Промежуточного соединения С61 и 29 мг (0.041 ммоль) Промежуточного соединения L69 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим гидрированием с использованием палладия на активированном угле (10%) при нормальном давлении, затем сочетанием с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение удалением 2-(триметилсилил)этоксикарбонильной защитной группы хлоридом цинка. ВЭЖХ очистка приводила к получению 11 мг (26% от теории за 4 стадии).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=1061 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F206

Трифторуксусная кислота / 1-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]пиперидин-4-ил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-валил-L-аланинат (1:1)

Синтез проводили аналогично Промежуточному соединению F205.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=975 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F207

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F155.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=1020 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F209

R-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

93.9 мг (0.78 ммоль) L-цистеина суспендировали в растворе 93.0 мг (1.11 ммоль) бикарбоната натрия и 0.9 мл воды. Добавляли 70.0 мг (0.11 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70), растворенного в 6.0 мл изопропанола, и 202.3 мг (1.33 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 90 мин. Добавляли воду (0.1% ТФУ), и реакционную смесь очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода; 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 53.9 мг (59% от теории) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=717 (М+Н)⁺.

86.0 мг (0.1 ммоль) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) и 58.5 мг (0.11 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида растворяли в 4.0 мл ДМФА и добавляли 20.9 мг (0.21 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 15.5 мг (0.26 ммоль) НОАс и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 68.6 мг (59% от теории) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=1115 (М+Н)⁺.

46.4 мг (0.04 ммоль) R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 17.0 мг (0.13 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли еще 8.5 мг (0.07 ммоль) дихлорида цинка, и смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 36.5 мг (0.13 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.4 мг (43% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=971 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F210

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-D-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично синтезу Промежуточного соединения F209, используя D-цистеин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=971 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F211

Трифторуксусная кислота / 3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]пропанамид (1:1)

30.0 мг (0.05 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70) сначала загружали вместе с 5.5 мг (0.05 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 0.5 мл метанола с каплей воды. Затем добавляли 23.0 мг (0.17 ммоль) карбоната калия, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли этилацетат и органическую фазу промывали один раз водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза. Это приводило к получению 30.3 мг (86% от теории) соединения 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=702 (М+Н)⁺.

30.0 мг (0.04 моль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты и 9.8 мг (0.06 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 2.0 мл ацетонитрила и добавляли 44.2 мг (0.34 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Добавляли 35.4 мг (0.06 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате), и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду, и очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 22.0 мг (63% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=824 (М+Н)⁺.

22.0 мг (0.03 моль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-3-оксопропил)сульфанил]ацетил}амино)пропил]карбамата растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 9.1 мг (0.07 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 5 ч. Добавляли 19.5 мг (0.07 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.0 мг (71% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=680 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F212

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10-оксо-3,6-диокса-13-тиа-9-азапентадекан-15-амид (1:1)

28.8 мг (0.04 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали вместе с 18.3 мг (0.05 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) (Промежуточное соединение L59) в 1.9 мл ацетонитрила. Затем добавляли 42.4 мг (0.33 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 33.9 мг (0.05 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.7 мг (26% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [16-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10,15-диоксо-3,6-диокса-13-тиа-9,16-диазанонадекан-19-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=812 (М+Н)⁺.

10.7 мг (0.01 моль) 2-(триметилсилил)этил [16-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-10,15-диоксо-3,6-диокса-13-тиа-9,16-диазанонадекан-19-ил]карбамата растворяли в 0.8 мл трифторэтанола и добавляли 8.0 мг (0.06 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 5 ч. Добавляли 17.1 мг (0.06 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=768 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F213

Трифторуксусная кислота / 3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)пропанамид (1:1)

27.5 мг (0.04 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали вместе с 15.9 мг (0.05 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L1) в 1.8 мл ацетонитрила. Затем добавляли 32.4 мг (0.31 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 32.4 мг (0.05 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.9 мг (35% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=881 (М+Н)⁺.

11.9 мг (0.01 моль) 2-(триметилсилил)этил-[13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил]карбамата растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 5.5 мг (0.04 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 11.8 мг (0.04 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.4 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F214

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

111.7 мг (0.30 ммоль) (2S)-5-(бензилокси)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентановой кислоты сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 46.1 (0.30 ммоль) HOBt, 96.6 мг (0.30 ммоль) TBTU и 38.9 мг (0.30 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 250.0 мг (0.30 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71), растворенного в 116.3 мг (0.9 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 3.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 257.0 мг (80% от теории) соединения (16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-{[(2S)-5-(бензилокси)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентаноил]амино}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=1071 (М+Н)⁺.

В атмосфере аргона 24.6 мг (0.11 ммоль) ацетата палладия (II) сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана и добавляли 33.2 мг (0.33 ммоль) триэтиламина и 254.3 мг (2.19 ммоль) триэтилсилана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин и добавляли 234.1 мг (0.22 ммоль) (16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-{[(2S)-5-(бензилокси)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентаноил]амино}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты, растворенной в 5.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через картонный фильтр и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель упаривали при пониженном давлении без нагревания. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 177.5 мг (85% от теории) соединения L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=846 (М+Н)⁺.

20.0 мг (20.83 мкмоль) соединения L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) сначала загружали вместе с 11.8 мг (22.91 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.3 мг (62.49 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 4.4 мг (0.07 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.1 мг (74% от теории) соединения N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=1244 (М+Н)⁺.

17.5 мг (14.06 мкмоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина растворяли в 1.5 мл трифторэтанола и добавляли 11.5 мг (84.37 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли 24.7 мг (0.08 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.8 мг (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=1100 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F215

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{3-[({[(2R)-2-ацетамидо-2-карбоксиэтил]сульфанил}ацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}-L-аланинамид

14.9 мг (0.02 ммоль) соединения N-ацетил-S-[2-([3-(L-аланиламино)пропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Пример 229) и 7.1 мг (0.02 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 5.7 мг (0.06 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 4.5 мг (0.08 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 13.3 мг (78% от теории) соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N-{3-[({[(2R)-2-ацетамидо-2-карбоксиэтил]сульфанил}ацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=919 (М+Н)⁺.

11.1 мг (0.01 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N-{3-[({[(2R)-2-ацетамидо-2-карбоксиэтил]сульфанил}ацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}-L-аланинамида растворяли в 5.0 мл этанола, добавляли 1.0 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и остаток на фильтре промывали смесью этанол/ТГФ/вода. Растворители упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 7.5 мг (69% от теории) соединения L-валил-N-{3-[({[(2R)-2-ацетамидо-2-карбоксиэтил]сульфанил}ацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}-L-аланинамид / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=785 (М+Н)⁺.

7.3 мг (8.12 мкмоль) соединения L-валил-N-{3-[({[(2R)-2-ацетамидо-2-карбоксиэтил]сульфанил}ацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}-L-аланинамид / трифторуксусная кислота (1:1) сначала загружали вместе с 4.6 мг (8.93 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 0.5 мл ДМФА и добавляли 2.5 мг (24.36 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 4.4 мг (0.03 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.9 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=1183 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F216

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 30.2 мг (0.06 ммоль) N,N'-бис[(бензилокси)карбонил]-L-цистина сначала загружали в 2.0 мл воды и 2.0 мл изопропанола и добавляли 56.7 мг (0.20 ммоль) ТСЕР. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли 50.0 мг (0.08 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70), растворенного в 2.0 мл изопропанола, и 122.2 мг (0.48 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 7 ч. Затем добавляли еще 122.2 мг (0.48 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу экстрагировали водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия и промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 43.1 мг (64% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(бензилокси)карбонил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=851 (М+Н)⁺.

16.5 мг (0.05 ммоль) соединения 4-метилбензолсульфоновая кислота / бензил бета-аланинат (1:1) сначала загружали вместе с 14.0 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина в 1.5 мл ацетонитрила. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 мин, и затем добавляли 30.8 мг (0.04 ммоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(бензилокси)карбонил]-L-цистеина, растворенного в 1.5 мл ацетонитрила, 23.4 мг (0.18 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 29.9 мг (0.05 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Полученное соединение представляло собой бензил S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(бензилокси)карбонил]-L-цистеинил-бета-аланинат.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.59 мин; МС (ESI положит.): m/z=1012 (М+Н)⁺.

43.8 мг (43.3 мкмоль) бензил S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(бензилокси)карбонил]-L-цистеинил-бета-аланината растворяли в 8.0 мл этанола, добавляли 4.4 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через картонный фильтр и остаток на фильтре промывали этанолом. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток обрабатывали еще два раза описанным только что путем. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.9 мг (50% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=788 (М+Н)⁺.

14.5 мг (16.1 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1) сначала загружали вместе с 9.1 мг (17.7 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 1.0 мл ДМФА и добавляли 4.9 мг (48.2 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 3.4 мг (0.06 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.9 мг (50% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.28 мин; МС (ESI положит.): m/z=1186 (М+Н)⁺.

14.1 мг (11.9 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1) растворяли в 1.5 мл трифторэтанола и добавляли 9.7 мг (71.3 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Добавляли еще 9.7 мг (71.3 мкмоль) дихлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Добавляли еще 9.7 мг (71.3 мкмоль) дихлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 70°С в течение 4 ч. Добавляли 20.8 мг (0.07 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 6.2 мг (44% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=1042 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F217

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 7.5 мг (0.05 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты сначала загружали в 1.5 мл ДМФА и добавляли 7.5 мг (0.05 ммоль) HOBt, 15.5 мг (0.05 ммоль) TBTU и 6.2 мг (0.05 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 40.0 мг (0.05 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71), растворенного в 1.5 мл ДМФА, и 18.7 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.2 мг (25% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=854 (М+Н)⁺.

10.9 мг (12.8 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 10.4 мг (76.6 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли 22.4 мг (0.08 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 7.5 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (ESI положит.): m/z=710 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F218

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-гамма-глутамил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 22.9 мг (0.06 ммоль) (4S)-5-(бензилокси)-4-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентановой кислоты сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 9.4 мг (0.05 ммоль) HOBt, 19.8 мг (0.06 ммоль) TBTU и 8.0 мг (0.06 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 51.2 мг (0.06 ммоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина (Промежуточное соединение С71), растворенного в 1.0 мл ДМФА, и 23.9 мг (0.19 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.2 мг (25% от теории) соединения (16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-{[(4S)-5-(бензилокси)-4-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентаноил]амино}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=1070 (М+Н)⁺.

В атмосфере аргона 3.9 мг (0.02 ммоль) ацетата палладия (II) сначала загружали в 1.0 мл дихлорметана и добавляли 5.3 мг (0.05 ммоль) триэтиламина и 254.3 мг (2.19 ммоль) триэтилсилана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин и добавляли 18.6 мг (0.02 ммоль) (16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-{[(4S)-5-(бензилокси)-4-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентаноил]амино}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты, растворенной в 1.0 мл дихлорметана. Растворитель упаривали при пониженном давлении без нагревания. Остаток вносили в ацетонитрил, фильтровали через шприцевой фильтр и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.0 мг (66% от теории) соединения L-гамма-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.14 мин; МС (ESI положит.): m/z=846 (М+Н)⁺.

15.0 мг (15.6 мкмоль) соединения L-гамма-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) сначала загружали вместе с 8.8 мг (17.2 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 1.0 мл ДМФА и добавляли 4.7 мг (46.9 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 3.3 мг (0.06 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 14.2 мг (70% от теории) соединения N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-гамма-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 4) R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=1244 (М+Н)⁺.

13.8 мг (11.1 мкмоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-гамма-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 9.1 мг (66.5 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли 19.4 мг (0.07 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 6.9 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=1100 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F235

Трифторуксусная кислота / N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-{4-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}карбамоил]фенил}-L-аланинамид (1:1)

120.0 мг (0.22 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (см. синтез Промежуточного соединения С11) и 52.1 мг (0.28 ммоль) 4-нитробензоил хлорида растворяли в 8.0 мл дихлорметана и добавляли 28.4 мг (0.28 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Это приводило к получению 97.7 мг (64% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.54 мин; МС (ESI положит.): m/z=705 (М+Н)⁺.

97.0 мг (0.14 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамата растворяли в 5.0 мл этанола, добавляли 9.7 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при стандартном давлении в течение 5 ч. Реакционную смесь фильтровали через картонный фильтр и остаток на фильтре промывали этанолом. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза. Это приводило к получению 87.4 мг (88% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=675 (М+Н)⁺.

59.3 мг (0.09 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамата и 25.5 мг (0.11 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланина сначала загружали вместе с 68.1 мг (0.53 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина в 5.0 мл ацетонитрила. Медленно добавляли 72.7 мг (0.11 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 52.2 мг (68% от теории) соединения бензил [(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]амино}-1-оксопропан-2-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=880 (М+Н)⁺.

23.9 мг (0.03 ммоль) бензил [(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]амино}-1-оксопропан-2-ил]карбамата растворяли в 3.0 мл этилацетата, добавляли 2.4 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при стандартном давлении в течение 2 ч. Реакционную смесь фильтровали через бумажный фильтр и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза. Это приводило к получению 20.1 мг (90% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-([4-(L-аланиламино)бензоил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=746 (М+Н)⁺.

20.0 мг (0.03 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-([4-(L-аланиламино)бензоил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата сначала загружали вместе с 14.9 мг (0.04 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината в 2.0 мл ДМФА и добавляли 5.4 мг (0.05 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=979 (М+Н)⁺.

17.0 мг (17.4 мкмоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида растворяли в 2.5 мл этилацетата, добавляли 1.7 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при стандартном давлении в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через бумажный фильтр и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.3 мг (60% от теории) соединения L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=845 (М+Н)⁺.

15.3 мг (0.01 ммоль) L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида сначала загружали вместе с 7.9 мг (0.02 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 2.4 мл ДМФА и добавляли 1.9 мг (0.02 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 1.4 мг (0.02 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.7 мг (70% от теории) соединения N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида.

11.7 мг (0.01 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-гамма-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]карбамоил)фенил]-L-аланинамида растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 3.9 мг (0.03 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 8.3 мг (0.03 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.4 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=1100 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F236

(2R)-2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F192 из соединения (2R)-4-{[(бензилокси)карбонил]амино}-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота / N-циклогексилциклогексанамин (1:1).

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.1 мин; МС (ESI положит.): m/z=751 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F238

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-1-амино-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропан-2-ил}-N'-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]сукцинамид (1:1)

18 мг (0.025 ммоль) Промежуточного соединения С72 вносили в 6 мл ДМФА и сочетали с 7.5 мг (0.03 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) в присутствии 11.3 мг (0.03 ммоль) HATU и 22 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Это приводило к получению 15 мг (67% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.71 мин; МС (EI положит.): m/z=873 [M+Na]⁺.

Указанное в заголовке соединение затем получали из этого промежуточного соединения путем снятия защиты хлоридом цинка в 4 мл трифторэтанола, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8.5 мг (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=707 (M+Na)⁺.

Промежуточное соединение F239

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 7.5 мг (0.05 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты сначала загружали в 1.5 мл ДМФА и добавляли 7.5 мг (0.05 ммоль) HOBt, 15.5 мг (0.05 ммоль) TBTU и 6.2 мг (0.05 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 40.0 мг (0.05 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71), растворенного в 1.5 мл ДМФА, и 18.7 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250x30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.2 мг (25% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=854 (М+Н)⁺.

10.9 мг (12.8 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 10.4 мг (76.6 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Добавляли 22.4 мг (0.08 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 7.5 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (ESI положит.): m/z=710 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F240

Трифторуксусная кислота / 3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)пропанамид (1:1)

27.5 мг (0.04 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали вместе с 15.9 мг (0.05 ммоль) соединения трифторуксусная кислота N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L1) в 1.8 мл ацетонитрила. Затем добавляли 32.4 мг (0.31 ммоль) N,N-диизопропилзтиламина, и по каплям добавляли 32.4 мг (0.05 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.9 мг (35% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=881 (М+Н)⁺.

11.9 мг (0.01 моль) 2-(триметилсилил)этил-[13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил]карбамата растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 5.5 мг (0.04 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 11.8 мг (0.04 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.4 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F241

Трифторуксусная кислота/ (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[N-(бромацетил)глицил]амино}этил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично из Промежуточного соединения С66 путем сочетания с коммерчески доступным 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-дионом и последующего деблокирования хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (EI положит.): m/z=733 и 735 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F242

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)бутанамид (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F104.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=707 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F243

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этил]бутанамид (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения проводили аналогично Промежуточному соединению F242.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F244

N-{2-[(S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеинил)амино]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид

100 мг (приблизительно 0.101 ммоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[3-(триметилсилил)пропаноил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С73) сначала загружали в 88 мл диметилформамида и добавляли 107 мг (приблизительно 0.15 ммоль) N-(2-аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамида (Промежуточное соединение L73), 46 мг (0.12 ммоль) HATU и 88 мкл (0.50 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли смесь вода/дихлорметан, и органическую фазу затем промывали водой и солевым раствором, сушили над сульфатом магния, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 92 мг (59%, чистота 72%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.59 мин; МС (ESI положит.): m/z=1096 (М+Н)⁺.

В атмосфере аргона 40 мг (0.30 ммоль) хлорида цинка добавляли к раствору 91 мг (приблизительно 0.06 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [(9R)-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-20-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,10,15-триоксо-9-{[3-(триметилсилил)пропаноил]амино}-7-тиа-4,11,14-триазаэйкоз-1-ил]карбамата в 1.45 мл трифторэтанола. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 30 мг (0.22 ммоль) хлорида цинка, и смесь перемешивали при КТ в течение еще 1 ч. Добавляли 52 мг (0.18 ммоль) EDTA, и после 10 минут перемешивания при КТ реакционную смесь немного разбавляли смесью вода/ацетонитрил и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 17 мг (31%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.80 мин; МС (ESI положит.): m/z=808 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F245

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутил}-N'-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)сукцинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 10 мг (0.0135 ммоль) Промежуточного соединения С65 с 8 мг (0.027 ммоль) Промежуточного соединения L1 в 8 мл ДМФА в присутствии 15 мг (0.04 ммоль) HATU и 9 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8.8 мг (58% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=778 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F247

Трифторуксусная кислота / метил 4-[(2-{[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-2-бром-4-оксобутаноат (1:1)

14 мг (0.018 ммоль) Промежуточного соединения С66 растворяли в 14 мл ДХМ и добавляли 10.1 мг (0.037 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния (ВЕР) и, небольшими порциями, в общей сложности 250 мкл пиридина, поддерживая рН в диапазоне между 5 и 6. рН затем доводили до 4 с помощью уксусной кислоты, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Объединение соответствующих фракций, лиофилизация и сушка давали 4 мг (21% от теории) защищенного промежуточного соединения, с аминной функции которого затем снимали защиту хлоридом цинка. ВЭЖХ очистка и лиофилизация приводила к получению 3 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения в виде бесцветной пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=805 и 807(М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F248

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этил}бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 10 мг (0.015 ммоль) Промежуточного соединения С58 с 5 мг (0.017 ммоль) Промежуточного соединения L12 в присутствии HATU и последующего снятия защиты хлоридом цинка. Это приводило к получению 6.5 мг (52% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=680 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F254

Трифторуксусная кислота / метил (3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-бром-4-оксобутаноат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению 247 путем сочетания 15 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения С66 с 21 мг (0.099 ммоль) (2S)-2-бром-4-метокси-4-оксобутановой кислоты, которую синтезировали, как описано в (J. Org. Chem. 200, 65, 517-522) из гидрохлорида (2S)-2-амино-4-метокси-4-оксобутановой кислоты (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=805 и 807 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F255

R/S-(N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил})гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

13.1 мг (0.04 ммоль) (2S)-5-(бензилокси)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-5-оксопентановой кислоты сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 5.4 мг (0.04 ммоль) HOBt, 11.4 мг (0.04 ммоль) TBTU и 4.6 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 30.0 мг (0.04 ммоль) соединения R/S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С11), растворенного в 12.9 мг (0.1 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 32 мг (73%) соединения 4-[2-[[(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил]-[3-(2-триметилсилилэтоксикарбониламино)пропил]амино]-2-оксоэтил]сульфанил-2-[[(2S)-5-бензилокси-2-(бензилоксикарбониламино)-5-оксо-пентаноил]амино]бутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=1084 (М+Н)⁺.

41.4 мг (0.038 ммоль) 4-[2-[[(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил]-[3-(2-триметилсилилэтоксикарбониламино)пропил]амино]-2-оксоэтил]сульфанил-2-[[(2S)-5-бензилокси-2-(бензилоксикарбониламино)-5-оксо-пентаноил]амино]бутановой кислоты растворяли в 10 мл этанола, добавляли 4.2 мг Pd/C и смесь гидрировали при нормальном давлении. Реакционную смесь фильтровали через картонный фильтр и остаток на фильтре промывали этанолом. Растворитель упаривали при пониженном давлении без нагревания. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 21.1 мг (56%) соединения R/S-(L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил))гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.11 мин; МС (ESI положит.): m/z=860 (М+Н)⁺.

20.4 мг (20.94 мкмоль) соединения R/S-(L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил))гомоцистеин / трифторуксусная кислота (1:1) сначала загружали вместе с 11.8 мг (23.04 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида в 1.0 мл ДМФА и добавляли 4.2 мг (41.88 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 3.1 мг (0.05 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9.5 мг (36%) соединения R/S-(N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил))гомоцистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.66 мин; МС (ESI положит.): m/z=1259 (М+Н)⁺.

9.4 мг (7.47 мкмоль) R/S-(N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-альфа-глутамил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил))гомоцистеина растворяли в 1.5 мл трифторэтанола и добавляли 6.1 мг (44.81 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Добавляли 13.1 мг (0.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 6.9 мг (75%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=1114 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F256

Трифторуксусная кислота / N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутил}-N'-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этил]сукцинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 10 мг (0.014 ммоль) Промежуточного соединения С65 и 9.6 мг (0.027 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / N-[2-(2-аминоэтокси)этил]-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 8 мг (64% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=822 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F257

R-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азаоктадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

50.0 мг (0.06 ммоль) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) и 29 мг (0.07 ммоль) 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропановой кислоты (Промежуточное соединение L74) растворяли в 3.0 мл ДМФА и добавляли 27.3 мг (0.07 ммоль) HATU и 23.3 мг (0.18 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 часов. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 17.4 мг (26%) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азаоктадекан-1-оил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=1101 (М+Н)⁺.

17 мг (0.02 ммоль) R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азаоктадекан-1-оил]-L-цистеина растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 6.3 мг (0.05 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 13.5 мг (0.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.6 мг (46%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=957 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F258

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-[3-{2-[(бромацетил)амино]этил}амино)-3-оксопропил]бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания Промежуточного соединения С58 с соединением трифторуксусная кислота / бензил [2-(бета-аланиламино)этил]карбамат (1:1), используя HATU, следующего за этим гидрогенолиза, и с последующим сочетанием с 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-дионом и в заключение снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=747 и 749 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F259

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметил пропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[N-(бромацетил)глицил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

75 мг (0.114 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 12.5 мл ДМФА и сочетали с 78 мг (0.171 ммоль) Промежуточного соединения L75 в присутствии 65 мг (0.11 ммоль) HATU и 79 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в 20 мл этанола и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводила к получению 63 мг (64% от теории за 2 стадии) 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.16 мин; МС (EI положит.): m/z=844 [М+Н]⁺.

40 мг (0.047 ммоль) этого промежуточного соединения затем сочетали, как описано выше, с N-[(бензилокси)карбонил]глицином в присутствии HATU и затем снова снимали защиту гидрогенолитически.

Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания 10 мг (0.012 ммоль) этого промежуточного соединения с 7.7 мг (0.032 ммоль) коммерчески доступного 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-диона в присутствии 4 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 1.3 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=777 и 779 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F260

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению F155.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=1020 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F261

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{2-[(бромацетил)амино]этокси}этил)бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 20 мг (0.03 ммоль) Промежуточного соединения С58 с 25.8 мг (0.061 ммоль) Промежуточного соединения L77 в присутствии HATU и последующего снятия защиты хлоридом цинка. Это приводило к получению 11.9 мг (47% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=722 и 720 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F262

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

30 мг (36 мкмоль) соединения S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) вместе с 16.9 мг (40 мкмоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-[2-(2-{3-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-3-оксопропокси}этокси)этил]пропанамида сначала загружали в 1.5 мл ДМФА и добавляли 10.9 мг (108 мкмоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли 7.58 мг (0.13 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 33.4 мг (80% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=1027 (М+Н)⁺.

32.8 мг (32 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеина растворяли в 3.0 мл трифторэтанола и добавляли 26.1 мг (192 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Добавляли 56.0 мг (0,192 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 22.9 мг (71% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=883 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F263

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

30.0 мг (0.036 ммоль) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) и 9.8 мг (0.04 ммоль) N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланина (Промежуточное соединение L78) растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 16.4 мг (0.04 ммоль) HATU и 14.0 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 часов. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.2 мг (13%) соединения N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=925 (М+Н)⁺.

11.3 мг (0.011 ммоль) N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 5.0 мг (0.04 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 часов. Добавляли 10.7 мг (0.04 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.4 мг (40%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=781 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F264

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

30.0 мг (0.036 ммоль) соединения R-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) и 12.2 мг (0.04 ммоль) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланина (Промежуточное соединение L79) растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 16.4 мг (0.04 ммоль) HATU и 14.0 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 часов. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 8.9 мг (24%) соединения N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=981 (М+Н)⁺.

15.3 мг (0.015 ммоль) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 6.3 мг (0.045 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 часов. Добавляли 13.5 мг (0.045 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9.1 мг (62%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.92 мин; МС (ESI положит.): m/z=837 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F265

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-6,17-диоксо-10,13-диокса-3-тиа-7,16-диазадокозан-1-амид (1:1)

30.0 мг (42.7 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) и 25.3 мг (55.6 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1) (Промежуточное соединение L82) сначала загружали в 1.9 мл ацетонитрила и добавляли 60 мкл (340 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 33 мкл (56 мкмоль) 50% 2,4,6-трипропил-1,3,5,2,4,6-триоксатрифосфинан 2,4,6-триоксида в этилацетате. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду (2.0 мл), и очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 26.7 мг (60% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,10,21 -триоксо-14,17-диокса-7-тиа-4,11,20-триазагексакоз-1-ил] карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.40 мин; МС (ESI положит.): m/z=1025 (М+Н)⁺.

25.3 мг (24.7 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,10,21-триоксо-14,17-диокса-7-тиа-4,11,20-триазагексакоз-1-ил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 20.2 мг (148 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 43.3 мг (148 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 23.4 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=881 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F266

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,13-диоксо-6,9-диокса-16-тиа-3,12-диазаоктадекан-18-амид (1:1)

30.0 мг (0.043 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали вместе с 22.2 мг соединения (0.056 ммоль) трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L83) в 1.9 мл ацетонитрила. Затем добавляли 60 мкл (0.34 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 33 мкл (0.056 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду (2.0 мл). Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 20.5 мг (49% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [19-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,13,18-триоксо-6,9-диокса-16-тиа-3,12,19-триазадокозан-22-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=969 (М+Н)⁺.

19.1 мг (19.7 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [19-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,13,18-триоксо-6,9-диокса-16-тиа-3,12,19-триазадокозан-22-ил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 16.1 мг (118 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 34.6 мг (118 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 13.9 мг (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=825 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F267

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 13.4 мг (33.3 мкмоль) 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-овой кислоты (Промежуточное соединение L74) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 9.3 мкл (54.4 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 12.6 мг (33.3 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 25.0 мг (27.7 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеинил-бета-аланин / трифторуксусная кислота (1:1) (см. синтез Промежуточного соединения F216), растворенного в 4.7 мкл (27.7 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 90 минут. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 6.90 мг (19% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеинил-бета-аланина.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=1172 (М+Н)⁺.

6.70 мг (5.71 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеинил-бета-аланина растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 4.67 мг (34.3 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 10 мг (34.3 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.4 мг (67% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=1028 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F268

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-28-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-6,23-диоксо-10,13,16,19-тетраокса-3-тиа-7,22-диазаоктакозан-1-амид (1:1)

30.0 мг (0.043 ммоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали вместе с 30.2 мг (0.056 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1) (Промежуточное соединение L84) в 2.0 мл ацетонитрила. Затем добавляли 60 мкл (0.34 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 33 мкл (0.056 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду (2.0 мл). Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 27.9 мг (59% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил[4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-32-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,10,27-триоксо-14,17,20,23-тетраокса-7-тиа-4,11,26-триазадотриаконт-1-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=1114 (М+Н)⁺.

25.6 мг (23.0 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-32-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-5,10,27-триоксотриоксо-14,17,20,23-тетраокса-7-тиа-4,11,26-триазадотриаконт-1-ил]карбамата растворяли в 2.5 мл трифторэтанола и добавляли 18.8 мг (138 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 40.3 мг (138 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 22.2 мг (88% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=969 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F269

4-{[(8R,14R)-13-(3-Аминопропил)-14-[l-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-lH-пиррол-2-ил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-8-ил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

17.0 мг (0.0195 ммоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеина (Промежуточное соединение С77) сначала загружали вместе с 4.99 мг (0.0253 ммоль) N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамида (Промежуточное соединение L1) в 1.0 мл ацетонитрила. Затем добавляли 27 мкл (0.16 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 15 мкл (0.025 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду (2.0 мл). Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9.5 мг (46% от теории) соединения трет-бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-23-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-5-окса-14-тиа-7,11,18,21-тетрааза-2-силатрикозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=1052 (М+Н)⁺.

8.3 мг (7.89 мкмоль) трет-бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-23-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-5-окса-14-тиа-7,11,18,21-тетрааза-2-силатрикозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноата растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 6.45 мг (47.3 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 6 ч. Добавляли 6.45 мг (47.3 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение ночи. Добавляли 27.7 мг (94.6 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.10 мг (14% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=852 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F270

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-N'-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)сукцинамид (1:1)

В атмосфере аргона 15.0 мг (22.9 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-овой кислоты (Промежуточное соединение С78) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 8.0 мкл (45.8 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 10.4 мг (27.4 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 8.54 мг соединения (27.4 мкмоль) трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L1), растворенного в 4.0 мкл (22.9 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 14.7 мг (77% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил } {4-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-4-оксобутаноил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=835 (М+Н)⁺.

13.2 мг (15.8 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{4-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-4-оксобутаноил}амино)пропил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 12.9 мг (94.8 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 27.7 мг (94.6 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.9 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=691 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F271

4-{[(20R,26R)-25-(3-Аминопропил)-26-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-27,27-диметил-2,19,24-триоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,18,25-триазаоктакозан-20-ил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 19.4 мг (22.2 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеина (Промежуточное соединение С77) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 21.7 мг (44.4 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L74), 12 мкл (67 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 16.9 мг (44.4 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 18.1 мг (66% от теории) соединения трет-бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-35-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-6,12,17,34-тетраоксо-5,21,24,27,30-пентаокса-14-тиа-7,11,18,33-тетрааза-2-силапентатриаконтан-16-ил]амино}-4-оксобутаноата.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=1.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=1250 (M+Na)⁺.

18.1 мг (14.7 мкмоль) трет-бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-35-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-6,12,17,34-тетраоксо-5,21,24,27,30-пентаокса-14-тиа-7,11,18,33-тетрааза-2-силапентатриаконтан-16-ил]амино}-4-оксобутаноата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 12.0 мг (88.4 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 4 ч. Добавляли 25.8 мг (88.4 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 12.3 мг (73% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=1028 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F272

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-N'-[17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагептадец-1-ил]сукцинамид (1:1)

В атмосфере аргона 15.0 мг (22.9 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-овой кислоты (Промежуточное соединение С78) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 8.0 мкл (45.8 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 10.4 мг (27.4 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 13.4 мг (27.4 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L85), растворенного в 4.0 мкл (22.9 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.8 мг (68% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [23-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,19,22-триоксо-6,9,12,15-тетраокса-3,18,23-триазагексакозан-26-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z=1011 (М+Н)⁺.

15.1 мг (14.9 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [23-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,19,22-триоксотриоксо-6,9,12,15-тетраокса-3,18,23-триазагексакозан-26-ил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 12.2 мг (89.6 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 26.2 мг (89.6 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.3 мг (70% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=867 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F273

Трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,19-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,18-диазатетракозан-24-амид (1:1)

В атмосфере аргона 20.0 мг (28.5 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 10.0 мкл (57.0 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 13.0 мг (34.2 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 16.7 мг (34.2 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1) (Промежуточное соединение L85), растворенного в 5.0 мкл (28.5 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 18.6 мг (62% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [25-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,19,24-триоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,18,25-триазаоктакозан-28-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=1057 (М+Н)⁺.

17.1 мг (16.2 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил [25-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,19,24-триоксотриоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,18,25-триазаоктакозан-28-ил]карбамата растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 13.2 мг (97.0 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 28.4 мг (97.0 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9.80 мг (59% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=913 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F274

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

13.9 мг (0.0167 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) сначала загружали вместе с 7.07 мг (0.0217 ммоль) N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланина (Промежуточное соединение L86) в 2.0 мл ацетонитрила. Затем добавляли 23 мкл (0.13 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и по каплям добавляли 13 мкл (0.022 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 3.70 мг (19% от теории) соединения N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=1024 (М+Н)⁺.

10.6 мг (10.3 мкмоль) N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 8.46 мг (62.1 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 18.1 мг (62.1 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.60 мг (54% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.69 мин; МС (ESI положит.): m/z=880 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F275

N-[3-({2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-L-альфа-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

39.0 мг (55.6 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали в 4.0 мл ДМФА, добавляли 41.6 мг (111 мкмоль) гидрохлорида 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-L-глутамата (1:1) (Промежуточное соединение L89), 29 мкл (170 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 42.3 мг (111 мкмоль) HATU, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 53.1 мг (93% от теории) соединения 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-L-глутамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=1021 [М+Н]⁺.

В атмосфере аргона 7.60 мг (33.9 мкмоль) ацетата палладия (II) сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 14 мкл (100 мкмоль) триэтиламина и 110 мкл (680 мкмоль) триэтилсилана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин и добавляли 69.2 мг (67.7 мкмоль) 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-L-глутамата, растворенного в 3.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через картонный фильтр и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 38.4 мг (61% от теории) соединения (19S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-19-{3-оксо-3-[2-(триметилсилил)этокси]пропил}-5-окса-14-тиа-7,11,18-триаза-2-силаэйкозан-20-овой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=931 (М+Н)⁺.

10.0 мг (10.7 мкмоль) (19S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-19-{3-оксо-3-[2-(триметилсилил)этокси]пропил}-5-окса-14-тиа-7,11,18-триаза-2-силаэйкозан-20-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли 6.73 мг (21.5 мкмоль) соединения N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид / 2,2,2-трифторэтан-1,1-диол (1:1) (Промежуточное соединение L1), 5.6 мкл (32 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 8.17 мг (21.5 мкмоль) HATU, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 часов, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 6.90 мг (58% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N2-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-L-альфа-глутамината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=1110 [М+Н]⁺.

6.90 мг (6.21 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил N²-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-L-альфа-глутамината растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 5.1 мг (37.2 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Добавляли 5.1 мг (37.2 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Добавляли 5.1 мг (37.2 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Добавляли 10.1 мг (74.4 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение ночи и при КТ в течение 72 ч. Добавляли 54.5 мг (186 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.4 мг (39% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=866 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F276

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 9.08 мг (28.9 мкмоль) 3-[2-(2-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропановой кислоты (Промежуточное соединение L87) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 8.33 мкл (48.2 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 11.0 мг (28.9 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Затем добавляли 20.0 мг (27.7 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71), растворенного в 4.67 мкл (24.1 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 1.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.70 мг (19% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-lH-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=1013 (М+Н)⁺.

13.9 мг (13.7 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноил}-L-цистеина растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 5.6 мг (41.2 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 5.6 мг (41.2 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 30 минут. Добавляли 24.1 мг (82.4 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10.8 мг (80% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=869 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F277

N-[3-({2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-3-[(бромацетил)амино]-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

8.90 мг (8.88 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-D-аланинат (1:1) (Промежуточное соединение С80) и 2.31 мг (9.77 мкмоль) 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-диона растворяли в 1 мл диметилформамида и добавляли 2.9 мкл (27 мкмоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.80 мг (65% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-[(бромацетил)амино]-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=1008 (М+Н)⁺.

5.80 мг (5.75 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-[(бромацетил)амино]-D-аланината растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 4.70 мг (34.5 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Добавляли 4.70 мг (34.5 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 5 ч. Добавляли 20.2 мг (69.0 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.70 мг (34% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.90 мин; МС (ESI положит.): m/z=764 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F278

N-[3-({2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

10.0 мг (9.98 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-D-аланинат (1:1) (Промежуточное соединение С80) и 2.77 мг (11.0 мкмоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 1 мл диметилформамида и добавляли 3.3 мкл (30 мкмоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 2.0 мкл (35 мкмоль) уксусной кислоты, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.50 мг (54% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (ESI положит.): m/z=1024 (М+Н)⁺.

5.50 мг (5.36 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-D-аланината растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 4.39 мг (32.2 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 4.39 мг (32.2 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли 4.39 мг (32.2 мкмоль) дихлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 4 ч. Добавляли 28.2 мг (96.5 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125x30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.70 мг (56% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=781 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F279

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[({(2R)-2-карбокси-2-[(3-карбоксипропаноил)амино]этил}сульфанил)ацетил]амино)пропил]-L-аланинамид

12.2 мг (14 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеина (Промежуточное соединение С77) растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 11.4 мг (83.8 мкмоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Добавляли 24.5 мг (83.8 мкмоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.60 мг (42% от теории) соединения 4-{[(1R)-2-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-1-карбоксиэтил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 (М+Н)⁺.

10.0 мг (12.7 мкмоль) соединения 4-{[(1R)-2-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-1-карбоксиэтил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1) и 7.41 мг (12.7 мкмоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланината (Промежуточное соединение L88) растворяли в 1.5 мл диметилформамида и добавляли 4.4 мкл (25 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Добавляли 2.0 мкл (35 мкмоль) уксусной кислоты, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.20 мг (39% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.11 мин; МС (ESI положит.): m/z=1036 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F280

Трифторуксусная кислота / N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)бензамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С64 путем сочетания с коммерчески доступным 1-(3-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}фенил)-1Н-пиррол-2,5-дионом и последующего снятия защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=755 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F281

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметил пропил} (гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[N-(бромацетил)-бета-аланил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего модифицированные аминокислотные структурные элементы N-(бромацетил)-бета-аланин и 2-(триметилсилил)этил-3-амино-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланинат получали классическими методами химии пептидов. Затем их сочетали в присутствии HATU и морфолина. трет-бутоксикарбонильную защитную группу затем удаляли, используя трифторуксусную кислоту 10% концентрации в дихлорметане, получая промежуточное соединение 2-(триметилсилил)этил 3-{[N-(бромацетил)-бета-аланил]амино}-D-аланинат.

В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого промежуточного соединения с Промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и 4-метилморфолина с последующим снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=791 и 793 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F282

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(3-{[N-(бромацетил)глицил]амино}пропил)бутанамид (1:1)

Прежде всего промежуточное соединение трифторуксусная кислота / N-(3-аминопропил)-N2-(бромацетил)глицинамид (1:1) получали из трет-бутил глицината и ангидрида бромуксусной кислоты классическими методами химии пептидов.

В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого промежуточного соединения с промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и 4-метилморфолина, с последующим снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=747 и 749 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F283

N-[(2R)-2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-2-карбоксиэтил]-N²-(бромацетил)-L-альфа-аспарагин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего модифицированный аминокислотный структурный элемент (2S)-2-[(бромацетил)амино]-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановую кислоту получали из (2S)-2-амино-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановой кислоты и ангидрида бромуксусной кислоты, и аминокислотный структурный элемент 2-(триметилсилил)этил-3-амино-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланинат получали из коммерчески доступного соединения 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланин / N-циклогексилциклогексанамин (1:1). Оба структурных элемента сочетали в присутствии HATU и морфолина и трет-бутоксикарбонильную защитную группу затем удаляли, используя трифторуксусную кислоту 5% концентрации в дихлорметане, обеспечивая силилэтильные сложноэфирные защитные группы и таким образом получая промежуточное соединение трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N-{(2R)-2-амино-3-оксо-3-[2-(триметилсилил)этокси]пропил}-N2-(бромацетил)-L-альфа-аспарагинат (1:1).

В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого промежуточного соединения с промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и 4-метилморфолина с последующим снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=835 и 837 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F284

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего промежуточное соединение L80 сочетали с коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем удаляли трет-бутоксикарбонильную защитную группу, используя трифторуксусную кислоту 16% концентрации в дихлорметане, обеспечивая силилэтильную сложноэфирную защитную группу.

В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого промежуточного соединения с промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=984.45 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F285

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-[(18-бром-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азаоктадекан-1-оил)амино]-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего промежуточное соединение L80 ацилировали коммерчески доступным ангидридом бромуксусной кислоты, и трет-бутоксикарбонильную защитную группу затем удаляли, используя трифторуксусную кислоту 20% концентрации в дихлорметане, обеспечивая силилэтильную сложноэфирную защитную группу.

В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого промежуточного соединения с промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=967 и 969 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F286

1-[(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-D-аланил)амино]-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего промежуточное соединение L91 сочетали с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем удаляли Boc защитную группу, используя ТФУ 12.5% концентрации в ДХМ. Полученное в результате промежуточное соединение сочетали с промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем превращали в указанное в заголовке соединение путем снятия защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=984 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F288

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-серил}амино)-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

35 мг (39 мкмоль) Промежуточного соединения С74 сочетали в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-серином, который был получен заранее из трет-бутил O-трет-бутил-L-серината и (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты. Осуществление снятия защиты хлоридом цинка и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 14 мг (38% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=824.34 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F289

N²-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-N⁶-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-D-лизин / трифторацетат (1:1)

Прежде всего соединение трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N⁶-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-D-лизинат (1:1) получали классическими методами химии пептидов из N⁶-[(бензилокси)карбонил]-N²-(трет-бутоксикарбонил)-D-лизина.

12.5 мг (25 мкмоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в присутствии HATU и 4-метилморфолина с 15 мг (23 мкмоль) Промежуточного соединения С58. Осуществление снятия защиты хлоридом цинка и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 14 мг (53% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=779 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F290

N²-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-N⁶-(бромацетил)-D-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего соединение трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N6-(бромацетил)-D-лизинат (1:1) получали классическими методами химии пептидов из N⁶-[(бензилокси)карбонил]-N²-(трет-бутоксикарбонил)-D-лизина.

12 мг (25 мкмоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в присутствии HATU и 4-метилморфолина с 15 мг (23 мкмоль) Промежуточного соединения С58. Осуществление снятия защиты хлоридом цинка и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 7 мг (36% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=762 и 764 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F291

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали из Примера М9 сперва путем сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли путем гидрирования в течение 1 часа над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода и затем промежуточное соединение со снятой защитой превращали в указанное в заголовке соединение путем сочетания с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=777 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F293

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)бензоил]амино}-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1)

35 мг (39 мкмоль) Промежуточного соединения С74 растворяли в 4 мл ДМФА и, в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, сочетали с 13.5 мг (43 мкмоль) коммерчески доступного 1-(3-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}фенил)-1Н-пиррол-2,5-диона. Осуществление снятия защиты хлоридом цинка и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 12 мг (34% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=799 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F294

N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-валил-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аланинамид

41 мг (0.05 ммоль) Промежуточного соединения С76, растворенного в 12 мл метанола, гидрировали над 10 мг 10% палладия на активированном угле при КТ в течение 1 ч при стандартном давлении водорода. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Это приводило к получению 32 мг (92% от теории) промежуточного соединения со снятой защитой.

15 мг (0.022 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в ДМФА и добавляли 13 мг (0.039 ммоль) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-диона и 7 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью ВЭЖХ. Это приводило к получению 9 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=895 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F295

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-[-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аланинамид

41 мг (0.05 ммоль) Промежуточного соединения С76, растворенного в 12 мл метанола, гидрировали над 10 мг 10% палладия на активированном угле при КТ в течение 1 ч при стандартном давлении водорода. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Это приводило к получению 32 мг (92% от теории) промежуточного соединения со снятой защитой.

15 мг (0.022 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 4 мл ДМФА и добавляли 10 мг (0.039 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона и 7 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 2 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью ВЭЖХ. Это приводило к получению 10 мг (56% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=821 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F296

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-{2-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)сульфонил]этил}бутанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения L81 путем сочетания с Промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 30 мин. Промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали путем сочетания с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение путем снятия защиты хлоридом цинка в указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=785 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F297

S-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(пирролидин-3-илметил)амино]-2-оксоэтил}-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Изомер 1)

В атмосфере аргона 15 мг (0.11 ммоль) хлорида цинка добавляли к раствору 36 мг (0.03 ммоль, чистота 68%) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С92) в 0.74 мл 2,2,2-трифторэтанола, и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 7 ч. Затем добавляли 32 мг (0.11 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 6.4 мг (25% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=792 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F298

S-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(пирролидин-3-илметил)амино]-2-оксоэтил}-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Изомер 2)

В атмосфере аргона 19 мг (0.14 ммоль) хлорида цинка добавляли к раствору 45 мг (0.04 ммоль, чистота 71%) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С91) в 0.94 мл 2,2,2-трифторэтанола, и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Затем добавляли 42 мг (0.14 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 5.7 мг (18% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=791 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F299

S-(2-{(3-Аминопропил)[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]амино}-2-оксоэтил)-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

К раствору 88.0 мг (0.09 ммоль) S-{11-[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С84) в 1.88 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 76.8 мг (0.57 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Затем добавляли 164.6 мг (0.57 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 31 мг (35% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=792 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F300

(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этил)бутанамид

К раствору 7 мг (0.08 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамата (Промежуточное соединение С100) в 0.2 мл 2,2,2-трифторэтанола в атмосфере аргона добавляли 11 мг (0.08 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 8 ч. Затем добавляли 14 мг (0.05 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 1.6 мг (27% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=707 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F302

Трифторацетат S-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(пирролидин-3-илметил)амино]-2-оксоэтил}-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина (1:1) (Изомер 1)

К смеси 56.9 мг (58.2 ммоль, чистота 85%) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С94) в 1.4 мл 2,2,2-трифторэтанола в атмосфере аргона добавляли 31.7 мг (0.23 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 3 ч. Затем добавляли 68.0 мг (0.23 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 7 мг (13% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=736 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F305

N-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-22-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-6,17-диоксо-N-(пирролидин-3-илметил)-10,13-диокса-3-тиа-7,16-диазадокозан-1-амид / трифторуксусная кислота (1:1) (Изомер 2)

К раствору 24.80 мг (0.02 ммоль) трет-бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-24-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,19-триоксо-12,15-диокса-5-тиа-2,9,18-триазатетракоз-1-ил]пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С99) в 0.65 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 13.42 мг (0.10 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 8 ч. Затем добавляли 28.78 мг (0.10 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 10 мг (44% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.11 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F306

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N2-{N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-бета-аланил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 24 мг (0.029 ммоль) Промежуточного соединения С61 с 30 мг (0.035 ммоль) Промежуточного соединения L99 в присутствии 16.7 мг (0.044 ммоль) HATU и 15 мкл N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано для Промежуточного соединения F119. Очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 19 мг (52% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=1091 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F307

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-S-{(5R,14R)-13-[(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-5-карбокси-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадец-1-ил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

8.90 мг (8.88 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-[-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-D-аланинат (1:1) (Промежуточное соединение С80) и 2.31 мг (9.77 мкмоль) 1-(2-бромацетокси)пирролидин-2,5-диона растворяли в 1 мл диметилформамида и добавляли 2.9 мкл (27 мкмоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.80 мг (65% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-[(бромацетил)амино]-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=1008 (М+Н)⁺.

2-(Триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-[(бромацетил)амино]-D-аланинат (31.9 мг, 31.6 мкмоль) и L-цистеин (7.66 мг, 63.2 мкмоль) растворяли в 3.0 мл ДМФА и перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 28.1 мг (76% от теории) соединения S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-19-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-5-окса-14-тиа-7,11,18,21-тетрааза-2-силатрикозан-23-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=1049 [М+Н]⁺.

Соединение S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-19-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-5-окса-14-тиа-7,11,18,21-тетрааза-2-силатрикозан-23-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (13.5 мг, 11.6 мкмоль) растворяли в 1.0 мл ДМФА, добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланинат (6.76 мг, 11.6 мкмоль) (Промежуточное соединение L88) и N,N-диизопропилэтиламин (4.0 мкл, 23 мкмоль) и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.1 мг (68% от теории) соединения N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-19-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-5-окса-14-тиа-7,11,18,21 -тетрааза-2-силатрикозан-23-ил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 14): R_t=7.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=1412 [М+Н]⁺.

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-19-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-5-окса-14-тиа-7,11,18,21-тетрааза-2-силатрикозан-23-ил]-L-цистеин (9.40 мг, 6.65 мкмоль) растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли дихлорид цинка (5.44 мг, 39.9 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли дихлорид цинка (5.44 мг, 39.9 мкмоль) и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (23.4 мг, 79.8 мкмоль), перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.60 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=1168 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F308

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[(12R,19R)-19-амино-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-12,19-дикарбокси-5,10,15-триоксо-7,17-дитиа-4,11,14-триазанонадец-1-ил]-L-аланинамид / трифторуксусная кислота (1:1)

Соединение N-[3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-3-[(бромацетил)амино]-D-аланин / трифторуксусная кислота (1:1) (12.7 мг, 14.5 мкмоль) и N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин (3.84 мг, 14.5 мкмоль) растворяли в 1.5 мл ДМФА и перемешивали при КТ в течение ночи.

Затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2.5 мкл, 14 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.40 мг (48% от теории) соединения S-{(5R,14R)-13-(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-5-карбокси-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадец-1-ил}-N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=949 [М+Н]⁺.

Соединение S-{(5R,14R)-13-(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-5-карбокси-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадец-1-ил}-N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (7.50 мг, 7.05 мкмоль) растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланинат (4.11 мг, чистота 82%, 7.05 мкмоль) (Промежуточное соединение L88) и N,N-диизопропилэтиламин (2.5 мкл, 14 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.30 мг (46%) соединения N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8,15-дикарбокси-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-5-окса-10,20-дитиа-7,13,16,23-тетрааза-2-силагексакозан-26-ил]-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 14): R_t=6.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=1312 [М+Н]⁺.

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8,15-дикарбокси-2,2-диметил-6,12,17,22-тетраоксо-5-окса-10,20-дитиа-7,13,16,23-тетрааза-2-силагексакозан-26-ил]-L-аланинамид (4.00 мг, 3.05 мкмоль) растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли дихлорид цинка (2.49 мг, 18.3 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч и затем к ней добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (5.34 мг, 18.3 мкмоль), реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.50 мг (64% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.00 мин; МС (ESI положит.): m/z=1168 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F309

4-{[(11R,17R)-16-(3-Аминопропил)-17-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-18,18-диметил-6,6-диоксидо-2,10,15-триоксо-6лямбда⁶,13-дитиа-3,9,16-триазанонадекан-11-ил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеин (50.0 мг, 57.3 мкмоль) (Промежуточное соединение С77) и соединение трифторуксусная кислота / бензил {2-[(2-аминоэтил)сульфонил]этил}карбамат (1:1) (27.5 мг, 68.7 мкмоль) (Промежуточное соединение L81) сначала загружали в 4.0 мл ДМФА и добавляли HATU (26.1 мг, 68.7 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламин (30 мкл, 170 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин и затем незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 53.9 мг (81%) соединения трет-бутил 4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}26,26-диметил-7,7-диоксидо-3,11,16,22-тетраоксо-1-фенил-2,23-диокса-7лямбда6,14-дитиа-4,10,17,21-тетрааза-26-силагептакозан-12-ил]амино}-4-оксобутаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.54 мин; МС (ESI положит.): m/z=1141 [М+Н]⁺.

В атмосфере аргона ацетат палладия(II) (5.12 мг, 22.8 мкмоль) сначала загружали в 3.0 мл ДХМ, добавляли триэтиламин (9.5 мкл, 68 мкмоль) и триэтилсилан (73 мкл, 460 мкмоль) и смесь перемешивали в течение 5 мин. Затем добавляли трет-бутил 4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}26,26-диметил-7,7-диоксидо-3,11,16,22-тетраоксо-1-фенил-2,23-диокса-7лямбда⁶,14-дитиа-4,10,17,21-тетрааза-26-силагептакозан-12-ил]амино}-4-оксобутаноат (52.1 мг, 45.6 мкмоль) в 2.0 мл ДХМ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем примешивали 2.0 мл воды. Растворители упаривали при пониженном давлении. К остатку добавляли ацетонитрил, и смесь фильтровали и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 43.4 мг (85%) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил 4-{[(16R)-23-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-21,21-диоксидо-6,12,17-триоксо-5-окса-14,21лямбда6-дитиа-7,11,18-триаза-2-силатрикозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноат (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=1007 [М+Н]⁺.

Соединение трифторуксусная кислота / трет-бутил 4-{[(16R)-23-амино-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-21,21-диоксидо-6,12,17-триоксо-5-окса-14,21лямбда⁶-дитиа-7,11,18-триаза-2-силатрикозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноат (1:1) (20.0 мг, 17.8 мкмоль) и (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусную кислоту (3.32 мг, 21.4 мкмоль) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли HATU (8.14 мг, 21.4 мкмоль) и N,N-диизопропилэтиламин (9.3 мкл, 54 мкмоль).

Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 17.4 мг (85%) соединения трет-бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-21,21-диоксидо-6,12,17,25-тетраоксо-5-окса-14,21лямбда6-дитиа-7,11,18,24-тетрааза-2-силагексакозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=1144 [М+Н]⁺.

трет-Бутил 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,2-диметил-21,21-диоксидо-6,12,17,25-тетраоксо-5-окса-14,21лямбда⁶-дитиа-7,11,18,24-тетрааза-2-силагексакозан-16-ил]амино}-4-оксобутаноат (15.9 мг, 13.9 мкмоль) растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли дихлорид цинка (11.4 мг, 83.4 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли дихлорид цинка (11.4 мг, 83.4 мкмоль) и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. Добавляли дихлорид цинка (11.4 мг, 83.4 мкмоль) и реакционную смесь перемешивали при 50°C в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (73.2 мг, 250 мкмоль), перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10 мг (68% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.45 мин; МС (ESI положит.): m/z=944 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F310

Трифторуксусная кислота / N-[(8R,14R)-13-(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-8-ил]-2,5,8,11-тетраоксатетрадекан-14-амид (1:1)

Соединение S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (100 мг, 120 мкмоль) (Промежуточное соединение С70) и 1-[(14-оксо-2,5,8,11-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]пирролидин-2,5-дион (44.1 мг, 132 мкмоль) сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 4-метилморфолин (40 мкл, 360 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, гасили уксусной кислотой (420 мкмоль) и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 69.4 мг (62% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(14-оксо-2,5,8,11-тетраоксатетрадекан-14-ил)-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.61 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=933 [М-Н]^-

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(14-оксо-2,5,8,11-тетраоксатетрадекан-14-ил)-L-цистеин (27.0 мг, 28.9 мкмоль) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (11.4 мг, 57.7 мкмоль) (Промежуточное соединение L1), N,N-диизопропилэтиламин (15 мкл, 87 мкмоль) и HATU (22.0 мг, 57.7 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 13.7 мг (43% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил {(16R)-21-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)карбамоил]-14,20-диоксо-2,5,8,11-тетраокса-18-тиа-15,21-диазатетракозан-24-ил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.54 мин; МС (ESI положит.): m/z=1114 [М+Н]⁺.

2-(Триметилсилил)этил {(16R)-21-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)карбамоил]-14,20-диоксо-2,5,8,11-тетраокса-18-тиа-15,21-диазатетракозан-24-ил}карбамат (13.7 мг, 12.3 мкмоль) растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли дихлорид цинка (10.1 мг, 73.8 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (21.6 мг, 73.8 мкмоль), перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 7.30 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=970 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение F311

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,30-диоксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

1-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-овую кислоту (10.8 мг, 18.7 мкмоль) (Промежуточное соединение L97) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли N,N-диизопропилэтиламин (5.4 мкл, 31.2 мкмоль) и HATU (7.10 мг, 18.7 мкмоль) и смесь перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли соединение S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (12.9 мг, 15.6 мкмоль) (Промежуточное соединение С71), растворенное в 1.0 мл ДМФА, и N,N-диизопропилэтиламин (2.7 мкл, 15.6 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и затем незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 3.5 мг (18%) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,30-диоксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-ил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.30 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=1276 [М-Н]^-.

S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,30-диоксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-ил]-L-цистеин (3.50 мг, 2.74 мкмоль) растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли дихлорид цинка (6.25 мг, 16.4 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (47 мкл, 16 мкмоль), перемешивали в течение 10 мин, и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.0 мг (59% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=1133 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F312

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(L-гамма-глутамиламино)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]-L-аланинамид / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С103 путем сочетания с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа. Промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали путем сочетания с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение путем снятия защиты хлоридом цинка и очистки с помощью препаративной ВЭЖХ в указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=992 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение F313

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-4-фторпирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

К раствору 55.0 мг (0.14 ммоль) 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-овой кислоты в 2.60 мл ДМФА в атмосфере аргона добавляли 16.9 мг (0.13 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 50.0 мг (0.13 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 40.0 мг (0.05 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-4-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С107) и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 10 мг (13% от теории, чистота 82%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=1145 (М+Н)⁺.

К раствору 10.9 мг (7.8 ммоль, чистота 82%) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-4-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеина в 0.85 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 4.3 мг (0.03 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. Затем добавляли 9.1 мг (0.03 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 2.3 мг (26% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t 0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=781 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F314

Трифторуксусная кислота / 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3S,4R)-4-фторпирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)пропанамид

К раствору 50.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-4-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение 106) в 3.14 мл ДМФА в атмосфере аргона добавляли 16.89 мг (0.13 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 33.13 мг (0.087 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 27.29 мг (0.09 ммоль) соединения N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид - трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L1), и смесь перемешивали при КТ в течение 15 минут. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 41 мг (68% от теории, чистота 66%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.55 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=959 (M-H+Na)^-.

К раствору 41.1 мг (0.03 ммоль, чистота 66%) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-14-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазатетрадец-1-ил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилата в 2.54 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 24.7 мг (0.18 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. Затем добавляли 53.0 мг (0.18 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 10 мг (36% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t 0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=781 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F315

S-(2-[(3-Аминопропил) {(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропаноил}-L-цистеин

К раствору 50.0 мг (0.07 ммоль) 3-[5-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановой кислоты (Промежуточное соединение L100) в 3.5 мл ДМФА в атмосфере аргона добавляли 18.02 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 31.82 мг (0.09 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 50.0 мг (0.07 ммоль) ацетата N-(2-аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамида (1:1) (Промежуточное соединение С107), и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 49 мг (21% от теории, чистота 31%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.30 мин; МС (ESI положит.): m/z=1022 (М+Н)⁺.

К раствору 49.0 мг (0.015 ммоль, чистота 31%) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропаноил}-L-цистеина в 0.5 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 8.0 мг (0.06 ммоль) хлорида цинка и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 17.2 мг (0.06 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 3 мг (21% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=877 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение F316

Трифторуксусная кислота / N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3S,4R)-4-фторпирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропаноил)амино]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

К раствору 50.0 мг (0.04 ммоль, чистота 65%) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-4-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение 106) в 3.0 мл ДМФА в атмосфере аргона добавляли 16.89 мг (0.13 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 33.13 мг (0.087 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 37.2 мг (0.09 ммоль, чистота 70%) ацетата N-(2-аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамида (1:1) (Промежуточное соединение L73), и смесь перемешивали при КТ в течение 7 минут. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 57 мг (77% от теории, чистота 59%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.60 мин; МС (ESI положит.): m/z=981 (М+Н)⁺.

К раствору 56.0 мг (0.03 ммоль, чистота 59%) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазаоктадец-1-ил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилата в 2.8 мл 2,2,2-трифторэтанола добавляли 36.0 мг (0.27 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 78.3 мг (0.27 ммоль) EDTA и смесь перемешивали в течение 15 минут. Реакционную смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 16 мг (44% от теории, чистота 85%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=837 (М+Н-АсОН)⁺.

Общий способ синтеза APDC или ADC предшественников (промежуточные соединения серии Q)

Вышеописанные промежуточные соединения F серии (F1-F305) можно превратить в APDC предшественник Q в соответствии со Схемой 1. В случае высвобождения N-концевой аминогруппы расщепляемого легумаином трипептида в молекуле APDC предшественника, ее можно модифицировать на последней стадии замещенными ацильными радикалами или алкильными радикалами различного строения с целью улучшения профиля свойств.

Иллюстративный способ описан ниже:

0.037 ммоль подходящего промежуточного соединения F1-F305, за исключением F194 и F294, или его соответствующим образом защищенного предшественника вносили в 1-20 мл, предпочтительно 5-10 мл, подходящего растворителя, например, ДМФА, ДМСО, ДХМ, хлороформа, толуола, ТГФ, метанола или их смеси, и добавляли 0.039 ммоль модифицированного по N-концу трипептидного производного, например, Промежуточного соединения L92, так же как и 0.041 ммоль стандартного реагента сочетания, например, HATU, EDCI/HOBT, ВЕР и т.п., и 0.11 ммоль стандартного основания, например, N,N-диизопропилэтиламина, триэтиламина, 4-метилморфолина и т.п. После перемешивания при КТ в течение 5 мин, смесь подкисляли 2 каплями трифторуксусной кислоты и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода.

Когда указанная N-концевая модификация присоединенного трипептидного производного представляет собой защитную группу, ее затем можно, равно как и любую защитную группу, все еще присутствующую в молекуле предшественника, отщепить известными способами, например, защитную группу Z - предпочтительно с помощью гидрогенолиза, защитную группу Boc - с помощью кислотного гидролиза, защитную группу Fmoc - с помощью основного гидролиза, или группу Теос - с помощью обработки фторидами или хлоридом цинка.

В заключение, таким образом высвобожденную аминогруппу можно ацилировать или алкилировать с целью улучшения профиля свойств, например, реагентами с реакционноспособными в отношении аминов группами, такими как активные сложные эфиры, хлорангидриды кислот, изоцианаты и т.п., или путем сочетания с производными карбоновой кислоты в присутствии стандартного реагента сочетания, например, HATU, EDCI/HOBT, ВЕР и т.п., и стандартного основания, например, N,N-диизопропилзтиламина, триэтиламина, 4-метилморфолина и т.п. Дальнейшие защитные группы, если они все еще присутствуют в молекуле, могут быть удалены на последней стадии.

Схема 1:

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) R22-COOH, EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²²-COOH, HATU, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²²-COOSu, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Кроме того, другие промежуточные соединения в соответствии со Схемами 2 и 3 можно превратить в расщепляемые легумаином предшественники ADC.

Схема 2:

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Схема 3:

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

В качестве альтернативы бензилоксикарбонильной группе, показанной на Схемах 1-3, можно использовать другие защитные группы, широко известные в химии пептидов, и присоединять их соответствующими способами, которые также известны. Выбор стратегии применения защитных групп осуществляют в соответствии с требованиями, известными специалистам в данной области, касающимися совместимости с другими структурными элементами, которые встречаются в молекуле. Если они все еще присутствуют, дальнейшие защитные группы в молекуле могут быть удалены на последней стадии.

Что касается последовательности их проведения, синтезы необязательно также можно проводить в ином порядке.

Кроме того, реакционноспособная в отношении белка группа в контексте линкерных структур L1-L2 может варьироваться в пределах объема формулы изобретения.

Промежуточное соединение Q1

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

30 мг (0.037 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 6 мл ДМФА и добавляли 16 мг (0.039 ммоль) Промежуточного соединения L92, 15.5 мг (0.041 ммоль) HATU и 0.11 ммоль N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 5 мин, смесь подкисляли 2 каплями трифторуксусной кислоты и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 21.5 мг (53% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=1083 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q2

N-Ацетил-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

30 мг (0.037 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 6 мл ДМФА и добавляли 14 мг (0.045 ммоль) Промежуточного соединения L93, 15.5 мг (0.041 ммоль) HATU и 0.112 ммоль N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 5 мин, добавляли еще 1.5 мг HATU и 0.01 ммоль N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 10 мин. Затем смесь подкисляли 2 каплями трифторуксусной кислоты и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 12.2 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=991 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q3

N-(3-Карбоксипропаноил)-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 5 мл ДМФА и добавляли 9.7 мг (0.02 ммоль) Промежуточного соединения L94, 8.5 мг (0.022 ммоль) HATU и 0.056 ммоль N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Затем смесь концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 5.7 мг (27% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=1149 (М+Н)⁺.

Это промежуточное соединение растворяли в 2 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 2.6 мг (0.019 ммоль) хлорида цинка, и смесь перемешивали при 50°С в течение 45 мин. Затем добавляли 5.6 мг (0.019 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и смесь разбавляли 3 мл смеси ацетонитрил/вода 9:1. Затем добавляли 10 мкл трифторуксусной кислоты, и смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 3.1 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=1049 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q4

Трифторуксусная кислота / N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N¹-[(11S,15R)-15-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-14-гликолоил-16,16-диметил-6,6-диоксидо-2,10-диоксо-6лямбда⁶-тиа-3,9,14-триазагептадекан-11-ил]-L-аспартамид (1:1)

5 мг (0.006 ммоль) Промежуточного соединения F296 вносили в 3 мл ДМФА и добавляли 2.8 мг (0.007 ммоль) Промежуточного соединения L92, как и 2.3 мг (0.006 ммоль) HATU и 0.017 ммоль N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 15 мин, смесь подкисляли 2 каплями трифторуксусной кислоты и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 0.93 мг (13% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=1175 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q5

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамид

55 мг смеси Промежуточного соединения С101 вносили в 33 мл ДМФА и добавляли 27.5 мг (0.067 ммоль) Промежуточного соединения L92, как и 28 мг (0.073 ммоль) HATU и 32 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Полученным таким образом сырой продукт сначала загружали в 4 мл ТГФ и добавляли 2 мл воды и 0.375 мл 2М раствора гидроксида лития. Смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем нейтрализовали 1 н. раствором хлористоводородной кислоты и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Получали 10.2 мг N-(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=904 (М+Н)⁺.

На следующей стадии защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа, и таким образом получали 7.5 мг (87% от теории) L-аланил-L-аланил-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.80 мин; МС (ESI положит.): m/z=770 (М+Н)⁺.

3.75 мг (0.005 ммоль) L-аланил-L-аланил-N¹-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамида вносили в 4 мл ДМФА и добавляли 1.72 мг (0.007 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона и 1.2 мкл (0.007 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.3 мг (29% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q6

N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-L-аланил-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамид

3.75 мг (0.005 ммоль) L-аланил-L-аланил-N¹-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аспартамидного промежуточного соединения, описанного в F5, вносили в 4 мл ДМФА и добавляли 2.2 мг (0.007 ммоль) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-диона и 1.2 мкл (0.007 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, затем концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.9 мг (27% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.04 мин; МС (ESI положит.): m/z=981 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q7

N-Ацетил-L-аланил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-({3-[(бромацетил)амино]пропил}амино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

4.1 мг (0.005 ммоль) Промежуточного соединения F282 вносили в 1 мл ДМФА и добавляли 1.7 мг (0.005 ммоль) Промежуточного соединения L93, 2.2 мг (0.006 ммоль) HATU и 0.6 мкл 4-метилморфолина. После 60 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 1.2 мг (24% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=1045 и 1047 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q8

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N¹-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-20-карбокси-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18,24-триоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,19,25-триазаоктакозан-28-ил]-L-аспартамид

6.80 мг (6.35 мкмоль) соединения S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение F257) и 2.71 мг (6.63 мкмоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина (Промежуточное соединение L92) растворяли в 1.0 мл ДМФА и добавляли 2.66 мг (6.98 мкмоль) HATU и 3.3 мкл (19 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 45 мин, смесь подкисляли 4 мкл трифторуксусной кислоты и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 1.20 мг (14% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=1346 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q9

5 мг (0.0062 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 2 мл ДМФА и добавляли 2.2 мг (0.0068 ммоль) Промежуточного соединения L95, 4.7 мг (0.012 ммоль) HATU и 5 эквивалентов N,N-диизопропилэтиламина. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 2 мг (32% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.28 мин; МС (ESI положит.): m/z=997 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q10

5 мг (0.0062 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 2 мл ДМФА и добавляли 2.2 мг (0.0068 ммоль) Промежуточного соединения L96, 5.9 мг (0.016 ммоль) HATU и 4 эквивалента 4-метилморфолина. После 2 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 2.5 мг (41% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=991 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q11

Трифторацетат N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамида (1:1)

7 мг (0.0087 ммоль) Промежуточного соединения F104 сочетали с Промежуточным соединением L103 по аналогии с Промежуточным соединением Q9. Это приводило к получению 3.5 мг (34% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=1068 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q12

Трифторацетат N-изоникотиноил-L-аланил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамида (1:1)

8 мг (0.0092 ммоль) Промежуточного соединения F104 сочетали с Промежуточным соединением L104 по аналогии с Промежуточным соединением Q9. Это приводило к получению 6 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=1054 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q13

N-{[2-(2-метоксиэтокси)этокси]ацетил}-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

7 мг (0.0087 ммоль) Промежуточного соединения F104 сочетали с Промежуточным соединением L105 по аналогии с Промежуточным соединением Q9. Это приводило к получению 4.6 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=1109 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q14

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-глутамид

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=1097 (М+Н)⁺.

Это промежуточное соединение получали аналогично Промежуточному соединению Q1.

Промежуточное соединение Q15

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-альфа-аспарагин

10 мг (0.012 ммоль) Промежуточного соединения F104 сочетали с Промежуточным соединением L106 по аналогии с Промежуточным соединением Q1. Затем, указанное в заголовке соединение получали путем расщепления сложного триметилсилилэтилового эфира хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.1 мин; МС (ESI положит.): m/z=1085 (М+Н)⁺.

По аналогии с Промежуточным соединением Q1, используя соответствующие предшественники промежуточных соединений, получали следующие промежуточные соединения Q16-Q22:

Промежуточное соединение Q16

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=1111 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q17

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-валил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=1111 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q18

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С111 путем сначала сочетания с промежуточным соединением L107 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты хлоридом цинка в трифторэтаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=1107 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q19

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-глицил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.06 мин; МС (ESI положит.): m/z=1069 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q20

N-(38-Оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-ил)-L-аланил-L-аланил-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-20-карбокси-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18,24-триоксо-6,9,12,15-тетраокса-22-тиа-3,19,25-триазаоктакозан-28-ил]-L-аспартамид

При 0°С 47.2 мг (0.0559 ммоль) Промежуточного соединения L102 вносили в 0.50 мл ДМФА и добавляли 7.2 мг (0.053 ммоль) HOAt, как и 20.2 мг (0.0532 ммоль) HATU и 74.1 мкл (0.425 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при 0°С в течение 5 мин, добавляли 57.0 мг (0.0532 ммоль) Промежуточного соединения F257 в ДМФА (0.5 мл). После перемешивания при 0°С в течение 2 ч, добавляли воду (1.0 мл) и ACN (1.5 мл). Смесь очищали два раза с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент = 1:2 → 2:1). Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 9.0 мг (9.5% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 14): R_t=5,43 мин; МС (ESI положит.): m/z=1783.8643 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q21

N-(38-Оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-ил)-L-аланил-L-аланил-N1-[(2S)-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

При 0°С 57.5 мг (0.0713 ммоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 0.80 мл ДМФА и добавляли 61.2 мг (0.0727 ммоль) Промежуточного соединения L102, как и 27.6 мг (0.0727 ммоль) HATU и 74.5 мкл (0.428 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при 0°С в течение 30 мин, добавляли воду (1.0 мл) и ACN (1.5 мл). Смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент = 45% → 85%). Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 39 мг (36% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 14): R_t=5,44 мин; МС (ESI положит.): m/z=1519.7598 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q22

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(L-гамма-глутамиламино)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С103, сперва путем сочетания с Промежуточным соединением L92 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в этаноле при стандартном давлении водорода при КТ в течение 30 минут, и промежуточное соединение со снятой защитой затем подвергали реакции с 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в ДМФА. На последней стадии снятие защиты осуществляли с помощью хлорида цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=1078 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q23

N-{5-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-L-аланил-N¹-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения М9, сперва путем сочетания с Промежуточным соединением L92 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в этаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 30 минут и промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали в указанное в заголовке соединение, как описано для Промежуточного соединения Q6, по реакции с 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дионом.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=938 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q24

Трифторацетат N-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аспартамида (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения М9, сперва путем сочетания с Промежуточным соединением L92 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в этаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 30 минут, и промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали в указанное в заголовке соединение по реакции с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=863 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q25

Трифторацетат N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-амино-5-карбоксипентил]амино}-3-оксопропил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамида (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С108, сперва путем сочетания с Промежуточным соединением L92 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ-метанол 1:1 при стандартном давлении водорода при КТ в течение 1 часа, и промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали в указанное в заголовке соединение по реакции с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение путем снятия защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=1106 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q26

Трифторацетат N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-амино-5-карбоксипентил]амино}-3-оксопропил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамида (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению Q25.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=1162 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q27

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С109, сначала путем сочетания с Промежуточным соединением L107 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты хлоридом цинка.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=1107 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q28

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С110, сперва путем сочетания с Промежуточным соединением L92 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии все защитные группы удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ-метанол 1:1 при стандартном давлении водорода при КТ в течение 1 часа и промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали в указанное в заголовке соединение по реакции с 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.74 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=1161 [М-Н]^-.

Промежуточное соединение Q29

N-{5-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-5-оксопентаноил}-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

40 мг (39 мкмоль) Промежуточного соединения С110 в 9 мл ДМФА в присутствии 30 мг HATU и 34 мкл N,N-диизопропилэтиламина сочетали с 19.6 мг (47 ммоль) Промежуточного соединения L92. Затем все защитные группы удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при стандартном давлении водорода при КТ в течение 1 часа и промежуточное соединение со снятой защитой затем превращали по реакции с 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в указанное в заголовке соединение, которое очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.9 мин; МС (ESI положит.): m/z=1181 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q30

N-{6-[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-N-метил-L-аланил-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

Прежде всего соединение трифторуксусная кислота / 4-нитробензил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагинат (1:1) получали путем сочетания N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланил-L-аланина с гидробромидом 4-нитробензил L-аспарагината (1:1) в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем снятия защиты с аминогруппы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=410 (М+Н)⁺.

Это промежуточное соединение сочетали с N-(трет-бутоксикарбонил)-N-метил-L-аланином в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, сложный n-нитробензиловый эфир расщепляли путем гидрирования в смеси ДХМ-метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=460 (М+Н)⁺.

Полученное таким образом промежуточное соединение сочетали с Промежуточным соединением С110 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, Boc защитную группу отщепляли путем перемешивания с 4 эквивалентами хлорида цинка в трифторэтаноле при 50°С в течение 1 ч.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=1235 (М+Н)⁺.

44 мг (32 мкмоль) этого промежуточного соединения объединяли с 25.4 мг (195 мкмоль) 6-оксогексановой кислоты, которая была получена заранее литературным методом (J. Org. Chem. 1993, 58, 2196), в 20 мл метанола и добавляли 7.8 мкл уксусной кислоты и 29 мг (313 мкмоль) комплекса боран-пиридин. Смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Получали 25 мг (56% от теории) (6S,13S,16S,19S,22S,25S)-16-(2-амино-2-оксоэтил)-13-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]этил}-6-[(бензилокси)карбонил]-19,22,25,26-тетраметил-3,8,12,15,18,21,24-гептаоксо-1-фенил-2-окса-7,11,14,17,20,23,26-гептаазадотриаконтан-32-овой кислоты.

24.5 мг (0.018 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 6 мл ДМФА и добавляли 34 мг (0.27 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона, 16 мкл N,N-диизопропилэтиламина и, порциями, в общей сложности 50 мг (0.13 ммоль) HATU. После перемешивания при КТ в течение 2 ч, реакционный раствор доводили до рН 3-4 с помощью ТФУ и затем концентрировали и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Получали 23 мг (87%) защищенного промежуточного соединения, которое затем вносили в 10 мл этанола. После добавления 10% палладия на активированном угле, сложноэфирные бензильные группы удаляли при стандартном давлении водорода и, после отфильтровывания катализатора, концентрирования оставшегося раствора и затем лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода 9:1, получали 20 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=1266 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q31

Трифторуксусная кислота / N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-1-({2-[(N²-ацетил-L-лизил)амино]этил}амино)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметил пропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем HATU сочетания Промежуточного соединения С112 с Промежуточным соединением L103 в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления Вое защитной группы путем перемешивания при 50°С в трифторэтаноле с 6 эквивалентами хлорида цинка в течение 30 мин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.76 мин; МС (ESI положит.): m/z=1101 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q32

N²-Ацетил-L-лизил-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-амино-5-карбоксипентил]амино}-3-оксопропил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего Промежуточное соединение С108 сочетали с Промежуточным соединением L92 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при стандартном давлении водорода при КТ в течение 1 часа. Затем промежуточное соединение со снятой защитой превращали в указанное в заголовке соединение по реакции с промежуточным соединением L109 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты путем перемешивания с 12 эквивалентами хлорида цинка в трифторэтаноле при 50°С в течение 90 мин.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.17 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=1137 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение Q33

N²-Ацетил-L-лизил-L-аланил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(L-гамма-глутамиламино)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем HATU сочетания Промежуточного соединения С103 с Промежуточным соединением L110 в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего полного снятия защиты путем перемешивания при 50°С в трифторэтаноле с 10 эквивалентами хлорида цинка в течение 6 ч.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.72 мин; МС (ESI положит.): m/z=1111 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q34

N²-Ацетил-L-лизил-L-аланил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(3-{[(1S)-1,3-дикарбоксипропил]амино}-3-оксопропил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

Синтез указанного в заголовке соединения начинали с HATU сочетания Промежуточного соединения С110 с промежуточным соединением L110 в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии сложноэфирную бензильную защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при стандартном давлении водорода при КТ в течение 1 часа. На последней стадии Теос защитную группу отщепляли путем перемешивания в трифторэтаноле при 50°С с 8 эквивалентами хлорида цинка в течение 6 ч.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=1140 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q35

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения F104, по аналогии с Промежуточным соединением Q1, сочетали с 10 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L111. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали 4 мг (17% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=1082 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q36

N-Ацетил-L-аланил-N-метил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения F104, по аналогии с Промежуточным соединением Q1, сочетали с 8 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L112. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали 5.8 мг (28% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=1005 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q37

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-({4-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-4-оксобутил}амино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

20 мг (31 мкмоль) Промежуточного соединения С114 сначала загружали вместе с 11.6 мг (22.9 мкмоль) соединения N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L104) в 5.0 мл ДМФА. Затем добавляли 11 мкл N,N-диизопропилэтиламина и 21 мг (55 мкмоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 60 минут. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Вслед за этим выполняли отщепление сложноэфирной трет-бутильной группы путем перемешивания при 50°С в трифторэтаноле с 6 экв. хлорида цинка в течение 2 часов. После добавления 6 экв. EDTA, очистку осуществляли с помощью препаративной ВЭЖХ. На последней стадии полученное промежуточное соединение вносили в ДМФА, добавляли 15 эквивалентов 1-гидроксипирролидин-2,5-диона и превращение в указанное в заголовке соединение осуществляли путем перемешивания в присутствии 5 экв. HATU и 5 экв. N,N-диизопропилэтиламина в течение 60 минут. Указанное в заголовке соединение очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=1071 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q38

N-Метил-N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения F104, по аналогии с Промежуточным соединением Q1, сочетали с 12.5 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L113. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали 4 мг (19% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=1082 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q39

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-(метиламино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

Указанное в заголовке соединение получали исходя из соединения С115 путем сочетания с Промежуточным соединением L107 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=920 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q40

N-{[2-(2-Метоксиэтокси)этокси]ацетил}-L-аланил-N-метил-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид

15 мг (0.019 ммоль) Промежуточного соединения F104, по аналогии с Промежуточным соединением Q1, сочетали с 12.5 мг (0.024 ммоль) Промежуточного соединения L114. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали 10.8 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=1123 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q41

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-аланил-L-аланил-N¹-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16,18-дикарбокси-5,10,14-триоксо-7-тиа-4,11,15-триазаоктадец-1-ил]-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овую кислоту (174 мг, чистота 94%, 234 мкмоль) (Промежуточное соединение С69) и соединение трифторуксусная кислота / дибензил бета-аланил-L-глутамат (1:1) (144 мг, 281 мкмоль) (Промежуточное соединение L115) сначала загружали в 4.0 мл ДМФА. К реакционной смеси добавляли HATU (107 мг, 281 мкмоль) и N,N-диизопропилэтиламин (120 мкл, 700 мкмоль), и перемешивали при КТ в течение 10 мин. Смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали водой и насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 229 мг (85% от теории) соединения дибензил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-бета-аланил-L-глутамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=1082 [М+Н]⁺.

Дибензил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-бета-аланил-L-глутамат (226 мг, 209 мкмоль) растворяли в 10 мл трифторэтанола. К реакционной смеси добавляли хлорид цинка (171 мг, 1.25 ммоль), и перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Добавляли еще две порции ZnCl₂, каждая по 6 экв., и смесь перемешивали при 50°С в течение 1 ч каждый раз. К смесь добавляли этилендиамин-N,N,Nʹ,Nʹ-тетрауксусную кислоту (1.10 г, 3.75 ммоль) и перемешивали в течение короткого периода. Реакционную смесь вносили в ацетонитрил, фильтровали через шприцевой фильтр и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 182 мг (83% от теории) соединения трифторуксусная кислота / дибензил N-[3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-бета-аланил-L-глутамат (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=938 [М+Н]⁺.

В атмосфере аргона соединение трифторуксусная кислота / дибензил N-[3-({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)пропаноил]-бета-аланил-L-глутамат (1:1) (55.0 мг, 52.3 мкмоль) и N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин (26.0 мг, 62.7 мкмоль) (Промежуточное соединение L92) сначала загружали в 2.5 мл ДМФА. К реакционной смеси добавляли HATU (23.9 мг, 62.7 мкмоль) и N,N-диизопропилэтиламин (27 мкл, 160 мкмоль), и смесь перемешивали при КТ в течение 10 мин. К смеси добавляли 1 мл воды (0.1% ТФУ) и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 54.6 мг (79% от теории) соединения дибензил (2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-амино-2-оксоэтил)-17-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-5,8-диметил-3,6,9,12,18,23,27-гептаоксо-1-фенил-2-окса-20-тиа-4,7,10,13,17,24-гексаазагептакозан-27-ил]амино}пентандиоата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=1328 [М+Н]⁺.

Дибензил (2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-амино-2-оксоэтил)-17-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-5,8-диметил-3,6,9,12,18,23,27-гептаоксо-1-фенил-2-окса-20-тиа-4,7,10,13,17,24-гексаазагептакозан-27-ил]амино}пентандиоат (53.3 мг, 40.1 мкмоль) растворяли в 3.0 мл этилацетата и 3.0 мл этанола и добавляли 10% палладий на активированном угле (5.37 мг). Реакционную смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении в течение ночи, и затем фильтровали через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывали этилацетатом и этанолом. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 5.6 мг (11% от теории) соединения L-аланил-L-аланил-N¹-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16,18-дикарбокси-5,10,14-триоксо-7-тиа-4,11,15-триазаоктадец-1-ил]-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=1014 [М+Н]⁺.

Соединение L-аланил-L-аланил-N¹-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-16,18-дикарбокси-5,10,14-триоксо-7-тиа-4,11,15-триазаоктадец-1-ил]-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1) (5.40 мг, 4.30 мкмоль) и 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дион (1.46 мг, 4.73 мкмоль) сначала загружали в 0.49 мл ДМФА. К реакционной смеси добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2.2 мкл, 13 мкмоль), и перемешивали при КТ в течение 4 ч 30 мин. К смеси добавляли 0.5 мл воды (0.1% ТФУ) и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 43.1 мг 4.10 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=1207 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q42

Трифторуксусная кислота / N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид (1:1)

Соединение трифторуксусная кислота / N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид (1:1) (10.0 мг, 10.9 мкмоль) (Промежуточное соединение С116) и N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланин (2.42 мг, 10.9 мкмоль) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА. К реакционной смеси добавляли HATU (4.95 мг, 13.0 мкмоль) и N,N-диизопропилэтиламин (9.5 мкл, 54 мкмоль), и перемешивали при КТ в течение 10 мин. К смеси добавляли 1.0 мл воды (0.1% ТФУ) и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 5.6 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.11 мин; МС (ESI положит.): m/z=1012 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Q43

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-альфа-аспарагил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

10 мг (0.011 ммоль) Промежуточного соединения С116 вносили в 4 мл ДМФА и добавляли 3.9 мг (0.012 ммоль) (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-трет-бутокси-4-оксобутановой кислоты и 6.2 мг (0.016 ммоль) HATU и 6 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 15 мин, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Получали 8.2 мг (68% от теории) защищенного промежуточного соединения, с которого затем снимали защиту с помощью 6 мг (0.044 ммоль) хлорида цинка в 4 мл трифторэтанола при 50°С. После добавления 13 мг (0.044 ммоль) EDTA с последующей ВЭЖХ очисткой получали 3 мг (35% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 мин; МС (ESI положит.): m/z=1056 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение Q44

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-альфа-аспарагил-N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид / трифторуксусная кислота (1:1)

10 мг (0.011 ммоль) Промежуточного соединения С116 вносили в 4 мл ДМФА и добавляли 5.3 мг (0.013 ммоль) (2S)-2-{[(2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}пропаноил]амино}-4-трет-бутокси-4-оксобутановой кислоты и 6.2 мг (0.016 ммоль) HATU и 6 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После перемешивания при КТ в течение 15 мин, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Получали 8 мг (57% от теории) защищенного промежуточного соединения, с которого затем снимали защиту с помощью 5 мг (0.037 ммоль) хлорида цинка в 2 мл трифторэтанола при 50°С. После добавления 11 мг (0.037 ммоль) EDTA с последующей ВЭЖХ очисткой получали 3.5 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.04 мин; МС (ESI положит.): m/z=1127 (М+Н)⁺.

В: Получение конъюгатов антитело/лекарственное средство (ADC)

В-1. Общий способ образования антител

Полную фаговую библиотеку антител человека (Hoet RM и др., Nat Biotechnol 2005; 23(3):344-8) использовали для выделения TWEAKR-специфических человеческих моноклональных антител путем пэннинга белка (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005;23(3):1105-16), используя димерные Fc-слитые внеклеточные домены человеческого и мышиного TWEAKR в качестве иммобилизованной мишени. Fab фаги идентифицировали, и соответствующие антитела переформатировали в формат IgG1 человека. Негликозилированное антитело ТРР-2658 образовывали путем введения мутации N297A в тяжелой цепи ТРР-2090 (система нумерации Кебота иммуноглобулинов). Полученное таким образом антитело использовали для рабочих примеров, описанных в настоящей заявке. Кроме того, антитела, которые связываются с TWEAKR, известны специалисту в данной области техники, см., например, WO 2009/020933(A2) или WO 2009140177 (А2).

Коммерчески доступные антитела цетуксимаб (торговое название: Эрбитукс), трастузумаб (торговое название: Герцептин; INN 7637, CAS №RN: 180288-69-1) и нимотузумаб (торговое название: CIMAher) использовали для рабочих примеров, описанных в настоящей заявке.

В случае трастузумаб-НС-N297A (соответствующего ТРР-7510), использовали тяжелую цепь с SEQ ID NO: 244. Легкая цепь была идентична легкой цепи из трастузумаба.

В случае трастузумаб-НС-N297Q (соответствующего ТРР-7511), использовали тяжелую цепь с SEQ ID NO: 245. Легкая цепь была идентична легкой цепи из трастузумаба.

В-2. Общий способ экспрессирования антител в клетках млекопитающих

Антитела, например, ТРР-2658, ТРР-7510 или ТРР-7511, продуцировали в транзиентных культурах клеток млекопитающих, как описано Tom и др., глава 12 в Methods Express: Expression Systems под редакцией Micheal R. Dyson и Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007.

B-3. Общий способ очистки антител из клеточных супернатантов

Антитела, например, ТРР-2658, ТРР-7510 или ТРР-7511, получали из супернатантов клеточных культур. Клеточные супернатанты очищали путем центрифугирования клеток. Клеточный супернатант затем очищали с помощью аффинной хроматографии на MabSelect Sure (GE Healthcare) хроматографической колонке. Для этой цели, колонку уравновешивали в DPBS рН 7.4 (Sigma/Aldrich), наносили клеточный супернатант и колонку промывали приблизительно 10 объемами колонки DPBS рН 7.4+500 мМ хлорид натрия. Антитела элюировали в 50 мМ ацетате натрия рН 3.5+500 мМ хлориде натрия и затем дополнительно очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) в DPBS рН 7.4.

Коммерчески доступные антитела очищали от коммерческих продуктов с помощью стандартных хроматографических методов (хроматография с белком А, препаративная гель-фильтрационная хроматография (SEC - эксклюзионная хроматография)).

В-4. Общий способ сочетания с цистеиновой боковой цепью

В реакциях сочетания использовали следующие антитела:

Примеры а: цетуксимаб (анти-EGFR AK)

Примеры е: трастузумаб (анти-Her2 AK)

Примеры i: нимотузумаб (анти-EGFR AK)

Примеры k: ТРР-2658 (анти-TWEAKR AK)

Реакции сочетания обычно проводили в атмосфере аргона.

От 2 до 5 эквивалентов гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), растворенного в PBS буфере, добавляли к раствору соответствующего антитела в PBS буфере в диапазоне концентраций между 1 мг/мл и 20 мг/мл, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 10 мг/мл до 15 мг/мл, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Для этой цели, раствор соответствующего применяемого антитела можно использовать при установленных концентрациях в рабочих примерах, или его необязательно можно также разбавлять PBS буфером до приблизительно половины установленных начальных концентраций для того, чтобы попасть в предпочтительный диапазон концентраций. Затем, в зависимости от предполагаемой загрузки, от 2 до 12 эквивалентов, предпочтительно приблизительно 5-10 эквивалентов соединения малеинимидного предшественника или соединения галогенидного предшественника, подлежащего сочетанию, добавляли в виде раствора в ДМСО. В данном случае количество ДМСО не должно превышать 10% от общего объема. Реакционную смесь перемешивали в случае малеинимидных предшественников в течение 60-240 мин при КТ, и в случае галогенидных предшественников в течение 8-24 ч при КТ, и затем наносили на PBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare) и элюировали PBS буфером. Обычно, если не указано иное, 5 мг рассматриваемого антитела в PBS буфере использовали для восстановления и последующего сочетания. В каждом случае очистка на PD10 колонке таким образом приводила к получению растворов соответствующих ADC в 3.5 мл PBS буфера. Образец затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и необязательно повторно разбавляли PBS буфером. При необходимости, для лучшего удаления низкомолекулярных компонентов, концентрирование с помощью ультрафильтрации повторяли после повторного разбавления PBS буфером. Для биологических исследований, при необходимости, концентрации конечных ADC образцов необязательно доводили до диапазона 0.5-15 мг/мл путем повторного разбавления. Определяли соответствующие концентрации белка, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. Кроме того, с использованием методов, описанных в В-7, определяли антительную нагрузку (отношение лекарственное средство/mAb).

В зависимости от линкера, ADC, показанные в примерах, также могут присутствовать в меньшей или большей степени в форме гидролизованных сукцинамидов с открытой цепью, присоединенных к антителам.

В частности KSP-I-ADC, присоединенные через линкер подструктуры

к тиольным группам антител, необязательно также можно получить целенаправленно путем повторного забуферивания после сочетания и перемешивания при рН 8 в течение приблизительно 20-24 ч в соответствии со Схемой 28 через ADC, присоединенные через сукцинамиды с открытой цепью.

#1 представляет собой серный мостик к антителу, и #2 представляет собой место присоединения к модифицированному KSP ингибитору.

Такие ADC, где линкер присоединен к антителу через гидролизованные сукцинамиды с открытой цепью, необязательно также можно получить целенаправленно с помощью иллюстративной методики, как описано ниже:

Сочетание в малом масштабе:

К раствору 2-5 мг соответствующего антитела в PBS буфере в диапазоне концентраций между 1 мг/мл и 20 мг/мл, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 5 мг/мл до 15 мг/мл, добавляли от 2 до 5 эквивалентов гидрохлорида трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), растворенного в PBS буфере, и смесь перемешивали при КТ в течение от 30 мин до 1 ч. Для этой цели, раствор применяемого антитела в каждом случае можно использовать в концентрации, указанной в рабочих примерах или же, при необходимости, разбавить его PBS буфером до приблизительно половины указанной начальной концентрации для того, чтобы попасть в предпочтительный диапазон концентраций. Затем, в соответствии с требуемой загрузкой, от 2 до 12 эквивалентов, предпочтительно приблизительно 5-10 эквивалентов, соединения малеимидного предшественника, подлежащего сочетанию, добавляли в виде раствора в ДМСО. Количество ДМСО в данном случае не должно превышать 10% от общего объема. Смесь перемешивали при КТ в течение 60-240 мин и затем разбавляли до объема 3-7 мл PBS буфером, который заранее доводили до рН 8, и перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare) уравновешенную до рН 7.2 PBS буфером, и элюировали PBS буфером рН 7.2. Вслед за этим выполняли концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2).

Сочетание в среднем масштабе:

В атмосфере аргона раствор 0.344 мг ТСЕР в 100 мкл буфера PBS добавляли к 60 мг рассматриваемого антитела в 5 мл буфера PBS (с~12 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.003 ммоль соединения малеинимидного предшественника, растворенного в 600 мкл ДМСО. После дополнительных 1.5 ч - 2 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь разбавляли 1075 мкл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8.

Этот раствор затем наносили на PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которые были уравновешены PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат разбавляли PBS буфером рН 8 до общего объема 14 мл. Этот раствор перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи. При необходимости, раствор затем повторно забуферивали до рН 7.2. Раствор ADC концентрировали с помощью ультрацентрифугирования, повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2) и затем необязательно концентрированный снова до концентрации приблизительно 10 мг/мл.

Другие потенциально чувствительные к гидролизу тианилсукцинимидные мостики к антителу в рабочих примерах содержат следующие линкерные подструктуры, где #1 представляет собой тиоэфирную связь к антителу, и #1 представляет собой место присоединения к модифицированному KSP ингибитору:

Эти линкерные подструктуры представляют собой связующую единицу к антителу и обладают (в дополнение к дальнейшим составным частям линкера) существенным влиянием на структуру и профиль метаболитов, образуемых в опухолевых клетках.

В показанных структурных формулах, AK₁ может означать

Примеры а: цетуксимаб (частично восстановленный) - S§¹

Примеры е: трастузумаб (частично восстановленный) - S§¹

Примеры i: нимотузумаб (частично восстановленный)- S§¹

Примеры k: анти-TWEAKR антитело ТРР-2658 (частично восстановленное) - S§¹

где

§¹ представляет собой связь к сукцинимидной группе или к любым изомерным гидролизованным сукцинамидным радикалам с открытой цепью или алкиленовому радикалу, образующемуся в результате этого,

и

S представляет собой атом серы остатка цистеина частично восстановленного антитела.

В-5. Общий способ сочетания с лизиновой боковой цепью

Для реакций сочетания использовали следующие антитела:

Примеры а: цетуксимаб (анти-EGFR AK)

Примеры е: трастузумаб (анти-Her2 AK)

Примеры i: нимотузумаб (анти-EGFR AK)

Примеры k: ТРР-2658 (анти-TWEAKR антитело)

Реакции сочетания обычно проводили в атмосфере аргона.

От 2 до 8 эквивалентов соединения предшественника, подлежащего сочетанию, добавляли в виде раствора в ДМСО к раствору рассматриваемого антитела в PBS буфере в диапазоне концентраций между 1 мг/мл и 20 мг/мл, предпочтительно приблизительно 10 мг/мл, в зависимости от предполагаемой загрузки. После перемешивания при КТ в течение 30 мин - 6 ч, снова добавляли такое же количество соединения предшественника в ДМСО. В данном случае количество ДМСО не должно превышать 10% от общего объема. После дополнительных 30 мин - 6 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь наносили на PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), уравновешенные PBS, и элюировали PBS буфером. Обычно, если не указано иное, для сочетания использовали 5 мг рассматриваемого антитела в PBS буфере. В каждом случае очистка на PD10 колонке таким образом приводила к получению растворов со ответствующих ADC в 3.5 мл PBS буфера. Образец затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и необязательно повторно разбавляли PBS буфером. При необходимости, для лучшего удаления низкомолекулярных компонентов, концентрирование с помощью ультрафильтрации повторяли после повторного разбавления PBS буфером. Для биологических исследований, при необходимости, концентрации конечных ADC образцов необязательно доводили до диапазона 0.5-15 мг/мл путем повторного разбавления.

Определяли соответствующие концентрации белка, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. Кроме того, с использованием методов, описанных в В-7, определяли антительную нагрузку (отношение лекарственное средство/mAb).

В показанных структурных формулах, AK₂ имеет следующее значение:

Примеры а: цетуксимаб -NH§²

Примеры е: трастузумаб -NH§²

Примеры i: нимотузумаб -NH§²

Примеры k: анти-TWEAKR антитело ТРР-2658 -NH-§²

где

§² представляет собой связь к карбонильной группе

и

NH представляет собой боковую цепь аминогруппы остатка лизина антитела.

В-5а. Общий способ синтеза ADC с помощью бактериальной трансглутаминазы

В реакциях сочетания в примерах серии t использовали следующие антитела (следующее далее название антитело-НС-N297Z означает антитело, где аминокислота N297 (номенклатура Кэбота) была заменена на аминокислоту Z в обеих тяжелых цепях, название TPP-XXXX-HC-Q295N-HC-N297Q означает антитело с ТРР-ХХХХ, где аминокислота Q295 (номенклатура Кэбота) была заменена на аминокислоту N и аминокислота N297 (номенклатура Кэбота) была заменена на аминокислоту Q в обеих тяжелых цепях. Название оригинального антитела может сообщаться либо как название (например, трастузумаб), либо как ТРР-ХХХХ (антитело с ТРР номером ХХХХ)):

AK_3a: анти-TWEAKR антитело ТРР-2658 (соответствующее ТРР-2090-HC-N297A)

AK_3b: анти-TWEAKR антитело ТРР-5442 (соответствующее ТРР-2090-HC-N297Q)

AK_3c: анти-TWEAKR антитело ТРР-8225 (соответствующее ТРР-2090-HC-Q295N-HC-N297Q)

AK_3d: ТРР-7510 (соответствующее трастузумаб-НС-М297А)

АК_3е: ТРР-7511 (соответствующее трастузумаб-HC-N297Q)

Общий способ для достижения максимального DAR 2:

К раствору 5 мг соответствующего аглико варианта антитела (HC-N297A, или HC-Q295N-HC-N297Q) в DPBS рН 7.4 (с ~ 5-15 мг/мл) добавляли 20 мкл (6 эквивалентов) раствора подходящего токсофор-линкерного предшественника (например, Промежуточного соединения Q31-Q34; 10 мМ раствор в ДМСО). После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 50 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до общего объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, объем ADC концентрировали с помощью прибора Amicon Ultracel-30K Zentrifugation (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS до объема 2.5 мл. В заключение, к раствору добавляли 0.00625 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 12.5 мкл DPBS. Определяли соответствующие концентрации белка, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. Кроме того, с использованием методов, описанных в В-7, определяли антительную нагрузку (отношение лекарственное средство/mAb).

Общий способ для достижения максимального DAR 4:

К раствору 5 мг соответствующего аглико варианта антитела (HC-N297Q) в DPBS рН 7.4 (с ~ 5-15 мг/мл) добавляли 16-24 эквивалентов раствора подходящего токсофор-линкерного предшественника (например, Промежуточного соединения Q31-Q34; 10 мМ раствор в ДМСО). После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 400 мкл (10 Ед) раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до общего объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, объем ADC концентрировали с помощью прибора Amicon Ultracel-30K Zentrifugation (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS до объема 2.5 мл. В заключение, к раствору добавляли 0.1 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 200 мкл DPBS. Определяли соответствующие концентрации белка, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. Кроме того, с использованием методов, описанных в В-7, определяли антительную нагрузку (отношение лекарственное средство/mAb).

Общий способ для опосредованного трансглутаминазой сочетания в масштабе для достижения максимального DAR 2:

К раствору 30 мг негликозилированного варианта (HC-N297A, HC-Q295N-HC-N297Q) отдельного антитела в DPBS рН 7.4 (с ~ 5-15 мг/мл) добавляли 6 эквивалентов раствора соответствующего токсофор-линкерного предшественника (10 мМ в ДМСО). После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 200 мкл (7.5 Ед) раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Реакционную смесь очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на Superdex 200 колонке (GE Healthcare) в DPBS рН 7.4 для отделения небольших молекул и трансглутаминазы от ADC. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирующей трубки Amicon Ultracel-30K (Millipore) до конечных концентраций 5-25 мг/мл. Раствор затем подвергали стерильной фильтрации.

Определяли соответствующие концентрации, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. С помощью методов, описанных в главе В7, определяли нагрузку. ADC партии характеризовали, как указано в рабочих примерах.

Общий способ для опосредованного трансглутаминазой сочетания в масштабе для достижения максимального DAR 4:

К раствору 30 мг негликозилированного варианта (HC-N297Q) отдельного антитела в DPBS рН 7.4 (с ~ 5-15 мг/мл) добавляли 16-24 эквивалентов раствора соответствующего токсофор-линкерного предшественника (10 мМ в ДМСО). После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 2400 мкл (60 Ед) раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Реакционную смесь очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) в DPBS рН 7.4 для отделения небольших молекул и трансглутаминазы от ADC. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирующей трубки Amicon Ultracel-30K (Millipore) до конечных концентраций 5-25 мг/мл. Раствор затем подвергали стерильной фильтрации.

Определяли соответствующие концентрации, установленные в рабочих примерах, ADC растворов. С помощью методов, описанных в главе В7, определяли нагрузку. ADC партии характеризовали, как указано в рабочих примерах.

В показанных структурных формулах, например, серии t, AK₃ в каждом случае имеет следующее значение:

AK_3a: анти-TWEAKR антитело (ТРР-2658) (соответствующее ТРР-2090-HC-N297A) - СО-§²

AK_3b,: анти-TWEAKR антитело (ТРР-5442) (соответствующее ТРР-2090-HC-N297Q) - СО-§²

AK_3c: анти-TWEAKR антитело (ТРР-8225) (соответствующее ТРР-2090-HC-Q295N-HC-N297Q) - СО-§²

AK_3d: ТРР-7510 (соответствующее трастузумаб-НС-И297А) - СО-§²

AK_3e: ТРР-7511 (соответствующее трастузумаб-HC-N297Q) - СО-§²

где

§² означает связь к аминогруппе токсофор линкерного предшественника, и

СО представляет собой карбонильную группу в боковой цепи остатка глутамина антитела.

В-6а. Общий способ получения замкнутых сукпинимид-цистеиновых аддуктов:

В иллюстративном варианте осуществления, 10 мкмоль соединений малеинимидных предшественников, описанных выше, вносили в 3-5 мл ДМФА и добавляли 2.1 мг (20 мкмоль) L-цистеина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение от 2 ч до 24 ч, затем концентрировали при пониженном давлении и затем очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

В-6аа. Общий способ получения изомерных открытых сукцинамид-цистеиновых аддуктов:

В иллюстративном варианте осуществления, 68 мкмоль соединений малеинимидных предшественников, описанных выше, вносили в 15 мл ДМФА и добавляли 36 мг (136 мкмоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ~20 ч, затем концентрировали при пониженном давлении и затем очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли и растворители упаривали при пониженном давлении, и остаток затем растворяли в 15 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 131 мкл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь затем нейтрализовали 1М хлористоводородной кислотой, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению ~50% от теории региоизомерных защищенных промежуточных соединений в виде бесцветной пены.

На последней стадии 0.023 ммоль этих региоизомерных продуктов гидролиза растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 12.5 мг (0.092 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Затем добавляли 27 мг (0.092 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению гидролизованных открытых сульфанилсукцинамидов в виде смеси региоизомеров.

Дополнительная очистка и определение характеристик конъюгатов в соответствии с изобретением

После реакции в некоторых случаях реакционную смесь концентрировали, например, с помощью ультрафильтрации, и затем обессоливали и очищали с помощью хроматографии, например, используя колонку Sephadex® G-25. Элюирование проводили, например, забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS). Раствор затем стерильно фильтровали и замораживали. Альтернативно, конъюгат можно лиофилизировать.

В-7. Определение антитела. токсофорной нагрузки и относительного содержания аддуктов с открытым цистеином

Для идентификации белка в дополнение к определению молекулярной массы после дегликозилирования и/или денатурирования, проводили расщепление трипсином, которое, после денатурирования, восстановления и дериватизации, подтверждало идентичность белка на основании обнаруженных триптических пептидов.

Токсофорную нагрузку полученных PBS буферных растворов конъюгатов, описанных в рабочих примерах, определяли следующим образом:

Определение токсофорной нагрузки лизин-присоединенных ADC проводили с помощью масс-спектрометрического определения молекулярных масс индивидуальных молекул конъюгатов. В данном случае конъюгаты антител вначале гликозилировали с помощью ПНГазы F, и образец подкисляли и, после ВЭЖХ разделения/обессоливания, анализировали с помощью масс-спектрометрии, используя прибор ESI-MicroTof_Q (Bruker Daltonik). Все спектры выше сигнала в TIC (общая ионная хроматограмма) добавляли и молекулярные массы различных молекул конъюгатов рассчитывали на основе MaxEnt деконволюции. Затем рассчитывали DAR (= отношение лекарственное средство/антитело) после интегрирования сигналов различных молекул.

Токсофорную нагрузку цистеин-присоединенных конъюгатов определяли с помощью обращено-фазовой хроматографии восстановленных и денатурированных ADC. К раствору ADC (1 мг/мл, 50 мкл) добавляли гидрохлорид гуанидина (GuHCl) (28.6 мг) и раствор DL-дитиотреитола (DTT) (500 мМ, 3 мкл). Смесь инкубировали при 55°С в течении одного часа и анализировали с помощью ВЭЖХ.

ВЭЖХ анализ проводили на ВЭЖХ системе Agilent 1260 с детектированием на 220 нм. Использовали полимерную колонку с обращенной фазой Polymer Laboratories PLRP-S (каталожный номер PL1912-3802) (2.1 ×150 мм, размер частиц 8 мкм, 1000 А) при скорости потока 1 мл/мин со следующим градиентом: 0 мин, 25%В; 3 мин, 25%В; 28 мин, 50%В. Подвижная фаза А состояла из 0.05% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в воде, подвижная фаза В состояла из 0.05% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле.

Обнаруженные пики соотносили с помощью времени удержания, сравнения с легкой цепью (L0) и тяжелой цепью (Н0) неконъюгированного антитела. Пики, обнаруженные исключительно в конъюгированном образце, соотносили с легкой цепью с одним токсофором (L1) и тяжелыми цепями с одним, двумя и тремя токсофорами (H1, Н2, Н3).

Среднюю нагрузку антитела токсофорами рассчитывали на основании площадей пиков, определенных путем интеграции в виде двойной суммы НС-нагрузки и LC-нагрузки, где LC-нагрузку рассчитывают исходя из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех LC пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех LC пиков, и где НС-нагрузку рассчитывают из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех НС пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех НС пиков. В отдельных случаях может отсутствовать возможность точного определения нагрузки токсофорами вследствие совместного элюирования некоторых пиков.

В случаях, когда легкие и тяжелые цепи не могут быть разделены в достаточной степени с помощью ВЭЖХ, определение токсофорной нагрузки цистеин-присоединенных конъюгатов проводили с помощью масс-спектрометрического определения молекулярных масс индивидуальных молекул конъюгатов в легкой и тяжелой цепи.

К раствору ADC (1 мг/мл, 50 мкл) добавляли гидрохлорид гуанидина (GuHCl) (28.6 мг) и раствор DL-дитиотреитола (DTT) (500 мМ, 3 мкл). Смесь инкубировали в течении одного часа при 55°С и анализировали с помощью масс-спектрометрии после онлайн обессоливания с использованием ESI-MicroTof_Q (Bruker Daltonik).

Для определения DAR, все спектры добавляли выше сигнала в TIC (общая ионная хроматограмма), и молекулярные массы различных молекул конъюгатов по легкой и тяжелой цепи рассчитывали на основе MaxEnt деконволюции. Среднюю нагрузку антитела токсофорами рассчитывали на основании площадей пиков, определенных путем интеграции в виде двойной суммы НС-нагрузки и LC-нагрузки, где LC-нагрузку рассчитывают исходя из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех LC пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех LC пиков, и где НС-нагрузку рассчитывают из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех НС пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех НС пиков.

Для определения относительного содержания аддукта с открытым цистеином, определяли отношение площади молекулярной массы замкнутого к площади молекулярной массы открытого аддукта цистеина (молекулярная масса дельта 18 Дальтон) всех однократно конъюгированных вариантов легкой и тяжелой цепи. Среднее значение всех вариантов дало относительное содержание аддукта с открытым цистеином.

Токсофорную нагрузку глутамин-присоединенных конъюгатов определяли с помощью обращено-фазовой хроматографии восстановленных и денатурированных ADC. К раствору ADC (1 мг/мл, 50 мкл) добавляли гидрохлорид гуанидина (GuHCl) (28.6 мг) и раствор DL-дитиотреитола (DTT) (500 мМ, 3 мкл). Смесь инкубировали при 55°С в течении одного часа и анализировали с помощью ВЭЖХ.

ВЭЖХ анализ проводили на ВЭЖХ системе Agilent 1260 с детектированием на 220 нм. Использовали полимерную колонку с обращенной фазой Polymer Laboratories PLRP-S (каталожный номер PL1912-3802) (2.1 ×150 мм, размер частиц 8 мкм, 1000 ) при скорости потока 1 мл/мин со следующим градиентом: 0 мин, 31%В; 1 мин, 31%В; 14 мин, 38%В, 16 мин, 95%В. Подвижная фаза А состояла из 0.05% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в воде, подвижная фаза В состояла из 0.05% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле.

Обнаруженные пики соотносили с помощью времени удержания, сравнения с легкой цепью (L0) и тяжелой цепью (Н0) неконъюгированного антитела. Пики, обнаруженные исключительно в конъюгированном образце, соотносили с легкой цепью с одним токсофором (L1) и тяжелыми цепями с одним и двумя токсофорами (H1, Н2).

Среднюю нагрузку антитела токсофорами рассчитывали на основании площадей пиков, определенных путем интеграции в виде двойной суммы НС-нагрузки и LC-нагрузки, где LC-нагрузку рассчитывают исходя из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех LC пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех LC пиков, и где НС-нагрузку рассчитывают из суммы числа токсофоров-средневзвешенных результатов интеграции всех НС пиков, разделенной на сумму однократно взвешенных результатов интеграции всех НС пиков.

Альтернативно, определение токсофорной нагрузки глутамин-присоединенных ADC проводили с помощью масс-спектрометрического определения молекулярных масс индивидуальных молекул конъюгатов. В данном случае конъюгаты антител вначале гликозилировали с помощью ПНГазы F, и образец подкисляли и, после ВЭЖХ разделения/обессоливания, анализировали с помощью масс-спектрометрии, используя прибор ESI-MicroTof_Q (Bruker Daltonik). Все спектры выше сигнала в TIC (общая ионная хроматограмма) добавляли и молекулярные массы различных молекул конъюгатов рассчитывали на основе MaxEnt деконволюции. Затем рассчитывали DAR (= отношение лекарственное средство/антитело) после интегрирования сигналов различных молекул.

В-8. Проверка связывания антигена с помощью ADC

Способность связующего связываться с целевой молекулой проверяли после того, как происходит сочетание. Специалист в данной области техники знает различные методы, которые можно использовать для этой цели; например, аффинность конъюгата можно проверять, используя технологию ELISA или анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore™ измерение). Концентрация конъюгата может быть измерена специалистом в данной области техники, используя общепринятые методы, например, для конъюгатов антител путем определения белка (см. также Doronina и др.; Nature Biotechnol. 2003; 21:778-784 и Poison и др., Blood 2007; 1102:616-623).

Варианты осуществления метаболитов

Пример M1

S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)-2,5-диоксопирролидин-3-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

1.8 мг (2 мкмоль) Промежуточного соединения F104 вносили в 1 мл ДМФА и добавляли 2.7 мг (22 мкмоль) L-цистеина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 20 ч, затем концентрировали при пониженном давлении и затем очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. 0.6 мг (26% от теории) указанного в заголовке соединения осталось в виде бесцветной пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.80 мин; МС (EI положит.): m/z=814 [М+Н]⁺.

Пример М2

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

и

4-[(2-{[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-2-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.80 мин; МС (EI положит.): m/z=814 [М+Н]⁺.

Прежде всего L-цистеин превращали с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин.

406 мг (1.53 ммоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 10 мл ДМФА, добавляли 157.5 мг (1.606 ммоль) малеинового ангидрида и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа. 7.5 мг (0.01 ммоль) Промежуточного соединения С66 добавляли к 130 мкл этого раствора, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Смесь затем концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 10 мг (89%) защищенного промежуточного соединения; региоизомеры не удалось разделить ни с помощью ВЭЖХ, ни с помощью ЖХ-МС.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (EI положит.): m/z=1120 [М+Н]⁺.

На последней стадии 10 мг этого промежуточного соединения растворяли в 2 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 12 мг (0.088 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 30 мин. Затем добавляли 26 мг (0.088 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 8.3 мг (99% от теории) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров в соотношении 87:13.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.3 мин и 2.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР, основной региоизомер: (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.7 (m, 1Н), 8.5 (m, 2Н), 8.1 (m, 1Н), 7.6 (m, 1Н), 7.5 (s, 1Н) 7.4-7.15 (m, 6Н), 6.9-7.0 (m, 1Н), 6.85 (s, 1Н), 5.61 (s, 1Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 4.26 и 4.06 (2d, 2Н), 3.5-3.8 (m, 5Н), 3.0-3.4 (m, 5Н), 2.75-3.0 (m, 3Н), 2.58 и 2.57 (dd, 1Н), 0.77 и 1,5 (2m, 2Н), 0.81 (s, 9Н).

Альтернативно, указанные в заголовке региоизомерные соединения получали следующим образом:

Для этой цели, сначала L-цистеин превращали с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин.

55 мг (0.068 ммоль) Промежуточного соединения F104 и 36 мг (0.136 ммоль) N-{[2-(триметилсилил) этокси]карбонил}-Е-цистеина растворяли в 15 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 20 ч. Смесь затем концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли и растворители упаривали при пониженном давлении, и остаток затем растворяли в 15 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 131 мкл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь затем нейтрализовали 1М хлористоводородной кислотой, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 37 мг (50% от теории) региоизомерных защищенных промежуточных соединений в виде бесцветной пены.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.33 мин и 3.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=976 (М+Н)⁺.

На последней стадии 25 мг (0.023 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 12.5 мг (0.092 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Затем добавляли 27 мг (0.092 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 18.5 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров в соотношении 21:79.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.37 мин и 3.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 (М+Н)⁺.

Пример М3

4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-2-карбоксиэтил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

и

4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)-2-карбоксиэтил]амино}-2-оксоэтил)амино]-2-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего L-цистеин превращали с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеин.

11 мг (0.013 ммоль) Промежуточного соединения F193 и 8 мг (0.016 ммоль) N-{[2-(триметилсилил) этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 3 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 20 ч. Смесь затем концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Соответствующие фракции объединяли и растворители упаривали при пониженном давлении, и остаток затем растворяли в 2 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 19 мкл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли еще 19 мкл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь затем нейтрализовали 1М хлористоводородной кислотой, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 4.1 мг (38% от теории) региоизомерных защищенных промежуточных соединений в виде бесцветной пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин (широкий); МС (ESI положит.): m/z=1020 (М+Н)⁺.

На последней стадии 4.1 мг (0.004 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 3 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 3 мг (0.022 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Затем добавляли 6 мг (0.022 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора 0.1% концентрации трифторуксусной кислоты, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 5 мг (колич.) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров в соотношении 20:80.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин (широкий); МС (ESI положит.): m/z=876 (М+Н)⁺.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.36 мин и 2.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=876 (М+Н)⁺.

Пример М4

S-(1-{2-[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этокси]этил}-2,5-диоксопирролидин-3-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

3 мг (4 мкмоль) Промежуточного соединения F248 вносили в 2 мл ДМФА и добавляли 0.9 мг (8 мкмоль) L-цистеина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали, с получением, после лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода, 1.1 мг (32% от теории) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (EI положит.): m/z=801 [М+Н]⁺.

Пример М5

(3R,7S)-7-Амино-17-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-3-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-4-гликолоил-2,2-диметил-8,16-диоксо-12-окса-4,9,15-триазанонадекан-19-овая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

и

(3R,7S)-7-амино-18-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-3-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-4-гликолоил-2,2-диметил-8,16-диоксо-12-окса-4,9,15-триазанонадекан-19-овая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

8 мг (0.010 ммоль) защищенного промежуточного соединения Промежуточного соединения F248 и 5.1 мг (0.02 ммоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 3 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч и затем обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 2 ч. Смесь затем концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли и растворители упаривали при пониженном давлении, и остаток затем растворяли в 2 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 15 мкл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 15 мин. Реакционную смесь затем доводили до рН ~3 с помощью 1М хлористоводородной кислоты, разбавляли 20 мл раствора хлорида натрия и два раза экстрагировали 20 мл этилацетата. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали, и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 8.4 мг (78% от теории за 2 стадии) региоизомерных защищенных промежуточных соединений в виде бесцветной пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин и 3.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=1107 (М+Н)⁺.

На последней стадии 8 мг (0.007 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 5 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 9.8 мг (0.072 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1.5 ч. Затем добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 4 мг (59% от теории) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров в соотношении 31:67.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.79 мин и 0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=819 (М+Н)⁺.

Пример М6

2-{[(2R)-2-Амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-({(14R)-13-(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадец-1-ил}амино)-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:2) и

3-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-({(14R)-13-(3-аминопропил)-14-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-15,15-диметил-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадец-1-ил}амино)-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:2)

18 мг (0.021 ммоль) Промежуточного соединения F213 и 11.2 мг (0.04 ммоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 2 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток (21.2 мг) растворяли в 3 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 0.04 мл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 часов. Добавляли 0.02 мл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа. Реакционную смесь затем доводили до рН ~7, используя 7.2 мг (0.12 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 13 мг (57% за 2 стадии) региоизомерных защищенных промежуточных соединений.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=1020 (М+Н)⁺.

На последней стадии 13 мг (0.01 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 2 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 6.2 мг (0.05 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 7 ч. Затем добавляли 13.3 мг (0.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 10.3 мг (81.4%) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=875 (М+Н)⁺.

Пример М7

S-(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)-L-цистеин/трифторуксусная кислота (1:1)

6 мг (8 мкмоль) Промежуточного соединения F119 вносили в 3 мл ДМФА и добавляли 1.8 мг (15 мкмоль) L-цистеина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 6 ч и затем оставляли стоять при КТ в течение 3 дней. Реакционную смесь затем концентрировали при пониженном давлении, и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=717 (М+Н)⁺.

Пример М8

(3R)-6-{(11S,15R)-11-Амино-15-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-14-гликолоил-16,16-диметил-2,5,10-триоксо-3,6,9,14-тетраазагептадец-1-ил}-5-оксотиоморфолин-3-карбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

4 мг (0.004 ммоль) соединения из Примера 135 растворяли в 4 мл смеси ТГФ/вода и добавляли 48 мкл 2-молярного водного раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения, концентрирования и лиофилизации соответствующих фракций из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 2.4 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (EI положит.): m/z=814 [М+Н]⁺.

Пример М9

N-(3-Аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид

150.0 мг (0.42 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (Промежуточное соединение С52) сначала загружали в 2.0 мл дихлорметана и добавляли 29.2 мг (0.49 ммоль) НОАс и 125.6 мг (0.59 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 98.9 мг (0.49 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором карбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 100:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 188.6 мг (74%) соединения 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.00 мин; МС (ESI положит.): m/z=541 [М+Н]⁺.

171.2 мг (0.32 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана и добавляли 73.6 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 94.9 мг (0.70 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 10 г SNAP, скорость потока 12 мл/мин, этилацетат/циклогексан 1:3). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 159.0 мг (77%) соединения 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z=642 [М+Н]⁺.

147.2 мг (0.23 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетата сначала загружали в 4.0 мл этанола и добавляли 356.2 мг (4.59 ммоль) метанамина (40% в воде). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с толуолом. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 10:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 67.4 мг (63%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин; МС (ESI положит.): m/z=470 [М+Н]⁺.

Пример М10

(2R,28R)-28-Амино-2-[({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)метил]-25-(карбоксиметил)-4,20,24-триоксо-7,10,13,16-тетраокса-26-тиа-3,19,23-триазанонакозан-1,29-дикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2) и

(1R,28R,34R)-1-амино-33-(3-аминопропил)-34-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-35,35-диметил-6,10,26,32-тетраоксо-14,17,20,23-тетраокса-3,30-дитиа-7,11,27,33-тетраазагексатриаконтан-1,4,28-трикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2)

20 мг (0.018 ммоль) соединения R-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение F209) и 9.78 мг (0.036 ммоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 2 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток (47.7 мг) растворяли в 3 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 0.08 мл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 часа. Реакционную смесь затем доводили до рН ~7, используя 9.26 мг (0.15 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.3 мг (29% за 2 стадии) региоизомерных защищенных промежуточных соединений.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=12.26 мин и 12.30 мин; МС (ESI положит.): m/z=1254 (М+Н)⁺.

На последней стадии 15.3 мг (0.01 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 2 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 6.1 мг (0.05 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 13.1 мг (0.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 11.9 мг (79.5%) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=1110 (М+Н)⁺.

Пример М11

S-{2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:2)

15.0 мг (0.018 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1H-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) растворяли в 1.0 мл трифторэтанола и добавляли 7.4 мг (0.054 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли 15.8 мг (0,054 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.1 мг (77%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=573 (М+Н)⁺.

Пример М12

4-{[(1R)-2-({2-[(3-Аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)-1-карбоксиэтил]амино}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

12.2 мг (0.014 ммоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеина (Промежуточное соединение С77) растворяли в 2.0 мл трифторэтанола и добавляли 11.4 мг (0.084 ммоль) дихлорида цинка. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Добавляли 24.5 мг (0,084 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, реакционную смесь перемешивали в течение 10 мин и затем добавляли воду (0.1% ТФУ). Очистку проводили незамедлительно с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.6 мг (42%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 (М+Н)⁺.

Пример М13

4-[(2-{[2-({(28)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-2-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 1, Эпимер 1 (2R) или (2S)

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Прежде всего гидрохлорид метил L-цистеината (1:1) превращали с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеинат.

408 мг (1.93 ммоль) коммерчески доступной 3-бром-4-метокси-4-оксобутановой кислоты и 180 мг (0.644 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеината растворяли в 8 мл ДМФА и добавляли 147 мг (0.97 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. После 18 ч перемешивания при КТ, добавляли еще 136 мг (0.64 ммоль) 3-бром-4-метокси-4-оксобутановой кислоты и 147 мг (0.97 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 12 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Объединение соответствующих фракций и упаривание растворителей при пониженном давлении приводило к получению 151 мг (57% от теории) 4-метокси-3-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.74 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=408 (М-Н)^-.

145 мг этого промежуточного соединения разделяли с помощью сверхкритической флюидной хроматографии на хиральных колонках на индивидуальные диастереомеры (СФХ; колонка DAICEL, AD-H 5 мк 250×20 мм; скорость потока 80 мл/мин; метод AD-25%ETOH-80 мл; давление 100 бар; длина волны 210 нм), получая 63 мг (43%) Эпимера 1 и 58 мг (40%) Эпимера 2.

Эпимер 1 характеризовался следующими параметрами:

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.94 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=408 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР: (400 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.57 (d, 1Н), 4.24 (m, 1Н), 4.05 (t, 2Н), 3.67 (t, 1Н), 3.65 (s, 3Н), 3.62 (s, 3Н), 3.05 (dd, 1Н), 2.70-2.88 (m, 2Н), 2.59 (dd, 1Н), 0.93 (t, 2Н), 0.02 (s, 9Н).

Эпимер 2 характеризовался следующими параметрами:

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.95 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=408 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР: (400 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.58 (d, 1Н), 4.16-4.23 (m, 1Н), 4.05 (t, 2Н), 3.67 (dd, 1Н), 3.65 (s, 3Н), 3.64 (s, 3Н), 3.04 (dd, 1Н), 2.88 (dd, 1Н), 2.77 (dd, 1Н), 2.61 (dd, 1Н), 0.92 (t, 2Н), 0.02 (s, 9Н).

32.5 мг (0.079 ммоль) Эпимера 1 сочетали в присутствии 30 мг (0.079 ммоль) HATU и 13.4 мг (0.132 ммоль) 4-метилморфолина с 50 мг (0.066 ммоль) Промежуточного соединения С66, с получением, после ВЭЖХ очистки, 43 мг (57% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения метил 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,9,14-триоксо-5-окса-7,10,13-триаза-2-силапентадекан-15-ил]амино}-2-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутаноата.

40 мг (0.035 ммоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 0.9 мл 2-молярного раствора гидроксида лития в 11 мл метанола в течение 20 мин, что приводило к расщеплению обеих метильных сложноэфирных групп. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 12 мг (31% от теории) производного - дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=1120 [М+Н]⁺.

В заключение, с 10 мг (0.009 ммоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 2.6 мг (30% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Пример М14

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксозтил)амино]-2-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 1, Эпимер 2 (2R или 2S)

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (EI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Эпимер 2, описанное в Примере М13, подвергали реакции аналогично описанию в Примере М13:

32.5 мг (0.079 ммоль) Эпимера 2 сочетали в присутствии 30 мг (0.079 ммоль) HATU и 13.4 мг (0.132 ммоль) 4-метилморфолина с 50 мг (0.066 ммоль) Промежуточного соединения С66, с получением, после ВЭЖХ очистки, 43 мг (57% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения метил 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,9,14-триоксо-5-окса-7,10,13-триаза-2-силапентадекан-15-ил]амино}-2-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутаноата.

40 мг (0.035 ммоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 0.9 мл 2-молярного раствора гидроксида лития в 11 мл метанола в течение 20 мин, что приводило к расщеплению обеих метальных сложноэфирных групп. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 11 мг (28% от теории) производного - дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=1120 [М+Н]⁺.

В заключение, с 10 мг (0.009 ммоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 4.4 мг (52% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Пример М15

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-{[(2К)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 2, Эпимер 1 (3R или 3S)

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.45 мин; МС (EI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

742.8 мг (3.3 ммоль) коммерчески доступной 2-бром-4-этокси-4-оксобутановой кислоты и 802 мг (2.87 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеината растворяли в 32 мл ДМФА и добавляли 655.4 мг (4.31 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. После 20 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций и упаривания растворителей при пониженном давлении приводило к получению 521 мг (43% от теории) 4-этокси-2-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=424 (М+Н)⁺.

510 мг этого промежуточного соединения разделяли с помощью сверхкритической флюидной хроматографии на хиральных колонках на индивидуальные диастереомеры (СФХ; колонка DAICEL, AD-H 5 мк 250×20 мм; скорость потока 80 мл/мин; метод AD-10%ETOH-80 мл; давление 100 бар; длина волны 210 нм), получая 100 мг (20%) Эпимера 1 и 141 мг (28%) Эпимера 2.

Эпимер 1 характеризовался следующими параметрами:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=422 (М-Н)^-

¹Н-ЯМР: (400 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.60 (d, 1Н), 4.18-4.26 (m, 1Н), 4.01-4.08 (m, 4Н), 3.63 (s, 3Н), 3.59 (dd, 1Н), 3.04 (dd, 1Н), 2.92 (dd, 1Н), 2.80 (dd, 1Н), 2.63 (dd, 1Н), 1.17 (t, 3Н), 0.92 (t, 2Н), 0.02 (s, 9Н).

Эпимер 2 характеризовался следующими параметрами:

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.95 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=408 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР: (400 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.56 (d, 1Н), 4.21-4.29 (m, 1Н), 4.01-4.1 (m, 4Н), 3.64 (s, 3Н), 3.58 (dd, 1Н), 3.08 (dd, 1Н), 2.85 (dd, 1Н), 2.78 (dd, 1Н), 2.60 (dd, 1Н), 1.17 (t, 3Н), 0.93 (t, 2Н), 0.02 (s, 9Н).

33.6 мг (0.079 ммоль) Эпимера 1 сочетали в присутствии 30 мг (0.079 ммоль) HATU и 13.4 мг (0.132 ммоль) 4-метилморфолина с 50 мг (0.066 ммоль) Промежуточного соединения С66, с получением, после ВЭЖХ очистки, 51 мг (63% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения этил 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,9,14-триоксо-5-окса-7,10,13-триаза-2-силапентадекан-15-ил]амино}-3-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутаноата.

49 мг (0.042 ммоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 0.5 мл 2-молярного раствора гидроксида лития в 12 мл смеси ТГФ/вода 1:1 в течение 30 мин, что приводило к расщеплению обеих метильных сложноэфирных групп. Осуществление подкисления и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 11 мг (24% от теории) производного - дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.68 мин; МС (ESI положит.): m/z=1120 [М+Н]⁺.

В заключение, с 11 мг (0.01 ммоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 3.7 мг (39% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.45 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Пример М16

4-[(2-{[2-({(28)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 2, Эпимер 2 (3R или 3S)

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (EI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение Эпимер 2, описанное в Примере M15, подвергали реакции аналогично описанию в Примере M15:

33.6 мг (0.079 ммоль) Эпимера 2 сочетали в присутствии 30 мг (0.079 ммоль) HATU и 13.4 мг (0.132 ммоль) 4-метилморфолина с 50 мг (0.066 ммоль) Промежуточного соединения С66, с получением, после ВЭЖХ очистки, 51 мг (63% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения этил 4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,9,14-триоксо-5-окса-7,10,13-триаза-2-силапентадекан-15-ил]амино}-3-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутаноата.

49 мг (0.042 ммоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 0.5 мл 2-молярного раствора гидроксида лития в 12 мл смеси ТГФ/вода 1:1 в течение 30 мин, что приводило к расщеплению обеих метальных сложноэфирных групп. Осуществление подкисления и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 13.4 мг (28% от теории) производного -дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.66 мин; МС (ESI положит.): m/z=1120 [М+Н]⁺.

В заключение, с 13.4 мг (0.012 ммоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 7.5 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Пример М17

Гидрохлорид (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутановой кислоты (1:1)

150 мг (0.2 ммоль) Промежуточного соединения С53 растворяли в 15 мл ДМФА и добавляли 2.29 г (20.39 ммоль) DABCO. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 30 мин. Путем добавления 1.17 мл уксусной кислоты, реакционную смесь затем доводили до рН 3-4, и смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и соответствующие фракции концентрировали при КТ при пониженном давлении. Остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 1:1, добавляли 5 мл 4 н. хлористоводородной кислоты и смесь затем лиофилизировали. Это приводило к получению 81 мг (68% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.69 мин; МС (EI положит.): m/z=514 [М+Н]⁺.

Пример М18

N-[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-L-глутамин / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего соединение трифторуксусная кислота / бензил N-(2-аминоэтил)-N²-[(бензилокси)карбонил]-L-глутаминат (1:1) получали, используя классические методы химии пептидов. В присутствии HATU это промежуточное соединение затем сочетали с Промежуточным соединением С58. После этого, сначала бензилоксикарбонильную защитную группу и сложноэфирную бензильную группу удаляли путем гидрогенолитического расщепления, и затем удаляли 2-(триметилсилил)этоксикарбонильную защитную группу, используя хлорид цинка.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.91 мин; МС (EI положит.): m/z=685 [М+Н]⁺.

Пример М19

N⁶-(N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:1)

Сначала соединение трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил N2-[(бензилокси)карбонил]-L-лизинат (1:1) получали, используя классические операции с защитными группами, известные в химии пептидов. В присутствии HATU, это промежуточное соединение затем сочетали с Промежуточным соединением С61. После этого, сначала 2-(триметилсилил)этоксикарбонильную защитную группу и 2-(триметилсилил)этильную сложноэфирную группу отщепляли с использованием хлорида цинка. В заключение, указанное в заголовке соединение получали путем гидрогенолитического отщепления бензилоксикарбонильной защитной группы и очистки с помощью препаративной ВЭЖХ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.65 мин;

Пример М20

(1R,4R,27R,33R)-1-Амино-32-(3-аминопропил)-33-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-34,34-диметил-6,9,25,31-тетраоксо-13,16,19,22-тетраокса-3,29-дитиа-7,10,26,32-тетраазапентатриаконтан-1,4,27-трикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2)

Прежде всего гидрохлорид метил L-цистеината (1:1) превращали с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилзтиламина в метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеинат.

408 мг (1.93 ммоль) коммерчески доступной 3-бром-4-метокси-4-оксобутановой кислоты и 180 мг (0.644 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеината растворяли в 8 мл ДМФА и добавляли 147 мг (0.97 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. После 18 ч перемешивания при КТ, добавляли еще 136 мг (0.64 ммоль) 3-бром-4-метокси-4-оксобутановой кислоты и 147 мг (0.97 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 12 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций и упаривания растворителей при пониженном давлении приводило к получению 151 мг (57% от теории) 4-метокси-3-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.74 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=408 (М-Н)^-.

3.66 мг (8.93 мкмоль) 4-метокси-3-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты сочетали в присутствии 3.66 мг (8.93 мкмоль) HATU и 1.6 мкл (15 мкмоль) 4-метилморфолина с 13.0 мг (7.44 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11 -диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-(глициламино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С80), с получением, после ВЭЖХ очистки, 3.9 мг (37% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-бис(метоксикарбонил)-2,2-диметил-6,13-диоксо-5-окса-10-тиа-7-аза-2-силатридекан-13-ил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина.

3.90 мг (2.76 мкмоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 35 мкл 2-молярного раствора гидроксида лития в 1.0 мл смеси ТГФ/вода 3:1 в течение 15 мин, что приводило к расщеплению обеих метальных сложноэфирных групп. Очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 3.60 мг (94% от теории) производного - дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=1385 [М+Н]⁺.

В заключение, с 3.6 мг (2.6 мкмоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 1.92 мг (55% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.72 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=1094 [М-Н]^-.

Пример М21

(2R,24S,27R)-27-Амино-2-[({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)метил]-24-(карбоксиметил)-4,20,23-триоксо-7,10,13,16-тетраокса-25-тиа-3,19,22-триазаоктакозан-1,28-дикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2)

742.8 мг (3.3 ммоль) коммерчески доступной 2-бром-4-этокси-4-оксобутановой кислоты и 802 мг (2.87 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеината растворяли в 32 мл ДМФА и добавляли 655.4 мг (4.31 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. После 20 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций и упаривания растворителей при пониженном давлении приводило к получению 521 мг (43% от теории) 4-этокси-2-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=424 (М+Н)⁺.

4.36 мг (10.3 мкмоль) 4-этокси-2-{[(2R)-3-метокси-3-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пропил]сульфанил}-4-оксобутановой кислоты сочетали в присутствии 3.92 мг (10.3 мкмоль) HATU и 1.9 мкл (17 мкмоль) 4-метилморфолина с 15.0 мг (8.59 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-(глициламино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С80), с получением, после ВЭЖХ очистки, 3.6 мг (26% от теории) полностью защищенного промежуточного соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-этокси-2-оксоэтил)-8-(метоксикарбонил)-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-10-тиа-7-аза-2-силадодекан-12-ил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина.

6.20 мг (2.82 мкмоль) этого промежуточного соединения затем перемешивали при КТ с 35 мкл 2-молярного раствора гидроксида лития в 1.0 мл смеси ТГФ/вода 1:1 в течение 15 мин, что приводило к расщеплению обеих сложноэфирных групп. Осуществление подкисления и очистки с помощью ВЭЖХ приводило к получению 3.60 мг (92% от теории) производного - дикарбоновой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=1385 [М+Н]⁺.

В заключение, с 3.60 мг (1.69 мкмоль) этого промежуточного соединения полностью снимали защиту хлоридом цинка в трифторэтаноле, как описано выше. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 0.88 мг (39% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.72 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=1094 [М-Н]^-.

Пример М22

(2R,27R)-27-Амино-2-[({2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}сульфанил)метил]-24-(карбоксиметил)-4,20,23-триоксо-7,10,13,16-тетраокса-25-тиа-3,19,22-триазаоктакозан-1,28-дикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2) и

(1R,27R,33R)-1-амино-32-(3-аминопропил)-33-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-34,34-диметил-6,9,25,31-тетраоксо-13,16,19,22-тетраокса-3,29-дитиа-7,10,26,32-тетраазапентатриаконтан-1,4,27-трикарбоновая кислота / трифторуксусная кислота (1:2)

16.5 мг (0.015 ммоль) соединения S-{2-[(3-аминопропил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-оксоэтил}-N-[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,18-диоксо-6,9,12,15-тетраокса-3-азаоктадекан-18-ил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение F257) и 8.18 мг (0.031 ммоль) N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-цистеина растворяли в 2 мл ДМФА, и смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток (28.9 мг) растворяли в 3 мл смеси ТГФ/вода 1:1. Добавляли 0.046 мл 2М водного раствора гидроксида лития и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 часов. Реакционную смесь затем доводили до рН ~7, используя 5.2 мкл (0.092 ммоль) уксусной кислоты. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 12.1 мг (58% за 2 стадии) региоизомерных защищенных промежуточных соединений.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=1240 (М+Н)⁺.

На последней стадии 12.1 мг (0.009 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 2 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 7.3 мг (0.054 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 15.7 мг (0.054 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 6.4 мг (59%) указанного в заголовке соединения в виде смеси региоизомеров.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=1096 (М+Н)⁺.

Пример М23

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-глутаминовая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего гидрохлорид ди-трет-бутил L-глутамата (1:1) сочетали с Промежуточным соединением С61 в присутствии HATU и N.N- диизопропилэтиламина. Затем защищенное промежуточное соединение вносили в трифторэтанол и полностью снимали защиту путем перемешивания при 50°С в присутствии хлорида цинка в течение ночи. После добавления EDTA, обработку смеси осуществляли путем очистки с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.45 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 [М+Н]⁺.

Пример М24

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутаминовая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего гидрохлорид ди-трет-бутил D-глутамата (1:1) сочетали с Промежуточным соединением С61 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем защищенное промежуточное соединение вносили в трифторэтанол и полностью снимали защиту путем перемешивания при 50°С в присутствии хлорида цинка. После добавления EDTA, обработку смеси осуществляли путем очистки с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 [М+Н]⁺.

Пример М25

N-{(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-L-глутаминовая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Прежде всего гидрохлорид ди-трет-бутил L-глутамата (1:1) сочетали с Промежуточным соединением С61 в присутствии HATU и N,N- диизопропилэтиламина. На следующей стадии Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 45 мин. Затем частично защищенное промежуточное соединение вносили в трифторэтанол и полностью снимали защиту путем перемешивания при 50°С в присутствии хлорида цинка в течение 7 часов. После добавления EDTA, обработку смеси осуществляли путем очистки с помощью препаративной ВЭЖХ.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Пример М26

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-2-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 1 смесь эпимеров

Этот пример описывает смесь эпимеров соединений из Примера 13 и Примера 14. Синтез осуществляли по аналогии с Примером 13, обходясь без разделения двух эпимеров с помощью сверхкритической флюидной хроматографии и получая указанное в заголовке соединение в виде смеси эпимеров.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Пример М27

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]амино}-2-оксоэтил)амино]-3-{[(2R)-2-амино-2-карбоксиэтил]сульфанил}-4-оксобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

Региоизомер 2, смесь эпимеров

Этот пример описывает смесь эпимеров соединений из Примера 15 и Примера 16. Синтез осуществляли по аналогии с Примером 15, обходясь без разделения двух эпимеров с помощью сверхкритической флюидной хроматографии и получая указанное в заголовке соединение в виде смеси эпимеров.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=2.45 мин; МС (EI положит.): m/z=832 [М+Н]⁺.

Рабочие примеры APDC и ADC

APDC и ADC, показанные в структурных формулах Рабочих примеров, которые сочетали с цистеиновыми боковыми цепями антител через малеимидные радикалы, в зависимости от линкера и методики сочетания, присутствуют в каждом случае преимущественно в формах с раскрытым циклом или циклических формах. Тем не менее, продукт может содержать небольшую часть соответствующей другой формы.

Реакции сочетания проводили в атмосфере аргона.

Пример 1а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мкл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.25 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q1, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.95 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 7.2, и элюировали PBS буфером рН 7.2.

Элюат затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.46 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.7

Пример 1е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q1 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.61 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 1i

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q1 сочетали с 5 мг нимотузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.75 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 1k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q1 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.26 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.0

Пример 1k*

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q1 сочетали с 50 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658.

В атмосфере аргона раствор 0.29 мг ТСЕР в 0.682 мкл буфера PBS добавляли к 50 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 3.07 мл PBS (с=16.3 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 2.53 мг (0.0023 ммоль) Промежуточного соединения Q1, растворенного в 357 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, смесь разбавляли до 7.5 мл с помощью 3.391 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), уравновешенную PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 7.2, и элюировали PBS буфером рН 7.2. Элюат затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2) и концентрировали повторно. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 9.56 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 2а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.23 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q2, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 7.2, и элюировали PBS буфером рН 7.2.

Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.87 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.2

Пример 2e

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q2 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.41 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 2k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q2 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.79 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 2k*

Аналогичным образом, как описано в Примере 1k*, 2.775 мг (0.0028 ммоль) Промежуточного соединения Q2 сочетали с 60 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 9.97 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.7

Пример 3k

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.25 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q3, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 7.2, и элюировали PBS буфером рН 7.2.

Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.15 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.3

Пример 4a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.25 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q4, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.98 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.0

Пример 4k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q4 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.65 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 5a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.21 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q5, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.91 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.4

Пример 5е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q5 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.55 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 5k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q5 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.54 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 6а

В данном случае 5 мг цетуксимаба в PBS (с=10 мг/мл) применяли для сочетания с Промежуточным соединением Q6. Прежде всего добавляли 5 экв. (0.24 мг) Промежуточного соединения Q6, растворенного в 50 мкл ДМСО, и после 1 ч перемешивания при КТ такое же количество добавляли снова и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительного часа. Реакционную смесь потом разбавляли до 2.5 мл PBS буфера (рН 7.2), очищали на колонке Sephadex, затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 2.26 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.7

Пример 6е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q6 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.97 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 5.4

Пример 6k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q6 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.07 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 6.7

Пример 7а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мкл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем добавляли 0.24 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q7, растворенного в 50 мкл ДМСО, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Затем реакционную смесь разбавляли до 2.5 мл PBS буфером (рН 7.2), очищали на колонке Sephadex, и потом концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 1.91 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.6

Пример 7k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q7 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.66 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.4

Пример 8а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 50 мкл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 458 мкл PBS (с=10.9 мг/мл). Реакционную смесь разбавляли 1892 мкл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 0.314 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q8, растворенного в 100 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь наносили на PD 10 колонки (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которые были уравновешены PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). В этих условиях, некоторые из ADC также могут присутствовать в циклической форме. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.15 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.1

Пример 8е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q8 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.21 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.9

Пример 8k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q8 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.65 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.5

Пример 9k

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 0.450 мл PBS (с=11.1 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.24 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q9, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, смесь разбавляли 1.95 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), уравновешенную PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.86 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 10a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг анти-TWEAKR антитела в 0.458 мл PBS (с=10.9 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.23 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q10, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, смесь разбавляли 1.95 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), уравновешенную PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.92 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 10k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q10 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.65 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 11a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.28 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q11, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.942 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.99 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 11e

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q11 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.70 мг/мл Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 11k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q11 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.71 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 12а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.305 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q12, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.942 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.23 мг/мл Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.5

Пример 12е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q12 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.73 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 12k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q12 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.91 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 13а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q13, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.98 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.1

Пример 13е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q13 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.83 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 13k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q13 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.54 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.2

Пример 14a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.29 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q14, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.92 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 14е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q14 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.72 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Пример 14k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q14 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.80 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 15а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.25 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q15, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.90 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 15k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q15 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.74 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 16а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q16, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.74 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.7

Пример 16e

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q16 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.61 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 16k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q16 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.75 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.2

Пример 17а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мкл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q17, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.93 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 17е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q17 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.83 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 17k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q17 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.34 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 18a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q18, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.57 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.4

Пример 18е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q18 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.79 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 18k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q18 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.68 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 19а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.25 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q19, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.95 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8, и перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 7.2, и элюировали PBS буфером рН 7.2.

Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.85 мг/мл Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.3

Пример 19е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q19 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.88 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.5

Пример 19k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q19 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.80 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.8

Пример 20k

В атмосфере аргона раствор 0.131 мг ТСЕР в 0.20 мл буфера PBS добавляли к 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 0.239 мл PBS (с=20.90 мг/мл). Реакционную смесь растворяли в 0.461 мл PBS и перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.833 мг (0.00040 ммоль) Промежуточного соединения Q20, растворенного в 100 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 120 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.50 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.96 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.6

Пример 20k*

В атмосфере аргона раствор 0.076 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 0.239 мл PBS (с=20.90 мг/мл). Реакционную смесь растворяли в 0.20 мл PBS и перемешивали при КТ в течение 150 мин, и затем добавляли 0.833 мг (0.00040 ммоль) Промежуточного соединения Q20, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 120 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.96 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.17 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 7.3

Пример 21a

В атмосфере аргона раствор 0.076 мг ТСЕР в 0.20 мл буфера PBS добавляли к 5 мг антитела цетуксимаба в 0.427 мл PBS (с=11.7 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 150 мин, и затем добавляли 0.811 мг (0.000533 ммоль) Промежуточного соединения Q21, растворенного в 40 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 120 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.98 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.37 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 8.1

Пример 21е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q21 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.27 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 8.0

Пример 21k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q21 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.73 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 7.9

Пример 22а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.28 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q22, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.91 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.2

Пример 22е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q22 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.59 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.7

Пример 22k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q22 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.89 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 23a

В данном случае 5 мг цетуксимаба в PBS (с=10 мг/мл) применяли для сочетания с Промежуточным соединением Q23. Прежде всего добавляли 5 экв. (0.2 мг) Промежуточного соединения Q23, растворенного в 50 мкл ДМСО, и после 1 ч перемешивания при КТ такое же количество добавляли снова, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительного часа. Реакционную смесь потом разбавляли до 2.5 мл PBS буфера (рН 7.2), очищали на колонке Sephadex, затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 1.88 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 23е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q23 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.68 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.7

Пример 23k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q23 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.23 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.9

Пример 24а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.23 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q24, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.80 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.2

Пример 24e

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q24 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.49 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.3

Пример 24k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q24 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.73 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.2

Пример 25а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.21 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q25, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.59 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 25е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q25 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.42 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 25k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q25 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.44 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.2

Пример 26а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.498 мл PBS (с=10 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.3 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q26, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером (рН 7.2), и элюировали PBS буфером (рН 7.2). Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.0 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 26е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q26 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.66 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 26k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q26 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.83 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Пример 27a

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q27, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали в атмосфере аргона при КТ в течение ночи. Вслед за этим выполняли концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.02 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 27е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q27 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.72 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.2

Пример 27k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q27 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.79 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 28а

В атмосфере аргона раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS добавляли к 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.92 мг/мл). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.32 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q28, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания в течение еще 90 мин при КТ, реакционную смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS. Этот раствор затем наносили на колонку PD 10 (Sephadex^® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером (рН 7.2), и элюировали PBS буфером (рН 7.2). Вслед за этим выполняли ультрацентрифугирование и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.01 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.0

Пример 28e

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q28 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.86 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.1

Пример 28k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q28 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.03 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 29а

В данном случае 5 мг цетуксимаба в PBS (с=9.1 мг/мл) применяли для сочетания с Промежуточным соединением Q29. Прежде всего в атмосфере аргона добавляли 5 экв. (0.21 мг) Промежуточного соединения Q29, растворенного в 50 мкл ДМСО, и после 1 ч перемешивания при КТ такое же количество добавляли снова и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительного часа. Реакционную смесь потом разбавляли до 2.5 мл PBS буфера (рН 7.2), очищали на колонке Sephadex, затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 2.14 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 29е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q29 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.05 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.8

Пример 29k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q29 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.09 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.9

Пример 30а

В данном случае 5 мг цетуксимаба в PBS (с=9.1 мг/мл) применяли для сочетания с Промежуточным соединением Q30. Прежде всего в атмосфере аргона добавляли 5 экв. (0.22 мг) Промежуточного соединения Q29, растворенного в 50 мкл ДМСО, и после 1 ч перемешивания при КТ такое же количество добавляли снова и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительного часа. Реакционную смесь потом разбавляли до 2.5 мл PBS буфера (рН 7.2), очищали на колонке Sephadex, затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 2.1 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.5

Пример 30е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q30 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.96 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 5.6

Пример 30k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q30 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.07 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 5.8

Пример 31t

К раствору 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 (соответствующего ТРР- 2090-HC-N297A) в 530 мкл DPBS рН 7.4 (с ~10 мг/мл) добавляли 20 мкл 10 мМ раствора Промежуточного соединения Q31 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 50 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирования на Amicon Ultracel-30K (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS. В заключение к раствору добавляли 0.00625 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 12.5 мкл DPBS. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.11 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.8

Пример 31t-4

К раствору 30 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-5442 (соответствующего TPP-2090-HC-N297Q) в DPBS рН 7.4 (с=10 мг/мл) добавляли 480 мкл раствора 10 ммоль Промежуточного соединения Q31 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 2400 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Реакционную смесь очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 (GE Healthcare) в DPBS рН 7.4 для отделения небольших молекул и трансглутаминазы от ADC. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирующей трубки Amicon Ultracel-30K (Millipore) до конечных концентраций приблизительно 12 мг/мл. Раствор затем подвергали стерильной фильтрации. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 12.0 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.8

Пример 32t

К раствору 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 (соответствующего ТРР- 2090-HC-N297A) в 530 мкл DPBS рН 7.4 (с ~10 мг/мл) добавляли 20 мкл раствора 10 ммоль Промежуточного соединения Q32 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 50 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS- уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирования на Amicon Ultracel-30K (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS. В заключение, к раствору добавляли 0.00625 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 12.5 мкл DPBS. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.8 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.0

Пример 33t

К раствору 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 (соответствующего ТРР- 2090-HC-N297A) в 530 мкл DPBS рН 7.4 (с ~10 мг/мл) добавляли 20 мкл раствора 10 ммоль Промежуточного соединения Q33 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 50 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирования на Amicon Ultracel-30K (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS. В заключение, к раствору добавляли 0.00625 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 12.5 мкл DPBS. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.68 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.9

Пример 34t

К раствору 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 (соответствующего ТРР- 2090-HC-N297A) в 530 мкл DPBS рН 7.4 (с ~10 мг/мл) добавляли 20 мкл раствора 10 ммоль Промежуточного соединения Q34 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 50 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение дополнительных 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS- уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью прибора центрифугирования Amicon Ultracel-30K (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS. В заключение, к раствору добавляли 0.00625 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 12.5 мкл DPBS. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.73 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 1.8

Пример 34t-4

К раствору 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-5442 (соответствующего ТРР- 2090-HC-N297Q) в DPBS рН 7.4 (с=7.4 мг/мл) добавляли 83 мкл раствора 10 ммоль Промежуточного соединения Q34 в ДМСО. После инкубации при 37°С в течение 5 мин, добавляли 400 мкл раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (номер продукта Т001 от Zedira GmbH, Дармштадт, Германия) (25 Ед/мл) и инкубацию продолжали при 37°С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь разбавляли с помощью DPBS рН 7.4 до общего объема 2.5 мл и пропускали, выполняя гель-фильтрацию, через DPBS-уравновешенные PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), и элюировали DPBS буфером при рН 7.4. Затем, раствор ADC концентрировали с помощью центрифугирования на Amicon Ultracel-30K (Millipore), и повторно разбавляли с помощью DPBS до объема приблизительно 2.5 мл. В заключение, к раствору добавляли 0.1 мкмоль блокатора b-трансглутаминазы Zedira С100 в 200 мкл DPBS. Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.76 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.9

Пример 34te-4

Аналогичным образом, как описано в Примере 34t-4, также использовали и подвергали сочетанию ТРР-7511 (соответствующий Трастузумабу-HC-N297Q). Полученный раствор ADC характеризовался следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.56 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.9

Пример 35а

К 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.28 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q35, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.94 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 35е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q35 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.89 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 35k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q35 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.78 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 36а

К 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q36, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.0 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.2

Пример 36е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q36 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.84 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.6

Пример 36k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q36 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.75 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Пример 37а

К 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 5 экв. (0.2 мг) Промежуточного соединения Q37, растворенного в 50 мкл ДМСО, и после перемешивания при КТ в течение 1 ч такое же количество добавляли снова и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительного часа. Затем, смесь разбавляли до 2.5 мл с помощью PBS буфера (рН 7.2), очищали с использованием колонки Sephadex и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS (рН 7.2).

Концентрация белка: 2.2 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.1

Пример 37е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q37 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.64 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.5

Пример 37k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q37 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.6 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 6.2

Пример 38а

К 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=11 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q38, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.94 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 38е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q38 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.82 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 38k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q38 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.01 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 39а

К 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.23 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q39, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли 1.9 мл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи. Вслед за этим выполняли концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.97 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.8

Пример 39е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q39 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.77 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.3

Пример 39k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q39 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.74 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Пример 40а

К 5 мг цетуксимаба в 0.5 мл PBS (с=10 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.26 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q40, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.95 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.4

Пример 40е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q40 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.84 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.9

Пример 40k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q40 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.93 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.0

Пример 41а

К 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.9 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.308 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q41, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера. Этот раствор затем очищали с использованием PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare). Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.26 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.9

Пример 41е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q41 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.0 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.3

Пример 41k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q41 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 2.15 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.0

Пример 42а

К 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.9 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин, и затем добавляли 0.263 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q42, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.93 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.5

Пример 42е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q42 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.53 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 4.2

Пример 42k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q42 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 0.88 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.7

Пример 43а

К 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.9 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.27 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q43, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.91 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 43е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q43 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.56 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.6

Пример 43k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q43 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.89 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.6

Пример 44а

К 5 мг цетуксимаба в 0.458 мл PBS (с=10.9 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.029 мг ТСЕР в 0.05 мл буфера PBS. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 0.29 мг (0.00023 ммоль) Промежуточного соединения Q44, растворенного в 50 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли до объема 2.5 мл с помощью PBS буфера, который заранее был доведен до рН 8. Этот раствор затем пропускали через колонку PD 10 (Sephadex® G-25, GE Healthcare), которая была уравновешена PBS буфером рН 8, и элюировали PBS буфером рН 8. Элюат перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи.

Этот раствор затем концентрировали путем ультрацентрифугирования и повторно разбавляли PBS буфером (рН 7.2). Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.82 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 2.6

Пример 44е

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q44 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.79 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Пример 44k

Аналогичным образом, Промежуточное соединение Q44 сочетали с 5 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.72 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.7

С: Оценка биологической эффективности

Биологическая активность соединений в соответствии с изобретением может быть продемонстрирована в исследованиях, описанных ниже:

а. С-1a Определение цитотоксических эффектов ADC

Анализ цитотоксических эффектов ADC проводили с различными клеточными линиями:

NCI-H292: клетки мукоэпидермоидной карциномы легких человека, АТСС-CRL-1848, стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стаб. глутамин) + 10% FCS (Sigma; #F2442), TWEAKR-положительные; EGFR-положительные.

ВхРС3: клетки карциномы поджелудочной железы человека, ATCC-CRL-1687, стандартная среда: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стаб. глутамин) + 10% FCS (Sigma; #F2442), TWEAKR-положительные.

LoVo клеточная линия колоректального рака человека, № АТСС CCL-229, культивирование для МТТ исследования: стандартная среда: Kaighn's + L-глутамин (Invitrogen 21127) + 10% инактивированной нагреванием FCS (от Gibco, №10500-064). Культивирование для CTG исследование: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, стаб. глутамин) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-положительные.

KPL4: клеточная линия рака молочной железы человека, Bayer Pharma AG (идентичность проверена и подтверждена на 19.7.2012 в DSMZ), стандартная среда: RPMI 1640 (от Gibco; #21875-059, стаб. L-глутамин) + 10% инактивированной нагреванием FCS (Gibco, №10500-064); HER2-положительные.

SK-HEP-1: клеточная линия рака печени человека, № АТСС НТВ-52, стандартная среда: MEM с солями Эрла + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% инактивированной нагреванием FCS (от Gibco, №10500-064); EGFR-положительные, TWEAKR-положительные

Клетки культивировали с помощью стандартного метода, как указано в Американской коллекции тканевых культур (АТСС) для соответствующих клеточных линий.

CTG исследование

Клетки культивировали в соответствии со стандартным методом, используя среду для выращивания, указанную в С-1. Исследование проводили путем отсоединения клеток раствором трипсина (0.05%) и EDTA (0.02%) в PBS (Biochrom AG #L2143), осаждения центрифугированием, ресуспендирования в культуральной среде, подсчета количества и высевания клеток в культуральный планшет на 96 лунок с белым дном (Costar #3610) (при 75 мкл/лунку, количества клеток на лунку были следующие: NCI-H292: 2500 клеток/лунку, ВхРС3 2500 клеток/лунку, LoVo 3000 клеток/лунку) и инкубирования в инкубаторе при 37°С и 5% углекислого газа. Через 48 ч, конъюгаты антитела с лекарственным средством добавляли в 25 мкл культуральной среды (концентрированной в четыре раза) к клеткам с получением конечных концентраций конъюгата антитела с лекарственным средством от 3×10^-7 М до 3×10^-11 М на клетках (в трех повторах). Клетки затем инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% углекислого газа. На параллельном планшете, активность клеток в момент начала лечения лекарственным средством (день 0) определяли с использованием CellTiter Glow (CTG) люминесцентного исследования жизнеспособности клеток (Promega #G7573 и #G7571). Для этой цели, на лунку добавляли партию 100 мкл субстрата, затем планшеты покрывали алюминиевой фольгой, встряхивали на планшетном шейкере при 180 об/мин в течение 2 минут, оставляли стоять на лабораторном столе в течение 8 минут и затем измеряли с использованием люминометра (Victor Х2, Perkin Elmer). Субстрат детектирует содержание АТФ живых клеток, генерирующих сигнал люминесценции, интенсивность которого прямо пропорциональна жизнеспособности клеток. Затем, после 72 ч инкубации с конъюгатами антитела с лекарственным средством, жизнеспособность этих клеток также определяли, используя CellTiter Glow люминесцентное исследование жизнеспособности клеток, как описано выше. Из измеренных данных, IC50 ингибирования роста рассчитывали по сравнению с днем 0, используя программу табличных расчетов для DRC (кривая зависимости доза-эффект) исследования и 4-параметрическую подгонку. DRC таблица исследования представляет собой программу табличных расчетов BioBook, разработанную Bayer Pharma AG и Bayer Business Services на IDBS E-WorkBook Suite платформе (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Гилдфорд, Великобритания).

В Таблице 1a ниже приведены значения IC50: для репрезентативных рабочих примеров из этого исследования:

Сообщенные данные активности относятся к рабочим примерам, описанным в настоящем экспериментальном разделе, с указанным соотношением лекарственной средство/mAB. Значения могут отклоняться в случае разных соотношений лекарственное средство/mAB. IC50 значения являются средними значениями независимых экспериментов или отдельными значениями. Действие конъюгатов антитела с лекарственным средством было селективным в отношении соответствующего изотипического контроля, содержащего соответствующий линкер и токсофор.

В качестве дополнительного эталонного соединения, по аналогии с Примером 1k, D-аспарагиновый эпимер Промежуточного соединения Q1 сочетали с анти-TWEAKR антителом ТРР-2658.

Контрольный пример для Примера 1k

В данном случае по аналогии с Примером 1k, D-аспарагиновый эпимер Q1 сочетали с 60 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 11.56 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.6

Как показано в Таблице 1а, этот контрольный ADC не оказывает какого-либо существенного цитотоксического действия на 3 клеточные линии.

МТТ исследование

Клетки культивировали в соответствии со стандартным методом, используя среду для выращивания, указанную в С-1. Исследование проводили путем отсоединения клеток раствором аккутазы в PBS (от Biochrom AG #L2143), осаждения центрифугированием, ресуспендирования в культуральной среде, подсчета количества и высевания клеток в культуральный планшет на 96 лунок с белым дном (от Costar #3610) (NCI Н292: 2500 клеток/лунку; SK-HEP-1: 1000 клеток/лунку; KPL-4: 1200 клеток/лунку; в общем объеме 100 мкл). Клетки затем инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% углекислого газа. Через 48 ч среду заменяли. Конъюгаты антитела с лекарственным средством в 10 мкл культуральной среды в концентрациях от 10^-5 М до 10^-13 М затем пипетировали к клеткам (в трех повторах), и исследуемый образец затем инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% углекислого газа. Через 96 ч пролиферацию клеток детектировали с использованием МТТ исследования (АТСС, Манассас, Вирджиния, США, каталожный №30-1010K). Для этой цели, МТТ реагент инкубировали с клетки в течение 4 ч с последующим лизисом клеток в течение ночи путем добавления детергента. Образовавшийся краситель детектировали при 570 нм (Infinite M1000 pro, Tecan). Данные измерений использовали для вычисления IC₅₀ ингибирования роста с использованием DRC (кривая зависимости доза-эффект). Пролиферацию клеток, которые не обрабатывали исследуемым веществом, но во всем остальном обрабатывали идентично, определяли как 100% значение.

В Таблицах 1b и 1с ниже приведены IC₅₀ значения для репрезентативных рабочих примеров из этого исследования:

Сообщенные данные активности относятся к рабочим примерам, описанным в настоящем экспериментальном разделе, с указанным соотношением лекарственное средство/mAB. Значения могут отклоняться в случае разных соотношений лекарственное средство/mAB. IC50 значения являются средними значениями независимых экспериментов или отдельными значениями. Действие конъюгатов антитела с лекарственным средством было селективным в отношении соответствующего изотипического контроля, содержащего соответствующий линкер и токсофор.

В данном случае также, по аналогии с Примером 1е, D-аспарагиновый эпимер Q1 сочетали с 5 мг трастузумаба. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 1.68 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.6

Как показано в Таблице 1с, этот контрольный ADC также не оказывает какого-либо существенного цитотоксического действия на клеточную линию KPL4.

C-1b Определение ингибирования белка кинезин веретена KSP/Eg5 выбранными соединениями примеров

Моторный домен белка кинезин веретена человека KSP/Eg5 (tebu-bio/Cytoskeleton Inc, №027EG01-XL) инкубировали при концентрации 10 нМ с микротрубочками (бычьими или свиными, tebu-bio/Cytoskeleton Inc), стабилизированными 50 мкг/мл таксола (Sigma № T7191-5MG) в течение 5 мин при КТ в 15 мМ PIPES, рН 6.8 (5 мМ MgCl₂ и 10 мМ DTT, Sigma). Из свежеприготовленной смеси отбирали аликвоты в 384 МТР (от Corning). Затем добавляли исследуемые ингибиторы в концентрациях от 1.0×10^-6 М до 1.0×10^-13 М и АТФ (конечная концентрация 500 мкМ, Sigma). Инкубацию осуществляли при КТ в течение 2 ч. АТФазную активность определяли путем детектирования образованного неорганического фосфата, используя малахитовый зеленый (Biomol). После добавления реагента, исследуемый образец инкубировали при КТ в течение 50 минут перед детектированием абсорбции при длине волны 620 нм. В качестве положительных контролей использовали монастрол (Sigma, M8515-lmg) и испинесиб (AdooQ Bioscience А10486). Индивидуальные данные кривой зависимости доза-активность представляют собой восьмикратные определения. Значения IC₅₀ представляют собой средние значения двух независимых экспериментов. 100% контроль представляет собой образец, который не обрабатывали ингибиторами.

В Таблице 2 ниже перечислены значения IC₅₀ репрезентативных рабочих примеров из описанного исследования и обобщены соответствующие данные цитотоксичности (МТТ исследование):

Сообщенные данные активности относятся к рабочим примерам, описанным в настоящем экспериментальном разделе.

С-1c Ферментные исследования

а: Исследование с катепсином В

Для каждого исследуемого пролекарства, расщепляемого катепсином В, смесь приготовляли в микрореакционном сосуде (0.5 мл, от Eppendorf). Использованный в данном случае фермент получали из ткани печени человека. Сначала загружали 2 мкг катепсина В (Sigma С8571 25 мкг) и доводили до общего объема 200 мкл с помощью 50 мМ Na фосфатного буфера, рН 6.0, 2 мМ DTT. Затем пипетировали 50 мкл раствора исследуемого субстрата. Смесь инкубировали в термоблоке (от Thermo Fisher Scientific) при 40°С и при постоянном перемешивании со скоростью 300 об/мин. Ферментативную реакцию контролировалось кинетически. Для этой цели, 10 мкл образец отбирали в разное время. Для того, чтобы остановить ферментативную реакцию, к отобранному образцу немедленно примешивали 20 мкл охлажденного льдом метанола и затем замораживали при -20°С. Время, выбранное для отбора проб, было следующим: после 10 мин, 2 ч, 4 ч и 24 ч. Осуществляли ОФ-ВЭЖХ анализ (обращенно-фазовая ВЭЖХ, от Agilent Technologies, 1200 Series). Определение высвобождения токофоров позволило определить время полужизни t_1/2 в случае данной ферментативной реакции.

b: Исследование с легумаином

Исследование с легумаином проводили с рекомбинантным человеческим ферментом. Раствор фермента rh легумаина (каталожный # 2199-CY, R&D Systems) разбавляли до желаемой концентрации в смеси 50 мМ Na ацетатный буфер/100 мМ NaCl, рН 4.0 и предварительно инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Конечную концентрацию rh легумаина затем доводили до 1 нг/мкл в 50 мМ MES буфера, 250 мМ NaCl, рН 5.0. Для каждого исследуемого отщепляемого легумаином пролекарства, смесь приготовляли в микрореакционном сосуде (0.5 мл, от Eppendorf). Для этой цели, раствор субстрата доводили до желаемой концентрации (двойная концентрация) с помощью 50 мМ MES буфера, 250 мМ NaCl, рН 5.0. Для определения кинетических параметров ферментативной реакции, сначала загружали 250 мкл раствора легумаина и ферментативную реакцию запускали путем добавления 250 мкл раствора субстрата (конечная концентрация: одинарная концентрация). В разные моменты времени отбирали 50 мкл образцы. Для того, чтобы остановить ферментативную реакцию, к этим образцам немедленно примешивали 100 мкл охлажденного льдом метанола и затем замораживали при -20°С. Время, выбранное для отбора проб, было следующим: после 0.5 ч, 1 ч, 3 ч и 24 ч. Образцы затем исследовали с помощью ОФ-ВЭЖХ анализа и ЖХ-МС анализа. Определение высвобождения токофоров позволило определить время полужизни t_1/2 в случае данной ферментативной реакции.

В качестве репрезентативных примеров для демонстрации опосредованного легумаином расщепления, субстраты, полученные в данном исследовании с легумаином, были модельными соединениями А и В.

Эталонный пример: модельное соединение А

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-(метиламино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид (1:1) получали, как описано в WO 2015096982 А1. Затем, это промежуточное соединение использовали для получения указанного в заголовке соединения путем сочетания с Промежуточным соединением L103 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.86 мин; МС (ESI положит.): m/z=902 [М+Н]⁺.

Эталонный пример: модельное соединение В

N-(Пиридин-4-илацетил)-L-аланил-N-метил-L-аланил-N¹-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-(метиламино)-1-оксобутан-2-ил]-L-аспартамид

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид (1:1) получали, как описано в WO 2015096982 А1. Затем, это промежуточное соединение использовали для получения указанного в заголовке соединения путем сочетания с Промежуточным соединением L119 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=916 [М+Н]⁺.

Соединение А расщепляется легумаином в условиях, описанных выше, до целевого соединения с временем полужизни 1.1 ч.

С-2 Исследование интернализации

Интернализация является ключевым процессом, который предоставляет возможность специфического и эффективного обеспечения цитотоксической нагрузки в раковых клетках, экспрессирующих антиген, с помощью конъюгатов антитела с лекарственным средством (ADC). Этот процесс контролируют с помощью введения флуоресцентной метки в специфические антитела и изотипическое контрольное антитело. Прежде всего флуоресцентный краситель конъюгируют с лизином антитела. Конъюгирование проводят, используя двукратный молярный избыток CypHer 5Е моно NHS сложного эфира (Batch 357392, GE Healthcare) при рН 8.3. После сочетания реакционную смесь очищают с помощью гель-хроматографии (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Thermo Scientific, №87768; буфер для элюирования: DULBECCO'S PBS, Sigma-Aldrich, № D8537), для удаления избытка красителя и доведения значения рН. Белковый раствор концентрировали, используя VIVASPIN 500 колонки (Sartorius stedim biotec). Антитело, загруженное красителем, определяли с помощью спектрофотометрического анализа (от NanoDrop) и последующего расчета (D/P=А_{краситель}ε_белок:(А₂₈₀-0.16А_{краситель})ε_{краситель}).

Антитело, загруженное красителем, исследуемое в настоящей заявке, и изотипический контроль были сравнимым по порядку полученных значений. В клеточных исследованиях связывания, было подтверждено, что сочетание не приводит к каким-либо изменениям аффинности антител.

Для исследование интернализации использовали меченные антитела. Перед началом обработки, клетки (2×10⁴/лунку) высевали в 100 мкл среды в 96-луночный МТР (жирный, черный, с прозрачным дном №4308776, от Applied Biosystems). После 18 ч инкубации при 37°С/5% CO₂, среду заменяли и добавляли меченные антитела в различных концентрациях (10, 5, 2.5, 1, 0.1 мкг/мл). Такой же протокол обработки применяли для меченного изотипического контроля (отрицательный контроль). Выбранное время инкубации составляло 0 ч, 0.25 ч, 0.5 ч, 1 ч, 1.5 ч, 2 ч, 3 ч, 6 ч и 24 ч. Измерения флуоресценции проводили, используя InCellAnalyzer 1000 (от GE Healthcare). Вслед за этим выполняли кинетическую оценку путем измерения параметров подсчета гранул/клетку и общей интенсивности гранул/клетку.

После связывания с рецептором, антитела исследовали касательно их способности к интернализации. Для этой цели отбирали клетки с различными уровнями экспрессии рецептора. Наблюдали специфическую интернализацию, опосредованною мишенью, с антителами, в то время как изотипический контроль не демонстрировал интернализации.

С-3 Исследования in vitro для определения проницаемости клеток

Клеточную проницаемость вещества можно исследовать с помощью in vitro исследования в проточном анализе, используя Сасо-2 клетки [M.D. Troutman и D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Для этой цели, клетки культивировали в течение 15-16 дней в фильтровальных планшетах на 24 лунки. Для определения проницаемости, соответствующее исследуемое вещество применяли в HEPES буфере к клеткам либо апикально (А), либо базально (В) и инкубировали в течение 2 часов. Через 0 часов и через 2 часа, образцы отбирали из цис- и транс-компартментов. Образцы разделяли с помощью ВЭЖХ (Agilent 1200, Беблинген, Германия), используя колонки с обращенной фазой. ВЭЖХ систему соединяли посредством Turbo Ion Spray Interface с масс-спектрометром Triple Quadropol API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Дармштадт, Германия). Проницаемость оценивали на основания значения Р_арр, которое рассчитывали, используя формулу, опубликованную Schwab и др. [D. Schwab и др., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Вещество классифицировали как активно транспортируемое, если соотношение Р_арр (В-А) к Р_арр (А-В) (соотношение эффлюкса) составляло >2 или <0.5.

Чрезвычайно важными для токсофоров, которые высвобождаются внутриклеточно, являются проницаемость от В к А [Р_арр (В-А)] и соотношение Р_арр (В-А) к Р_арр (А-В) (соотношение эффлюкса): чем ниже эта проницаемость, тем медленнее активность и процессы пассивного транспорта вещества через монослой Сасо-2 клеток. Если соотношение эффлюкса дополнительно не указывает на какой-либо активный транспорт, то вещество может, после внутриклеточного высвобождения, оставаться дольше в клетке. Следовательно, также доступно больше времени для взаимодействия с биохимической мишенью (в данном случае: белок кинезина веретена, KSP/Eg5).

В Таблице 3 ниже приведены данные проницаемости для репрезентативных рабочих примеров из этого исследования:

С-4 Исследования in vitro для определения свойств субстратов для Р-гликобелка (P-gp)

Многие опухолевые клетки экспрессируют транспортные белки для лекарственных препаратов, и это часто сопровождается развитием резистентности к цитостатикам. Таким образом, вещества, которые не являются субстратами для таких транспортных белков, такие как, например, Р-гликобелок (P-gp) или BCRP, могут проявлять улучшенный профиль активность.

Субстратные свойства вещества для P-gp (АВСВ1) определяли с помощью исследования потока, используя LLC-PK1 клетки, которые сверхэкспрессируют P-gp (L-MDR1 клетки) [А.Н. Schinkel и др., J. Clin. Invest. 96, 1698-1705 (1995)]. Для этой цели, LLC-PK1 клетки или L-MDR1 клетки культивировали в фильтровальных планшетах на 96 лунок в течение 3-4 дней. Для определения проницаемости, соответствующее исследуемое вещество, отдельно или в присутствии ингибитора (такого как, например, ивермектин или верапамил), применяли в HEPES буфере к клеткам либо апикально (А), либо базально (В), и инкубировали в течение 2 часов. Через 0 часов и через 2 часа, образцы отбирали из цис- и транс-компартментов. Образцы разделяли с помощью ВЭЖХ, используя колонки с обращенной фазой. ВЭЖХ систему соединяли посредством Turbo Ion Spray Interface с масс-спектрометром Triple Quadropol API 3000 (Applied Biosystems Applera, Дармштадт, Германия). Проницаемость оценивали на основания значения Р_арр которое рассчитывали, используя формулу, опубликованную Schwab и др. [D. Schwab и др., J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]. Вещество классифицировали как P-gp субстрат, если соотношение эффлюкса Р_арр (В-А) к Р_арр (А-В) составляло >2.

В качестве дальнейшего критерия для оценки свойств P-gp субстрата, можно сравнить соотношение эффлюксов в L-MDR1 и LLC-PK1 клетках, или соотношение эффлюксов в присутствии или отсутствии ингибитора. Если эти значения отличаются более, чем в 2 раза, то данное вещество является P-gp субстратом.

С-5 Фармакокинетика

С5а: Идентификация ADC метаболитов после интернализации in vitro

Описание метода:

Исследования интернализации с иммуноконъюгатами проводили для анализа метаболитов, образованных внутриклеточно. Для этой цели, клетки опухоли легкого человека NCI Н292 (3×10⁵/лунку) высевали в планшеты на 6 лунок и инкубировали в течение ночи (37°С, 5% СО₂). Клетки обрабатывали с помощью 10 мкг/мл (66 нМ) исследуемого ADC. Интернализацию проводили при 37°С и 5% СО₂. В различные временные точки (0, 4, 24, 48, 72 ч), отбирали образцы клеток для дальнейшего анализа. Прежде всего супернатанты (приблизительно 5 мл) собирали и, после центрифугирования (2 мин, КТ, 1000 об/мин Heraeus Variofuge 3.0R), хранили при -80°С. Клетки промывали PBS и отсоединяли с помощью Аккутазы, и подсчитывали количество клеток. После еще одного промывания, определенное количество клеток (2×10⁵) обрабатывали с помощью 100 мл лизирующего буфера (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1) и инкубировали при непрерывном встряхивании (Thermomixer, 15 мин, 4°С, 650 об/мин) в пробирках Protein LoBind (Eppendorf № кат. 0030 108.116). После инкубирования, лизат центрифугировали (10 мин, 4°С, 12000 g, Eppendorf 5415R) и супернатант собирали. Полученный супернатант хранили при -80°С. Затем все образцы анализировали следующим образом.

Измерения соединений в культуральном супернатанте или клеточном лизате проводили после осаждения белков метанолом или ацетонитрилом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) сопряженной с трехквадрупольным масс-спектрометром (МС).

Для обработки 50 мкл культурального супернатанта/лизата клеток, добавляли 150 мкл преципитирующего реагента (обычно ацетонитрил) и смесь встряхивали в течение 10 секунд. Преципитирующий реагент содержит внутренний стандарт (ISTD) в подходящей концентрации (обычно в диапазоне 20-100 нг/мл). После центрифугирования в течение 3-х минут при 16000 g, супернатант переносили во флакон с автоматическим пробозаборником, доводили до 500 мкл с помощью буфера, подходящего для подвижной фазы, и снова встряхивали.

Затем измеряли двухматричные образцы, используя ВЭЖХ-сопряженный трехквадрупольный масс-спектрометр API6500 от АВ SCIEX Deutschland GmbH.

Для калибровки, к образцам плазмы добавляли концентрации 0.5-2000 мкг/л. Предел детектирования (LOQ) составлял приблизительно 2 мкг/л. Линейный диапазон распространялся от 2 до 1000 мкг/л.

Для калибровки образцов опухолей, к супернатанту необработанных опухолей добавляли концентрации 0.5-200 мкг/л. Предел детектирования составлял 4 мкг/л. Линейный диапазон распространялся от 4 до 200 мкг/л.

Контроли качества для достоверности исследования содержали 5 и 50 мкг/л.

C5b: Идентификация ADC метаболитов in vivo

После в/в введения 3-30 мг/кг различных ADC, в плазме и опухоли можно измерить концентрации ADC и любых встречающихся метаболитов, и можно рассчитать фармакокинетические параметры, такие как клиренс (CL), площадь под кривой (AUC) и время полураспада (t_1/2).

В качестве эталонного примера (R10k), ADC с агонистическим антителом ТРР-2658 получали с нерасщепляемым линкером:

Эталонный пример R10k

К 150 мг анти-TWEAKR антитела ТРР-2658 в 10.5 мл PBS (с=14.28 мг/мл) в атмосфере аргона добавляли раствор 0.86 мг ТСЕР в 2 мл буфера PBS. Антитело ТРР-2658 и его получение подробно описано в WO 2015/189143 А1.

Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем добавляли 6.63 мг (0.008 ммоль) Промежуточного соединения F104, растворенного в 1250 мкл ДМСО. После перемешивания при КТ в течение дополнительных 90 мин, смесь разбавляли 1250 мкл буфера PBS, который заранее был доведен до рН 8.

Этот раствор затем пропускали через PD 10 колонки (Sephadex® G-25, GE Healthcare), уравновешенные PBS буфером, рН 8, и элюировали рН буфером, рН 8. Элюат разбавляли до общего объема 22.5 мл PBS буфером, рН 8. Этот раствор перемешивали при КТ в атмосфере аргона в течение ночи и затем повторно забуферивали до рН 7.2 с помощью PD-10 колонок. Вслед за этим выполняли концентрирование путем ультрацентрифугирования, повторное разбавление PBS буфером (рН 7.2) и еще раз концентрирование. Полученная партия ADC характеризовалась следующими параметрами:

Концентрация белка: 14.06 мг/мл

Соотношение лекарственное средство/mAb: 3.4

Анализы для количественной оценки любых встречающихся метаболитов

Измерения соединений в опухоли и ткани проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сопряженной с трехквадрупольным масс-спектрометром (МС), после осаждения белков метанолом или ацетонитрилом.

Во время осуществления обработки опухоли или ткани, ее обрабатывали 3 раза определенным количеством буфера для экстракции. Буфер для экстракции содержал 50 мл реагента для экстракции тканевого белка (Pierce, Rockford, IL), две пеллеты полной смеси ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и фенилметилсульфонил фторид (Sigma, St. Louis, МО) в конечной концентрации 1 мМ. Образец гомогенизировали два раза в течение 20 минут в Tissuelyser II (Qiagen), при максимальном количестве ударов. 50 мкл гомогената переносили во флакон с автоматическим пробозаборником и доводили до 150 мкл с помощью метанола, включающего ISTD. После центрифугирования в течение 3-х минут при 16000 g, 10 мкл супернатанта доводили до 180 мкл с помощью буфера, подходящего для подвижной фазы, и снова встряхивали. После этого опухолевый образец был готов для измерения.

Затем измеряли двухматричные образцы, используя ВЭЖХ, сопряженную с трехквадрупольным масс-спектрометром API6500 от АВ SCIEX Deutschland GmbH.

Для калибровки образцов опухолей и ткани, концентрации 0.5-200 мкг/л добавляли к супернатанту нелеченых опухолей или ткани. Предел детектирования составил 3 мкг/л. Линейный диапазон распространялся от 3 до 200 мкг/л.

Контроли качества для достоверности исследования содержали 5 и 50 мкг/л, в плазме дополнительно 500 мкг/л.

Таблица: концентрации катаболитов в NCI Н292 ксенотрансплантате опухоли мыши, печени и почке через 24 ч после введения 10 мг/кг ADC из Примера 1k* (n=3) или 10 мг/кг ADC из эталонного примера R10k (n=2). Измеренный в обоих случаях катаболит представлял собой: М26.

После введения ADC Примера 1k* согласно изобретению, содержащего отщепляемый легумаином пролекарственный остаток, в опухоли измеряли концентрации активного катаболита М26, и они были сопоставимы с концентрациями, измеренными после введения ADC с тем же антителом, но без отщепляемого легумаином пролекарственного остатка. В отличие от этого, измеренные концентрации активного метаболита, в особенности, в печени, после введения ADC из Примера 1k*, были значительно ниже, чем после введения эталонного ADC R10k. Наблюдается гораздо более селективное высвобождение активного компонента в ткани-мишени (опухоль) по сравнению с другими органами, когда в активном компоненте используется отщепляемый легумаином пролекарственный остаток.

Анализ для количественной оценки применяемого антитела

Часть антитела ADC определяли, используя исследование связывания лиганда (ELISA) в виде общей концентрации IgG в образцах плазмы и опухолевых лизатах. В данном случае использовали сэндвич-формат ELISA. Этот ELISA был квалифицирован и утвержден для определения в образцах плазмы и опухоли. Планшеты ELISA покрывали анти-человеческими козьими IgG Fc антителами. После инкубирования с образцом, планшеты промывали и инкубировали с обнаруживающим конъюгатом обезьяньего анти-человеческого IgG(H+L) антитела и пероксидазой хрена (HRP). После дополнительной стадии промывки, HRP субстрат добавляли к OPD и за развитием цвета наблюдали по абсорбции на длине 490 нм. Стандартные образцы, имеющие известную концентрацию IgG, подгоняли, используя 4-параметрическое уравнение. В пределах нижнего (LLOQ) и верхнего (ULOQ) пределов количественного определения неизвестные концентрации определяли путем интерполяции.

С-6 Исследование активности in vivo

Активность конъюгатов в соответствии с изобретением исследовали, например, используя модели ксенотрансплантатов. Специалист в данной области техники знает такие методы из уровня техники, которые предоставляют возможность исследовать активность соединений в соответствии с изобретением (см., например, WO 2005/081711; Polson и др., Cancer Res. 2009 Mar 15; 69(6):2358-64). Для этой цели, опухолевую клеточную линию, экспрессирующую целевую молекулу связующего, инокулировали грызунам (например, мышам). Затем инокулированным животным вводили конъюгат в соответствии с изобретением, изотипический контрольный конъюгат, контрольное антитело или изотонический солевой раствор. Введение осуществляли один раз или несколько раз. После времени инкубирования несколько дней, размер опухоли определяли путем сравнения животных, обработанных конъюгатом, и контрольной группы. У животных, которых лечили конъюгатом, обнаруживали меньший размер опухоли.

С-6а. Ингибирование роста/регрессия экспериментальных опухолей у мышей

Опухолевые клетки человека, которые экспрессируют антиген для конъюгата антитела с лекарственным средством, инокулировали подкожно в бок иммуносупрессивным мышам, например, NMRI бестимусным или SCID мышам. 1-10 миллионов клеток отсоединяли от клеточной культуры, центрифугировали и ресуспендировали в среде или среде/матригеле. Клеточную суспензию инъецировали под кожу мышам.

В течение нескольких дней, опухоль росла. Лечение начинали после разрастания опухоли, при размере опухоли приблизительно 40 мм². Для оценки влияния на большие опухоли, лечение можно начинать только при размере опухоли 50-100 мм².

Лечение с помощью APDC и ADC проводили путем внутривенного введения (в/в) в хвостовую вену мыши. ADC вводили в объеме 5 мл/кг.

Протокол лечения зависел от фармакокинетики антитела. Лечение конъюгатами в соответствии с изобретением осуществляли один раз в неделю в течение 2 или 3 недель в качестве стандарта. Для быстрой оценки, можно использовать протокол с однократным введением. Тем не менее, лечение также можно продолжать, или второй цикл трех дней лечения можно проводить позже.

В качестве стандарта использовали 8 животных на леченную группу. Дополнительно к группам, которым вводили активные вещества, одной группе в качестве контрольной группы в соответствии с тем же протоколом вводили только буфер.

Во время осуществления эксперимента, площадь опухоли измеряли регулярно в двух измерениях (длина/ширина), используя штангенциркуль. Площадь опухоли определяли как длина × ширину. Соотношение средней площади опухоли леченной группы к средней площади опухоли контрольной группы обозначали как Т/С площадь.

Когда после окончания лечения, все экспериментальные группы останавливали в одно и то же время, опухоли можно было удалить и взвесить. Соотношение средней массы опухоли леченной группы к средней массе опухоли контрольной группы обозначали как Т/С масса.

С-6b. Эффективность APDC и ADC в соответствии с изобретением в различных моделях опухолей

Опухолевые клетки инокулировали подкожно в бок самкам NMRI голых мышей (Janvier). При размере опухоли ~40 мм² осуществляли внутривенное лечение конъюгатом антитело-лекарственное средство. После лечения, в случае необходимости, наблюдение за ростом опухоли продолжали.

Лечение с помощью APDC в соответствии с изобретением приводило к четко выраженному и в некоторых случаях длительному ингибированию роста опухоли по сравнению с контрольной группой конъюгированного изотипического контрольного антитела. Таблица 8 показывает Т/С значения, определенные для массы и площади опухолей в соответствующий день окончания эксперимента, рассчитанный с начала лечения.

--->

SEQUENCE LISTING

<110> Bayer Pharma AG

<120> Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) und Binder-Prodrug-Konjugate

(APDCs) mit enzymatisch-spaltbaren Gruppen

<130> BHC 15 1 031 A

<160> 245

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 3

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 5

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 6

Pro Tyr Pro Met Ile

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 7

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 8

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 11

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 13

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 14

Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 15

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 16

Pro Tyr Pro Met Ile

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 17

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 18

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 20

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 21

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 22

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 24

Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 25

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 26

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 27

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 28

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 30

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 31

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 32

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 32

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 33

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 34

Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 35

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 36

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 37

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 37

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 38

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 40

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 41

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 42

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 42

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 43

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 44

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 45

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 46

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 47

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 48

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 49

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 50

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 50

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 51

<211> 215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 52

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 52

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 53

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 53

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 54

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 55

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 56

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 57

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 58

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 59

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 60

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 61

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 61

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 62

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 62

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 63

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 64

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 65

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 66

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 67

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 67

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 68

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 69

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 70

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 70

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 71

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 71

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 72

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 72

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 73

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 74

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 74

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 75

Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 76

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 77

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 78

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 78

Gly Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 79

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 79

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 80

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 81

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 81

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 82

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 82

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 83

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 83

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 84

Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 85

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 85

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 86

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 86

Pro Tyr Pro Met Ile

1 5

<210> 87

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 87

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 88

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 88

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 89

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 89

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 90

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 90

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 91

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 91

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 92

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 92

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 93

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 93

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 94

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 94

Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 95

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 96

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 97

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 98

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 98

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 99

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 99

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 100

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 100

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 101

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 101

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 102

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 102

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 103

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 103

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 104

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 104

Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 105

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 105

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Gly Ile Thr

1 5 10

<210> 106

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 106

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 107

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 107

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 108

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 108

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 109

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 109

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 110

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 110

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 111

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 111

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 112

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 112

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 113

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 113

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 114

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 114

Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 115

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 115

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 116

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 116

Pro Tyr Pro Met Met

1 5

<210> 117

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 117

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 118

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 118

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 119

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 119

Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser

85 90 95

Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 120

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 120

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 121

<211> 218

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 121

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 122

<211> 450

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 122

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser

115 120 125

Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val

130 135 140

Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr

180 185 190

Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro

195 200 205

Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr

210 215 220

Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met

245 250 255

Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu

260 265 270

Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val

275 280 285

His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu

290 295 300

Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly

305 310 315 320

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr

355 360 365

Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu

370 375 380

Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val

405 410 415

Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val

420 425 430

His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 123

<211> 218

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 123

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 124

<211> 448

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 124

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asn Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Gly Gly Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

260 265 270

Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val

290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr

355 360 365

Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr

370 375 380

Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys

405 410 415

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu

420 425 430

Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly

435 440 445

<210> 125

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 125

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 126

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 126

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 127

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 127

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 128

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 128

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 129

<211> 218

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 129

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Thr Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp

85 90 95

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 130

<211> 448

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 130

Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser

245 250 255

Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp

260 265 270

Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr

275 280 285

Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val

290 295 300

Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu

305 310 315 320

Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr

355 360 365

Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr

370 375 380

Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys

405 410 415

Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu

420 425 430

Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly

435 440 445

<210> 131

<211> 218

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 131

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

115 120 125

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

145 150 155 160

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

180 185 190

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

195 200 205

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215

<210> 132

<211> 451

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 132

Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Arg Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro

115 120 125

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro

210 215 220

Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu

245 250 255

Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu

275 280 285

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser

305 310 315 320

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val

355 360 365

Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val

370 375 380

Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg

405 410 415

Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val

420 425 430

Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg

435 440 445

Thr Pro Gly

450

<210> 133

<211> 282

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 133

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser His Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ser Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 134

<211> 282

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 134

Glu Gln Ala Pro Gly Asn Ala Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe

35 40 45

Arg Met Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 135

<211> 282

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 135

Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ser Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 136

<211> 282

<212> PRT

<213> Canis lupus

<400> 136

Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Pro Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 137

<211> 282

<212> PRT

<213> Mus Musculus

<400> 137

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ser Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 138

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 138

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 139

<211> 296

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 139

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp

50 55 60

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

65 70 75 80

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

85 90 95

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

100 105 110

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

115 120 125

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

130 135 140

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

145 150 155 160

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

165 170 175

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

180 185 190

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

195 200 205

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

210 215 220

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

225 230 235 240

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

245 250 255

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

260 265 270

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

275 280 285

Gly Lys His His His His His His

290 295

<210> 140

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 140

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 141

<211> 47

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 141

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala His His His His His His

35 40 45

<210> 142

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 142

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Gln Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 143

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 143

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

Lys Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 144

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 144

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 145

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 145

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Ala Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 146

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 146

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Ala Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 147

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 147

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Arg Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 148

<211> 282

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 148

Glu Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

50 55 60

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

65 70 75 80

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

85 90 95

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

100 105 110

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

115 120 125

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

130 135 140

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

145 150 155 160

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

180 185 190

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

210 215 220

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

245 250 255

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

260 265 270

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

275 280

<210> 149

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 149

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Ala

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 150

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 150

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Ala Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 151

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 151

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Ala Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 152

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 152

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ala Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 153

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 153

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro Ala Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 154

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 154

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Ala His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 155

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 155

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Ala Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 156

<211> 240

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 156

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Ala Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

<210> 157

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 157

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ala Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 158

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 158

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Ala Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 159

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 159

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Ala Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 160

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 160

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Ala Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 161

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 161

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Ala Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 162

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 162

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ala Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 163

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 163

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 164

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 164

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ala Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 165

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 165

Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ala Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 166

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 166

Ala Pro Cys Ser Ala Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 167

<211> 278

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 167

Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys

1 5 10 15

Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu

20 25 30

Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

35 40 45

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

50 55 60

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

85 90 95

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

115 120 125

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

130 135 140

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

145 150 155 160

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

165 170 175

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

180 185 190

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

195 200 205

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

210 215 220

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

225 230 235 240

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

245 250 255

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265 270

His His His His His His

275

<210> 168

<211> 53

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 168

Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser

1 5 10 15

Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro

20 25 30

His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe

35 40 45

Arg Leu Leu Trp Pro

50

<210> 169

<211> 129

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 169

Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly

20 25 30

Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys

35 40 45

Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys

50 55 60

Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro

65 70 75 80

Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser

85 90 95

Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr

100 105 110

Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile

115 120 125

Gln

<210> 170

<211> 959

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 170

atggctcggg gctcgctgcg ccggttgctg cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg 60

ttgctgcgct ccgtggccgg ggagcaagcg ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc 120

tcctggagcg cggacctgga caagtgcatg gactgcgcgt cttgcagggc gcgaccgcac 180

agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct gctttggccc 240

atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300

tggagacgat gccgcaggag agagaagttc accaccccca tagaggagac cggcggagag 360

ggctgcccag ctgtggcgct gatccagtga caatgtgccc cctgccagcc ggggctcgcc 420

cactcatcat tcattcatcc attctagagc cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc 480

caagctcctc caaccacaag gggggtgggg ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc 540

agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa 600

gggagcctca cgctggctca cacaaaacag ctgacactga ctaaggaact gcagcatttg 660

cacaggggag gggggtgccc tccttcctta ggacctgggg gccaggctga cttggggggc 720

agacttgaca ctaggcccca ctcactcaga tgtcctgaaa ttccaccacg ggggtcaccc 780

tggggggtta gggacctatt tttaacacta ggggctggcc cactaggagg gctggcccta 840

agatacagac ccccccaact ccccaaagcg gggaggagat atttattttg gggagagttt 900

ggaggggagg gagaatttat taataaaaga atctttaact ttaaaaaaaa aaaaaaaaa 959

<210> 171

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SITE

<222> 5..5

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 171

Pro Tyr Pro Met Xaa

1 5

<210> 172

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SITE

<222> 8..8

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 172

Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Xaa Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 173

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 173

Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 174

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SITE

<222> 8..8

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 174

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Xaa Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 175

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SITE

<222> 1..1

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 175

Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 176

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> SITE

<222> 5..6

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> SITE

<222> 8..8

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 176

Gln Gln Ser Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Ile Thr

1 5 10

<210> 177

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 177

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc ggctacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctaccag gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300

cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360

cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420

tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480

caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540

accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600

ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645

<210> 178

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 178

gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt cacattcagc ccctacccca tgatctgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcccca gcggcggcag cacccactac 180

gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300

gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 179

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 179

gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc ggctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300

cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 180

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 180

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatctgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 181

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 181

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctaccag gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180

agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300

cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360

cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420

tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480

caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540

accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600

ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645

<210> 182

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 182

gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt cacattcagc ccctacccca tgatgtgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcccca gcggcggcag cacccactac 180

gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300

gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 183

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 183

gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300

cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 184

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 184

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 185

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 185

gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctatgcc gccagctctc tgcagagcgg agtgcccagc 180

agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacagca cccccggcat cacatttggc 300

cagggcacca aggtggaaat caagcggaca gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360

cctagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420

tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagtc cggcaactcc 480

caggaaagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540

accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600

ggcctgtcta gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgt 645

<210> 186

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 186

gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc ccctacccta tgatgtgggt ccgacaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtgtcctac atctctccca gcggcggcag cacccactac 180

gccgattctg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcggc 300

gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcatct 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 187

<211> 645

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 187

gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctactcta gtccagggat cactttcggc 300

cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600

ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645

<210> 188

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 188

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacgtatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 189

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 189

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct actctagtcc agggatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 190

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 190

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacgtatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 191

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 191

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct actctagtcc agggatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 192

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 192

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatggttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080

atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 193

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 193

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcggct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc attcatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 194

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 194

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatctgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 195

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 195

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc agggatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 196

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 196

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 197

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 197

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcggct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc agggatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 198

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 198

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 199

<211> 651

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 199

gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60

gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120

aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240

caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc attcatcact 300

ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651

<210> 200

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 200

gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60

tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120

cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180

gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240

ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300

gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420

ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480

tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540

ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600

tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720

cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900

agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080

ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347

<210> 201

<211> 654

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 201

gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60

atcagctgcc gggccaacaa gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc tctggcaccg acttcatcct gaacatccac 240

cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcagaga gctgcccttc 300

accttcggca gcggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360

atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420

aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480

aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540

agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600

acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654

<210> 202

<211> 1350

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 202

caggtgcagc tgcagcagtc tggccctgaa gtcgtgcggc ctggcgtgtc cgtgaagatc 60

agctgcaagg gcagcggcta caccttcacc gactacggca tccactgggt caagcagagc 120

cacgccaaga gcctggaatg gatcggcgtg atcagcacct acaacggcta caccaactac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccatg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240

atggaactgg cccggctgac cagcgaggac agcgccatct actactgcgc cagagcctac 300

tacggcaacc tgtactacgc catggactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc 360

tctgccaaga ccaccgcccc tagcgtgtac cctctggccc ctgtgtgtgg cgacaccacc 420

ggcagctctg tgactctggg ctgcctggtc aagggctact tccccgagcc cgtgacactg 480

acctggaaca gcggcagcct gagcagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540

gacctgtaca ccctgagcag ctccgtgacc gtgacaagca gcacctggcc cagccagagc 600

atcacctgta acgtggccca ccccgccagc agcaccaagg tggacaagaa gatcgagccc 660

agaggcccca ccatcaagcc ctgcccccct tgcaagtgcc cagcccccaa tctgctgggc 720

ggacccagcg tgttcatctt cccacccaag atcaaggacg tgctgatgat cagcctgagc 780

cccatcgtga cctgcgtggt ggtggacgtg tccgaggacg accccgacgt gcagatcagt 840

tggttcgtga acaacgtgga agtgcacacc gcccagaccc agacccacag agaggactac 900

aacagcaccc tgcgggtggt gtccgccctg cccatccagc accaggactg gatgagcggc 960

aaagaattca agtgcaaagt gaacaacaag gacctgcctg cccccatcga gcggaccatc 1020

agcaagccca agggcagcgt gcgggctccc caggtgtacg tgctgccccc acccgaggaa 1080

gagatgacca agaagcaggt cacactgacc tgcatggtca ccgacttcat gcccgaggac 1140

atctacgtgg aatggaccaa caacggcaag accgagctga actacaagaa caccgagcct 1200

gtgctggaca gcgacggcag ctacttcatg tacagcaagc tgcgggtgga aaagaaaaac 1260

tgggtggaac ggaacagcta cagctgcagc gtggtgcacg agggcctgca caaccaccac 1320

accaccaaga gcttcagccg gacccccggc 1350

<210> 203

<211> 654

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 203

gatatcgtgc tgacacagag ccccgccagc ctgaccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60

atcagctgcc gggccagcca gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcagtggtat 120

cagcagcggc ctggccagcc ccccaagctg ctgattaagt acgccaccaa cctggacagc 180

ggcgtgcccg ccagattttc tggcagcggc agcggcacag acttcaccct gaacatccac 240

cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagctggga gatcccttac 300

accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360

atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420

aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480

aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540

agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600

acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654

<210> 204

<211> 1344

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 204

gaagtgaagc tggaagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60

agctgcgtgg ccagcggctt caccttcaac aactactgga tgagctgggt ccgacagagc 120

cccgagaagg gcctggaatg gctggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180

cactacgccg agagcgtgaa gggcaagttc accatcagcc gggacgacag caagagccgg 240

ctgtacctgc agatgaacaa cctgcgggcc gagaacaccg gcatctacta ctgcaccggc 300

ggcttcgccg actacttcga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gtcctctgcc 360

aagaccaccg cccctagcgt gtaccctctg gcccctgtgt gtggcgacac caccggcagc 420

tctgtgactc tgggctgcct ggtcaagggc tacttccccg agcccgtgac actgacctgg 480

aacagcggca gcctgagcag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcgacctg 540

tacaccctga gcagctccgt gaccgtgaca agcagcacct ggcccagcca gagcatcacc 600

tgtaacgtgg cccaccccgc cagcagcacc aaggtggaca agaagatcga gcccagaggc 660

cccaccatca agccctgccc cccttgcaag tgcccagccc ccaatctgct gggcggaccc 720

agcgtgttca tcttcccacc caagatcaag gacgtgctga tgatcagcct gagccccatc 780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtccgag gacgaccccg acgtgcagat cagttggttc 840

gtgaacaacg tggaagtgca caccgcccag acccagaccc acagagagga ctacaacagc 900

accctgcggg tggtgtccgc cctgcccatc cagcaccagg actggatgag cggcaaagaa 960

ttcaagtgca aagtgaacaa caaggacctg cctgccccca tcgagcggac catcagcaag 1020

cccaagggca gcgtgcgggc tccccaggtg tacgtgctgc ccccacccga ggaagagatg 1080

accaagaagc aggtcacact gacctgcatg gtcaccgact tcatgcccga ggacatctac 1140

gtggaatgga ccaacaacgg caagaccgag ctgaactaca agaacaccga gcctgtgctg 1200

gacagcgacg gcagctactt catgtacagc aagctgcggg tggaaaagaa aaactgggtg 1260

gaacggaaca gctacagctg cagcgtggtg cacgagggcc tgcacaacca ccacaccacc 1320

aagagcttca gccggacccc cggc 1344

<210> 205

<211> 654

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 205

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ctggctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaaat atgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttctccct caacatccat 240

cccatggagg aggacgatac cgcaatgtat ttctgtcagc acagtaggga gcttccattc 300

acgttcggcg gagggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360

atcttcccac ccagcgacga gcagctgaag tccggcaccg ccagcgtcgt gtgcctgctg 420

aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480

ggcaacagcc aggaaagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgtcc 540

agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600

acccaccagg gcctgagcag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654

<210> 206

<211> 1350

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 206

caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatggca tgcactgggt gcggcaggcc 120

cctggacaag ggctagagtg gatgggagtt attagtactt acaatggtta tacaaactac 180

aaccagaagt ttaagggcag agtcacaatg actgtagaca aatccacgag cacagcctat 240

atggaacttc ggagcttgag atctgacgat acggccgtgt attactgtgc aagagcctac 300

tatggcaacc tttactatgc tatggactac tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggccc cgagcagcaa gagcaccagc 420

ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtg aaagactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480

tcctggaact ctggcgccct gaccagcgga gtgcatacct tccccgccgt gctgcagagc 540

agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccca gcagcagcct gggaacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660

cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720

ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780

cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaagt gaagtttaat 840

tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900

aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960

aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020

agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgccccc cagccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta ccccagcgat 1140

atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca attacaagac caccccccct 1200

gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1260

tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320

acccagaagt ccctgagcct gagccccggc 1350

<210> 207

<211> 654

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 207

gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgtc gggccagcca gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgccca gccggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240

agtctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc acagctggga gatcccttac 300

accttcggcg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgtctaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654

<210> 208

<211> 1347

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 208

caggtggaat tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60

agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgagctgggt ccgacaggct 120

ccaggcaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180

cactacgccg agagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacagc 240

ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccggc 300

tactacgccg acgccatgga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt cagctcagcc 360

tccaccaagg gtccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagcgggt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210> 209

<211> 654

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 209

gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60

atcagctgca aggccagcca gagcgtgtcc accagcacct acagctacat gcagtggtat 120

cagcagcggc ctggacagag ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa gctggacagc 180

ggcgtgcccg ccagattttc tggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240

cccgtggaag aagaggacac cgccacctac tactgccagc acagctggga gctgccctac 300

accttcggcg gaggcacccg gctggaaatc aagagggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360

atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420

aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480

aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540

agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600

acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654

<210> 210

<211> 1344

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 210

gaagtgaagc tgggagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60

agctgcgtgg ccagcggctt cccattcacc aaatactgga tgaactgggt ccgacagagc 120

cccgagaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180

cactacgccg agagcgccaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag ccggtccagc 240

gtgtacctgc agatgaacaa cctgcgggcc gaggacaccg ccatctacta ctgcagcccc 300

acctatgccg acaccatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgacagt gtccagcgcc 360

aagaccaccg cccctagcgt gtaccctctg gcccctgtgt gtggcgacac caccggcagc 420

tctgtgactc tgggctgcct ggtcaagggc tacttccccg agcccgtgac actgacctgg 480

aacagcggca gcctgagcag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcgacctg 540

tacaccctga gcagctccgt gaccgtgaca agcagcacct ggcccagcca gagcatcacc 600

tgtaacgtgg cccaccccgc cagcagcacc aaggtggaca agaagatcga gcccagaggc 660

cccaccatca agccctgccc cccttgcaag tgcccagccc ccaatctgct gggcggaccc 720

agcgtgttca tcttcccacc caagatcaag gacgtgctga tgatcagcct gagccccatc 780

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtccgag gacgaccccg acgtgcagat cagttggttc 840

gtgaacaacg tggaagtgca caccgcccag acccagaccc acagagagga ctacaacagc 900

accctgcggg tggtgtccgc cctgcccatc cagcaccagg actggatgag cggcaaagaa 960

ttcaagtgca aagtgaacaa caaggacctg cctgccccca tcgagcggac catcagcaag 1020

cccaagggca gcgtgcgggc tccccaggtg tacgtgctgc ccccacccga ggaagagatg 1080

accaagaagc aggtcacact gacctgcatg gtcaccgact tcatgcccga ggacatctac 1140

gtggaatgga ccaacaacgg caagaccgag ctgaactaca agaacaccga gcctgtgctg 1200

gacagcgacg gcagctactt catgtacagc aagctgcggg tggaaaagaa aaactgggtg 1260

gaacggaaca gctacagctg cagcgtggtg cacgagggcc tgcacaacca ccacaccacc 1320

aagagcttca gccggacccc cggc 1344

<210> 211

<211> 654

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 211

gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60

atcagctgcc gggccagcaa gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120

cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatcaagt acaccagcaa cctggaaagc 180

ggcgtgcccg ccagattcag cggaagcggc tccggcaccg acttcatcct gaacatccac 240

cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcagaga gctgccctgg 300

accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360

atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420

aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480

aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540

agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600

acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654

<210> 212

<211> 1353

<212> DNA

<213> Mus Musculus

<400> 212

caggtgtccc tgaaagagag cggccctggc atcctgcagc ctagccagac cctgagcctg 60

acctgcagct tcagcggctt cagcctgagc accagcggca tgggcgtgtc ctggatcaga 120

cagcccagcg gcaagggcct ggaatggctg gcccacatct actgggacga cgacaagcgg 180

tacaacccca gcctgaagtc ccggctgacc atctccaagg acaccagccg gaatcaggtg 240

ttcctgaaga tcaccagcgt ggacaccgcc gataccgcca cctactactg cgccagaaga 300

ggccccgact actacggcta ctaccccatg gactattggg gccagggcac cagcgtgacc 360

gtgtctgcca agaccaccgc ccctagcgtg taccctctgg cccctgtgtg tggcgacacc 420

accggcagct ctgtgactct gggctgcctg gtcaagggct acttccccga gcccgtgaca 480

ctgacctgga acagcggcag cctgagcagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcag 540

agcgacctgt acaccctgag cagctccgtg accgtgacaa gcagcacctg gcccagccag 600

agcatcacct gtaacgtggc ccaccccgcc agcagcacca aggtggacaa gaagatcgag 660

cccagaggcc ccaccatcaa gccctgcccc ccttgcaagt gcccagcccc caatctgctg 720

ggcggaccca gcgtgttcat cttcccaccc aagatcaagg acgtgctgat gatcagcctg 780

agccccatcg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtccgagg acgaccccga cgtgcagatc 840

agttggttcg tgaacaacgt ggaagtgcac accgcccaga cccagaccca cagagaggac 900

tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgcc ctgcccatcc agcaccagga ctggatgagc 960

ggcaaagaat tcaagtgcaa agtgaacaac aaggacctgc ctgcccccat cgagcggacc 1020

atcagcaagc ccaagggcag cgtgcgggct ccccaggtgt acgtgctgcc cccacccgag 1080

gaagagatga ccaagaagca ggtcacactg acctgcatgg tcaccgactt catgcccgag 1140

gacatctacg tggaatggac caacaacggc aagaccgagc tgaactacaa gaacaccgag 1200

cctgtgctgg acagcgacgg cagctacttc atgtacagca agctgcgggt ggaaaagaaa 1260

aactgggtgg aacggaacag ctacagctgc agcgtggtgc acgagggcct gcacaaccac 1320

cacaccacca agagcttcag ccggaccccc ggc 1353

<210> 213

<211> 1210

<212> PRT

<213> Homo

<400> 213

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu

645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu

690 695 700

Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser

705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu

725 730 735

Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser

770 775 780

Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp

785 790 795 800

Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn

805 810 815

Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala

850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp

865 870 875 880

Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp

885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr

930 935 940

Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln

965 970 975

Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe

1010 1015 1020

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln

1045 1050 1055

Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp

1060 1065 1070

Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro

1075 1080 1085

Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser

1090 1095 1100

Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

1105 1110 1115 1120

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro

1125 1130 1135

Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp

1140 1145 1150

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp

1155 1160 1165

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn

1170 1175 1180

Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val

1185 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala

1205 1210

<210> 214

<211> 622

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 214

Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro

1 5 10 15

Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln

20 25 30

Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu

35 40 45

Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg

50 55 60

Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu

65 70 75 80

Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu

85 90 95

Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro

100 105 110

Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro

115 120 125

Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile

130 135 140

Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln

145 150 155 160

Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu

165 170 175

Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu

195 200 205

Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg

210 215 220

Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp

225 230 235 240

Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly

245 250 255

Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg

260 265 270

Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile

275 280 285

Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser

290 295 300

Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys

305 310 315 320

Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met

325 330 335

Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu

340 345 350

Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val

355 360 365

Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile

370 375 380

Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu

385 390 395 400

Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp

405 410 415

Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr

420 425 430

Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu

435 440 445

Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp

450 455 460

Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala

465 470 475 480

Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile

485 490 495

Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser

500 505 510

Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr

515 520 525

Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly

530 535 540

Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg

545 550 555 560

Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu

565 570 575

Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser

580 585 590

Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro

595 600 605

Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala

610 615 620

<210> 215

<211> 459

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala

1 5 10 15

Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Val Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro

35 40 45

Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp

50 55 60

Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu

65 70 75 80

Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro

85 90 95

Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp

100 105 110

Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn

115 120 125

Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly

130 135 140

Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe

145 150 155 160

Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala

165 170 175

Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu

180 185 190

Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro

195 200 205

Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln

210 215 220

Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr

225 230 235 240

Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser

245 250 255

Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu

260 265 270

Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala

275 280 285

Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser

290 295 300

Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp

305 310 315 320

Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys

325 330 335

Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser

340 345 350

Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp

355 360 365

Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg

370 375 380

Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala

385 390 395 400

Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp Ile Leu

405 410 415

Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala Phe Leu

420 425 430

Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser

435 440 445

Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala

450 455

<210> 216

<211> 346

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 216

Met Asp Pro Ala Arg Lys Ala Gly Ala Gln Ala Met Ile Trp Thr Ala

1 5 10 15

Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ala Leu Glu

20 25 30

Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro Asn Lys

35 40 45

Met Lys Thr Val Lys Cys Ala Pro Gly Val Asp Val Cys Thr Glu Ala

50 55 60

Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Arg

65 70 75 80

Gly Cys Gly Ser Gly Leu Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu Asp Leu

85 90 95

His Gly Leu Leu Ala Phe Ile Gln Leu Gln Gln Cys Ala Gln Asp Arg

100 105 110

Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ala Leu Asp Pro Ala Gly

115 120 125

Asn Glu Ser Ala Tyr Pro Pro Asn Gly Val Glu Cys Tyr Ser Cys Val

130 135 140

Gly Leu Ser Arg Glu Ala Cys Gln Gly Thr Ser Pro Pro Val Val Ser

145 150 155 160

Cys Tyr Asn Ala Ser Asp His Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp Gly Asn

165 170 175

Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val Arg Gly

180 185 190

Cys Val Gln Asp Glu Phe Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly Pro Gly

195 200 205

Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Ser Arg Cys Asn Ser Asp

210 215 220

Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu Val Arg

225 230 235 240

Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Thr Val Ala Ser Thr Thr Ser Val Thr

245 250 255

Thr Ser Thr Ser Ala Pro Val Arg Pro Thr Ser Thr Thr Lys Pro Met

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ser Gln Thr Pro Arg Gln Gly Val Glu His Glu Ala

275 280 285

Ser Arg Asp Glu Glu Pro Arg Leu Thr Gly Gly Ala Ala Gly His Gln

290 295 300

Asp Arg Ser Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Pro Gln Gln

305 310 315 320

Pro His Asn Lys Gly Cys Val Ala Pro Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu

325 330 335

Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val Leu Leu

340 345

<210> 217

<211> 61

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 217

Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met

1 5 10 15

Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr

20 25 30

Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe

35 40 45

Phe Val Ala Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser

50 55 60

<210> 218

<211> 1255

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 218

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu

1010 1015 1020

Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly

1025 1030 1035 1040

Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly

1045 1050 1055

Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg

1060 1065 1070

Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly

1075 1080 1085

Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His

1090 1095 1100

Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu

1105 1110 1115 1120

Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln

1125 1130 1135

Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro

1140 1145 1150

Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu

1155 1160 1165

Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val

1170 1175 1180

Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln

1185 1190 1195 1200

Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala

1205 1210 1215

Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala

1220 1225 1230

Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 219

<211> 297

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 219

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 220

<211> 595

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 220

Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu

1 5 10 15

Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn

20 25 30

Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys

35 40 45

Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp

50 55 60

Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg

65 70 75 80

Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr

85 90 95

Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met

100 105 110

Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His

115 120 125

Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln

130 135 140

Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys

145 150 155 160

Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln

165 170 175

Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met

180 185 190

Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu

195 200 205

Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp

210 215 220

Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys

225 230 235 240

Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys

245 250 255

Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro

260 265 270

Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile

275 280 285

Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Arg Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro

290 295 300

Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys

305 310 315 320

Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn

325 330 335

Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln

340 345 350

Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr

355 360 365

Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala

370 375 380

Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly

385 390 395 400

Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile

405 410 415

Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys

420 425 430

Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg

435 440 445

Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met

450 455 460

Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu

465 470 475 480

Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser

485 490 495

Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn

500 505 510

Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly

515 520 525

Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala

530 535 540

Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr

545 550 555 560

Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met

565 570 575

Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala

580 585 590

Ser Gly Lys

595

<210> 221

<211> 847

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 221

Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu

20 25 30

Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala

35 40 45

Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr

50 55 60

Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr

65 70 75 80

Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly

85 90 95

Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn

100 105 110

Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp

115 120 125

Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His

130 135 140

Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr

145 150 155 160

Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp

165 170 175

Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser

180 185 190

Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro

195 200 205

Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala

210 215 220

Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His

225 230 235 240

Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg

245 250 255

Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro

260 265 270

Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys

275 280 285

Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser

290 295 300

Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser

305 310 315 320

Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val

325 330 335

Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu

340 345 350

Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His

355 360 365

Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro

370 375 380

Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn

385 390 395 400

Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln

405 410 415

Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile

420 425 430

Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn

435 440 445

Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu

450 455 460

Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr

465 470 475 480

Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro

485 490 495

Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys

500 505 510

Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln

515 520 525

Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu

530 535 540

Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser

545 550 555 560

Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser

565 570 575

Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala

580 585 590

Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu

595 600 605

Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val

610 615 620

Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His

625 630 635 640

Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala

645 650 655

Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu

660 665 670

Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val

675 680 685

Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys

690 695 700

Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly

705 710 715 720

Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys

725 730 735

Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr

740 745 750

Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro

755 760 765

Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln

770 775 780

Arg Pro Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His

785 790 795 800

Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu

805 810 815

Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu

820 825 830

Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His

835 840 845

<210> 222

<211> 364

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 222

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro

35 40 45

Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly

50 55 60

Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln

65 70 75 80

Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro

85 90 95

Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp

100 105 110

Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser

115 120 125

Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg

130 135 140

Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn

145 150 155 160

Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile

165 170 175

Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr

180 185 190

His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr

195 200 205

Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu

210 215 220

Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr

225 230 235 240

Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly

245 250 255

Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala

260 265 270

Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys

275 280 285

Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly

290 295 300

Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr

305 310 315 320

Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu

325 330 335

Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys

340 345 350

Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln

355 360

<210> 223

<211> 572

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 223

Met Glu Cys Leu Tyr Tyr Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ala Arg

1 5 10 15

Leu Pro Leu Asp Ala Ala Lys Arg Phe His Asp Val Leu Gly Asn Glu

20 25 30

Arg Pro Ser Ala Tyr Met Arg Glu His Asn Gln Leu Asn Gly Trp Ser

35 40 45

Ser Asp Glu Asn Asp Trp Asn Glu Lys Leu Tyr Pro Val Trp Lys Arg

50 55 60

Gly Asp Met Arg Trp Lys Asn Ser Trp Lys Gly Gly Arg Val Gln Ala

65 70 75 80

Val Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe

85 90 95

Ala Val Asn Leu Ile Phe Pro Arg Cys Gln Lys Glu Asp Ala Asn Gly

100 105 110

Asn Ile Val Tyr Glu Lys Asn Cys Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Ala

115 120 125

Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Ala Trp Ser Glu Asp Ser Asp Gly

130 135 140

Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ser His His Asn Val Phe Pro Asp Gly Lys

145 150 155 160

Pro Phe Pro His His Pro Gly Trp Arg Arg Trp Asn Phe Ile Tyr Val

165 170 175

Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Val

180 185 190

Arg Val Ser Val Asn Thr Ala Asn Val Thr Leu Gly Pro Gln Leu Met

195 200 205

Glu Val Thr Val Tyr Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Val Pro Ile Ala

210 215 220

Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Val Thr Asp Gln Ile Pro Val Phe Val

225 230 235 240

Thr Met Phe Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu

245 250 255

Lys Asp Leu Pro Ile Met Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His

260 265 270

Phe Leu Asn Tyr Ser Thr Ile Asn Tyr Lys Trp Ser Phe Gly Asp Asn

275 280 285

Thr Gly Leu Phe Val Ser Thr Asn His Thr Val Asn His Thr Tyr Val

290 295 300

Leu Asn Gly Thr Phe Ser Leu Asn Leu Thr Val Lys Ala Ala Ala Pro

305 310 315 320

Gly Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ser Lys Pro Thr

325 330 335

Pro Ser Leu Ala Thr Thr Leu Lys Ser Tyr Asp Ser Asn Thr Pro Gly

340 345 350

Pro Ala Gly Asp Asn Pro Leu Glu Leu Ser Arg Ile Pro Asp Glu Asn

355 360 365

Cys Gln Ile Asn Arg Tyr Gly His Phe Gln Ala Thr Ile Thr Ile Val

370 375 380

Glu Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Met Thr Asp Val Leu Met

385 390 395 400

Pro Val Pro Trp Pro Glu Ser Ser Leu Ile Asp Phe Val Val Thr Cys

405 410 415

Gln Gly Ser Ile Pro Thr Glu Val Cys Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr

420 425 430

Cys Glu Ile Thr Gln Asn Thr Val Cys Ser Pro Val Asp Val Asp Glu

435 440 445

Met Cys Leu Leu Thr Val Arg Arg Thr Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr

450 455 460

Cys Val Asn Leu Thr Leu Gly Asp Asp Thr Ser Leu Ala Leu Thr Ser

465 470 475 480

Thr Leu Ile Ser Val Pro Asp Arg Asp Pro Ala Ser Pro Leu Arg Met

485 490 495

Ala Asn Ser Ala Leu Ile Ser Val Gly Cys Leu Ala Ile Phe Val Thr

500 505 510

Val Ile Ser Leu Leu Val Tyr Lys Lys His Lys Glu Tyr Asn Pro Ile

515 520 525

Glu Asn Ser Pro Gly Asn Val Val Arg Ser Lys Gly Leu Ser Val Phe

530 535 540

Leu Asn Arg Ala Lys Ala Val Phe Phe Pro Gly Asn Gln Glu Lys Asp

545 550 555 560

Pro Leu Leu Lys Asn Gln Glu Phe Lys Gly Val Ser

565 570

<210> 224

<211> 848

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 224

Met Leu Gln Thr Lys Asp Leu Ile Trp Thr Leu Phe Phe Leu Gly Thr

1 5 10 15

Ala Val Ser Leu Gln Val Asp Ile Val Pro Ser Gln Gly Glu Ile Ser

20 25 30

Val Gly Glu Ser Lys Phe Phe Leu Cys Gln Val Ala Gly Asp Ala Lys

35 40 45

Asp Lys Asp Ile Ser Trp Phe Ser Pro Asn Gly Glu Lys Leu Thr Pro

50 55 60

Asn Gln Gln Arg Ile Ser Val Val Trp Asn Asp Asp Ser Ser Ser Thr

65 70 75 80

Leu Thr Ile Tyr Asn Ala Asn Ile Asp Asp Ala Gly Ile Tyr Lys Cys

85 90 95

Val Val Thr Gly Glu Asp Gly Ser Glu Ser Glu Ala Thr Val Asn Val

100 105 110

Lys Ile Phe Gln Lys Leu Met Phe Lys Asn Ala Pro Thr Pro Gln Glu

115 120 125

Phe Arg Glu Gly Glu Asp Ala Val Ile Val Cys Asp Val Val Ser Ser

130 135 140

Leu Pro Pro Thr Ile Ile Trp Lys His Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu

145 150 155 160

Lys Lys Asp Val Arg Phe Ile Val Leu Ser Asn Asn Tyr Leu Gln Ile

165 170 175

Arg Gly Ile Lys Lys Thr Asp Glu Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Gly Arg

180 185 190

Ile Leu Ala Arg Gly Glu Ile Asn Phe Lys Asp Ile Gln Val Ile Val

195 200 205

Asn Val Pro Pro Thr Ile Gln Ala Arg Gln Asn Ile Val Asn Ala Thr

210 215 220

Ala Asn Leu Gly Gln Ser Val Thr Leu Val Cys Asp Ala Glu Gly Phe

225 230 235 240

Pro Glu Pro Thr Met Ser Trp Thr Lys Asp Gly Glu Gln Ile Glu Gln

245 250 255

Glu Glu Asp Asp Glu Lys Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Ser Ser Gln Leu

260 265 270

Thr Ile Lys Lys Val Asp Lys Asn Asp Glu Ala Glu Tyr Ile Cys Ile

275 280 285

Ala Glu Asn Lys Ala Gly Glu Gln Asp Ala Thr Ile His Leu Lys Val

290 295 300

Phe Ala Lys Pro Lys Ile Thr Tyr Val Glu Asn Gln Thr Ala Met Glu

305 310 315 320

Leu Glu Glu Gln Val Thr Leu Thr Cys Glu Ala Ser Gly Asp Pro Ile

325 330 335

Pro Ser Ile Thr Trp Arg Thr Ser Thr Arg Asn Ile Ser Ser Glu Glu

340 345 350

Lys Thr Leu Asp Gly His Met Val Val Arg Ser His Ala Arg Val Ser

355 360 365

Ser Leu Thr Leu Lys Ser Ile Gln Tyr Thr Asp Ala Gly Glu Tyr Ile

370 375 380

Cys Thr Ala Ser Asn Thr Ile Gly Gln Asp Ser Gln Ser Met Tyr Leu

385 390 395 400

Glu Val Gln Tyr Ala Pro Lys Leu Gln Gly Pro Val Ala Val Tyr Thr

405 410 415

Trp Glu Gly Asn Gln Val Asn Ile Thr Cys Glu Val Phe Ala Tyr Pro

420 425 430

Ser Ala Thr Ile Ser Trp Phe Arg Asp Gly Gln Leu Leu Pro Ser Ser

435 440 445

Asn Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Tyr Asn Thr Pro Ser Ala Ser Tyr Leu

450 455 460

Glu Val Thr Pro Asp Ser Glu Asn Asp Phe Gly Asn Tyr Asn Cys Thr

465 470 475 480

Ala Val Asn Arg Ile Gly Gln Glu Ser Leu Glu Phe Ile Leu Val Gln

485 490 495

Ala Asp Thr Pro Ser Ser Pro Ser Ile Asp Gln Val Glu Pro Tyr Ser

500 505 510

Ser Thr Ala Gln Val Gln Phe Asp Glu Pro Glu Ala Thr Gly Gly Val

515 520 525

Pro Ile Leu Lys Tyr Lys Ala Glu Trp Arg Ala Val Gly Glu Glu Val

530 535 540

Trp His Ser Lys Trp Tyr Asp Ala Lys Glu Ala Ser Met Glu Gly Ile

545 550 555 560

Val Thr Ile Val Gly Leu Lys Pro Glu Thr Thr Tyr Ala Val Arg Leu

565 570 575

Ala Ala Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser Ala Ala Ser Glu

580 585 590

Phe Lys Thr Gln Pro Val Gln Gly Glu Pro Ser Ala Pro Lys Leu Glu

595 600 605

Gly Gln Met Gly Glu Asp Gly Asn Ser Ile Lys Val Asn Leu Ile Lys

610 615 620

Gln Asp Asp Gly Gly Ser Pro Ile Arg His Tyr Leu Val Arg Tyr Arg

625 630 635 640

Ala Leu Ser Ser Glu Trp Lys Pro Glu Ile Arg Leu Pro Ser Gly Ser

645 650 655

Asp His Val Met Leu Lys Ser Leu Asp Trp Asn Ala Glu Tyr Glu Val

660 665 670

Tyr Val Val Ala Glu Asn Gln Gln Gly Lys Ser Lys Ala Ala His Phe

675 680 685

Val Phe Arg Thr Ser Ala Gln Pro Thr Ala Ile Pro Ala Asn Gly Ser

690 695 700

Pro Thr Ser Gly Leu Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly Ile Leu Ile Val

705 710 715 720

Ile Phe Val Leu Leu Leu Val Val Val Asp Ile Thr Cys Tyr Phe Leu

725 730 735

Asn Lys Cys Gly Leu Phe Met Cys Ile Ala Val Asn Leu Cys Gly Lys

740 745 750

Ala Gly Pro Gly Ala Lys Gly Lys Asp Met Glu Glu Gly Lys Ala Ala

755 760 765

Phe Ser Lys Asp Glu Ser Lys Glu Pro Ile Val Glu Val Arg Thr Glu

770 775 780

Glu Glu Arg Thr Pro Asn His Asp Gly Gly Lys His Thr Glu Pro Asn

785 790 795 800

Glu Thr Thr Pro Leu Thr Glu Pro Glu Lys Gly Pro Val Glu Ala Lys

805 810 815

Pro Glu Cys Gln Glu Thr Glu Thr Lys Pro Ala Pro Ala Glu Val Lys

820 825 830

Thr Val Pro Asn Asp Ala Thr Gln Thr Lys Glu Asn Glu Ser Lys Ala

835 840 845

<210> 225

<211> 193

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 225

Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly

1 5 10 15

Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile

20 25 30

Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His

50 55 60

Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala

65 70 75 80

Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu

85 90 95

Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu

100 105 110

Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu

115 120 125

Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg

180 185 190

Pro

<210> 226

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 226

Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val

1 5 10 15

Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met

20 25 30

Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala

35 40 45

Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln

50 55 60

Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys

65 70 75 80

Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys

85 90 95

Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro

100 105 110

Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met

115 120 125

Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His

130 135 140

Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly

145 150 155 160

Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile

165 170 175

Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu

180 185 190

Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys

195 200 205

Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys

210 215 220

Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met

225 230

<210> 227

<211> 557

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 227

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala

485 490 495

Gly Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro

500 505 510

Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp

515 520 525

Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala

530 535 540

Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210> 228

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 228

Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly

20 25 30

Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser

35 40 45

Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser

50 55 60

Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser

65 70 75 80

Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe

100 105 110

Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly

115 120 125

Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr

130 135 140

Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser

145 150 155 160

Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly

165 170 175

Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala

180 185 190

Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn

195 200 205

Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met

210 215 220

Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser

225 230 235 240

Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly

245 250 255

Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn

260 265 270

Leu

<210> 229

<211> 310

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 229

Met Arg Arg Ala Ala Leu Trp Leu Trp Leu Cys Ala Leu Ala Leu Ser

1 5 10 15

Leu Gln Pro Ala Leu Pro Gln Ile Val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu

20 25 30

Asp Gln Asp Gly Ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe Ser Gly Ser Gly

35 40 45

Ala Gly Ala Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Gln Gln Thr Pro Ser Thr

50 55 60

Trp Lys Asp Thr Gln Leu Leu Thr Ala Ile Pro Thr Ser Pro Glu Pro

65 70 75 80

Thr Gly Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ser Thr Leu Pro Ala Gly

85 90 95

Glu Gly Pro Lys Glu Gly Glu Ala Val Val Leu Pro Glu Val Glu Pro

100 105 110

Gly Leu Thr Ala Arg Glu Gln Glu Ala Thr Pro Arg Pro Arg Glu Thr

115 120 125

Thr Gln Leu Pro Thr Thr His Gln Ala Ser Thr Thr Thr Ala Thr Thr

130 135 140

Ala Gln Glu Pro Ala Thr Ser His Pro His Arg Asp Met Gln Pro Gly

145 150 155 160

His His Glu Thr Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ser Gln Ala Asp Leu His

165 170 175

Thr Pro His Thr Glu Asp Gly Gly Pro Ser Ala Thr Glu Arg Ala Ala

180 185 190

Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gln Leu Pro Ala Ala Glu Gly Ser Gly Glu

195 200 205

Gln Asp Phe Thr Phe Glu Thr Ser Gly Glu Asn Thr Ala Val Val Ala

210 215 220

Val Glu Pro Asp Arg Arg Asn Gln Ser Pro Val Asp Gln Gly Ala Thr

225 230 235 240

Gly Ala Ser Gln Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val

245 250 255

Ile Ala Gly Gly Leu Val Gly Leu Ile Phe Ala Val Cys Leu Val Gly

260 265 270

Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu

275 280 285

Glu Glu Pro Lys Gln Ala Asn Gly Gly Ala Tyr Gln Lys Pro Thr Lys

290 295 300

Gln Glu Glu Phe Tyr Ala

305 310

<210> 230

<211> 1048

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 230

Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu

1 5 10 15

Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn

20 25 30

Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr

35 40 45

Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met

50 55 60

Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile

65 70 75 80

Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg

85 90 95

Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys

100 105 110

Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val

115 120 125

Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp

130 135 140

Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu

145 150 155 160

Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp

165 170 175

Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp

180 185 190

Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr

195 200 205

Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys

210 215 220

Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr

225 230 235 240

Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val

245 250 255

Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly

260 265 270

Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly

275 280 285

Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala

290 295 300

Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp

325 330 335

Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala

355 360 365

Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly

370 375 380

Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys

385 390 395 400

Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val

405 410 415

Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro

420 425 430

Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly

435 440 445

Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu

450 455 460

Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr

465 470 475 480

Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr

485 490 495

Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp

500 505 510

Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu

515 520 525

Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu

530 535 540

Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly

545 550 555 560

Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser

565 570 575

Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg

580 585 590

Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu

595 600 605

Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu

610 615 620

Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val

625 630 635 640

Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr

645 650 655

Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu

660 665 670

Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg

675 680 685

Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn

690 695 700

Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly

705 710 715 720

Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu

725 730 735

Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu

740 745 750

Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val

755 760 765

Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe

770 775 780

Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu

785 790 795 800

Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly

805 810 815

Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys

820 825 830

Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly

835 840 845

Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys

850 855 860

Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln

865 870 875 880

Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu

885 890 895

Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile

900 905 910

Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr

915 920 925

Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln

930 935 940

Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu

945 950 955 960

Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu

965 970 975

Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val

980 985 990

Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu

995 1000 1005

Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val

1010 1015 1020

Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu

1025 1030 1035 1040

Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr

1045

<210> 231

<211> 188

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 231

Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile

1 5 10 15

Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly

20 25 30

His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp

35 40 45

Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser

50 55 60

Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg

65 70 75 80

Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala

85 90 95

Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys

100 105 110

Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys

115 120 125

Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala

130 135 140

Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala

145 150 155 160

Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met

165 170 175

Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr

180 185

<210> 232

<211> 750

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 232

Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

1 5 10 15

Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe

20 25 30

Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu

35 40 45

Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu

50 55 60

Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile

65 70 75 80

Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile

85 90 95

Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His

100 105 110

Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile

115 120 125

Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe

130 135 140

Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro

145 150 155 160

Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr

165 170 175

Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met

180 185 190

Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val

195 200 205

Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly

210 215 220

Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys

225 230 235 240

Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly

245 250 255

Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr

260 265 270

Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly

275 280 285

Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys

290 295 300

Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg

305 310 315 320

Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn

325 330 335

Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val

340 345 350

Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro

355 360 365

Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly

370 375 380

Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg

385 390 395 400

Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile

405 410 415

Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr

420 425 430

Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala

435 440 445

Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val

450 455 460

Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu

465 470 475 480

Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser

485 490 495

Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile

500 505 510

Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn

530 535 540

Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu

545 550 555 560

Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val

565 570 575

Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val

580 585 590

Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala

595 600 605

Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr

610 615 620

Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr

625 630 635 640

Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser

645 650 655

Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu

660 665 670

Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg

675 680 685

His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser

690 695 700

Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp

705 710 715 720

Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala

725 730 735

Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala

740 745 750

<210> 233

<211> 976

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 233

Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu

20 25 30

Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr

35 40 45

Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile

50 55 60

Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp

65 70 75 80

Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile

85 90 95

Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala

100 105 110

Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu

115 120 125

Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr

130 135 140

Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His

145 150 155 160

Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys

165 170 175

Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu

180 185 190

Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu

195 200 205

Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala

210 215 220

Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly

225 230 235 240

Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro

245 250 255

Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala

260 265 270

Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser

275 280 285

Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala

290 295 300

Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro

305 310 315 320

Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr

325 330 335

Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln

340 345 350

Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln

355 360 365

Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg

370 375 380

Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser

385 390 395 400

Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn

405 410 415

Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val

420 425 430

Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser

435 440 445

Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser

450 455 460

Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn

465 470 475 480

Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp

485 490 495

Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln

500 505 510

Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser

515 520 525

Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly

530 535 540

Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg

545 550 555 560

Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe

565 570 575

Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His

580 585 590

Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile

595 600 605

His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe

610 615 620

Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu

625 630 635 640

Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln

645 650 655

Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His

660 665 670

His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met

675 680 685

Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu

690 695 700

Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu

705 710 715 720

Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val

725 730 735

His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val

740 745 750

Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro

755 760 765

Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr

770 775 780

Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val

785 790 795 800

Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg

805 810 815

Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp

820 825 830

Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln

835 840 845

Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe

850 855 860

Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser

865 870 875 880

Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro

885 890 895

Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp

900 905 910

Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala

915 920 925

Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile

930 935 940

Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr

945 950 955 960

Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile

965 970 975

<210> 234

<211> 668

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 234

Met Gly Gly Lys Gln Arg Asp Glu Asp Asp Glu Ala Tyr Gly Lys Pro

1 5 10 15

Val Lys Tyr Asp Pro Ser Phe Arg Gly Pro Ile Lys Asn Arg Ser Cys

20 25 30

Thr Asp Val Ile Cys Cys Val Leu Phe Leu Leu Phe Ile Leu Gly Tyr

35 40 45

Ile Val Val Gly Ile Val Ala Trp Leu Tyr Gly Asp Pro Arg Gln Val

50 55 60

Leu Tyr Pro Arg Asn Ser Thr Gly Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu Asn

65 70 75 80

Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Asn Ile Phe Ser Cys Ile Leu

85 90 95

Ser Ser Asn Ile Ile Ser Val Ala Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro Thr

100 105 110

Pro Gln Thr Val Ile Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Cys Pro Ser Phe

115 120 125

Leu Leu Pro Ser Ala Pro Ala Leu Gly Arg Cys Phe Pro Trp Thr Asn

130 135 140

Val Thr Pro Pro Ala Leu Pro Gly Ile Thr Asn Asp Thr Thr Ile Gln

145 150 155 160

Gln Gly Ile Ser Gly Leu Ile Asp Ser Leu Asn Ala Arg Asp Ile Ser

165 170 175

Val Lys Ile Phe Glu Asp Phe Ala Gln Ser Trp Tyr Trp Ile Leu Val

180 185 190

Ala Leu Gly Val Ala Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu

195 200 205

Arg Leu Val Ala Gly Pro Leu Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Val Leu

210 215 220

Gly Val Leu Ala Tyr Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val

225 230 235 240

Leu Arg Asp Lys Gly Ala Ser Ile Ser Gln Leu Gly Phe Thr Thr Asn

245 250 255

Leu Ser Ala Tyr Gln Ser Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu Ile

260 265 270

Val Leu Ala Val Leu Glu Ala Ile Leu Leu Leu Met Leu Ile Phe Leu

275 280 285

Arg Gln Arg Ile Arg Ile Ala Ile Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ser Lys

290 295 300

Ala Val Gly Gln Met Met Ser Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Thr Phe

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ala Tyr Trp Ala Met Thr Ala Leu Tyr

325 330 335

Leu Ala Thr Ser Gly Gln Pro Gln Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn Ile

340 345 350

Ser Ser Pro Gly Cys Glu Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro

355 360 365

Thr Ala His Leu Val Asn Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe

370 375 380

Gln Gly Tyr Ser Ser Lys Gly Leu Ile Gln Arg Ser Val Phe Asn Leu

385 390 395 400

Gln Ile Tyr Gly Val Leu Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu

405 410 415

Ala Leu Gly Gln Cys Val Leu Ala Gly Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp

420 425 430

Ala Phe His Lys Pro Gln Asp Ile Pro Thr Phe Pro Leu Ile Ser Ala

435 440 445

Phe Ile Arg Thr Leu Arg Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala

450 455 460

Leu Ile Leu Thr Leu Val Gln Ile Ala Arg Val Ile Leu Glu Tyr Ile

465 470 475 480

Asp His Lys Leu Arg Gly Val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met

485 490 495

Cys Cys Phe Lys Cys Cys Leu Trp Cys Leu Glu Lys Phe Ile Lys Phe

500 505 510

Leu Asn Arg Asn Ala Tyr Ile Met Ile Ala Ile Tyr Gly Lys Asn Phe

515 520 525

Cys Val Ser Ala Lys Asn Ala Phe Met Leu Leu Met Arg Asn Ile Val

530 535 540

Arg Val Val Val Leu Asp Lys Val Thr Asp Leu Leu Leu Phe Phe Gly

545 550 555 560

Lys Leu Leu Val Val Gly Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe

565 570 575

Ser Gly Arg Ile Pro Gly Leu Gly Lys Asp Phe Lys Ser Pro His Leu

580 585 590

Asn Tyr Tyr Trp Leu Pro Ile Met Thr Ser Ile Leu Gly Ala Tyr Val

595 600 605

Ile Ala Ser Gly Phe Phe Ser Val Phe Gly Met Cys Val Asp Thr Leu

610 615 620

Phe Leu Cys Phe Leu Glu Asp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp

625 630 635 640

Arg Pro Tyr Tyr Met Ser Lys Ser Leu Leu Lys Ile Leu Gly Lys Lys

645 650 655

Asn Glu Ala Pro Pro Asp Asn Lys Lys Arg Lys Lys

660 665

<210> 235

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 235

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 236

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody consituent

<400> 236

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 237

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 237

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 238

<211> 444

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 238

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440

<210> 239

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 239

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 240

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 240

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 241

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 241

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 242

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 242

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 243

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 243

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 244

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 244

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 245

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antibody constituent

<400> 245

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<---

1. Конъюгат связующего с молекулами лекарственного средства, который имеет следующую формулу:

где СВЯЗУЮЩЕЕ представляет собой анти-HER2 антитело, анти-EGFR антитело, анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент,

L представляет собой линкер, в котором аминокислоты находятся в природной конфигурации L-конфигурации,

n представляет собой число от 1 до 20 и

KSP представляет собой ингибитор кинезина веретена (лекарственное средство),

где эта формула имеет следующие структуры:

где АК₁ означает цистеин-присоединенное антитело;

АК₂ означает лизин-присоединенное антитело; и

АК₃ означает глутамин-присоединенное антитело;

и его соли, сольваты, соли сольватов и эпимеры.

2. Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и/или ангиогенных нарушений, содержащая конъюгат по п.1 в эффективном количестве в комбинации с инертным нетоксичным фармацевтически подходящим вспомогательным веществом.

3. Конъюгат по п.1 для применения и/или предотвращения злокачественных заболеваний.

4. Конъюгат по п.1 для применения для лечения и/или предотвращения гиперпролиферативных и/или ангиогенных нарушений.

5. Конъюгат по п.1, где антитело связывается с раковой целевой молекулой.

6. Конъюгат по п.1, где антитело связывается с внеклеточной целевой молекулой.

7. Конъюгат по п.1, где антитело после связывания с внеклеточной целевой молекулой интернализируется и лизосомально процессируется путем клеточной экспрессии целевой молекулы.

8. Конъюгат по любому из пп.5-7, где антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

9. Конъюгат по п.8, где антитело представляет собой анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

10. Конъюгат по п.9, где анти-TWEAKR антитело специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169).

11. Конъюгат по п.10, где анти-TWEAKR антитело представляет собой анти-TWEAKR антитело ТРР-2090.

12. Конъюгат по любому из пп.9 и 10, где анти-TWEAKR антитело специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169).

13. Конъюгат по п.12, где анти-TWEAKR антитело представляет собой анти-TWEAKR антитело ТРР-2658.

14. Конъюгат по любому из пп.9-13, где анти-TWEAKR антитело содержит:

вариабельную тяжелую цепь, содержащую:

a) CDR1 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу PYPMX (SEQ ID NO: 171), где X означает I или М;

b) CDR2 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO: 172), где X означает S или K; и

с) CDR3 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO: 173);

и вариабельную легкую цепь, содержащую:

d) CDR1 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу RASQSISXYLN (SEQ ID NO: 174), где X означает G или S;

е) CDR2 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу XASSLQS (SEQ ID NO: 175), где X означает Q, А или N; и

f) CDR3 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу QQSYXXPXIT (SEQ ID NO: 176), где X в положении 5 означает Т или S, Х в положении 6 означает Т или S и Х в положении 8 означает G или F.

15. Конъюгат по любому из пп. 9-14, где анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

а) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 10, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 9, или

b) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 20, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 19, или

с) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 30, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 29, или

d) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 40, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 39, или

е) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 50, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49, или

f) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 60, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 59, или

g) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 70, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 69, или

h) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 80, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 79, или

i) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 90, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 89, или

j) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 100, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 99, или

k) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 110, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 109, или

l) вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 120, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 119.

16. Конъюгат по любому из пп. 9-15, где анти-TWEAKR антитело содержит:

а) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 2, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

b) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 12, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 11, или

с) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 21, или

d) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 32, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 31, или

е) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 42, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 41, или

f) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 52, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 51, или

g) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 62, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 61, или

h) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 72, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 71, или

i) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 82, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 81, или

j) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 92, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 91, или

k) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 102, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 101, или

l) последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 112, и последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 111.