Способ определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей и его применение

Изобретения относятся к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и могут быть использованы для определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей. Определяют активности дегидрогеназ митохондрий и гликолиза в неповрежденных лимфоцитах капиллярной крови на мазке, который окрашивают красителем нитросиним тетразолием, подвергают микроскопии. В каждом мазке проводят морфологический анализ лимфоцитов и определяют количество и распределение красителя в каждой клетке. Об активности ферментов в лимфоцитах судят по определяемому количеству красителя в условных единицах. Вывод о наличии дисфункции ферментов энергетического обмена делают по значениям активностей ферментов сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. За норму принимают значение сукцинатдегидрогеназы 1-1,3 условных единиц, а значение лактатдегидрогеназы 8-11 условных единиц. Определение активности дегидрогеназ можно осуществлять путем проведения количественного морфологического анализа цветных изображений с использованием компьютерной программы «Cell Composer». Данный способ применяют для контроля эффективности назначенной терапии, индивидуального выбора препаратов патогенетической терапии и своевременной ее коррекции, а также с прогностической целью для формирования групп риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний. Способ обеспечивает возможность создания для клинической практики эффективного и информативного метода диагностики нарушения энергообмена в клетке и прогностической оценки течения заболевания при респираторной патологии у детей за счет определения дисфункции митохондриальных и гликолитических ферментов энергетического обмена в лимфоцитах из капиллярной крови, а также возможность применения данного способа для различных клинических задач. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 4 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей и может быть использовано для индивидуального выбора тактики энерготропной терапии в педиатрической практике.

Постепенно накапливаются данные, что при болезнях легких патологическим признаком, который появляется на ранних стадиях и развивается последовательно, являются нарушения клеточной биоэнергетики.

Респираторные патологии - чаще всего хронические заболевания, характеризующиеся постоянными воспалительными процессами и частично обратимой обструкцией верхних дыхательных путей. Токсины окружающей среды, такие как табачный дым, выхлопные газы и пр. являются высоко окисляющими по своей природе и вызывают повреждения легких окислительным стрессом (Герасимова Н.Г., Ахвердиева Т.Б., Шувалова Ю.В. и др. О роли перекисной и антиоксидантной систем в патогенезе бронхиальной астмы // Самарский научный вестник. 2015. 2. (11): 65-68.).

Именно окислительный стресс является ведущим фактором в развитии стойкого воспаления при респираторных патологиях. Хорошо известно, что митохондрии - главные сенсоры окислительного стресса и воспаления в клетке; также эти органеллы играют важную роль при адаптивном иммунном ответе лимфоцитов в дыхательных путях и легочной ткани и регулировании клеточного воспалительного ответа. Нарушение функции митохондрий приводит к снижению захвата богатых энергией субстратов (жирные кислоты, пируват, углеродный скелет аминокислот) из цитоплазмы и их окислительному расщеплению с образованием СO₂ и Н₂O, сопряженному с синтезом АТФ. Это в итоге приводит к дисфункции ферментов энергетического обмена. Таким образом, повреждение биоэнергетики наряду с увеличением производства активных форм кислорода в митохондриях и повреждением эпителия легких становится новым ключевым аспектом патогенеза заболеваний дыхательных путей.

Следует обратить внимание на то, что процессы в организме детей протекают иначе, чем у взрослых. Для обеспечения значительных энергетических потребностей ребенка необходимы относительно большие энергетические резервы организма. На протяжении первого года жизни ребенка происходят качественные изменения в характере энергообеспечения тканей: снижается удельный вес анаэробного гликолиза и нарастает интенсивность процессов окислительного фосфорилирования, что ведет к повышенному расходованию АТФ. Следствием этого является высокая интенсивность биоэнергетических процессов, наиболее выраженная у детей раннего возраста (особенно у новорожденных). В дальнейшем она постепенно снижается (Тамбовцева Р.В. Биохимические особенности онтогенетического развития энергообеспечения мышечной деятельности // Новое исследование. 2014.1 (38): 68-75.)

У детей в процессе роста и развития происходят значительные изменения морфологических характеристик тканей, их химического состава и метаболизма, поэтому детский организм нельзя рассматривать как уменьшенную копию взрослого организма. И показатели активности ферментов, которые определяют у взрослых, нельзя механически переносить на растущий детский организм и назначение патогенетической терапии у них требует особой осторожности.

Терапия детей с респираторной патологией требует комплексного подхода и наряду с препаратами базисной терапии, необходимо дополнительно проводить и коррекцию метаболических нарушений.

В реальной клинической практике антиоксидантная терапия назначается эмпирически, без учета степени нарушений активности ферментов энергетического обмена, что может привести к прооксидантному эффекту и вызвать еще большее повреждение тканей.

В настоящее время для диагностики (митохондриальной) дисфункции ферментов энергетического обмена имеются различные методы.

1. Биохимические методы позволяют выявлять в биологических жидкостях метаболиты, указывающие на нарушение энергетического обмена.

Биохимические показатели, свидетельствующие о нарушении процессов клеточного энергообмена (метаболический ацидоз, увеличение содержания в крови лактата, пирувата натощак и после нагрузки глюкозой, снижение содержания общего карнитина, активация перекисного окисления липидов, увеличение экскреции ряда органических кислот), к сожалению, могут служить лишь дополнительными критериями диагностики.

Их изменение не отличается стабильностью, не обладает высокой специфичностью, могут встречаться при различных заболеваниях, не позволяют дифференцировать первичные митохондриальные заболевания от сопутствующей митохондриальной недостаточности. (Barshop В.A. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.) Кроме того, эти способы часто малоспецифичны и требуют уточняющих исследований - определение концентрации молочной и пировиноградной кислот с вычислением коэффициента лактат/пируват;

Биохимическим и морфологическим методами оценки дисфункции митохондрий проводилось исследование состояния мембранного потенциала митохондрий при внебольничной пневмонии у детей (Ли Л.А., Лебедъко О.А., Козлов В.К. Оценка дисфункции митохондрий при внебольничной пневмонии у детей Дальневосточный медицинский журнал 2015. 1:30-35).

Однако, в основе патогенеза внебольничной пневмонии лежит острая воспалительная реакция в паренхиме легких, которая зависит от количества и вирулентности микроорганизмов, состояния защитных механизмов дыхательных путей и организма в целом. Нарушения проходимости бронхов, расстройства микроциркуляции, воспалительная инфильтрация, интерстициальный отек и снижение воздушности легочной паренхимы приводят к нарушению перфузии газов и гипоксемии. Последняя, сопровождается респираторным ацидозом, гиперкапнией, компенсаторной одышкой и появлением других клинических признаков дыхательной недостаточности.

Пневмония у детей нередко сопровождается не только дыхательной, но и сердечно-сосудистой недостаточностью, возникающей в результате циркуляторных нарушений, перегрузки малого круга кровообращения (Crawford S.Е., Daum R.S. Bacterial pneumonia, lung abscess and empyema / Pediatric respiratory medicine / ed. Taussig L.M., Landau L.I. Mosby, Inc., 2008: 501-553)

Биолюминесцентным методом у взрослых пациентов изучалась ферментативная активность лимфоцитов, выделенных из венозной крови при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией у взрослых пациентов (Капустина Т.А. Ферментативная активность лимфоцитов при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией. // Российская ринология. 2013; 21(1): 16-18)

Исследование проводилось у взрослых пациентов и изученные ферменты не могли дать полную картину нарушений энергетического обмена.

Ранее также изучалась ферментативная активность лимфоцитов, выделенных из венозной крови биолюминесцентным методом при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией у взрослых пациентов (Капустина Т.А. Ферментативная активность лимфоцитов при хронических риносинуситах, ассоциированных с хламидийной инфекцией. // Российская ринология. 2013; 21(1): 16-18)

2. Способ хроматомасс-спектрометрии предназначен для количественного и качественного определения отдельных компонентов в сложных смесях. Это позволит получить информацию о тех процессах, ключевым участником которых является синтез АТФ.

Карнитин, один из компонентов сложной смеси, транспортирует длинноцепочечные жирные кислоты в митохондрии через внутреннюю мембрану последних, в которых происходит их β-окисление до ацетил-КоА с последующей его утилизацией. В частности, используют способ, заключающийся в том, что определяют соотношение в крови общего и свободного карнитина и по показателю их соотношения судят о митохондриальной дисфункции, то есть о степени нарушений энергетического обмена. (Barshop В.А. Metabolomic approaches to mitochondrial disease: correlation of organic acids. Mitochondrion 2004; 4: 521-527.)

Но такой способ не позволяет достоверно судить о полноте происходящих нарушений функции митохондриальных ферментов энергетического обмена. Такие исследования в нашей стране практически не проводятся. Отчасти это можно объяснить отсутствием современного оборудования в клинических лабораториях, отчасти - инвазивностью процедуры, проводимой на биопсийном материале мышц, печени и фибробластах.

3. Гистологические исследования.

Проводится определение комплексов дыхательной цепи на полученном инвазивным путем биопсийном материале мышц, печени и фибробластах, включающее анализ ультраструктуры митохондрий с помощью электронной микроскопии или гистохимического выявления активности (митохондриальных) ферментов энергетического обмена в мышце.

Выделение митохондрий из клетки для проведения исследований приводит к разрушению ультраструктуры митохондрий, изменению величины, формы и внутренней структуры в их митохондриальном аппарате. (Сухорукое B.C. Проблемы диагностики митохондриальной недостаточности. Клинико-лабораторный консилиум 2012)

Результаты, получаемые на выделенных in vitro митохондриях, очевидно, существенно отличаются от соответствующих параметров, характерных для этих органелл в живой клетке (Kondrashova М., Zakharchenko М., Khunderyakova N. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria. IntJBiochem Cell Biol 2009; 41: 2036-2050.).

Указанные диагностические способы, используемые в педиатрии для диагностики митохондриальных дисфункций, далеки от совершенства. Так, с одной стороны, выявление лабораторных признаков митохондриальной недостаточности у больных с различными заболеваниями зачастую приводит к гипердиагностике первичных митохондриальных болезней. С другой стороны, недостаточная надежность ряда ранее использовавшихся диагностических критериев ведет к их гиподиагностике.

4. Цитохимические исследования.

Еще в 60-х годах, прошлого века советский ученый Р.П. Нарциссов показал, что лимфоциты периферической крови можно рассматривать не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма.

Но его исследования не получили широкого распространения за рубежом, и только в последнее десятилетие начали появляться независимые исследования зарубежных коллег, о том, что множество патологий, которые клинически проявляются симптомами преимущественно в одном органе, таком как, например, мозг, сердце или легкие, также могут модулировать энергетику митохондрий в циркулирующих лейкоцитах крови.

Хорошо известно, что лейкоциты крови постоянно подвергаются множеству факторов, ассоциированных с метаболическим стрессом, чувствуют и отвечают на системные метаболические и воспалительные стрессоры. Вероятно, поэтому они и могут служить функциональными биомаркерами для клинической биоэнергетики, являясь при этом идеальными объектами для исследований. Таким образом, мониторинг биоэнергетики иммунных клеток может стать диагностическим инструментом для количественной оценки митохондриальных функций и общего биоэнергетического здоровья индивидуума.

Известен цитобиохимический способ определения адренергической регуляции в организме, включающий определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), путем измерения на мазке крови величины восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в лимфоцитах после их инкубации в водной среде, отличающийся тем, что измерения проводят в комплексе проб: в основной среде инкубации, которая содержит КСl 100-150 мМ, преимущественно 125 мМ, HEPES 5-15 мМ, преимущественно 10 мМ, НСТ 0,8-1,5 мМ, преимущественно 1,22 мМ рН 7,2±0,05; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ малоната; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ янтарной кислоты (ЯНТ); в основной среде инкубации в присутствии 5 мкМ ЯНТ; в основной среде инкубации в присутствии 5 мМ ЯНТ и 50 мкМ - 5 мМ, преимущественно 5 мМ природной формы изолимонной кислоты (ИЗЛ) (Патент РФ 2364868, G01N 33/50, 20.08.2009).

Как маркер состояния митохондрий этот цитобиохимический способ гораздо чувствительнее, чем принятые биохимические методы. В частности, с его помощью можно определять активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Интерес к цитобиохимическому анализу активности (митохондриальных) ферментов энергетического обмена в лимфоцитах для диагностики полисистемных митохондриальных нарушений объясняется сравнительной простотой и малой травматичностью взятия и обработки крови. Таким образом, у многих больных с полисистемной митохондриальной недостаточностью диагностическая биопсия мышц может быть заменена цитобиохимическим анализом клеток периферической крови. Комплексный цитобиохимический анализ является ценным диагностическим инструментом при подборе медикаментозного лечения и при оценке динамики митохондриальной недостаточности в процессе терапии.

Известно, что изучение активности митохондриальных дегидрогеназ проводилось цитохимическим, а не цитобиохимическим методом в различных популяциях лимфоцитов из венозной крови у детей с респираторными и кожными проявлениями аллергии (Капустина Е.Ю. Активность митохондриальных ферментов лимфоцитов периферической крови у детей с респираторными и кожными проявлениями аллергиии, автореф. дисс. к.м.н., Москва, 2006. 270 с.)

Описываемый способ не использовался для анализа изменений активности митохондриальных ферментов в динамике у обследованных детей и отсутствует сравнительный анализ выявленных изменений с другой патологией, например, с группой часто и длительно болеющих детей. Известно, что иммунная система у таких детей характеризуется крайней напряженностью, нарушением межклеточной кооперации и недостаточностью резервных возможностей., что, по-видимому, является результатом длительного и массивного антигенного воздействия на организм ребенка. (Заплатников А.Л. Клинико-патогенетическое обоснование иммунотерапии и иммунопрофилактики вирусных и бактериальных заболеваний у детей: Автореф. дисс… докт. мед. наук. - М., 2003.)

Наиболее близким к заявляемому решению можно отнести способ, описанный в работе, в которой применялся цитобиохимический способ для определения дисфункции митохондриальных ферментов у детей с онкологическими заболеваниями. (Хундерякова Н.В., Плясунова С.А., Литвинова Е.Г., Ячкула Т.В., Захарченко М.В., Ковзан А.В., Федотчева Н.И., Шварцбурд П.М., Кондрашова М.Н. Изменения в лимфоцитах под действием субстратов окисления. // Биофизика. 2014. (59). вып. 6: 1101-1107) Этот способ заключается в том, что проводят отбор крови, затем на мазке крови окрашивание по методике с часовой инкубацией клеток в биохимической среде для определении активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, при этом величины активности рассчитывают по восстановлению нитросинего тетразолия при компьютерной обработке микроскопических изображений (М. Кондрашова, М. Захарченко, Н. Хундерякова и др., в кн.: Инновационные методы диагностики в медицине.НП «Сибак», Новосибирск, 2013), сс.1058). Исследование проводилось цитобиохимическим методом с измерением активности митохондриального дыхания и гликолиза именно у детей с онкологическими процессами без локализации его в органах респираторного тракта. Активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы лимфоцитов являются показателями основных процессов энергообеспечения в клетке - митохондриального дыхания и гликолиза.

Однако следует отметить, что метаболизм раковой клетки значительно отличается от метаболизма клеток здоровых детей.

У детей с онкопатологией преобладает доминирование гликолиза над дыханием.

При использовании описываемого способа определение активностей указанных ферментов не проводилось в динамике для контроля эффективности назначенной терапии, индивидуального выбора препаратов патогенетической терапии и своевременной ее коррекции.

Заявляемый способ определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей характеризуется использованием цитобиохимического метода (ЦБХ) для определения активности сукцинатдегидрогеназы - основного фермента митохондриального дыхания и лактатдегидрогеназы - цитоплазматического фермента, характеризующего гликолиз и процессы восстановления энергетического баланса организма

Он обеспечивает возможность выявления нарушений энергетического обмена клеток, что способствует индивидуализации патогенетической терапии.

Кроме того, этот способ позволяет формировать группы риска развития аллергических заболеваний у детей группы часто и длительно болеющих.

Раскрытие изобретения.

Предлагается способ диагностики дисфункций ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей, включающий определение активности дегидрогеназ митохондрий и гликолиза в неповрежденных лимфоцитах капиллярной крови на мазке по концентрации продукта реакции восстановления нитросинего тетразолия - формазана в каждой клетке, путем проведения количественного морфологического анализа цветных изображений. При этом вывод о митохондриальной дисфункции делают по полученным значениям активностей ферментов сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), принимая за норму значение активности СДГ - 1-1,3 условных единиц, а значение активности ЛДГ - 8-11 условных единиц.

Морфологический анализ цветных изображений проводят с использованием специализированной компьютерной программы, позволяющей определить количество и распределение красителя в клетке на основе вычисления декомпозиции красителей по данным цветового пространства.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят забор образца капиллярной крови из пальца ребенка. Мазки крови после фиксации и окрашивания красителем нитросиний тетразолий (НСТ) подвергают микроскопии на микроскопе при увеличении х100 под масляной иммерсией. В каждом мазке проводят морфологический анализ 100-150 лимфоцитов и определяют количество и распределение красителя в каждой клетке.

Об активности ферментов в лимфоцитах судят по определяемому количеству красителя в условных единицах.

Способ предоставляет достоверную информацию об энергообменных процессах в клетке при различных патогенетических механизмах воспаления, в том числе позволяет выявлять нарушения активности ферментов энергетического обмена

При использовании предлагаемого способа исследование проводится на лимфоцитах из капиллярной крови. Взятие крови из пальца - несомненно более щадящий способ при работе с больными детьми.

Технической проблемой, решаемой изобретением, является индивидуальный выбор методов коррекции нарушений энергообмена клеток у детей при респираторной патологии, основанный на определении дисфункции митохондриальных и гликолитических ферментов энергетического обмена.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является создание для клинической практики более эффективного и информативного способа диагностики нарушения энергообмена в клетке и прогностической оценки течения заболевания при респираторной патологии у детей.

Предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска развития аллергических заболеваний у детей группы часто и длительно болеющих и индивидуально подбирать патогенетическую терапию для коррекции этих нарушений.

Из уровня техники не было известно, что цитобиохимический метод может быть использован для определения дисфункции ферментов при респираторной патологии у детей.

Особенностью нашего исследования стало изучение (митохондриальной) дисфункции энергетического обмена у детей группы часто и длительно болеющих (ЧДБ) в сравнении с детьми с атопической бронхиальной астмой и группой практически здоровых детей.

Было установлено, что у детей группы ЧДБ выявлены такие же нарушения активности ферментов энергетического обмена, как и при легком течении атопической бронхиальной астмы.

Таким образом, определение активности дегидрогеназ лимфоцитов становится прогностическим маркером для формирования групп риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний.

Краткое описание чертежей.

Изобретения поясняются графическими материалами, подтверждающими возможность реализации изобретения с достижением заявленного технического результата, которые более подробно изложены в примерах.

Фиг. 1. Активность СДГ (А) и ЛДГ (Б) у детей до (2016 и 2017 гг.) и после лечения (2019 г). Диапазон нормы находится между пунктирными линиями.

Фиг. 2. Распределение показателей у обследуемых детей выделенных групп по активности СДГ и ЛДГ. Заштрихованные участки показывают зону нормы для этих ферментов.

Был проведен ЦБХ анализ энергетического обмена на мазках капиллярной крови у 19 детей -14 мальчиков и 5 девочек возраста 6-14 лет. Из них 12 детей было обследовано повторно (первое обследование - 2016 и 2017 гг.), 7 человек -впервые.

Измерялись активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

Данные проведенного анализа для первой группы повторно обследованных детей представлены на фиг. 1.

Линией на рисунке показан диапазон нормы: СДГ от 1,0 до 1,3 ус.ед. и ЛДГ от 8,0 до 11,0 ус.ед.

Как видно из данных фиг. 1 А, у большинства детей при первом обследовании активность СДГ была значительно выше нормы (7 человек), незначительно превышала уровень нормы (3 человека) и у двух человек была ниже нормы.

При повторном обследовании после лечения у подавляющего большинства (10 человек) активность СДГ нормализовалась, у одного активность СДГ снизилась незначительно и осталась выше нормы и у одного снизилась ниже нормы.

Активность ЛДГ (фиг. 1 Б) также у большинства детей была гиперактивна и превышала норму (7 человек), у 4-х находилась в зоне нормы и у одного - ниже нормы.

Как и в случае с СДГ, при повторном обследовании наблюдалось нормализация активности ЛДГ до нормы (8 человек) и у 4-х человек снизилась до нижней границы нормы.

Данные, представленные на фиг. 2, говорят о следующем.

У детей контрольной группы показатели находятся в зоне нормы - как по активности ЛДГ, так и по активности СДГ.

Четверо детей из самой «тяжелой» группы №1 занимают нижнее левое положение, т.е. все они имеют активность ЛДГ значительно ниже нормы; при этом активность СДГ у двух из них также ниже нормы.

Следующая по тяжести заболевания группа №2 занимает верхнее правое положение на диаграмме распределения: у всех детей наблюдается гиперактивация СДГ, а у 6 человек из 10 также и ЛДГ превышает норму.

Дети из группы №3 (легкое течение БА с редкими обострениями) занимают промежуточное положение между 1 и 2 группами: часть из них находится вообще в зоне нормы (4 человека), четверо имеют гиперактивную ЛДГ при нормальной СДГ, остальные по своим показателям близки к группе №2, т.е. имеют превышение нормы по обоим показателям, но меньшее по абсолютным величинам.

Дети группы №4 (часто болеющие дети - ЧБД), все их показатели находятся в зоне группы №2 (у детей с бронхиальной астмой): у всех наблюдается гиперактивная СДГ и у двух детей из пяти также и ЛДГ выше нормы.

Повторное обследование детей, проведенное через 6-9 месяцев лечения, показало у большинства из них значительные улучшения показателей энергетического обмена. Для большей наглядности данные приведены по группам.

Впервые было установлено, что у часто болеющих детей имелись такие же нарушения показателей ферментов энергетического обмена, как и у детей с легким течением бронхиальной астмы.

У детей группы ЧДБ под влиянием инфекционных агентов и триггеров формируется в респираторном тракте хронический воспалительный процесс, который ведет к гипоксии тканей, накоплению продуктов перекисного окисления и напряженности процессов иммунного реагирования, нарушению межклеточной кооперации и недостаточности резервных возможностей, что, по-видимому, является результатом длительного и массивного антигенного воздействия на организм ребенка. У таких детей даже в период клинического благополучия и при отсутствии признаков ОРЗ выявляются отчетливые изменения в межклеточном взаимодействии в иммунной системе: достоверно повышается содержание провоспалительных интерлейкинов (IL2, IL4), в том числе интерлейкинов, участвующих в хронизации процессов воспаления (IL6, IL8).

Это сопровождается снижением клеточной цитотоксичности, дисиммуноглобулинемией, недостаточностью резервных возможностей интерфероногенеза, особенно в плане синтеза интерферона-гамма, осуществляющего мощную противовирусную защиту в организме, несмотря на нормальный уровень интерферона в сыворотке крови, объясняет сохранение вялотекущей реакции воспаления в организме ребенка даже при отсутствии клинических признаков ОРВИ. Снижение активности интерферона - гамма ведет к активации Th-2 лимфоцитов, повышению уровня IL4 и как следствие формированию инфекционно-аллергического воспаления. (Заплатников А.Л. Клинико-патогенетическое обоснование иммунотерапии и иммунопрофилактики вирусных и бактериальных заболеваний у детей: Автореф. дисс… докт. мед. наук. - М, 2003)

Возможность осуществления предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами, но не исчерпывается ими.

Пример 1

Ребенок 6 лет (пациентка под №10) с тяжелым течением атопической бронхиальной астмы, с частыми обострениями, и сопутствующей аллергической патологией - сезонным аллергическим ринитом (АР).

Для определения нарушений энергетического обмена клеток (митохондриальных дисфункций) проводят забор образца крови из пальца ребенка, определение активностей СДГ и ЛДГ в лимфоцитах крови путем определения интенсивности восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ) до формазана в лимфоцитах при инкубации мазков крови.

Мазки после окрашивания красителем нитросиний тетразолий (НСТ) подвергают микроскопии на микроскопе (Leica-DM 2000 с цветной фотокамерой Leica DFC 425) при увеличении х100 под масляной иммерсией. В каждом мазке проводится морфологический анализ 100-150 лимфоцитов и с помощью компьютерной программы «Cell Composer», позволяющей определить количество и распределение красителя в клетке на основе вычисления декомпозиции красителей по данным цветового пространства, для дальнейшего изучения активности СДГ и ЛДГ.

Затем во всех клетках измеряют активность ЛДГ и СДГ.

При первом обследовании в 2019 году в период ремиссии активность СДГ и ЛДГ были снижены до 0,8 и 4,0 усл. ед., в группе контроля в этот же период - 1,1 и 8,6 усл. ед., соответственно.

Проводилась базисная терапия комбинированными глюкокортикостероидами (ГКС) в режиме постоянного дозирования и дополнительно топическими ГКС, с включением в программу лечения сорбента с янтарной кислотой и пре- и пробиотиков. Причем в качестве сорбента с янтарной кислотой применялся Жидкий активированный уголь по аннотации и в качестве пре- и пробиотика - синбиотик флувир, который представляет собой комбинацию пробиотиков - Lactobacillus plantarum LP01 и LP02, Lactobacillus rhamnosus LR04 и LR05, Bifidobacterium lactis BS01 и пребиотика - фруктоолигосахаридов.

Через 6 месяцев использования подобранной базисной терапии комбинированными ГКС и топическими ГКС, с включением в программу лечения сорбента с янтарной кислотой и пре- и пробиотиков был проведен анализ крови, как описано выше в проведении первого обследования. Было отмечено повышение активности СДГ и ЛДГ до 1,2 и 9,3 усл. ед., при норме СДГ - 1-1,3 усл. ед. и ЛДГ 8-11 усл. ед., что указывало на восстановление активности митохондриальных ферментов.

Это послужило основанием для завершения лечения.

Пример 2.

Ребенок 9 лет (пациент под №4) со средне тяжелым течением атопической бронхиальной астмы, с частыми не тяжелыми обострениями после ОРВИ, которые легко купировались бета-2-агонистами короткого действия через небулайзер, и с сопутствующим сезонным аллергическим ринитом.

Базисную терапию монтелукастом и топическими ГКС получал не регулярно.

Был проведен анализ крови ребенка, как описано выше в Примере 1, с определением ферментов в динамике их активности способом, который описан в примере 1

При первом обследовании в период ремиссии активность митохондриальных ферментов была повышена: СДГ-1,5 усл. ед. и ЛДГ - 14,0 усл. ед., что говорило о перенапряжении механизмов энергообеспечения.

После обучения в астмашколе и занятий с психологом, регулярного использования базисной терапии, полученные спустя 6 месяцев, показатели активности СДГ снизились до 1,3 усл. ед, но не достигла значений контрольной группы - 1,1 усл.ед. Показатели ЛДГ снизилась значительно - с 14 усл.ед. до 8,6 усл. ед., практически до значений контрольной группы - 8,6 усл. ед.

Такая положительная динамика послужила поводом продолжить базисную терапию и курс синбиотика.

Пример 3.

Ребенок 7 лет (пациентка под №22) с легким течением атопической бронхиальной астмы, с сопутствующим сезонным аллергическим ринитом, соблюдает гипоаллергенный быт и гипоаллергенную диету.

Был проведен анализ крови ребенка, как описано выше в Примере 1.

При первом обследовании в период ремиссии отмечено было повышение активности митохондриальных ферментов: СДГ - 1,6 усл. ед. и ЛДГ - 10,5 усл. ед., что указывало на активность аллергического воспаления даже при отсутствии клинических проявлений со стороны респираторного тракта.

Ребенку был назначен курс монтелукаста на 2 месяца, предсезонная подготовка антигистаминовыми препаратами 2-го поколения и уход за слизистой полости носа.

Через 6 месяцев после начала лечения значение СДГ снизилось до 1,3, но оставалось повышенным значение ЛДГ - 9,6 усл.ед., что послужило основанием для продолжения лечения монтелукастом и назначить курс синбиотика.

Пример 4.

Ребенок 9 лет (пациент под №30) из группы длительно и часто болеющих (ЧБД). За год переносил до 6-8 эпизодов ОРВИ с обострением хронического тонзиллита, которые приводили к назначению антибактериальной терапии. Аллергоанамнез не был отягощеным, аллергообследование не выявило наличия аллергического процесса. Кожные пробы методом prick-теста были отрицательные, в крови не определялись специфические иммуноглобулины класса Е (sIgE) с группой пыльцевых, пищевых, бытовых, эпидермальных и грибковых аллергенов методом ImmunoCap. Настораживающим моментом послужило наличие у ребенка повышенного уровня эозинофилов в крови (420 кл/мкл). На период обследования ребенок являлся реконвалесцентом после очередного обострения (18 день после обострения и 12 день после завершения курса антибактериальной терапии), получал витаминотерапию. В состав витаминного комплекса входило большое количество витаминов и минералов, в том числе витамин С и Е.

Показатели СДГ и ЛДГ были повышенными, СДГ - 1,7 усл. ед. и ЛДГ - 11 усл. ед., соответственно, что указывало на перенапряжение систем клеточного энергообмена. Ребенку была отменена витаминотерапия, продолжена местная санация ЛОР-органов, скорректирована диета путем назначения гипоаллергенных продуктов и снижения количества потребления простых углеводов, соблюдения гипоаллергенного быта. Ребенок был включен в группу риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний.

В течение последующих 6 месяцев было 2 эпизода ОРВИ, пролеченных противовирусными препаратами без назначения антибиотиков. Обострения хронического тонзиллита не было.

При контрольном исследовании показатели СДГ и ЛДГ снизились до 0,8 и 7,0, соответственно, что указывало на истощение активности как митохондриальных функций, так и поддерживающего их гликолиза, количество эозинофилов оставалось повышенным - 340 кл/мкл. Ребенку продолжены были санационные процедуры ЛОР-органов и назначен курс сорбентов, содержащих, в частности, пектины, а также янтарную кислоту и синбиотик.

Наряду с базисной терапией в лечении детей с респираторной патологией большое значение приобретает адекватно подобранная патогенетическая терапия и в первую очередь препараты гипооксиданты, антиоксидантны, синбиотики и сорбенты. (Таблица 2.) Опираясь на полученные результаты исследования активности ферментов энергетического обмена клеток, детям индивидуально подбиралась препараты патогенетической терапии.

Так, при активации и гиперактивации СДГ и ЛДГ назначение антиоксидантов может привести к усилению оксидативного стресса и дальнейшему повреждению клеток, при сниженной активности детям показано назначение антиоксидантов и гипооксидантов, ингибирование активности СДГ и ЛДГ требовало назначения сорбентов.

Таким образом, предлагаемое цитобиохимическое исследование ферментов лимфоцитов капиллярной крови позволило повысить диагностическую чувствительность при обследовании детей с респираторной патологией для выбора более эффективного патогенетического лечения.

Кроме того, это позволило обратить внимание на часто болеющих детей, как группу риска по развитию аллергических заболеваний в дальнейшем.

Исследование в динамике ферментов дает возможность дифференцированно подбирать адекватную базисную и патогенетическую терапию и своевременно вносить коррекцию в процесс восстановления функций митохондриальных и гликолитических ферментов.

Комплексный цитобиохимический анализ является ценным диагностическим инструментом при подборе медикаментозного лечения и при оценке динамики митохондриальной недостаточности в процессе терапии. Чувствительность вышеупомянутых показателей позволяет уже вскоре после первого назначения препарата сделать вывод об его эффективности и прогнозировать результат лечения.

Таким образом, достигнут технический результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, - создание для клинической практики более эффективного и информативного способа прогностической оценки и диагностики нарушения энергообмена в клетке при респираторной патологии у детей, что дает возможность индивидуально подбирать терапию для коррекции этих нарушений.

1. Способ определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей, заключающийся в том, что определяют активности дегидрогеназ митохондрий и гликолиза в неповрежденных лимфоцитах капиллярной крови на мазке, который окрашивают красителем нитросиним тетразолием, подвергают микроскопии, в каждом мазке проводят морфологический анализ лимфоцитов и определяют количество и распределение красителя в каждой клетке, об активности ферментов в лимфоцитах судят по определяемому количеству красителя в условных единицах, при этом вывод о наличии дисфункции ферментов энергетического обмена делают по значениям активностей ферментов сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, при этом за норму принимают значение сукцинатдегидрогеназы 1-1,3 условных единиц, а значение лактатдегидрогеназы 8-11 условных единиц.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение активности дегидрогеназ проводят путем проведения количественного морфологического анализа цветных изображений с использованием компьютерной программы «Cell Composer».

3. Применение способа определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей по п. 1 для контроля эффективности назначенной терапии, индивидуального выбора препаратов патогенетической терапии и своевременной ее коррекции.

4. Применение способа определения дисфункции ферментов энергетического обмена при респираторной патологии у детей по п. 1 с прогностической целью для формирования групп риска развития в дальнейшем аллергических заболеваний.