Технология производства жидкой формы комбинированного биопрепарата на основе bacillus subtilis и bacillus megaterium var. phosphaticum

Изобретение относится к биотехнологии, растениеводству. Предложена технология производства жидкого комбинированного биопрепарата на основе штаммов бактерий рода Bacillus, включающая раздельное, единовременное культивирование штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-13494 и Bacillus megaterium var. phosphaticum штамм ВКПМ В-13497 при непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде, содержащей маннит, пептон ферментативный, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый и воду в заданных количествах и смешивают в соотношении от 60:40 до 40:60. При этом засев среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста с концентрацией (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл и осуществляют первоначальное культивирование до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии – (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл. Затем с каждого ферментера сливают и утилизируют половину содержимого, после этого объем жидкости в ферментерах доводят до первоначального уровня концентрированной питательной средой, маннит, пептон ферментативный, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый и воду с повышенной концентрацией. Культивируют в первоначальном режиме до достижения концентрации клеток в (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл. Затем половину содержимого каждого ферментера сливают в бак-накопитель, а оставшееся содержимое ферментеров доводят концентрированной питательной средой до первоначального объема и цикл культивирования повторяют. По окончании цикла культивирования полученное содержимое бака-накопителя и ферментеров перемешивают между собой и разливают в контейнеры в качестве готового продукта для использования по назначению. Изобретение позволяет увеличить срок хранения препарата до 2 лет, улучшить адгезию препарата к обрабатываемым поверхностям, равномерность обработки гидрофобных поверхностей, таких как листовая поверхность растения. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, растениеводству, в частности, к производству комбинированного биопрепарата на основе двух видов бактерий рода Bacillus – B. subtilis и B. megaterium var. phosphaticum. Биопрепарат предназначен для обработки посевного материала и обработок по вегетации широкого спектра агрокультур, включая зерновые, технические и овощные. Биопрепарат обладает комплексным действием благодаря наличию в составе двух видов спорообразующих бактерий рода Bacillus – B. subtilis и B. megaterium var. phosphaticum. Оба микроорганизма преимущественно являются ростостимуляторами, однако, первый микроорганизм дополнительно обладает ярковыраженным фунгицидным действием, а второй – фосфатмобилизующим.

Как известно, микробные препараты представляют собой живые клетки, селекционированные по полезным свойствам микроорганизмов, а также продукты их метаболизма, которые либо находятся в культуральной жидкости, либо адсорбированы на нейтральном носителе. Такой препарат дает возможность создать огромную концентрацию полезных форм микроорганизмов (в 1 мл или 1 г препарата содержится до 1–5 млрд. клеток бактерий). За счет этого внесенные микроорганизмы могут успешно конкурировать с аборигенной микрофлорой и захватывать экологические ниши, предоставляемые им растением.

География распределения микроорганизмов зависит от комплекса экологических факторов: влажности, типа субстрата, кислотности, температуры, засоленности почв и т. д. Для почв характерны разные ассоциации (комплексы доминирующих почвенных микроорганизмов). Поэтому в качестве объекта микробной географии целесообразно использовать не биологический вид, а микробное сообщество, т.е. комбинацию микроорганизмов.

В процессе эволюции в различных типах почв в зависимости от экологических и антропогенных факторов сложились специфические микробиоценозы, в которых сосуществуют микроорганизмы, принадлежащие к различным таксономическим и физиологическим группам. Среди них встречаются как полезные, так и отрицательно влияющие на растения микроорганизмы.

Создание микробных комплексов из агрономически полезных штаммов микроорганизмов и обогащение ими почвы, либо обработка ими растений с целью направленного воздействия на протекающие в этой среде процессы представляет большой практический интерес. Препараты поливалентного действия на основе композиций микроорганизмов и биологически активных веществ при условии эколого-физиологической совместимости бактерий и индивидуального комплементарного подбора компонентов отличаются большей стабильностью и эффективностью в разных агроклиматических условиях.

В состав таких многокомпонентных препаратов могут входить симбиотические, ассоциативные и ризосферные микроорганизмы. При этом следует учитывать, что на сообщество микроорганизмов корневой зоны влияние растения-хозяина сильнее, чем влияние абиотических факторов среды обитания.

Многие исследования в области создания микробных препаратов свидетельствуют о том, что правильно выбранные и примененные микробные препараты положительно влияют на биохимическую активность почв. Создание биопрепаратов комплексного действия, одновременно включающих свойства биоудобрений и фунгицидов, инсектицидов, дает возможность решать многие проблемы биологической защиты растений и повышать качество конечной продукции (овощей, фруктов, плодов, трав и фуража для животных), а также улучшать состояние почв, т. е. плодородие, обеспечивая повышение урожайности сельскохозяйственных культур. В свою очередь, это приводит к сокращению или исключению использования химических средств защиты растений — гербицидов, фунгицидов, а также минеральных удобрений. В результате снижается нагрузка на почву, в частности на агрополезные микроорганизмы, химическими средствами. Это также повышает биологическую активность почвы за счет увеличения количества полезной микрофлоры, следовательно, и почвенное плодородие.

Для создания бактериальных препаратов, способствующих повышению продуктивности сельскохозяйственных культур, используют микроорганизмы – представители семейства Rhizobiaceae, а также родов Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Azospirillum. Такие препараты экологически безопасны, поскольку созданы на основе микроорганизмов, выделенных из природных объектов.

При подборе культур в качестве основы моно- или композиционных препаратов отдают предпочтение штаммам, способным продуцировать биологически активные вещества, проявлять фосфатазную активность, фиксировать азот атмосферы, подавлять развитие фитопатогенов и стимулировать формирование растений. При этом отобранные микроорганизмы должны обладать колонизирующей активностью по отношению к корневой системе растений и способностью сосуществовать в их ризосфере.

Использование живых микроорганизмов позволяет сократить геологический круговорот за счет их способности переводить метаболически неактивные, связанные химические элементы в доступные для растений формы.

Еще одной из глобальных экологических проблем земледелия всего мира является проблема зафосфаченности почв, которая возникла в результате ежегодного внесения в почвы под сельскохозяйственные культуры большого количества фосфорных удобрений. Коэффициент использования растениями фосфора из удобрений невысок и составляет всего 10-20% от вносимого количества, остальная же его часть, реагируя с комплексами почвы, переходит в нерастворимые в воде и недоступные для растений соединения. При этом нарушается фосфатный режим почв, который приводит к дефициту доступного фосфора и в результате:

-снижается активность полезных микроорганизмов в почве (особенно

азотного цикла – нитрификаторов, азотобактера, целлюлозоразлагающих);

-нарушается баланс питательных биогенных (азот, калий) и других макро- и микроэлементов (Са, Mg, Zn);

-снижается эффективность фотосинтеза, дыхания, задерживается корнеобразование, рост и развитие растений;

-создаются благоприятные условия для развития микроскопических грибов в почве, в том числе и фитопатогенов;

-повышается поступление в растения тяжелых металлов;

-снижается плодородие почвы, т.к. существует прямая корреляция между плодородием и фосфатным режимом почв;

-снижается способность почвы и растений удерживать воду;

-снижается урожайность сельскохозяйственных культур и их качество.

Улучшение фосфатного режима почв и фосфорного питания растений крайне необходимо в связи с тем, что при фосфорном голодании заметно снижается эффективность всех других питательных элементов – тормозится

поглощение азота, калия, вносимого с удобрениями, а также макро- и микроэлементов корнями растений и передвижение их в надземные органы растений.

По данным Туевой О. Ф. [1996] недостаток фосфора в начальный период развития растения отрицательно сказывается на его росте и развитии в течение всего вегетационного периода, и, в конечном счете, на урожайности и качестве продукции, даже если в последующие периоды роста растения были хорошо обеспечены фосфором. При недостатке фосфора азот не полностью включается в состав белков, нуклеиновых кислот и других соединений, а частично содержится в растениях в виде нитратов и нитритов, что ухудшает качество продукции (Персикова Т.Ф., 2002).

Одним из перспективных путей решения проблемы зафосфаченности почв является микробиологическая трансформация труднорастворимых фосфорсодержащих соединений. Так, некоторые почвенные микроорганизмы способны в результате своей жизнедеятельности выделять различные органические кислоты и ферменты и, находясь в симбиотических взаимодействиях с корневыми системами растений и другими микроорганизмами, они могут увеличивать содержание растворимого фосфора в почве, легкоусвояемого растениями. Поэтому разработка биотехнологии получения и применения эффективных, экономически выгодных и экологически безопасных биоудобрений на основе фосформобилизующих бактерий, способных к утилизации накопленных запасов нерастворимых соединений фосфора в почве и повышению эффективности применяемых фосфорных удобрений, является актуальной задачей современной почвенной микробиологии и биотехнологии.

Муромцев Г.С. (1983) использовал некоторые виды фосфатмобилизующих бактерий для стимуляции ростовых, фотосинтетических процессов, повышения урожайности и качества растительной продукции.

Banik S, Dey B.K. (1983) изолировали из индийских почв 6 штаммов фосфатмобилизующих бактерий р. Bacillus, 2 штамма актиномицетов р. Streptomyces. Mohammed G., Indian J (1984) исследовали возможность дополнения дорогостоящих химических удобрений фосфоробактериями B. megaterium, B. subtilis, B. cereus и Escherichia freundii и установили, что ½ и ¼ дозы NPK могут быть дополнены эффективными штаммами фосфоробактерий при возделывании гороха.

El – Giobaly M.H, El – Roweiny (1987) в Египте, из ризосферы и ризопланы растений - маиса, гороха и хлопчатника выделили 200 культур фосфатмобилизующих микроорганизмов, из которых 50 культур были наиболее активными по способности увеличивать количество водорастворимого фосфора в среде.

Известен целый ряд биопрепаратов для овощных культур, в частности огурцов и картофеля, на основе фосформобилизующих бактерий, которые обладают способностью переводить труднодоступные фосфаты алюминия и железа в усвояемую форму - «Микрокорневит почвенный» на основе Bacillus

megaterium, Bacillus mucilaginosus, Azotobacter chroococcum и р. Beijerinckia

(Виноградов, Няникова и др.,1992).

Л. А. Суховицкая, Г. М. Клышко (1997) установили, что интродуцированные в почву ризобиальные и фосфатмобилизующие инокулянты, приживаясь в ризосфере озимых агрофитоценозов, проявляли свои функциональные свойства, положительно влияя на урожай зерна и его качество и повышая содержание общего азота и подвижной Р2О5 в ризосфере инокулированных посевов.

Natiyal C.S., Bahadautia S., (2000) выделили из ризосферы турецкого гороха фосфатрастворяющие бактерии NBRI 0603, NBRI2601, NBRI 3246 и NBRI 4003. Все четыре штамма бактерий обладали способностью растворять Са3(РО4)2.

И. М. Коваль (2001) и Т. М. Шлома (2002) выявили, что инокуляция семян зернобобовых культур фосфатмобилизующим препаратом Фитостимофосом существенно повышала урожайность.

Вилфванко А.В., Курдский И.К. (2001) из черноземных почв областей Украины выделили 216 штаммов микроорганизмов, способных минерализовать органофосфаты. 16 активных штаммов были отнесены к р.Bacillus. Новые штаммы бацилл отобраны для создания комбинированных бактериальных удобрений.

Микробные сообщества корневой зоны растений занимают особое место в системе управления факторами естественного плодородия почв. И.К.

Курдиш с соавт. (2007) проводили интродукцию в корневую зону растений высокоактивных штаммов азотфиксирующих Azotobacter vinelandii и фосфатмобилизующих Bacillus бактерий. Интродукция смесей микробных суспензий вышеназванных бактерий оказывала синергическое действие на развитие и урожай растений.

В результате изучения взаимодействия азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий с глинистыми минералами были созданы гранулированные бактериальные препараты комплексного действия, которые улучшают азотное и фосфорное питание растений, синтезируют ростстимулирующие вещества, а также угнетают развитие фитопатогенных микроорганизмов.

Эффективным в плане повышения подвижности фосфора, по данным исследователей Вильдфлуш И. Р., Брагинa А. М. (1974), является применение органических удобрений, которые способствуют увеличению емкости поглощения фосфатов почвой и улучшению перехода фосфатов твердой фазы почвы в почвенный раствор.

В Украине созданы препараты на основе фосформобилизующих бактерий – альбобактерин и полимиксобактерин, которые с успехом применяются для предпосевной обработки семян различных культур: сахарной свеклы, ржи, ячменя, льна, подсолнуха. Применение этих биопрепаратов повышает урожайность растений, а также способствует повышению устойчивости сахарной свеклы против корнееда и увеличивает сбор сахара до 8 ц/га.

В Институте микробиологии и вируcологии им. Д.К.Заболотного для формирования эффективных микробно-растительных систем созданы новые комплексные микробные препараты – Экобакт (на основе Bacillus megaterium УКМ В-5724 и Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035 и В-6018), Экофосфорин (на основе Agrobacterium radiobacter 59-1 и Bacillus megaterium УКМ В-5724) (Иутинская Г.А., 2010).

Фосфоэнтерин – жидкий препарат, создан в Южной опытной станции на основе эффективного штамма фосфатмобилизующих бактерий Enterobacter nimipressuralis 32-3. Препарат комплексного действия применяется на зерновых и бобовых культурах, хорошо влияет на рост овощных растений, повышает урожайность за счет продуцирования штаммом физиологически-активных веществ и органических кислот.

Научный и практический интерес представляло создание такой биотехнологии, которая бы одновременно, улучшая корневое питание растений, повышала бы урожайность с/х культур, качество продукции и при этом постепенно восстанавливала бы плодородие деградированных почв.

Кроме того, экономически выгодным была бы возможность длительного сохранения биопрепаратов без потери активности, упрощение производства комбинированных биопрепаратов, проявляющих широкий ряд активностей, присущих входящих в их состав микроорганизмов.

Новая биотехнология также должна быть также экологически безопасной, импортозамещающей и экспортоориентируемой.

Фосфор находится в почве в составе химических соединений, усвоение которых недоступно растениям. Такого неподвижного, необменного фосфора в почве содержится до 5-6 т на каждый га.

Бактерии Bacillus megaterium var. Phosphaticum живут в почве и способны разлагать органические вещества и высвобождать содержащийся в них фосфор, переводя его в растворимые соли фосфорной кислоты.

Образуемые в дальнейшем соединения фосфорной кислоты становятся доступны для усвоения растениями.

Использование таких бактериальных препаратов особенно эффективно на плодородных почвах. Поскольку таких почв на нашей планете осталось немного, особенно важно выделить штаммы микроорганизмов, потенциально активные в мобилизации биогенных элементов не только из органической, но и из неорганической составляющей почвы, например, вторичных минералов.

Анализ минеральных фосфорных удобрений показал, что простой суперфосфат содержит лишь 18-21% Р2O5, 80% остатка – это примеси, 1/5 из которых составляет алюминий, а также сопутствующие элементы-загрязнители: фтор, железо, редкоземельные элементы гафний, цирконий, скандий.

Двойной суперфосфат содержит около 45-46% Р2O5, на загрязнения приходится около 50%.

В России фосфорные удобрения изготавливаются из природных оливиновых бокситов на Ангарском алюминиевом заводе, поэтому после их применения на полях остается большое количество алюминия. Этот элемент опасен не только для людей, но и для развития растений его повышенное количество нежелательно, поскольку алюминий вреден тем, что он сильно влияет на гидролитическую кислотность почвы, то есть связывает катионы калия, натрия и других жизненно необходимых растению элементов. Внесение живых бактерий Bacillus megaterium var. Phosphaticum в «зафосфаченные» почвы позволяет в 2-3 раза снизить норму расхода минеральных фосфорных удобрений и повысить качество сельхозпродукции.

Агробиотехнологии с использованием бактериальных препаратов, улучшающих взаимоотношения почвы и растений, разработаны и внедряются с начала прошлого века. Главным моментом в механизме действия микробных препаратов является их приуроченность к корневым зонам растений, а также способность мобилизовать полезные компоненты не только из удобрительных комплексов, вносимых в почву, но и из самой почвы.

Таким образом, необходимо выявление и селекция микроорганизмов, обладающих высокой активностью в процессах мобилизации биогенных элементов для усиленного развития растений.

Основой получения любого бактериального препарата является классическая схема асептического биотехнологического производства.

Однако при этом культивирование каждого конкретного штамма предполагает выполнение специфических условий, необходимых для максимального проявления штаммом его промышленно значимых свойств.

Особенно важно сохранить свойства исходной матричной культуры после допустимого периода хранения препарата.

В современном промышленном биотехнологическом производстве многие биопрепараты изготавливаются на основе различных штаммов бактерий рода Bacillus sp.

Одним из существенных негативных эффектов подобного производства является фаголиз бактериальной культуры, особенно Bacillus megaterium. Фаголиз – эффект разрушения (лизирования) бактериальных клеток под действием вирусов бактерий-бактериофагов, которые могут попасть в клетку снаружи, либо могут активироваться в определенных условиях в виде провируса, встроенного в бактериальный геном.

Основными способами борьбы с лизогенными вирусами бактерий являются поддержание строжайшей стерильности исходной матричной культуры для производства препарата и селекция устойчивых к бактериофагам штаммов.

Известны штаммы Bacillus megaterium var. Phosphaticum de Ваrу (В200-B208), обладающие свойством мобилизовать фосфор. Штаммы-аналоги находятся на хранении в ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов). Данные об этих штаммах получены из «Каталога штаммов Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, 1997 г.».

Известен штамм Bacillus megaterium de Bary 1884, обладающий свойством мобилизовать фосфор. Он имеет ограниченную функциональную способность выщелачивать фосфор и большую подверженность лизису колоний на скошенной агаризованной среде.

Однако был получен культуральный штамм, обладающий фосфат- и кремниймобилизующими свойствами из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину: Bacillus megaterium var. Phosphaticum ВКМ В-2357Д, который получен из лабораторного штамма Bacillus megaterium путем его постепенной адаптации к полигексаметиленгуанидину.

Полученный штамм Bacillus megaterium var. Phosphaticum Pl-04 депонирован с научным описанием и паспортом во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина (г. Москва) 24.05.2005 под № ВКМ В-2357Д.

Полигексаметиленгуанидин относится к классу биоцидных катионных полиэлектролитов, который помимо флокуляции обладает высокой и разнообразной биоцидной активностью: бактерицидной, фунгицидной, вирулицидной, алгицидной.

Производство фосфобактерина представляет собой процесс получения бактериального удобрения, содержащего споры микроорганизма Bacillus megaterium var. рhosphaticum (Производство бактериальных удобрений. Найдено http://biofile.ru/bio/18511.html, дата размещения онлайн

14.08.2018 подтверждена по адресу вебархива

https://web.archive.org/web/20180814160058/http://biofile.ru/bio/18511.html).

Помимо способности превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и т.д.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму, Bacillus megaterium var. рhosphaticum вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты и др.), стимулирующие рост растения. Фосфобактерин относится к числу препаратов со стимулирующим рост растений эффектом.

Bacillus megaterium var. phosphaticum представляют собой мелкие, грамположительные аэробные спорообразующие палочки размером 2*6 мкм.

Их клетки содержат значительное количество соединений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные одиночные палочки, при старении образуют эндоспоры, локализующиеся в одном из концов клетки. В силу вышеизложенного технология выращивания сводится к получению их спор.

В целом производство фосфобактерина похоже на производство азотобактерина и препаратов клубеньковых бактерий. Состав питательной среды, %: кукурузный экстракт -1.8, меласса - 1.5, сульфат аммония - 0.1, мел - 1, остальное - вода.

Культивирование ведется глубинным методом в строго асептических условиях при постоянном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор. Основные параметры проведения процесса: температура 28-30 град. Цельсия, рН 6.5-7.5, длительность культивирования 1.5-2 суток.

Полученную в ходе культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и высушивают в распылительной сушилке при температуре 65-75 град. Цельсия до остаточной влажности 2-3%. Высушенные споры смешивают с наполнителем. Готовый препарат должен содержать не менее 8 млрд. клеток в 1 г.

Расфасовывают препарат в полиэтиленовые пакеты по 50-500 г. В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфобактерин обладает большей устойчивостью при хранении. Фосфобактерин рекомендуют применять на черноземных почвах, которые содержат наиболее значительное количество фосфороорганических соединений. Необходим для повышения урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и др. с/х растений.

Семена обрабатывают смесью сухого фосфобактерина с наполнителем (золой, почвой и др.) в соотношении 1:40. На 1 га требуется 5 г препарата и 200 г наполнителя. Клубни картофеля равномерно увлажняют суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата на 15 л воды. Урожай при этом повышается на 10%.

Известен также биопрепарат АМБ (аутохтонная микрофлора Б), представляющий собой готовое сообщество микроорганизмов, нативную микрофлору почвы, способную разлагать органические вещества, высвобождая газообразный аммиак – то есть вести процесс нитрификации или аммонификации. Препарат АМБ применяется в тех случаях, когда почва обеднена и не имеет достаточного количества нативных микроорганизмов для проведения сельскохозяйственной деятельности. Кроме АМБ известен также вид препаратов ЭМ, который отличается от АМБ тем, что содержит не все почвенные бактерии подряд, а только их «элитных» представителей. В настоящее время ЭМ-препараты представляются одним из наиболее прогрессивных направлений развития биопрепаратов сельского хозяйства.

Примеры бактерий, принадлежащих к виду Bacillus subtilis, включают, но не ограничиваются ими: штамм Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), штамм Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) Bacillus subtilis штамм В-10 ВИЗР, Bacillus subtilis штамм ИПМ 215, Bacillus subtilis штамм 26 Д, штамм М-22 ВИЗР и т.д.

Штамм Bacillus subtilis В-14 был выделен из почвы и депонирован в НИИ «Коллекция культур микроорганизмов» ГНЦ ВБ «ВЕКТОР» по регистрационным номером В-1149. Штамм проявляет антагонистические свойства против широкого спектра фитопатогенных грибов и бактерий, не требователен к питательным средам и может быть использован для защиты различных видов растений от болезней, в качестве источника фунгицидной, пестицидной, иммуногенной для растений активности.

Производится в виде концентрата бактериальной суспензии, порошка (дуст), смачивающегося порошка, таблеток.

Применение таких непатогенных почвенных бактерий, живущих в ассоциации с корнями высших растений, усиливает адаптивный потенциал хозяев, стимулирует их рост и служит перспективной альтернативой химическим пестицидам (В.К. Чеботарь с соавт., 2015).

Бактерия Bacillus subtilis признана мощным инструментом биоконтроля, поскольку обладает супрессивными качествами по отношению к широкому набору фитопатогенов благодаря способности продуцировать множество вторичных метаболитов различной химической природы: циклических липопептидов, полипептидов, белков и непептидных соединений (T. Stein, 2005).

Информация о структуре активных метаболитов бактерий — антагонистов фитопатогенов, а также механизмах их биологической активности способствует целенаправленному отбору штаммов для создания микробиологических препаратов.

Бактерия B. subtilis широко распространена благодаря способности формировать биопленки (A.L. McLoon с соавт., 2011). Химический состав соединений определяется ее генетическими особенностями и физико-химическими условиями окружающей среды. Циклический липопептид сурфактин проявляет антимикробную (антибактериальную, антивирусную, антигрибную) активность, вызывая лизис клетки, а также способствует снижению продукции микотоксинов микроорганизмами (M. Mohammadipour с соавт., 2009). Структура другого пептидного метаболита – ризоктицина способствует проникновению в микробную клетку и ингибированию синтеза белка (K. Kino с соавт., 2009).

Бактерии B. subtilis способны продуцировать различные гидролитические ферменты, благодаря которым происходит лизис клеточной стенки фитопатогенного гриба (C.P. Quardros с соавт., 2011). Среди метаболитов, синтезируемых бактериями, важное значение имеют лантибиотики, структура которых позволяет осуществить синтез пептидогликана, что способствует формированию пор в цитоплазматической мембране (J. Parisot с соавт., 2008).

Семейство поликетонов проявляет антимикробную активность благодаря способности собирать многофункциональные полипептиды в большие пестицидные комплексы. Фосфолипидный антибиотик бацилизоцин вырабатывается непосредственно после прекращения роста и перед формированием термостабильных спор, проявляет фунгицидную активность против некоторых грибов (A. Hamdache с соавт., 2011).

Известны штаммы B. subtilis, которые синтезируют полиеновые антибиотики с сопряженными двойными связями, например гексаены, и ингибируют рост фитопатогенных грибов (E.B. Kudryashova с соавт., 2005). Часть почвенных микроорганизмов, в том числе некоторые штаммы B. subtilis, способны синтезировать гиббериллины и гиббериллиноподобные вещества, стимулирующие рост растений (R. Aloni с соавт., 2006). Белки, липопептиды, полисахариды и другие соединения, ассоциированные с клеточной стенкой B. subtilis, могут запускать защитный механизм растения, то есть выступать в качестве элиситоров (M. Ongena с соавт., 2007).

Способность Bacillus subtilis синтезировать соединения определенной структуры предполагает наличие специфичного механизма действия на фитопатогенный объект, а также объясняет биологическую активность определенного штамма в отношении конкретных патогенов.

При подборе штаммов-продуцентов для создания эффективных биопрепаратов необходимо уделить внимание структуре и свойствам активных метаболитов, которые они синтезируют, поскольку на этой основе могут быть разработаны новые экологически безопасные технологии защиты растений (Сидорова Т.М. и др. Биологически активные метаболиты Bacillus subtilis и их роль в контроле фитопатогенных микроорганизмов (обзор)// Сельскохозяйственная биология, 2018, т.53, № 1, с.29-37).

Bacillus subtilis – наиболее продуктивные представители рода Bacillus по синтезу антибиотиков. Как правило, штаммы Bacillus subtilis образуют на питательной среде выпуклые колонии ризоидной формы. Хорошо растут на МПА, пептонно-кукурузном агаре и других средах. Размер клеток 0,7..0,8х2..3мкм. В почве бациллы находятся в виде спор или вегетативных клеток. При температурах почвы, близких к 0°C, большая часть бацилл образует споры; в этом состоянии микроорганизмы отличаются высокой устойчивостью к внешним факторам.

При наступлении благоприятных условий бактерии переходят в активное (вегетативное) состояние и начинают работать – защищать почву и растения от болезней.

Чем выше рН (щелочные почвы), тем больше процент спор Bacillus subtilis.

Действующие вещества биопрепаратов в любом случае представляют собой живые клетки и комплекс метаболитов продуцента, однако, изготовленные на их основе средства могут быть представлены в различной форме.

Штаммы Bacillus subtilis, помимо разностороннего действия на возбудителей заболеваний, в большинстве случаев проявляют стимулирующий эффект в отношении защищаемой культуры. Препараты на основе каждого из действующих веществ имеют свои особенности.

Из всех представителей Bacillus subtilis в сельском и личном подсобном хозяйствах обычно используют 4 штамма:

штамм 26 Д,

штамм В-10 ВИЗР,

штамм ИПМ 215,

штамм М-22 ВИЗР.

В настоящее время на основе этих штаммов рода Bacillus разработан и применяется ряд биопрепаратов:

ФИТОСПОРИН (BACILLUS SUBTILIS, ШТАММ 26 Д),

АЛИРИН (BACILLUS SUBTILIS, ШТАММ В-10 ВИЗР),

БАКТОФИТ (BACILLUS SUBTILIS, ШТАММ ИПМ 215),

ГАМАИР (BACILLUS SUBTILIS, ШТАММ М-22 ВИЗР).

Фитоспорины вообще (различные препаративные формы на основе Bacillus subtilis, штамм 26 Д) содержат эндофитные (внутрикорневые) и ризосферные (прикорневые, поверхностные) бактерии. Сосуществуя с клетками растений, они препятствуют проникновению в них многих патогенов.

Bacillus subtilis, штамм 26 Д – живая бактериальная культура. На основе ее споровой формы с продуктами жизнедеятельности широко применяется известный универсальный препарат Фитоспорин-М – промышленный фунгицид с длительным сроком хранения.

При неблагоприятных внешних условиях (жара, холод, нехватка питания и пр.) Bacillus subtilis переходит в споровое (спящее) состояние. Препарат в таком виде легко переносит жару до +60 °С, морозы до -60 °С.

Биопрепарат Фитоспорин на основе живых клеток и спор эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26 ВНИИСХМ 128 для защиты растений от комплекса фитопатогенов (патент N 2099947) разлит в стерильные ампулы, лиофильно высушен и запаян. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), молоко, обрат, сахарозо-желатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при лиофильном высушивании препарата. Главным недостатком данного способа получения препарата является необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих и энергоемких аппаратов для лиофильной сушки, а также трудоемкость и длительность самого процесса высушивания, что повышает себестоимость продукции. Так же в состав препарата входит только один вид бактерий, что обусловливает пониженный спектр фунгицидной активности, пониженную ростостимулирующую активность и отсутствие фосфатмобилизирующей активности.

Лиофильно высушенный препарат имеет ограниченный срок хранения без потери активности бактерий, но увеличивает время приготовления непосредственно жидкой формы для применения на растениях – требует разведения перед использованием.

Фитоспорин-М отличается высокой биологической эффективностью против листовых грибных болезней, корневых гнилей на зернобобовых, зерновых культурах (65-75%), ризоктониоза и фитофтороза на картофеле (60%), гнили и парши на плодовых культурах (75%), гомоза на хлопчатнике (90%). Действие препарата при полной экологической безопасности по эффективности близко к химическим контактным фунгицидам.

Механизм действия препарата основан на том, что живая споровая бактериальная культура Bacillus subtilis подавляет размножение патогенных грибов и бактерий продуктами своей жизнедеятельности. Обладает свойством повышения иммунитета у растений к этим же болезням, что снижает повторные заражения. Стартовый эффект включает механизм самозащиты, прямое подавление болезней как внутри растений, так и в прикорневой зоне. Активно подавляет патогенов в течение всего периода вегетации.

Баковые смеси Фитоспорина-М с гумми на оптимально удобренных фонах позволяют уменьшить в 2-3 раза дозу Фитоспорина-М с одновременным увеличением урожайности.

Баковые смеси Фитоспорина-М с гербицидами, по сравнению с обработкой только гербицидами, дают устойчивое повышение урожайности за счет биостимулирующих свойств Фитоспорина-М.

Препарат Бактофит на основе Bacillus subtilis, штамм ИПМ 215 обладает токсическим действием на афидофагов, особенно на лизифлебусов и галлицу афидимизу, как при опрыскивании листовой поверхности против мучнистой росы, так и при проливах растений против корневых гнилей.

Препараты на основе бактерий относятся к 3 и 4 классам опасности для человека и к 3 и 4 классам опасности для пчел (http://www.pesticidy.ru).

Препарат на основе Bacillus subtilis штамм ВКПМ В-12079 может быть использован при получении пробиотических средств для крупного рогатого скота и птицы, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями процессов пищеварения. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 составляет основу кормовой добавки «Энзимспорин».

Составы питательных сред для культивирования Bacillus subtilis хорошо изучены на лабораторном и промышленном уровнях.

Так, известна питательная среда для стационарного культивирования Bacillus subtilis – мясопептонный бульон (МПБ). Мясопептонный бульон готовится из мясной воды, к которой добавляют 1% пептона и 0,5% натрия хлорида. Мясную воду получают путем проварки в 2-4-кратном объеме водопроводной воды мяса или фарша крупного рогатого скота или лошадей в течение 1 ч с последующей фильтрацией.

Недостатком данной среды является дороговизна используемых компонентов и сложная технология приготовления. Применение данной среды для промышленного производства трудновыполнимо.

Можно использовать и L-бульон состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон ферментативный - 15, хлорид натрия - 5, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводят при давлении 1,1 атм. в течение 40 мин. Однако при культивировании Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в такой среде максимальное количество организмов – не выше 5×10⁹ КОЕ/мл.

Чтобы обеспечить количество Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 в процессе культивирования выше 5×10⁹ КОЕ/мл, известно использование питательной среды, состоящей из дрожжевого экстракта, пептона ферментативного, хлорида натрия, 96%-го спиртового экстракта кофе арабика, дистиллированной воды, доведенной до объема 1 л (рН 6,8-7,0), при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, 96% спиртовой экстракт кофе арабика 2-40 мл/л, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизация при давлении 1,1 атм. в течение 40 минут.

Приготовление экстракта включает в себя экстрагирование растительного сырья. Использовали аппарат Сокслета. На 1 г воздушно-сухого вещества использовали 15 мл растворителя. В качестве растворителя выбрали 96%-ый раствор этанола.

В патрон из белой фильтровальной бумаги добавляли 10 г воздушно-сухого растительного сырья, после чего закрывали с обеих сторон и помещали в экстрактор Сокслета. В колбу добавляли 150 мл растворителя и начинали экстрагирование на водяной бане. Продолжительность экстрагирования - 3 часа, количество циклов - 10. На выходе получали спиртовой экстракт растительного сырья.

Культивирование производили в шейкер-инкубаторе «Innova 44» (New Brunswick, США) при вращении со скоростью 250 об/мин (эксцентриситет 5 см), температуре 37°С в течение 24 ч.

Для определения количества микроорганизмов использовали стандартный метод десятикратных разведений с пересевом на питательный агар, приготовленный при следующем соотношении компонентов (г/л): дрожжевой экстракт - 5, пептон - 15, хлорид натрия - 5, агар-агар - 18, дистиллированная вода - до 1 л (рН 6,8-7,0). Стерилизацию проводили при давлении 1,1 атм. в течение 40 мин. Затем термостатировали при температуре 37°С в течение 24 ч. В качестве контрольной пробы использовали среду, без внесения экстрактов кофе арабика.

В опытной пробе было получено количество Bacillus subtilis ВКПМ В-12079 до 6×10⁹ КОЕ/мл.

Известен способ получения препарата из бактерий рода Bacillus (RU 2076902) методом жидкостного глубинного культивирования, включающий засев питательной среды маточной культурой одной из предыдущих генераций (т.е. споровой культурой) в количестве 1-2% от объема засеваемой среды (т. е. 1,6-3⋅10⁷ кл/мл). При этом культивирование проводят 14 суток при температуре 35-37 град. Цельсия и отделяют целевой продукт в виде спор. Наполнитель или стабилизатор не используется, а используется естественное свойство бактерий переходить в споры, которые хорошо сохраняются, для непосредственного использования получающейся взвеси спор в «отработанной среде» в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки.

Это позволяет снизить производственные затраты за счет экономии на лиофильной сушке. Однако недостатками данного способа производства биопрепарата, помимо наличия в составе только одного вида бактерий и отсутствия улучшающих технологические свойства препарата добавок, является длительность самого процесса культивирования (14 суток), что приводит к значительному росту себестоимости продукции, а также низкий конечный титр бациллярных микроорганизмов ((1,6-3)⋅10⁹ КОЕ/мл), что приводит к меньшей эффективности препарата при той же норме расхода.

Стоит отметить и небольшой срок хранения препарата, получаемого по данной технологии, который составляет не более 4 мес при хранении при температуре 6 град. Цельсия.

Известно комбинированное микробное удобрение, с компонентами, в частности, Bacillus subtilis и Bacillus megaterium var. рhosphaticum (CN 105907397 A, публ. 31.08.2016). Однако данный биопрепарат имеет дополнительные компоненты в составе (Lactobacilus plantarum, Aspergillus, полиглутаминовая кислота), которые при производстве постепенно смешивают между собой, что, однако, удорожает себестоимость препарата. Продукт повышает урожайность кукурузы: 790 кг, в контрольной группе – 540 кг, расход поливной воды в фазу роста культуры снижается на 18% по сравнению с контролем. При этом отсутствуют сведения о сроках хранения препарата без потери активности составляющих его бактерий.

Из ЕА 005716 В1, публ. 28.04.2005, известно комплексное удобрение, которое включает бациллы рода Bacillus subtilis и Bacillus megaterium var. рhosphaticum (а, помимо этого, и другие многочисленные виды бактерий и химические соединения) (с.2 абз.2 описания). Производство включает смешивание компонентов, культивирование на питательных средах в течение определенного времени (описание, с. 2 послед. абз.-с.3 абз.1). Решается задача создания эффективного и экологически чистого, универсального для всех видов почв удобрения, упрощения и удешевления способа его получения. Технический результат заключается:

-в превращении неусвояемых форм калия и фосфора в легкоусвояемую форму;

-фиксировании минерального азота до 30-45%;

-закреплении его в органической форме до 25-32%;

-вырабатывании аминокислоты, микро и макроэлементов;

-обеспечении постоянным питанием с/х культур в течение всего периода вегетации;

-переводе органических остатков растений и животных в минерализат и постоянном улучшении плодородия практически всех почв, в том числе засоленных и загрязненных химическими и промышленными отходами;

-низкой стоимости удобрения при минимальном его расходе на 1 га и значительном повышении урожайности;

-получении экологически чистого урожая сельскохозяйственной продукции, выращенной без применения искусственных минеральных удобрений и химических веществ и обладающей улучшенными вкусовыми качествами и более длительным сроком хранения;

-получении комплексного микробиологического удобрения, основой которого является природная ассоциация микроорганизмов, где впервые отмечено совместное существование аэробных и анаэробных микроорганизмов в симбиозе с различными группами эффективных микроорганизмов, способствующих образованию биологически активных веществ в почве.

Однако данное удобрение требует культивирования множества видов бактерий, что усложняет и удорожает процесс. Кроме того, отсутствуют данные о длительности сроков его хранения без утери активности всех входящих в его состав микроорганизмов.

Из RU 2128914 С1, публ. 20.04.1999, известно получение биопрепарата из бактерий рода Bacillus. Бактерии культивируют при непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде, содержащей пептон ферментативный и минеральные соли. Засев среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста в количестве (1-2)⋅10⁹ кл/мл. Культивирование осуществляют в течение 12-14 ч до достижения максимальных значений биомассы (24-26)⋅10⁹ кл/мл и перехода в споры 70-100% популяции. Культуральную жидкость сливают и добавляют стабилизатор биомассы (гуми - 0,5-2% или сульфит натрия - 2-6%). Получают препарат Фитоспорин в жидком виде. Препарат хранится без лиофильной сушки в течение 6-8 месяцев.

Однако данный препарат содержит бактерии лишь одного вида рода Bacillus, что ограничивает область его применения лишь имеющимися у штаммов активностями.

Известен способ получения биопрепрата из RU 2128915 С1, публ. 20.04.1999, для защиты растений. Бактерии Bacillus subtilis культивируют при непрерывной аэрации в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли и пептон. Засев производят маточной экспоненциальной культурой в количестве (1-2)⋅10⁹ кл/мл. Маточную культуру готовят путем подращивания бактерий посевного материала последовательно в реакторах возрастающих объемов. Объем каждого последующего реактора больше предыдущего в 10 раз. Культуру пересевают в экспоненциальной фазе, разбавляя ее в каждом последующем реакторе в 10 раз, так чтобы посевная доза составляла (1-2)⋅10⁹ кл/мл. В последнем производственном реакторе выращивают культуру в течение 14-16 ч и до достижения максимального количества биомассы и 70-100% перехода вегетативных клеток в споры, после чего отделяют целевой продукт в виде культуральной жидкости. Полученная культуральная жидкость содержит 22-24 млрд. кл/мл (70-100% спор). В нее добавляют стабилизатор биомассы гумми 0,5-2% или сульфит натрия 2-6%. Указанное количество живых колонеобразующих клеток в препарате показано на протяжении 6-8 месяцев.

Однако иногда требуются более длительные сроки хранения биопрепарата, что не может обеспечить данный способ получения. Кроме того, в состав препарата входит лишь один вид Bacillus, что так же ограничивает область его применения.

Джуманиязова и др. (Djumaniyasova G. I Phosphorus mobilizing bacteria and biopreparations on their basis. Dr. of Sci. Dissertation: 03.00.07.-03.00.23. Institut mikrobiologii ANSUZ. Tashkent, 2012. 101 p., in Russian) на основе ассоциации из 3 штаммов фосформобилизирующих бактерий B. megaterium BM-1, B.Polymyxa BP-700, B. subtilis BS-26 также разработано бактериальное удобрение Fosstim-1 для технических культур (хлопчатник, сахарная свекла). Авторы отмечают, что применение этого комплекса на овощных культурах (огурцы и картофель) оказывает стимулирующие действие на развитие корневой системы и способствует накоплению микроклубней стимуляцией развития полезных микробных сообществ в ризосфере, повышающих коэффициент использования вносимых и почвенных запасов.

Это приводит к улучшению корневого питания овощных культур за счет макро- и микроэлементов, повышению урожайности и качества овощной продукции без ущерба для почвенного плодородия. Авторами особо подчеркивается наличие эффективности даже при снижении нормы минеральных удобрений на 50 и 75%.

Однако данный биопрепарат содержит лишь определенные штаммы бактерий, что ограничивает его применение присущими им активностями на определенных овощных культурах.

Известно также бактериальное удобрение, которое содержит клетки штаммов бактерий Bacillus subtilis B-1, Bacillus megaterium BM-1, Azotobacter chroococcum A-2, Pseudomonas putida PP-1, Streptomyces UZGIT-1 (Patent. IAP 04660. Bacterial fertilizer and the way of its acquisition. Davranov K. Uzb, Узбекистан, January 19, 2013). Положительный эффект препарата объясняется наличием в ассоциации микроорганизмов-продуцентов, биологически активных соединений, которые улучшают корневое питание растений, а также оказывают профилактическое влияние на некоторые заболевания растений во время всего вегетационного периода. Однако применение данного препарата ограничено активностями лишь тех штаммов бактерий, которые входят в его состав (см. также Муродова С.С., Давранов К.Д. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике. BIOTECHNOLOGIA ACTA, V. 7, No 6, 2014, с. 92-101).

В качестве прототипа заявляемой технологии получения биопрепарата в жидкой форме рассмотрена публикация ES 2345969 A1 (SERNA CALVO PEDRO VICENTE, ES), публ. 06.10.2010 (реф., пп.1-3 формулы и с.1 описания: перевод Espacenet на англ. на сайте https://worldwide.espacenet.com). Предложен жидкий биопрепарат для защиты растений, используемый путем инъекций в растение (дерево банана) и содержащий, в частности, штаммы видов: Bacillus subtilis и B.megaterium var. рhosphaticum. Целью изобретения является быстрое и эффективное стимулирование роста, цветения и плодоношения растений, в которых он применяется, а также индуцирование активации естественной защиты от болезней. В частности, при выращивании бананов изобретение подходит для значительного ускорения производственного цикла культуры и обеспечения более устойчивой защиты и борьбы с болезнями, которые особенно вредны для с/х культур, которые являются экономически и экологически очень дорогими (болезнь, вызванные грибком Mycosphaerella fijiensis, панамская болезнь, вызванная грибком Fusarium oxysporum и др.).

При получении данного препарата не используют лиофильное высушивание, биопрепарат получают сразу в жидкой форме.

Однако в состав данного известного биопрепарата дополнительно входят экстракты морских водорослей, гидролизованные аминокислоты, грибок Trichoderma viridаe, регулятор роста, комплексное соединение оксида кальция, хелатированные калий, магний и другие микронутриенты для растений (см. реферат прототипа), что удорожает его производство.

Кроме того, известный биопрепарат не обеспечивает целевую концентрацию микробных тел (5-10)⋅10⁹ КОЕ/мл и длительного срока хранения без потери полезных свойств.

В ближайшем аналоге компоненты препарата в определенных %-ных соотношениях добавляют по одному в указанном в публикации порядке в контейнеры, которые имеют герметичное закрытие, емкостью 1 л. В конечном итоге получается 18 л продукта. В процессе заливки различных компонентов необходимо осуществлять небольшое перемешивание, чтобы обеспечить правильное их смешивание.

Как только процесс смешивания будет завершен, все контейнеры будут храниться холодными, в диапазоне температур между 4ºC и 10ºC, чтобы избежать деградации биологических компонентов продукта до момента его использования. А после того, как препарат транспортирован к с/х культуре, где он должен применяться, контейнеры будут распределены между несколькими операторами для того, чтобы осуществить инъекции как можно быстрее, принимая во внимание, что чем меньше времени требуется для применения продукта к деревьям, тем выше полученная эффективность. Инъекции выполняют с помощью полипропиленовых шприцев, аналогичных тем, которые используют в санитарии, с введением иглы в ствол под углом, близким к 45º, и в направлении нижней части ствола и введением продукта в область проводящих волокон растения, после преодоления иглой поверхностных слоев.

Задачами предлагаемого нами изобретения являются:

-получение жидкой формы комбинированного биопрепарата, обладающего широким кругом активности на различных с/х культурах, с высокой целевой концентрацией микробных тел в конечном продукте – не менее 5,0⋅10⁹ КОЕ/мл,

-увеличение срока хранения препарата с сохранением всех его полезных свойств – не менее 1 года,

-удешевление и ускорение процесса производства биопрепарата, по сравнению с ближайшим аналогом, без использования лиофильной сушки, использование процесса производства более производительного, менее длительного и трудоемкого.

Техническими результатами, достигаемыми при получении жидкой формы биопрепарата с помощью предлагаемой нами технологии его производства, являются:

1. Введение в состав культуры B. subtilis дополнительного микроорганизма – Bacillus megaterium var. phosphaticum, помимо обеспечения препарата дополнительной ростостимулирующей и фосфатмобилизующей активностью, повышает его фунгицидную активность и спектр уязвимых фитопатогенов за счет продуцированием Bacillus megaterium var. phosphaticum «второго комплекта» антибиотиков, дополняющего антибиотики, производимые Bacillus subtilis.

2. Использование жидкой формы биопрепарата избавляет от необходимости предварительного растворения сухого порошка перед непосредственным использованием (экономия времени) и снижает риск засорения форсунок опрыскивателя за счет забивания нерастворимыми компонентами.

3. Полунепрерывный режим культивирования (с 50% отливом/доливом бактериальной суспензии каждые 8 ч) позволяет интенсифицировать процесс получения суспензии вегетативных клеток (клетки переходят в спору в процессе исчерпания остаточных элементов питания при хранении бактериальной суспензии).

4. Использование при переходе к полунепрерывному культивированию более богатых полусинтетических питательных сред, обеспечивает получение титра целевых микроорганизмов в (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл.

5. Дополнительное добавление в жидкую бактериальную суспензию компонентов, улучшающих технологические свойства препарата, таких как стабилизаторы биомассы, поверхностно-активные вещества и полимеры-пленкообразователи, обеспечивает повышение качества биопрепарата – увеличивает срок его хранения до 2 лет, улучшает адгезию препарата к обрабатываемым поверхностям, улучшает равномерность обработки гидрофобных поверхностей, таких как листовая поверхность растения.

Для достижения указанных технических результатов предлагается технология производства комбинированного биопрепарата в жидкой форме.

В производстве комбинированных биопрепаратов спорообразующих микроорганизмов по заявленной технологии могут использоваться только те штаммы, которые определены как совместимые друг с другом. Совместимые штаммы в процессе хранения смешанной бактериальной суспензии не подавляют друг друга, что выражается в сохранении достаточно высокого титра обоих видов бактерий на конец срока годности биопрепарата.

В заявляемой технологии используют штаммы Bacillus subtilis Е-161, и Bacillus megaterium var. phosphaticum F-308. Данные штаммы задепонированы (национальное патентное депонирование) 24.12.2019, депозитарий – Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов(БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика, правообладателем штаммов (депозитором) Bacillus subtilis Е-161, и Bacillus megaterium var. phosphaticum F-308 является ООО “ЭКОС”, регистрационные номера ВКПМ: В-13494, В-13497.

Bacillus subtilis шт. Е-161 выделен из тканей здорового растения яровой пшеницы, произрастающей на солонцеватой черноземной почве в Уфимском районе Башкирии. Идентификацию вида бактерий проводили по «Определителю бактерий Берджи» М. Мир, 1997.

Bacillus megaterium F-308 (Bacillus megaterium var. phosphaticum F-308) выделен из выщелоченного чернозема рыхлой целинной почвы Ордынского района Новосибирской области. Идентификацию вида бактерий проводили по «Определителю бактерий Берджи» М. Мир, 1997.

Оба микроорганизма преимущественно являются ростостимуляторами, однако, первый микроорганизм дополнительно обладает ярковыраженным фунгицидным действием, а второй –фосфатмобилизующим.

Для получения упомянутого комбpинированного биопрепарата в жидкой форме применяют способ получения жидкого комбинированного биопрепарата, который включает культивирование бактерий на питательных средах и отличается тем, что используют штаммы бактерий Bacillus subtilis Е-161 и Bacillus megaterium var. phosphaticum F-308, в соотношении, соответственно, от 60:40 до 40:60, которые единовременно культивируют в раздельных ферментерах при одинаковом режиме и составе питательной среды при температуре 29°С, непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде следующего состава: маннит, пептон ферментативный и минеральные соли в концентрациях, г/л:

маннит – 10-15

пептон ферментативный – 5-10

магний сернокислый – 0,5-1,0

калий фосфорнокислый (однозамещенный) – 0,5-1,0

натрий хлористый 0,1-0,2;

при этом засев среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста с концентрацией (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл и осуществляют первоначальное культивирование до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл,

затем с каждого ферментера сливают и утилизируют половину содержимого, после этого объем жидкости в ферментерах доводят до первоначального уровня концентрированной питательной средой – с повышенной концентрацией элементов питания, представляющих собой следующие ингредиенты в ее составе, г/л:

маннит – 30-40

пептон ферментативный – 15-30

магний сернокислый – 1,5-2,0

калий фосфорнокислый (однозамещенный) – 1,5-2,0

натрий хлористый 0,2-0,4;

далее снова запускают культивирование в первоначальном режиме до достижения концентрации клеток в (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл;

затем половину содержимого каждого ферментера сливают в бак-накопитель, а оставшееся содержимое ферментеров доводят концентрированной питательной средой до первоначального объема и цикл культивирования повторяют;

по окончании цикла культивирования полученное содержимое бака-накопителя и ферментеров перемешивают между собой и разливают в контейнеры в качестве готового продукта для использования по назначению.

Перед окончательным перемешиванием в содержимое бака-накопителя могут быть добавлены дополнительные компоненты, улучшающие свойства биопрепарата, г/л:

сульфит натрия – 20-60

поливинилпирролидон – 15-100

50%-ный водный раствор алкилполиглюкозида – 1-10.

При этом, маточной культуры титром (2,0-3,0)⋅10⁹ вносят всего 3 литра на 97 л питательной среды, соответственно, в ферментере сразу после инокуляции титр (2,0-3,0)⋅10⁹/33=0,6-0,9⋅10⁸. Мы культивируем до тех пор, пока титр в ферментере не поднимется до уровня маточной культуры, т.е. чтоб сам ферментер стал как одна большая маточная культура для последующих циклов культивирования.

Технологию осуществляют следующим образом.

Оба штамма указанных видов бактерий рода Bacillus единовременно культивируют в раздельных ферментерах при одинаковом режиме и составе питательной среды. Соотношение штаммов – от 60:40 до 40:60. Культивирование обоих культур ведут при непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде, содержащей пептон ферментативный и минеральные соли (таб. 1).

Таблица 1. Состав первоначальной питательной среды (элементы питания растворяются в водопроводной воде), которую инокулируют маточной культурой.

Компонент	Концентрация (г/л)
Маннит	10-15
Пептон ферментативный	5-10
Магний сернокислый	0,5-1,0
Калий фосфорнокислый (однозамещенный)	0,5-1,0
Натрий хлористый	0,1-0,2
Вода	остальное

Засев первоначальной среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста с концентрацией (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл. Первоначальное культивирование осуществляют в течение 14 ч до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл (поскольку засев маточной культурой, подразумевает то, что 3 литрами бактерий (титр 2,0-3,0⋅10⁹) засевают 97 литров питательной среды (титр которой, очевидно, 0), соответственно, бактерии 3 л маточной культуры распределяются по 100 литрам содержимого ферментера и титр в этот момент содержимого ферментера составляет (2,0-3,0)⋅10⁹/33=0,6-0,9⋅10⁸. Культивацию осуществляют до тех пор, пока титр содержимого ферментера не станет такой же, как в 3 л маточной культуры (посев-урожай).

Затем с каждого ферментера сливается и утилизируется (отход суспензии с низкой концентрацией клеток) половина содержимого, после этого уровень жидкости в ферментерах доводится до первоначального уровня питательной средой с повышенной концентрацией элементов питания (таб. 2) и культивирование запускается заново в первоначальном режиме до достижения концентрации клеток уже в (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл. Это занимает около 8 ч (циклы культивирования могут быть повторены несколько раз – до достижения указанной целевой концентрации микроорганизмов).

Таблица 2. Состав концентрированной питательной среды (с повышенной концентрацией элементов питания), используемой для повторных циклов полунепрерывного культивирования (элементы питания растворяются в водопроводной воде).

Компонент	Концентрация (г/л)
Маннит	30-40
Пептон ферментативный	15-30
Магний сернокислый	1,5-2,0
Калий фосфорнокислый (однозамещенный)	1,5-2,0
Натрий хлористый	0,2-0,4
Вода	остальное

Затем половина содержимого ферментеров также сливается, но уже в бак-накопитель, а содержимое ферментеров снова доводится концентрированной питательной средой до первоначального уровня и цикл культивирования повторяется. По окончании цикла культивирования, в содержимое бака-накопителя добавляют дополнительные компоненты, улучшающие технологические свойства биопрепарата (таб. 3).

Таблица 3. Концентрация дополнительных веществ (вносимых в бак-накопитель со смесью бактериальных суспензий), улучшающих технологические свойства готового продукта - биопрепарата.

Компонент	Концентрация (г/л готового продукта)
Сульфит натрия	20-60
Поливинилпирролидон	15-100
Алкилполиглюкозид в виде 50%-ного водного р-ра	1-10

При добавлении дополнительных веществ в бактериальную суспензию, проценты считаются к этому итоговому раствору (бактериальная суспензия + дополнительные компоненты)

Содержимое бака-накопителя смешивается и разливается в качестве готового продукта в подходящие резервуары, например, пластиковые контейнеры требуемого объема.

Таким образом, поставленная задача решается путем гомогенного глубинного культивирования разных видов бактерий в разных ферментерах в жидкой питательной среде в полунепрерывном режиме с последующим смешением культур в баке-накопителе, добавлении в него технологических добавок (сульфит натрия, поливинилпирролидон, алкилполиглюкозид) и розливом получившейся суспензии в тару.

Для демонстрации достижения упомянутых выше технических результатов изобретения приведены нижеследующие примеры.

В ряде соответствующих опытов указанные штаммы двух видов бактерий рода Bacillus были определены, во-первых, как совместимые друг с другом, что выражается в сохранении относительно высокого титра на протяжении 5-летнего хранения смешанной бактериальной культуры (таб. 4), а во-вторых, как эффективные бактериальные компоненты комплексных биопрепаратов для растениеводства, что выражается в положительном синергическом эффекте от совместного применения данных микроорганизмов на продуктивность обработанных растений и длительное сохранение эффектов, обеспечиваемых биопрепаратом, по сравнению с ранее известными аналогами (таблица 5).

Таблица 4. Динамика титра бактерий Bacillus subtilis и Bacillus megaterium var. phosphaticum в совместной культуре при продолжительном хранении.

Время хранения биопрепарата	Bacillus subtilis шт. Е-161 КОЕ⋅109/мл	Bacillus megaterium var. phosphaticum шт. F-308 КОЕ⋅109/мл
6 месяцев	7,6	5,1
12 месяцев	6,9	4,8
24 месяца	6,0	4,5
60 месяцев	5,1	3,7

Таблица 5. Сравнение качественных характеристик предлагаемого биопрепарата и его аналогов.

Технико-экономические параметры продукта	Экстрасол	Бактофорт	Предлагаемый биопрепарат
Активные компоненты препарата	-Бактерии Bacillus subtilis -Продукты микробного метаболизма и остатки питательной среды	-Бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens -Продукты микробного метаболизма и остатки питательной среды	-Бактерии Bacillus subtilis, Bacillus megatherium var. phosphaticum -Продукты микробного метаболизма и остатки питательной среды -Технологические добавки – стабилизаторы биомассы, полимерные прилипатели
Титр микроорганизмов в продукте на конец срока годности	Не менее 100 млн клеток/мл	Не менее 5 млрд/мл	Не менее 10 млрд/мл
Срок годности	2 года	12 месяцев	5 лет
Функции препарата	-Биофунгицид -Росто-стимулятор	-Биофунгицид -Росто-стимулятор	-Биофунгицид -Росто-стимулятор -Фосфат-мобилизатор
Перечень подавляемых групп патогенов (грибы и др.)	-Семенная инфекция (плесневение семян) -Капельно-семенная инфекция (бактериальные пятнистости) -Почвенно-корневая инфекция (фузариозная гниль, гельминтоспориозная гниль) -Аэрогенно-пылевая листостебельная инфекция (ржавчина, мучнистая роса)	-Почвенно-корневая инфекция (фузариозная гниль, гельминтоспориозная гниль, офиоболезная гниль) -Аэрогенно-пылевая листостебельная инфекция (ржавчина, мучнистая роса) -Воздушно-капельная листостебельная инфекция (фитофтороз, септориоз)	-Семенная инфекция (головня, плесневение семян) -Воздушно-семенная инфекция (церкоспороз) -Капельно-семенная инфекция (пероноспороз, бактериальные пятнистости) -Почвенно-корневая инфекция (фузариозная гниль, гельминтоспориозная гниль, офиоболезная гниль, парша, черная ножка) -Аэрогенно-пылевая листостебельная инфекция (ржавчина, мучнистая роса) -Воздушно-капельная листостебельная инфекция (фитофтороз, антракноз, септориоз)
Эффективность (увеличение урожайности пшеницы)	10-15%	15-20%	20-30%
Нормы применения	1 л/га	1,5 – 10 л/га	1 л/га

Из таблицы 5 следует, что, помимо как таковой эффективности биопрепарата, получаемого по заявляемой технологии, даже без использования дополнительных технологических компонентов, перечисленных в таблице 3, наблюдается еще и небольшой, экономичный объем использования биопрепарата на 1 гектар.

Абсолютная производительность технологии варьирует в зависимости от объемов используемых рабочих ферментеров. При выходе рабочих ферментеров на полунепрерывный режим культивирования (когда начинает использоваться концентрированная питательная среда) их относительная производительность составляет около 50% рабочего объема ферментера за 8 часов в виде бактериальной суспензии с титром (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл. Так как используется концентрированная питательная среда, часть элементов питания далее может использоваться бактериями, что может выражаться в некотором последующем увеличении титра микроорганизмов в процессе хранения.

Эффективное взаимодействие с растениями полученного препарата наблюдается при соотношении в нем указанных штаммов видов B.subtilis к B. megaterium var. рhosphaticum от 60:40 до 40:60 (таб.6). В противном случае эффективного взаимодействия препарата с растениями, с проявлением видов активности, присущей используемым штаммам, не произойдет, и качество препарата будет низким.

Таблица 6.

Активность полученного комбинированного биопрепарата в условиях лабораторного эксперимента на растениях, в зависимости от соотношения компонентов (от «-» - отсутствие активности, до «+++» - выраженная активность):

Соотношение компонентов биопрепарата B.subtilis Е-161/B.megaterium var. phosphaticum F-308	Активность
фунги цидная	антибактери альная	фосфоро литическая	ростостимулирующая
90:10	+++	++	+	++
80:20	+++	++	+	++
70:30	+++	++	++	++
60:40	+++	++	+++	+++
50:50	+++	++	+++	+++
40:60	++	++	+++	+++
30:70	++	++	+++	++
20:80	++	++	+++	++
10:90	+	++	+++	++

При этом среднее содержание (титр) штаммов бактерий, составляющих комбинированный биопрепарат, в конечном продукте при использовании различных питательных сред для культивирования, КОЕ/мл, было следующим (таб.7), что демонстрирует эффективность использования именно предлагаемой последовательности использования двух различных сред (первоначальной и концентрированной), а также диапазонов концентраций их компонентов.

Таблица 7.

Комбинированный препарат с использованием штаммов бактерий:	Питательные среды по заявленной технологии – используют сначала по таб.1, затем по таб.2, применяя компоненты в различных комбинациях и указанных диапазонов их концентраций	Питательная среда – пептонно-кукурузный агар	Питательная среда – мясопептонный агар (МПА)
B.subtilis Е-161 + B.megaterium var.phosphaticum F-308	~8,9⋅109	~3,2⋅109	~2,6⋅109

Таким образом, из таблицы 7 видно, что именно предлагаемая технология полунепрерывного культивирования на предлагаемой полусинтетической питательной среде с указанным диапазоном концентраций их компонентов, приводит к наиболее выраженному повышению целевого числа бактерий в конечном препарате.

Сохранение активности микроорганизмов в биопрепарате на протяжении срока хранения (в % к уровню активности только что полученного препарата) характеризовалось показателями, представленными в таблице 8.

Таблица 8.

Активность, %	6 мес.	1 год	1 г. 6 мес.	2 года	2 г. 6 мес.
фунгицидная	~99,8	~98,6	~98,3	~90,6	~70,2
антибактериальная	~99,5	~98,7	~98,1	~91,8	~64,7
фосфоролитическая	~99,7	~99,1	~98,8	~95,0	~67,6
ускорение роста с/х культур	~80,4	~74,3	~65,3	~60,9	~50,1
увеличение урожайности	~25,3	~23,2	~20,0	~15,4	~10,1

Применение комбинированного препарата при его разработке и получении с помощью заявляемой технологии исследовалось на таких с/х культурах, как различные виды зерновых культур, сахарная свекла, огурцы, капуста белокачанная, морковь, картофель, черная смородина. Эффективные результаты получены на всех видах использованных культур.

Таким образом, результаты лабораторных испытаний показали, что получение заявляемой технологией жидкой формы комбинированного биопрепарата обеспечивает высокий титр полезных микроорганизмов, необходимый для получения качественного комбинированного лечебно-удобрительного биопрепарата для растений даже при его длительном хранении.

Заявляемый способ получения комбинированного биопрепарата для растений не только позволяет получить высокий титр полезных (фунгицидных, бактерицидных, фосфоролитических, ростостимулирующих растения) микроорганизмов, за счет наличия в нем определенных питательных веществ, а также этот эффект обеспечивается одновременным культивированием двух физиологических групп микроорганизмов, которые способны стимулировать рост и развитие друг друга.

1. Способ получения жидкого комбинированного биопрепарата на основе штаммов бактерий рода Bacillus, включающий культивирование бактерий на питательных средах, отличающийся тем, что используют бактерии Bacillus subtilis штамм ВКПМ В-13494 и Bacillus megaterium var. phosphaticum штамм ВКПМ В-13497, в соотношении, соответственно, 60:40 до 40:60, которые единовременно культивируют в раздельных ферментерах при одинаковом режиме и составе питательной среды при температуре 29°С, непрерывной аэрации и перемешивании с частотой вращения мешалки 250-300 об/мин в жидкой питательной среде следующего состава: маннит, пептон ферментативный и минеральные соли в концентрациях, г/л:

маннит	10-15
пептон ферментативный	5-10
магний сернокислый	0,5-1,0
калий фосфорнокислый (однозамещенный)	0,5-1,0
натрий хлористый	0,1-0,2
вода	остальное

при этом засев среды производят маточной культурой в экспоненциальной фазе роста с концентрацией (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл и осуществляют первоначальное культивирование до установления стабильного уровня клеточного титра в бактериальной суспензии (2,0-3,0)⋅10⁹ КОЕ/мл, затем с каждого ферментера сливают и утилизируют половину содержимого, после этого объем жидкости в ферментерах доводят до первоначального уровня питательной средой с повышенной концентрацией элементов питания, представляющих собой следующие ингредиенты в ее составе, г/л:

маннит	30-40
пептон ферментативный	15-30
магний сернокислый	1,5-2,0
калий фосфорнокислый (однозамещенный)	1,5-2,0
натрий хлористый	0,2-0,4
вода	остальное

далее снова запускают культивирование в первоначальном режиме до достижения концентрации клеток в (5,0-10,0)⋅10⁹ КОЕ/мл;

затем половину содержимого каждого ферментера сливают в бак-накопитель, а оставшееся содержимое ферментеров доводят питательной средой с повышенной концентрацией элементов питания до первоначального объема и цикл культивирования повторяют;

по окончании цикла культивирования полученное содержимое бака-накопителя и ферментеров перемешивают между собой и разливают в контейнеры в качестве готового продукта для использования по назначению.

2. Способ по п. 2, отличающийся тем, что дополнительно, перед розливом в контейнеры, в содержимое бака-накопителя могут быть добавлены следующие компоненты, улучшающие свойства биопрепарата, г/л, содержимого бака:

сульфит натрия	20-60
поливинилпирролидон	15-100
50%-ный водный раствор алкилполиглюкозида	1-10