2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1н-пиррол-3-карбоксамид, обладающий цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам

Изобретение относится к новому 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиду формулы I, обладающему цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам. Технический результат: получено новое соединение, проявляющее противоопухолевую активность и низкую токсичность. 3 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области органической химии, производным пиррола, а именно, новому биологически активному - 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамиду I формулы:

который может найти применение в медицине в качестве лекарственного противоопухолевого препарата.

Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения - этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1H-пирролидин-3-карбоновых кислот общей формулы II, проявляющие противоопухолевую активность [Патент №2607920 Российская Федерация, МПК C07D 417/00, А61К 31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1H-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: №2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова].

В качестве эталона сравнения нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [Патент №2059631, МПК C07D 305/14, A61K 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентине Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью], ЛД 50 которого составляет 48 мг/кг.

В тесте острой токсичности ЛД 50 2-АНПК имеет токсичность более 1000 мг/кг.

Таким образом, токсичность 2-АНПК гораздо меньше, чем у прототипа биологической активности - паклитаксела.

Целью предлагаемого изобретения является синтез нового, ранее не описанного 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I), обладающего цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентным к химиопрепаратам.

Поставленная цель достигается получением 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (2-АНПК) (I), взаимодействием N-(5-(нафталин-1-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)бензогидразида (II) с цианоацетамидом в присутствии триэтиламина в среде толуола по схеме:

Методика получения 2-амино-1-бензамидо-5-(2-нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I). Смесь 1.71 г (0.005 моль) N-(5-(нафталин-1-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)бензогидразида (II), 0.42 г (0.005 моль) цианоацетамида и 0.5 г (0.005 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл толуола в течение 35 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из смеси пропанол-2 - уксусная кислота (1:1). Получали 1.27 г (60%) кристаллического вещества (I) с Т_пл 260-261°С. C₂₄H₁₈N₄O₄. ИК-спектр, ν/см^-1, вазелиновое масло: 3406 (NH), 3337 (NH), 3206 (NH), 1701 (С=O), 1679 (С=O), 1628 (С=С) Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 6.69 с (1H, СН), 7.06 с (1Н, NH), 7.70 м (13Н, аром.), 8.80 уш. с (1Н, NH), 9.25 уш. с (1Н, NH), 11.11 с (1H, NH), 11.86 уш. с (1Н, NH). Спектр ЯМР ¹³С, δ, м.д., ДМСО-d₆: 20.90, 87.64, 105.46, 124.71, 125.01, 126.27, 127.59, 127.90, 128.38, 129.27, 129.85, 130.95, 131.89, 132.96, 133.26, 134.99, 141.26, 165.30, 165.54, 166.96, 171.82, 176.00, 192.63.

Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в ДМСО, ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании - в этиловом спирте, устойчивое при хранении.

Цитотоксическое и проапоптогенное действие соединения 2-АБПК устанавливали предварительно при помощи микроскопии, а затем количественно - с помощью МТТ-теста.

Изобретение подтверждается следующими графическими материалами, на которых представлено:

На фиг. 1 - морфология клеток ГИСО (GIST - T1-R), инкубированных с 2-АНПК и паклитакселом (положительный контроль) в течение 24 часов.

На фиг. 2 - дозо-зависимое повышение уровня расщепленных форм ПАРП и каспазы-3 в клеточной линии RD в присутствии 2-АНПК (5 и 10 μМ). Паклитаксел (1 μМ) использован в качестве положительного контроля. Клеточная линия проинкубирована с препаратами в течение 48 часов. В качестве контроля белковой загрузки был использован β-актин.

На фиг. 3 - цитотоксическая активность паклитаксела в отношении паклитаксел-наивных (GIST Т1 и НСС1806) и паклитаксел-резистентных клеточных линий (GIST T1-Tx-R и HCC1806-Tx-R). По оси абсцисс отражены дозы паклитаксела (0,000001-1000000 nM), по оси ординат - % жизнеспособности.

Микроскопическое исследование клеточной линии гастроинтестинальной стромальной опухоли (ГИСО) GIST - T1-R выявило выраженное снижение конфлюэнтности и усиление гибели клеток под действием 2-АНПК, аналогичное эффекту паклитаксела (Фигура 1). Подобные результаты были получены при исследовании других клеточных линий, в том числе клеток рака молочной железы, чувствительных и резистентных к паклитакселу (НСС1806 и HCC1806-TaxR), клеток ГИСО, чувствительных и резистентных к паклитакселу (GIST Т1 и GIST T1-TaxR), а также клеток лейомиосаркомы (SK-LMS-1), рабдомиосаркомы (RD) и остеосаркомы (U2OS).

Для дальнейшего определения механизма клеточной гибели был проведен анализ клеточных культур методом иммуноблоттинга. В клетках рабдомиосаркомы линии RD были определены следующие маркеры апоптоза: расщепленная форма эффекторной каспазы-3, расщепленная форма поли-АДФ-рибоза-полимеразы (ПАРП). Повышенные уровни указанных маркеров апоптоза были выявлены в образцах, инкубированных с 2-АНПК, паклитакселом (положительный контроль), при этом уровень маркеров в образце, инкубированном с исследуемым соединением, был сопоставим с эффектом препарата, используемого в качестве положительного контроля (Фигура 2). Аналогичные результаты были получены при исследовании других клеточных линий.

Цитотоксическая активность исследуемого соединения и паклитаксела была оценена при помощи МТТ-теста (Табл. 1).

Было подтверждено, что половинная ингибирующая доза (IC50) паклитаксела для паклитаксел-резистентных клеточных линий (GIST Т1-Тх-R и HCC1806-Tx-R) была существенно выше, чем для паклитаксел-наивных клеток (GIST T1, GIST T1-R и НСС1806) (Фигура 3). В то же время, IC50 2-АНПК для паклитаксел-резистентных линий была сопоставима с IC50 для паклитаксел-наивных клеточных линий. Это свидетельствует о потенциальном преимуществе исследуемого соединения для лечения паклитаксел-резистентных опухолей.

Подтверждение гибели клеток GIST T1-IM-R по механизму апоптоза и анализ клеточного цикла был произведен методом проточной цитометрии (Flow Cytometer BD FACSCanto II). В образцах, инкубированных 48 часов с 2-АНПК и паклитакселом, выбранного в качестве положительного контроля, наблюдалось повышенное количество гиподиплоидных клеток (subG1). Результаты количественной оценки приведены в таблице 2.

Представленные результаты исследований показывают, что 2-АНПК обладает цитотоксической и проапоптогенной активностью в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентным к химиопрепаратам.

Литература:

1. Патент №2607920 Российская Федерация, МПК C07D 417/00, А61К 31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: №2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова.

2. Патент №2059631, МПК C07D 305/14, А61К 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентине Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью.

2-Амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид формулы I:

,

обладающий цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам.