Способ изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена без использования экзогенного тромбина

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена. Способ изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена без использования экзогенного тромбина включает забор крови с цитратом натрия, получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови с помощью центрифугирования, выделение преципитата из плазмы крови методом этаноловой преципитации с низким содержанием этанола, инкубации при постоянном перемешивании и центрифугировании, регулирование концентрации фибриногена в преципитате путем разведения буфером, внесения раствора кальция хлорида при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить аутологичный, биосовместимый и безопасный фибрин для регенеративной и тканевой инженерии, имеющий регулируемый состав и имеющий высокую интеграцию с организмом хозяина. 3 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии. Полученный таким образом аутологичный фибрин может быть использован как самостоятельный каркас, биоматрикс или в качестве модифицирующего покрытия. Изобретение будет полезным также для экспериментальной медицины при моделировании фибрин-заинтересованных процессов in vitro и in vivo (клеточных взаимодействий, влияния лекарственных, физических или химических факторов).

Фибрин представляет собой биополимер, который, благодаря своим уникальным свойствам, широко используется в различных областях медицины. Фибриновый гель с успехом применяют в медицине для остановки кровотечений (US 8821861 B2. Fibrin sealant. Stephanie A. Smith (US), James H. Morrissey (US). Appl. No.: 12/680,947. Date of Patent: Sep.2, 2014), как средство ускоряющее заживление ран, в качестве герметика при повреждениях тканей (Breen AM, Dockery Р, O'Brien Т, Pandit AS. The use of therapeutic gene eNOS delivered via a fibrin scaffold enhances wound healing in a compromised wound model. Biomaterials. 2008 Jul; 29(21):3143-51. doi:10.1016/j.biomaterials.2008.04.020). Большие перспективы для применения фибрина раскрываются в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Клеточная терапия создает условия для лучшей регенерации и восстановления функциональности ткани путем непосредственного введения стволовых или прогениторных клеток в область повреждения (клеточная терапия). В клеточной терапии фибрин может быть полезен в качестве биоматрикса или клеточного каркаса для прогениторных или стволовых клеток (WO 2003093433 A3. Fibrin-based biomatrix. Jianyi Zhang (US), Zong Li Wang (US), publication 2004-07-29. US 7442397 B2. Pegylated fibrinogen-based biomatrix. Jianyi Zhang (US), Date of Patent: Oct. 28, 2008). Доказано, что имплантация клеток непосредственно в мышцу неэффективна и клетки удаляются или погибают примерно через 24 часа после имплантации (Martens TP, Godier AF, Parks JJ, et al. Percutaneous cell delivery into the heart using hydrogels polymerizing in situ. Cell Transplant. 2009; 18(3): 297-304. doi:10.3727/096368909788534915. Nakamuta JS, Danoviz ME, Marques FL, dos Santos L, Becker C, Goncalves GA, Vassallo PF, Schettert IT, Tucci PJ, Krieger JE. Cell therapy attenuates cardiac dysfunction post myocardial infarction: effect of timing, routes of injection and a fibrin scaffold. PLoS One. 2009; 4(6): e6005. doi: 10.1371/journal.pone.0006005). Введение клеток в составе биополимеров, таких как фибрин, помогает сохранить и обеспечить жизнеспособность клеток в месте имплантации, делая ее эффективной (Christman KL, Vardanian AJ, Fang Q, Sievers RE, Fok HH, Lee RJ. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 2004; 44(3): 654-60. doi: 10.1016/j.jacc.2004.04.040. Hunt NC, Grover LM. Cell encapsulation using biopolymer gels for regenerative medicine. Biotechnol Lett. 2010; 32(6): 733-42. doi: 10.1007/s 10529-010-0221-0).

Фибриновый гель предложен в качестве системы доставки факторов роста, биоактивных молекул, лекарственных средств (Wong С, Inman Е, Spaethe R, Helgerson S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 2003; 89(3): 573-82. PMID: 12624643. Rubalskii, E., Ruemke, S., Salmoukas, C. et al. Fibrin glue as a local drug-delivery system for bacteriophage PA5. Sci Rep 9, 2091 (2019). doi:10.1038/s41598-018-38318-4) с возможностью регулирования кинетики высвобождения веществ за счет изменения состава композиции, аффинности и количества ковалентных связей (Spicer РР, Mikos AG. Fibrin glue as a drug delivery system. J Control Release. 2010; 148(1):49-55. doi:10.1016/j.jconrel.2010.06.025). Широкий спектр применения фибрина в тканевой инженерии в качестве самостоятельного каркаса или модифицирующего покрытия при создании сердечно-сосудистых протезов (Moreira R, Neusser С, Kruse М, Mulderrig S, Wolf F, Spillner J, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, Mela P. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement. Adv Healthc Mater. 2016; 5(16): 2113-21. doi: 10.1002/adhm.201600300. T.C. Flanagan, C. Cornelissen, S. Koch, B. Tschoeke, J.S. Sachweh. The in vitro development of autologous fibrin-based tissue-engineered heart valves through optimised dynamic conditioning. Biomater. 2007, 28 (23), 3388-3397, 7-10. Aper T, Wilhelmi M, Gebhardt C, Hoeffler K, Benecke N, Hilfiker A, Haverich A. Novel method for the generation of tissue-engineered vascular grafts based on a highly compacted fibrin matrix. Acta Biomater. 2016; 29: 21 -32. doi: 10.1016/j.actbio.2015.10.012. Gui L, Boyle MJ, Kamin YM, Huang AH, Starcher ВС, Miller CA, Vishnevetsky MJ, Niklason LE. Construction of tissue-engineered small-diameter vascular grafts in fibrin scaffolds in 30 days. Tissue Eng Part A. 2014; 20(9-10): 1499-507. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0263), как основы герметика для восстановление дефектов костной и хрящевой ткани (US 8986304 B2. Injection of fibrin sealant using reconstituted components in spinal applications. Brian D. Burkinshaw (US), Steven I. Whitlock (US), Kevin Pauza (US), Mark I. Richards (US), James B. Rogan (US). Date of Patent: Mar. 24, 2015. EP1395298B1. Fibrin porous structure. Yves Delmotte (BE). Publication 26.07.2006. Baykul T, Findik Y. The use of platelet-rich fibrin (PRF) and PRF-mixed particulated autogenous bone graft in the treatment of bone defects: An experimental and histomorphometrical study. Dent Res J. 2015; 12(5): 418-424. doi: 10.4103/1735-3327.166188), а так же каркаса для искусственной кожи (Kljenak A, Tominac Trcin М, Dolenec Т, Jevak М, Fibrin gel as a scaffold for skin substitute - production and clinical experience. Acta Clin Croat. 2016 Jun;55 (2): 279-89. doi: 10.20471/acc.2016.55.02.15. Kober J, Gugerell A, Schmid M, Kamolz LP, Keck M. Generation of a Fibrin Based Three-Layered Skin Substitute. Biomed Res Int. 2015; 2015:170427. doi: 10.1155/2015/170427), в качестве средства фиксации в офтальмологии (Panda A, Kumar S, Kumar A, Bansal R, Bhartiya S. Fibrin glue in ophthalmology. Indian J Ophthalmol. 2009; 57(5): 371-379. doi: 10.4103/0301-4738.55079) и т.д.

Каркасы в тканевой инженерии являются главной составляющей и должны соответствовать ряду общих требований (быть биосовместимым, соответствовать по физико-механическим свойствам тканям замещения, обладать биоактивностью, при этом не вызывать воспалительной и иммунной реакции организма при отсутствие потенциальной возможности передачи инфекции), а также специфических для каждого вида тканей. К примеру, для сосудистого каркаса такими специфическими требованиями является гемосовместимость, включающая отсутствие возможности активировать коагуляцию, агрегацию тромбоцитов и не вызывать гемолиз.

Различные синтетические полимеры и их сополимеры способны обеспечить необходимые физико-механические свойства (Pashneh-Tala S, MacNeil S, Claeyssens F. The Tissue-Engineered Vascular Graft-Past, Present, and Future. Tissue Eng Part В Rev. 2016; 22(1):68-100. doi: 10.1089/ten.teb.2015.0100). Однако, эти материалы обладают недостаточной биосовместимостью из-за отсутствия сайтов для клеточной адгезии, могут демонстрировать токсическое разложение, вызывать воспалительные и иммунные реакции (Mariani Е, Lisignoli G, Borzi RM, Pulsatelli L. Biomaterials: Foreign Bodies or Tuners for the Immune Response. Int J Mol Sci. 2019; 20(3):636. Published 2019 Feb 1. doi:10.3390/ijms20030636). Для повышения биосовместимости полимеров предлагаются различные способы их модификации среди которых создание на поверхности изолирующего, биосовместимого слоя. В качестве модифицирующего биосовместимого слоя, а в некоторых случаях и основного материала часто используют фибрин. Будучи натуральным физиологическим каркасом, он поддерживает ангиогенез и репарацию тканей (Hadjipanayi Е, Kuhn РН, Moog Р, et al. The Fibrin Matrix Regulates Angiogenic Responses within the Hemostatic Microenvironment through Biochemical Control. PLoS One. 2015; 10(8): e0135618). Волокна фибрина содержат сайты необходимые для адгезии, миграции и пролиферации клеток, создают условия для формирования полноценной ткани (Podolnikova NP, Yakovlev S, Yakubenko VP, et al. The interaction of integrin αIIbβ3 with fibrin occurs through multiple binding sites in the αIIb β-propeller domain. J Biol Chem. 2014; 289(4): 2371-2383. doi: 10.1074/jbc.M113.518126). Трехмерная пористая структура фибрина поддерживает жизнедеятельность клеток благодаря диффузии питательных веществ и кислорода внутрь фибринового каркаса и удалению отработанных продуктов (Aper Т, Teebken ОЕ, Steinhoff G, Haverich A. Use of a fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model. Eur J Vasc Endovasc Surg 2004; 28: 296-302. doi: 10.1016/j.ejvs.2004.05.016). Фибрин имеет высокое сродство к различным биологическим поверхностям, способен повышать устойчивость клеток к смыванию током жидкости (удержание клеток на поверхности) Riedel Т, et al. Attachment of human endothelial cells to polyester vascular grafts: pre-coating with adhesive protein assemblies and resistance to short-term shear stress. Physiol Res. 2014; 63(2): 167-177). Биодеградация фибрина происходит посредством фибринолиза и протеолиза, при этом продукты биодеградации нетоксичны (Li Y, Meng HrLiu Y, & Lee BP. Fibrin Gel as an Injectable Biodegradable Scaffold and Cell Carrier for Tissue Engineering. The Scientific World Journal 2015; Article ID 685690: 10 p.doi: 10.1155/2015/685690). Процесс деградации фибрина можно контролировать с помощью ингибиторов фибринолиза и протеолиза (апротинин, ε-аминокапроновая и транексамовая кислоты) (Cholewinski E.Dietrich М. Flanagan Т.С.Schmitz-Rode Т. Jockenhoevel S. Tranexamic acid -an alternative to aprotinin in fibrin-based cardiovascular tissue engineering. Tissue Eng Part A1536452009.16).

Фибрин является самым доступным из всех биополимеров. Фибриновые гели просто, в короткие сроки и в достаточном количестве могут быть получены из собственной крови пациентов. Использование аутологичного фибрина исключает риск переноса различных патогенов, не вызывает активации иммунной реакции организма на инородное тело. Наиболее доступным и дешевым способом получения аутологичного фибрина является выделение из плазмы крови преципитата, содержащего фибриноген, и последующая его полимеризация с помощью тромбина и ионов кальция.

Этап получения преципитата.

Преципитат получают путем осаждения белков плазмы крови. Помимо фибриногена в преципитате содержатся другие белки, в том числе фактор XIII, α2-антиплазмин, α2-макроглобулин, растворимая форма фибронектина (Ismail, Ayman Е. Purification of fibrinogen from human plasma. (2012) Chemical & Biomolecular Engineering Theses, Dissertations, & Student Research. 13), что является крайне полезным для стабилизации и сохранения сгустка фибрина.

Известны и подробно описаны различные методы получения преципитата, среди них наиболее популярны криопреципитация, преципитация этанолом (EtOH), преципитация аммония сульфатом ((NH4)2SO4), полиэтиленгликолем (ПЭГ), комбинацией преципитации аммония сульфатом с криопреципитацией, полиэтилен гликоля (ПЭГ) с криопреципитацией.

1. Метод криопреципитации (В. Casali, F. Rodeghiero, A. Tosetto, В. Palmieri, R. Immovilli, С. Ghedini, P. Rivasi. Fibrin glue from single-donation autologous plasmapheresis. Transfusion 1992, Volume32, Issue7, pp 641-643) очень длительный и на приготовление фибрина уходит до 30 часов. Плазма замораживается при -80°С и оставляется на 18 часов, после чего медленно размораживается при 4°С 16 часов. В результате в осадок выпадает криопреципитат содержащий фракцию криоглобулинов. Центрифугирование проводят при температуре 4°С 1000g 15 минут. Кроме длительности выполнения данный метод имеет еще один важный недостаток - крайне низкий итоговый выход фибриногена, по данным различных авторов от 24 до 36% от фибриногена, содержащегося в плазме (Galanakis, D.K. Plasma cryoprecipitation studies: major increase in fibrinogen yield by albumin enrichment of plasma. Thromb Res 78, 303, 1995. Weis-Fogh, U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system. Eur Surg Res 20, 381, 1988). Для повышения выхода фибриногена цикл замораживания/оттаивания иногда повторяют.

2. Преципитация аммония сульфатом с и без криопреципитации дает хороший выход фибриногена (54,8±5,3; 69,5±9,9), однако присутствие соли сульфата аммония в толще фибрина закисляет среду и поддерживает нестабильность рН. При этом полностью избавиться от солей с помощью промывания невозможно, поскольку фибрин имеет пористую структуру, в которой заключен большой объем остаточной жидкости. Данный факт негативно влияет на клеточную жизнедеятельность - значительно замедляется миграция клеток в толщу и синтез белков внеклеточного матрикса (ВКМ). Как результат происходит снижение прочностных характеристик образцов после заселения клетками за счет превалирования процессов фибринолиза и деградации над синтетическими (Dietrich М, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473).

3. Преципитация ПЭГ с и без криопреципитации дает высокий выход фибриногена (61,3±9,4%), однако демонстрирует самые низкие показатели физико-механики. Заселение клетками не улучшает прочностные свойства, что объясняется определенным негативным влиянием ПЭГ на синтез клетками белков ВКМ.

4. Метод этаноловой преципитации достаточно прост и позволяет в течение 1-1,5 часов получать до 80% фибриногена, содержащегося в плазме крови (Weis-Fogh, U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhesive system. Eur Surg Res 20, 381, 1988. Dietrich M, Heselhaus J, Wozniak J, et al. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part С Methods. 2013; 19(3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC2011.0473). Полимеризованный из такого фибриногена фибрин обладает наилучшими прочностными характеристиками, при этом не зарегистрировано негативного влияния этаноловой преципитации на клеточную жизнедеятельность и синтез белков ВКМ. Данные преимущества делают метод этаноловой преципитации лидером среди описанных выше вариантов.

Этап полимеризации фибриногена.

Следующим этапом является полимеризация фибриногена под действием тромбина и ионов кальция. Тромбин в присутствии ионов кальция последовательно отщепляет фибринопептиды А и В от молекулы фибриногена (Weisel JW, Litvinov RI. Fibrin Formation, Structure and Properties. Subcell Biochem. 2017; 82:405-456. doi:10.1007/978-3-319-49674-0_13). После отделения фибринопептидов происходит самосборка мономеров фибрина в димеры, далее в олигомеры и полимеры, которые удлиняются с образованием двухцепочечных протофибрилл. Время свертывания - это определенная задержка во времени от момента внесения активаторов свертывания до момента образования макроскопического сгустка. В условиях in vitro время свертывания преципитата фибриногена довольно короткое всего несколько секунд и зависит от активности тромбина и концентрации ионов кальция. Боковая сборка протофибрилл происходит только в конце времени свертывания, и может длиться от нескольких секунд до часов в зависимости от рН и ионной силы (Scheraga, Н.A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophys. Chem. 2004; 112, 117-130). Протофибриллы собираются в поперечном и продольном направлении, образуя разветвленные волокна трехмерной гелеобразной сети или фибринового сгустка. Полимер фибрина стабилизируется посредством ковалентного сшивания XIIIa фактором (трансглутаминазой) с образованием механически и химически более стабильного зрелого фибринового сгустка.

В большинстве случаев при получении фибринового клея, каркаса или покрытия используют коммерческий, экзогенный тромбин из плазмы крови человека (Moreira R, Neusser С, Kruse М, Mulderrig S, Wolf F, Spillner J, Schmitz-Rode T, Jockenhoevel S, Mela P. Tissue-Engineered Fibrin-Based Heart Valve with Bio-Inspired Textile Reinforcement. Adv Healthc Mater. 2016; 5(16): 2113-21. doi: 10.1002/adhm.201600300) или животных (Pankajakshan D, Krishnan V K, Krishnan LK. Functional stability of endothelial cells on a novel hybrid scaffold for vascular tissue engineering. Biofabrication. 2010; 2(4): 041001. doi: 10.1088/1758-5082/2/4/041001).

Сочетание криопреципитации и полимеризации экзогенным тромбином представлены в патенте получения фибринового клея для герметизация хирургических ран (US 4627879 A. Fibrn adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma. Eric Rose, Arthur Dresdale. Publication 1986-12-09). Недостатком данного метода является использование менее эффективного и более длительного метода криопреципитации по сравнению с этаноловым. Кроме того, использование экзогенного тромбина создает предпосылки для активации иммунного и воспалительного ответа. Несмотря на принимаемые производителем меры по снижению риска вирусного заражения препаратов из компонентов крови человека или животных, все же существует опасность переноса различных инфекционных заболеваний. Кроме того, введенные в организм реципиента чужеродные белки способны вызывать иммунную реакцию и формирование аутореактивных антител. Сообщалось о ксеногенной иммунизации пациентов бычьим тромбином и последующим формированием у них аутореактивных антител к собственному тромбину и фактору V (Berruyer М, Amiral J, Ffrench Р, et al. Immunization by bovine thrombin used with fibrin glue during cardiovascular operations: development of thrombin and factor V inhibitors. J. Thorac Cardiovasc Surg. 1993; 105: 892-897. Rapaport SI, Zivelin A, Minow RA, Hunter CS, Donnelly K. Clinical significance of antibodies to bovine and human thrombin and factor V after surgical use of bovine thrombin. Am J Clin Pathol. 1992; 97: 84-91. Flaherty MJ, Henderson R, Wener MH. Iatrogenic immunization with bovine thrombin: a mechanism for prolonged thrombin times after surgery. Ann Intern Med. 1989; 111(8): 631-4. doi: 10.7326/0003-4819-111-8-631. PMID: 2802417). Представлены неутешительные данные о сенсибилизации и аллергических реакциях на бычий тромбин при местном применении у пациентов, находящиеся на гемодиализе (Wai Y, Tsui V, Peng Z, Richardson R, Oreopoulos D, Tarlo SM. Anaphylaxis from topical bovine thrombin (Thrombostat) during haemodialysis and evaluation of sensitization among a dialysis population. Clin Exp Allergy. 2003; 33(12): 1730-4. doi: 10.1111/j. 1365-2222.2003.01806.x). Доказана возможность препаратов бычьего тромбина вызывать патологический системный аутоиммунный синдром с волчаночноподобной серологией (Schoenecker JG, Johnson RK, Lesher АР, Day JD, Love SD, Hoffman MR, Ortel TL, Parker W, Lawson JH: Exposure of mice to topical bovine thrombin induces systemic autoimmunity. Am J Pathol 2001, 159: 1957-1969). Реже для полимеризации фибриногена используют рекомбинантный тромбин (WO 2007103447 A2. А method for the preparation of recombinant human thrombin. Kurt Osther (US). Publication 2007-09-13) технология получения и очистки которого сложна и затратна, при этом, сохраняется возможность иммунной реакции реципиента на чужеродный белок (Schellekens Н, Casadevall N. Immunogenicity of recombinant human proteins: causes and consequences. J Neurol. 2004; 251 Suppl 2: II4-9. doi: 10.1007/s00415-004-1202-9).

Изобретение RU 2653434 C1 (Способ создания биорезорбируемого клеточного скаффолда на основе фибрина плазмы крови» Егорихина М.Н., Левин Г.Я., Чарыкова И.Н., Алейник Д.Я., Соснина Л.Н. Дата публикации 2018-05-08) позволяет получить биорезорбируемый клеточный скаффолд на основе фибрина плазмы крови, имеющий 3D структуру и содержащий равномерно распределенные по всей толще клетки. Однако данный способ так же предполагает использование криопреципитата плазмы крови и экзогенного тромбина с описанными выше особенностями и возможными вариантами негативного воздействия.

Известен способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови (RU 2522237. Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови. Момот А.П., Шахматов И.И., Ломаев И.С., Терехов С.С. Дата публикации 10.07.2014). В данном варианте фибриноген выделяют из плазмы крови с помощью преципитации сульфатом аммония, полимеризацию запускают внесением экзогенного тромбина. Сгустки фибрина отмывают и растворяют в ацетатном буфере с мочевиной, получая фибрин-мономеры. Фибрин-мономер может быть использован как местное или системное кровоостанавливающее средство, для ускорения заживления швов и ран в хирургии, травматологии, гинекологии, спортивной медицине и т.д. Способ направлен на изготовление фибрин-мономеров, а не фибрин-полимера, кроме того, используется преципитация сульфатом аммония и экзогенный тромбин.

Вариант получения двухкомпонентного фибринового клея описан в патенте RU 2704256 C1 (Способ приготовления аутологичного двухкомпонентного фибринового клея» Гаврилюк И.О., Куликов А.Н., Кузнецова А.Ю., Гаврилюк В.Н., Чурашов С.В., Черныш В.Ф. Дата публикации 2019-10-25). Для этого из крови пациента получают обогащенную живыми тромбоцитами плазму, содержащую фибриноген в физиологических концентрациях, факторы свертывания крови и живые тромбоциты, продуцирующие различные факторы роста. Использование физиологических концентраций фибриногена позволяет создать фибриновый продукт с исходно слабыми механическими характеристиками. Поскольку изобретение является клеем и не несет значительной физической нагрузки, использование физиологических концентраций фибриногена вполне допустимо. Однако, данная технология не применима для создания каркасов подверженных физическому воздействию, поскольку не подразумевается использование методов концентрации и обогащения фибриногена. Второй компонент, как и в предыдущих вариантах, включает раствор кальция хлорида (CaCl2) и экзогенный тромбин с его отрицательными влияниями на организм.

С целью нивелирования инфекционных, иммунных и аллергических рисков наиболее безопасно использовать аутологичный тромбин. Вариант решения предлагается в изобретении, которое направлено на получение фибринового геля, способствующего клеточной пролиферации из собственной крови (WO 2013016836 A1. Preparation of fibrin gel for use as implant system. Manuel Eduardo Young Anze, Caroline Ruth Weinstein Oppenheimer, Donald Irving Brown Miguel Fuentes Chandia, Ricardo Ceriani Fernando Antonio Albornoz Cristian Acevedo Publication 2013-02-07). Используют кровь с цитратом натрия в качестве антикоагулянта. Из крови с помощью центрифугирования получают плазму и далее в этой плазме ресуспендируют клетки. Для образования фибринового геля используют аутологичный тромбин, находящийся в плазме, который активируют внесением раствора CaCl2. Разработанный таким образом аутологичный продукт имеет гораздо более низкую стоимость, чем коммерческий фибриновый клей, исключает риск инфекций и иммунологического отторжения. Недостатком данного решения так же является использования физиологических концентраций фибриногена и, соответственно, слабые каркасные и механические свойства, аналогично описанному выше варианту в патенте RU 2704256 C1.

Ближайшим прототипом нашего предложения является вариант, представленный в патенте US 5643192 A, который направлен на получение аутологичного фибринового клея для остановки кровотечения и ускорения заживления раны при различных видах повреждений (травматические, хирургические) (US 5643192 А. Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use. Jack Hirsh Marilyn Johnston, Kevin Teoh. Publication 1997-07-01). Методом криопреципитации выделяют преципитат фибриногена, а из супернатанта, после удаления резидуального фибриногена, получают тромбин-содержащую сыворотку. Смешивание преципитата фибриногена с тромбин-содержащей сывороткой и CaCl2 в соотношении 1:1 вызывает быстрое формирование фибрина. Получения аутологичного тромбина в данном варианте возможно лишь при использовании криопреципитации, поскольку извлечение идет из сыворотки, которая в других случаях будет разведена и контаминирована этанолом, аммония сульфатом или ПЭГ. При этом, как известно, метод криопреципитации более длительный и менее эффективный по сравнению с этаноловым. В результате средняя концентрация фибриногена в преципитате составляет 20 мг/мл (данные патента), что достаточно для использования средства в качестве клея, но слишком мало для формирования каркаса протезов. Кроме того, получение аутологичного тромбина требует выполнения дополнительного этапа по удалению резидуального фибриногена из тромбин-содержащей сыворотки, который включает полимеризацию фибриногена, центрифугирование и фильтрование.

Техническим результатом нашего изобретения является создание простой технологии получения аутологичного, биосовместимого, безопасного материала для регенеративной и тканевой инженерии, поддерживающего высокую интеграцию с организмом хозяина и имеющим регулируемые свойства.

Технический результат достигается за счет использования аутологичного фибрина, который получают из фибриногена, выделенного из плазмы крови этаноловой преципитацией, и активации присутствующего в преципитате эндогенного тромбина ионами кальция. Этаноловая преципитация позволяет просто и в короткие сроки получить из плазмы крови фибриноген в высокой концентрации и регулировать его концентрацию путем разведения преципитата буфером рН 7,2-7,5.

Теоретическая предпосылка изобретения.

Ионы кальция придают активную конформацию белковым факторам свертывания крови. Для получения преципитата кровь забирают с цитратом натрия или цитратом декстрозы (состав А) в качестве антикоагулянта, которые связывают ионы кальция и блокируют переход протромбина в тромбин. Соответственно коагуляционный каскад не запускается и свертывания крови не происходит. Процесс приготовления преципитата включает этап осаждения белков и центрифугирования с последующим удалением надосадка. С надосадком окончательно удаляются ионы кальция. Важным моментом является то, что преципитат фибриногена содержит осажденные белки плазмы крови в том числе и протромбин. Восстановление концентрации ионов кальция при нормальных значениях рН приведет к активации эндогенного протромбина в тромбин и запуску каскада полимеризации фибриногена.

Предлагаемый способ реализуется согласно следующей методике:

1. Проводим забор собственной крови пациента в стерильные пробирки, содержащие цитрат натрия 3,8% или ACD-A (антикоагулянт цитрат декстроза (состав А)).

2. С помощью центрифугирования получаем плазму крови. В зависимости от целей можно использовать как обогащенную, так обедненную тромбоцитами и бестромбоцитарную плазму. Для предотвращения повреждения клеток рекомендуем использовать скорости не более 2000 G.

3. Из плазмы крови методом этаноловой преципитации получаем преципитат фибриногена. Для этого плазму отбираем в отдельные пробирки и при постоянном перемешивании на вортексе по каплям добавляем ледяной (4°С) раствор 10-20%) этанола (мы использовали 16%) рН 7,4 до соотношения с плазмой 1:1. Проводим инкубацию при температуре 4°С и постоянном перемешивании в течение 60 минут, затем центрифугируем 20-30 минут при температуре 4°С и скорости вращения 1000-1200 G. Надосадок удаляем. Полученный преципитат содержит концентрацию фибриногена в среднем диапазоне 70-100 мг/мл.

4. Для достижения необходимой концентрации фибриногена в полученный преципитат вносим Hepes-буфер на NaCl рН 7,2-7,5 и хорошо перемешиваем.

5. Для запуска полимеризации в подготовленный преципитат добавляем раствор CaCl2 (или сбалансированной смеси солей, содержащий CaCl2) в финальной концентрации 0,1-2%).

6. Образцы выдерживаем в течение 30-60 минут до полной полимеризации.

Отличительной особенностью предлагаемого способа получения фибрина является простота и отсутствие дополнительных этапов очищения аутологичного тромбина, включающих удаление резидуального фибриногена, центрифугирование и фильтрование. Данный способ позволяет получать аутологичный фибрин в условиях обычной лаборатории, без использования дополнительной сложной техники.

Предложенное решение избавляет от необходимости использовать экзогенный тромбин (аутологичный или ксеногенный). Полученный аутологичный фибрин не несет риска инфицирования, формирования иммунных реакций и в дальнейшем может быть имплантирован в виде самостоятельного каркаса, в качестве покрытия для протезов, биоматрикса для клеточной терапии. Изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине для моделирования фибрин-заинтересованных процессов in vitro и in vivo (клеточных взаимодействий, влияния лекарственных, физических или химических факторов).

В зависимости от концентрации ионов кальция и активности эндогенного тромбина полимеризация наступает в течение 40-70 секунд, что является достоинством, поскольку позволяет управлять процессом полимеризации и контролировать равномерность заполнения формы. Высокая скорость формирования фибринового сгустка ограничивает возможность равномерного заполнения (удаление воздуха, пузырей) и распределения фибрина в сложной или узкой форме, а попытка коррекции распределения смеси в условиях начавшейся полимеризации приводит к дефекту сгустка, разрыву или неправильному формированию волокон.

Данный способ позволяет регулировать физико-механические свойства фибрина, а так же клеточные и фибринолитические процессы за счет использования различных видов плазмы (обогащенная, обедненная тромбоцитами или бестромбоцитарная), а так же изменения концентрации фибриногена в преципитате с помощью разведения, поскольку в преципитате одновременно с фибриногеном содержатся XIII фактор, фибронектин, ингибиторы фибринолиза, ростовые факторы.

Пример 1. Фибрин, полученный без экзогенного тромбина, имеет структуру аналогичную фибрину, полученному с использованием экзогенного тромбина (Фигура 1.).

Тестирование образцов выполнено с помощью СЭМ. Для этого в форму залиты образцы, содержащие одинаковую исходную концентрацию фибриногена (20 мг/мл), который выделяли с помощью преципитации 16% этанолом. Для образцов без использования экзогенного тромбина полимеризацию активировали 0,2% раствором CaCl2. В случае использования экзогенного тромбина - тромбин-кальциевой смесью, содержащей 500 UI|/мл тромбина из бычьей плазмы и 0,2% раствор CaCl2. После прохождения полной полимеризации все образцы фибрина отделяли от формы и подвергали пробоподготовке для проведения СЭМ. На фотографиях со СЭМ измеряли диаметр волокон и размер пор.

Обработку всех полученных данных выполняли в программе GraphPad. Распределение в группах отличалось от нормального, поэтому результаты представлены в виде медианы и квартилей. Достоверность различий между двумя независимыми группами оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Сравнение между несколькими группами проведено методом ANOVA с коррекцией результатов с учетом множественности сравнения методом FDR. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р<0,05.

Не зарегистрировано различий размера пор и диаметра волокон в образцах без- и с использованием экзогенного тромбина.

Описание Фигуры 1.

- А - внешний вид фибриновых матриц, залитых в форму (верхний ряд концентрация фибриногена 10 мг/мл, средний - 20 мг/мл, нижний - 30 мг/мл. Левый столбец - образцы полимеризованы экзогенным тромбином (Экзо Тр), правый - эндогенным тромбином (Эндо Тр));

- Б - внешний вид фибриновых каркасов после отделения от формы и усадки (концентрация фибриногена 30 мг/мл);

- В, Г - фотографии со СЭМ (ув. 6000).

- Д - графическое распределение диаметра волокон и размера пор в образцах (данные СЭМ).

Пример 2. Фибрин, полученный без- и с использованием экзогенного тромбина не нарушает клеточную жизнедеятельность ни на поверхности, ни в толще матрикса (Фигура 2.).

С помощью этанолового метода получали преципитат.Фибробласты кожи человека 5 пассажа из расчета 100 тыс.на 1 мл готового фибрина вносили в Hepes-буфер с апротинином, 100 КИЕ/мл. В преципитат добавляли Hepes-буфер с клетками до достижения концентрации фибриногена 20 мг/мл и равномерно перемешивали. Полимеризацию фибриногена активировали в одном случае солевым раствором, содержащим 0,1% CaCl2, 0,8% NaCl, 0,03% KCl, в другом тромбин-кальциевой смесью, содержащей 500 IU|/мл тромбина из бычьей плазмы и аналогичным солевым раствором (0,1% CaCl2, 0,8% NaCl, 0,03%) KCl). Изменение состава раствора, содержащего ионы кальция обусловлено необходимостью сохранять и поддерживать жизнеспособность клеток, соответственно, раствор должен быть изотоническим и содержать набор солей, необходимых для жизнедеятельности. Смесь преципитата с клетками и полимеризующего компонента была немедленно залита в лунки 24-луночного планшета и помещена в CO2-инкубатор. После полимеризации в лунки вносили культуральную среду, содержащую DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой, а так же Hepes, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин и амфотерицин. Образцы культивировали в СО2-инкубаторе при 37°С 5% СО2 в течение 14 суток. Жизнеспособность клеток на поверхности и на дне матрикса оценивали с помощью флуоресцентой микроскопии после прижизненного окрашивания образцов этидиумом бромидом 30 мкг/мл и Hoechst 33342 10 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). В лунки с образцами вносили теплый раствор Hoechst 33342, инкубировали 10 минут при 37°С, далее образцы отмывали ФСБ и добавляли этидиум бромид на 1 минуту. Далее образцы повторно отмывали теплым раствором ФСБ и просматривали на флуоресцентном микроскопе. Контролем служили пустые лунки планшета, заселенные фибробластами. Данные обрабатывали в программе GraphPad как описано выше. Жизнеспособность клеток на поверхности матриц, на дне матриц и в контрольных лунках не отличалась и составила 96-100%.

Описание Фигуры 2. - Жизнеспособность фибробластов в толще фибриновой матрицы через 14 суток культивирования:

- А, Б - фотографии клеток (А. световая микроскопия, Б. флуоресцентная микроскопия, ув. об ×10);

- В - график жизнеспособности фибробластов на различных носителях.

Пример 3. Фибрин, полученный без использования ЭТ обладает более низкой тромбогенностью по сравнению фибрином, полимеризованным с помощью экзогенного тромбина (Фигура 3.).

Нами была оценена тромбогенность образцов на основании изменения показателей коагуляционного и тромбоцитарного звена гемостаза.

Для исследования контактной активации коагуляционного звена гемостаза измеряли активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ). Образцы готовили аналогично описанию, представленного в примере 2, но без заселения клетками. После отделения от формы и процесса усадки, образцы (n=7 на каждый вариант) погружали в отдельные лунки, заливали донорской обедненной тромбоцитами плазмой и инкубировали 30 минут при температуре 37°С. После инкубации плазму отбирали и измеряли АЧТВ. Контролем служила плазма, подвергшаяся инкубации в лунках планшета, но без погружения образцов фибрина.

Способность фибрина активировать тромбоцитарную агрегацию исследовали согласно международным стандартам ISO 10993-4. Из свежей донорской цитратной крови с помощью центрифугирования получали обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП). Интактную ОТП использовали в качестве контроля. Для регистрации изменения агрегации тромбоцитов после контакта с поверхностью фибрина образцы инкубировали с ОТП 5 мин при температуре 37°С. В контроле и образцах проводили измерение спонтанной агрегации тромбоцитов и активированной индуктором аденозин 5'-дифосфатом (АДФ) на анализаторе агрегации тромбоцитов - 4004 (АРАСТ, Беларусь). Соотношение индуктора и ОТП составило 25 мкл + 250 мкл соответственно. Графическая и статистическая обработка данных выполнена в программе GraphPad в соответствие с описанием в примере 1.

Описание Фигуры 3.

- А - показатели контактной активации коагуляционного звена гемостаза на поверхности фибрина;

- Б - тромбоцитарного звена гемостаза на поверхности фибрина

АЧТВ достоверно укорачивалось после контакта плазмы с образцами фибрина, полученными при использовании экзогенного тромбина (р<0,0002). Агрегация тромбоцитов происходила более активно на образцах фибрина с экзогенным тромбином по сравнению с контролем и использованием эндогенного тромбина. Таким образом, тромбогенность фибрина без экзогенного тромбина ниже и это делает его более предпочтительным вариантом для покрытия сердечно-сосудистых протезов. Полагаем, что после внесения экзогенного тромбина и закончившейся полимеризации, в составе фибрина может оставаться свободный, не связавшийся тромбин, который после контакта с кровью или имплантации в кровеносное русло запускает процессы свертывания и стимулирует образование тромбов, что крайне нежелательно в сердечно-сосудистой хирургии.

Способ изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена без использования экзогенного тромбина, включающий забор крови с цитратом натрия 3,8%, получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови с помощью центрифугирования, выделение преципитата из плазмы крови методом этаноловой преципитации с низким содержанием этанола путем медленного добавления ледяного раствора 16% этанола рН 7,4 до соотношения с плазмой 1:1, инкубации при постоянном перемешивании 60 мин при 4°С и центрифугировании 4°С и скорости вращения 1000-2000 G в течение 20-30 мин, регулирование концентрации фибриногена в преципитате путем разведения Heres-буфером на NaCl pH 7,2-7,5, запуск полимеризации фибриногена с помощью активации эндогенного тромбина, содержащегося в преципитате, путем внесения раствора кальция хлорида в финальной концентрации 0,1-2%.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и касается лечения храпа. Для этого получают тромбоцитарную аутологичную плазму и вводят ее путем инъекций в мягкое нёбо, нёбные дужки и язычок.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии. Проводят последовательную обработку очагов склероатрофического лихена вульвы от клиторальной области до задней спайки, для чего используют фракционный СО2-лазер в микроаблятивных режимах: для атрофической ткани вульвы - мощность 30 Вт, длительность импульса 1000 мкс, расстояние между микротермальными зонами повреждения 1000 мкм, количество стеков 1.
Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмохирургии. Проводят витрэктомию, вводят в область макулярного разрыва (MP) аутологичную обогащенную тромбоцитами плазму (Platelet-rich Plasma, далее PRP), полученную из венозной крови пациента, в количестве, достаточном для закрытия MP, и газовую тампонаду витреальной полости.
Изобретение относится к фармацевтики, а именно к способу получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis. Способ получения гипериммунной сыворотки крови кролика к диметилсульфоксид-антигену Yersinia pseudotuberculosis заключается в многократной не менее 5 раз иммунизации кролика смесью диметилсульфоксид-антигена псевдотуберкулёзного микроба и гидроксиапатита с последующим взятием крови у иммунизированного животного и отделением из неё сыворотки, содержащей специфические иерсиниозные антитела, причем для одной иммунизации кролику массой 2-3 кг подкожно вдоль спины в 4-5 точек вводят 1 мл смеси раствора диметилсульфоксид-антигена и 1%-ной взвеси гидроксиапатита в соотношении 1:1, кроме того, доза диметилсульфоксид-антигена Y.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и косметологии, и может быть использовано при коррекции возрастных изменений, связанных с процессами старения кожи, в частности кожи лица. Способ включает радиоволновое воздействие на заданную область с помощью электрода-канюли 21G аппарата Иннофилл с последующим введением в данную область аутологичной богатой тромбоцитами плазмы.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для лечения посттравматических анкилозов суставов кисти. Переднюю капсулу поврежденного сустава рассекают под местной анестезией.

Изобретение относится к медицине, а именно к абдоминальной хирургии. Формируют вначале заднюю, затем переднюю губы панкреато-кишечного анастомоза атравматическим шовным материалом в один ряд.
Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, и предназначено для лечения маточных форм бесплодия. Для лечения «тонкого» эндометрия женщинам репродуктивного возраста с «тонким» эндометрием в пролиферативную фазу менструального цикла (до 10 дня) проводят инъекционное введение аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами (Platelet-rich plasma (PRP)), под контролем офисной гистероскопии в условиях малой операционной под внутривенной анестезией.
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может найти применение в лечении стрессового недержания мочи у женщин, не завершивших репродуктивную функцию. Способ малоинвазивного лечения стрессового недержания мочи у женщин характеризуется введением аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, в комбинации с 2% нестабилизированной гиалуроновой кислотой в подслизистый слой средней трети уретры в четыре точки, соответствующие 3, 6, 9 и 12 часам условного циферблата, по 1 мл в каждую точку, иглой толщиной 20G длиной 70 мм, через аппликатор Люэра, с учетом индивидуальной длины уретры, измеренной с помощью катетера Фоллея №14 после опорожнения мочевого пузыря и локальной анестезии катеджелем с лидокаином/инстилагелем.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для профилактики и остановки послеродовых маточных кровотечений. Способ включает эластичную компрессию матки, при кесаревом сечении в полость матки вводят одногруппную полуразмороженную плазму с консистенцией снега в дозе 400 мл, далее осуществляют наложение двух слоев стерильного эластичного бинта по часовой стрелке, начиная со дна матки с переходом на тело и нижний сегмент до разреза, затем ушивают разрез на матке, после чего бинт удаляют, проводят интраоперационное УЗИ для верификации продолжающегося кровотечения, а при естественном родоразрешении при помощи катетера, который заводят за внутренний зев до дна матки, вводят одногруппную полуразмороженную плазму с консистенцией снега в дозе 400 мл с последующей бимануальной компрессией матки в течение 20 минут.

Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии и может быть использовано для противоопухолевой таргетной терапии и профилактики рака и других злокачественных новообразований. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований содержит аутологичные или иммуносовместимые аллогенные мононуклеарные клетки (МНК) мобилизованной периферической крови человека (компонент А), содержащие гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+ в количестве 1-2% клеток от общего числа МНК и мезенхимальные стромальные стволовые клетки (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- в количестве 0,5-2% клеток от общего числа МНК, а также линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных нейральных стволовых клеток (НСК) с маркером CD133+ (компонент Б) и/или линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (компонент В).
Наверх