Способ укоренения и адаптации побегов голозерного и пленчатого овса и пшеницы, полученных в культуре in vitro, в асептических условиях на скошенном агаре

Авторы патента:

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2754733:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" (ФИЦ КНЦ СО РАН, КНЦ СО РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ укоренения и адаптации побегов, полученных в культуре in vitro, в асептических условиях на скошенном агаре. В данном способе, включающем культивирование побегов на стерильной агаризованной среде МС с добавлением сахарозы и фитогормонов и последующее постепенное снижение влажности воздуха внутри культурального сосуда с сохранением стерильности среды, укоренение ведут в пробирках на скошенном под углом 30-40° агаре, а адаптацию растений проводят в тех же культуральных сосудах, открытых и наклоненных под углом менее 30 градусов относительно горизонтальной поверхности. Изобретение позволяет ускорить процесс укоренения и адаптации получаемых in vitro побегов.

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для производства посадочного материала методом клонального микроразмножения, а также укоренения и адаптации растений регенерантов, полученных в каллусной культуре.

Известен способ укоренения и адаптации, включающий пересадку микрорастений на стадии пролиферации на вегетирующий мох сфагнум, при этом основание микропобегов предварительно обрабатывают корневином с действующим веществом индолил-3-масляная кислота (ИМК) [RU 2659237, опубл. 29.06.2018]. Использование мха позволяет обеспечить высокую влажность воздушной среды, аэрацию корневой системы за счет пористой структуры моховой подложки, его асептические свойства снижают грибковое поражение побегов.

Существует способ укоренения и адаптации растений голубики, включающий ризогенез на среде Мурасиге-Скуга (МС) с ИМК (8 недель) и последующую высадку на мох сфагнум с культивированием на слое верхового торфа в течение 4 недель [Божидай, Т.Н. Ризогенез и адаптация регенерантов голубики // Плодоводство и виноградарство Юга России. - 2018. - № 49 (1). - С. 162-169].

Недостатком этих способов является необходимость источника и места хранения мха, наличия площади для культивирования мха с побегами.

Наиболее близким способом укоренения и адаптации побегов к предлагаемому является способ укоренения и адаптации in vitro, включающий культивирование их на стерильной агаризованной среде МС с добавлением 20 г/л сахарозы и 0,2 мг/л ИМК в течение 30 суток, с последующей адаптацией в этом же сосуде (10 суток), за счет использования двух слоев пленки: пропускающей влагу и термоусадочной, удаление которой после формирования корневой системы позволяет обеспечить постепенное снижение влажности воздуха с обеспечением сохранения стерильности за счет непроницаемости первой пленки для микроорганизмов. [RU 2279212, опубл. 10.07.2006].

Недостатками данного способа являются необходимость использования двух типов пленок (дополнительные расходы) и длительный период культивирования - 40 дней.

Техническим результатом изобретения является ускорение процессов укоренения и адаптации получаемых in vitro побегов и снижение материальных затрат.

Технический результат достигается тем, что в способе укоренения и адаптации побегов, полученных в культуре in vitro, в асептических условиях на скошенном агаре, включающем культивирование побегов на стерильной агаризованной среде МС с добавлением сахарозы и фитогормонов и последующее постепенное снижение влажности воздуха внутри культурального сосуда с сохранением стерильности среды, новым является то, что укоренение ведут в пробирках на скошенном под углом 30-40° агаре, а адаптацию растений проводят в тех же культуральных сосудах, открытых и наклоненных под углом менее 30 градусов относительно горизонтальной поверхности.

Улучшение аэрированности зоны корнеобразования за счет культивирования проростков на скошенном под углом 30-40 градусов агаре создает условия для формирование корневой системы за 14-21 дней.

Адаптация растений в тех же культуральных сосудах, открытых и наклоненных под углом менее 30 градусов относительно горизонтальной поверхности, обеспечивает сохранение стерильности без использования дополнительных мембран (отсутствует занос микроорганизмов на среду культивирования под действием гравитации) и адаптацию за 7 дней.

Количество сахарозы, а также состав и концентрация фитогормонов подбирается индивидуально для каждого вида растений.

Объектом исследования при разработке способа служили каллусные культуры голозерного и пленчатого овса и пшеницы. Для стимуляции получения каллусов овса использовали среду введения Мурасиге-Скуга с 2,4-Д - 3 мг/л и ИУК - 2 мг/л, для пшеницы - МС с 1 мг/л 2,4-Д. Пролиферацию каллусов овса проводили на средах с 2,4 Д - 1,5 мг/л, пшеницы - 0,5 мг/л. Не образовавшие регенерантов каллусы овса пассировали на среды регенерации, содержащие стимуляторы роста побегов и корней - кинетин (1 мг/л) и индолилуксусную кислоту (0,5 мг/л), пшеницы - содержащую 0,1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАП.

После формирования побегов образцы укореняли и адаптировали следующим способом.

После формирования побегов образцы укореняют и адаптируют на агаризованной среде МС с добавлением 30 г/л сахарозы, кинетина - 0,1 мг/л и ИУК - 5 мг/л на скошенном под углом 30°-40° агаре. Степень развития корневой системы оценивают визуально по заполнению корневой системой свободного пространства в «треугольнике» сбоку от скоса, обычно этот период не превышает 21 день. Угол скоса 30-40° обеспечивает максимальную рабочую поверхность среды, а постепенное высыхание среды культивирования в этих условиях также работает на замедленное снижение влажности надкультуральной атмосферы.

После образования корней в ходе экспозиции в течение 14-21 дней пробирки открывают и помещают в наклонное положение под углом менее 30° относительно горизонтальной поверхности. В таком положении образцы выдерживают в течение 7 дней для адаптации к внешним условиям. В дальнейшем окрепшие регенеранты доращивают до семенного потомства.

Предлагаемый способ укоренения и адаптации побегов, полученных в культуре in vitro, в асептических условиях на скошенном агаре ускоряет процесс укоренения и адаптации получаемых in vitro побегов и обеспечивает снижение материальных затрат.

Способ укоренения и адаптации побегов голозерного и пленчатого овса и пшеницы, полученных в культуре in vitro, в асептических условиях на скошенном агаре, включающий культивирование побегов на стерильной агаризованной среде МС с добавлением сахарозы и фитогормонов и постепенное снижение влажности воздуха внутри культурального сосуда с сохранением стерильности среды, отличающийся тем, что укоренение ведут на скошенном под углом 30-40 градусов агаре, а адаптацию растений проводят в тех же культуральных сосудах, открытых и наклоненных под углом менее 30 градусов относительно горизонтальной поверхности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Заявляемая питательная среда содержит половинную концентрацию растворенных в дистиллированной воде солей по прописи MS: аммоний нитрат, калий нитрат, кальций хлорид, калий дигидрофосфат, магний сульфат, борную кислоту, дигидрат сульфата марганца, кобальт хлорид, пентагидрат сульфата меди, дигидрат молибдата натрия, гептагидрат сульфата цинка, калий иодид, гептагидрат сульфата железа (II), 2-водную динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, витамины пиридоксин и тиамин, а также сахарозу и агар.

Способ размножения in vitro штамбовых сортов малины // 2751250

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий в себя чередование культуральных сред и условий освещения на этапе размножения с использованием разных фитогормонов: 6-Бензиламинопурина, зеатина и 6-Бензиламинопурина и индолилмасляной кислоты; и интенсивности освещения 1500-2000 люкс и 800-1000 люкс.

Питательная среда для размножения на стадии пролиферации крыжовника сорта "розовый-2" // 2751234

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается питательная среда, которая содержит следующие компоненты (мг/л): аммоний азотнокислый 200-360, калий азотнокислый 750-1550, кальций азотнокислый 650-800, магний сернокислый 120-250, калий фосфорнокислый 300-370, борная кислота 6,0-6,4, цинк сернокислый 8,0-9,2, калий йодистый 0,075-0,085, натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03: кобальт хлористый 0,02-0,03, железный(П) комплекс гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты 15,2-60,8, миоинозит 100, тиамин гидрохлорид 0,5, пиродоксин гидрохлорид 0,5, никотинамид 0,5; глицин 1000, 6-бензиламинопурин 0,3, сахароза 30000, агар 6000, остальное вода до 1 л.

Способ мультипликации подвойного материала л-2 в условиях in vitro // 2749614

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения подвойного материала (Л-2) в условиях in vitro, черенкование пробирочных растений и высадку одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу, при этом в питательную среду добавляют высокую концентрацию солей (Хелат - Fe 50 мг/л и Ca(NO3)2 1000 мг/л) и для растительной активности растения пересаживают на питательную среду содержанием 1 мг 6 БАП и 0,05 г/л янтарной кислоты, при этом концентрация микросолей: ZnSO4*7H2O - 4.3 мг/л и Н3ВО3 - 3.1 мг/л, источник кальция тоже изменен в форме (от CaCl2*2H2O на Ca(NO3)2*4H2O), пересадку проводят через 3 недели, при размножении особое внимание уделяют стекловидности или сверховодненности тканей, при этом оптимальными условиями культивирования Л-2 являются: температура 22-26 градусов, освещенность 2500-5000 лк, при 16-часовом фотопериоде.

Генетический локус, ассоциированный с гнилью корня и стебля, обусловленной phytophthora, у сои // 2748688

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу идентификации растения сои, которое проявляет повышенную устойчивость к гнили корня и стебля, обусловленной Phytophthora (PRSR). Также раскрыт способ селекции с помощью маркера.

Способ получения посадочного материала хризантемы в условиях in vitro // 2743967

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов из язычковых цветков хризантем in vitro, предназначенный для культивирования in vitro язычковых цветков растений хризантемы, и может быть использовано для массового получения генетически однородного посадочного материала ценных сортов и гибридов хризантем, где в качестве первичного экспланта используют язычковые цветки, которые культивируют на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасиге и Скуга, а также гормоны 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л и препарат Аминовен 15%-ный в концентрации 3 мл/л.

Способ клонального микроразмножения флокса метельчатого // 2743966

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ, включающий высадку микрорастений на питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга (MS) с минеральными солями для этапа пролиферации, дополнительно в питательную среду добавляют препараты кинетин (0,1 мг/л) и ИМК (0,1 мг/л) и микрорастения в течение 50-60 дней инкубируют в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-часовом фотопериоде и температуре 20-22°С.

Способ длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной // 2743965

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии растений, и может быть использован для длительного беспересадочного хранения микрорастений малины ремонтантной.

Способ получения растений-регенерантов рода brassica in vitro // 2741647

Способ относится к биотехнологии и может быть использован для получения нового исходного материала для создания сортов. Способ включает изолирование соцветий и культивирование пыльников и завязей на питательной среде.

Способ снижения витрификации микрорастений ореха грецкого в культуре in vitro // 2735622

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ снижения витрификации микрорастений ореха грецкого в культуре in vitro.

Способ получения микрорастений лекарственного растения stephania glabra (roxb.) miers // 2757318

Изобретение относится к области биотехнологии растений, предполагает использование метода культуры растительной ткани для микроклонального размножения лекарственного вида Stephania glabra. Способ осуществляют следующим образом: из первичного экспланта на жидкой питательной среде культивируют гетерогенную культуру, после чего полученную гетерогенную клеточную культуру культивируют на питательной среде для образования соматических зародышей с последующим формированием из полученных соматических зародышей микрорастений на питательной безгормональной твердой среде. В качестве первичного экспланта используют молодые листья растения Stephania glabra, которые предварительно стерилизуют в ламинарном боксе в 0,1-0,2% растворе диацида в течение 3-5 минут и после тщательной промывки в 5-ти сменах стерильной воды культивируют не менее 3-х пассажей на питательной среде для получения гетерогенной культуры на орбитальной качалке с 14-суточными интервалами в темноте при температуре 25°C и относительной влажности 50-70%. Жидкую питательную среду для получения гетерогенной культуры (W2,4D жидкая) готовят на основе макро- и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга с уменьшенным содержанием нитрата аммония (NH4NO3) до 400 мг/л. В результате, она содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH4NO3, 1900 - KNO3, 170 - KH2PO4, 440 - CaCl2 2H2O, 370 - MgSO4 7H2O, 37,3 - Na2EDTA 2H2O, 27,8 – FeSO4 7H2O, 6,2 - H3BO3, 22,3 - MnSO4 4H2O, 0,025 - CuSO4 5H2O, 0,025 - CoCl2 2H2O, 8,6 - ZnSO4 7H2O, 0,25 - Na2MoO4 2H2O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 – никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 – сахароза и 0,5 - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота. В качестве питательной среды для образования соматических зародышей используют питательную среду, которая содержит, мг/л, соответственно: 400 - NH4NO3, 1900 - KNO3,, 170 - KH2PO4, 440 - CaCl2 2H2O, 370 - MgSO4 7H2O, 37,3 - Na2EDTA 2H2O, 27,8 – FeSO4 7H2O, 6,2 - H3BO3, 22,3 - MnSO4 4H2O, 0,025 - CuSO4 5H2O, 0,025 - CoCl2 2H2O, 8,6 - ZnSO4 7H2O, 0,25 - Na2MoO4 2H2O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 - тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 0,5 - 6-бензиламинопурин и 2,0 - α-нафтилуксусная кислота, культивирование ведут не менее 2-х пассажей с 20-суточными интервалами на орбитальном шейкере в темноте при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 50-70%. Затем сформированные соматические зародыши для доращивания и регенерации полноценных микрорастений в количестве 30-50 штук на колбу помещают в 100 мл колбы Эрленмейерана на безгормональную твердую питательную среду и доращивают на свету в течение не менее 4-х недель (Фиг. Б) до формирования отдельных микрорастений, при этом безгормональная твердая питательная среда включает, мг/л, соответственно: 400 - NH4NO3, 1900 - KNO3, 170 - KH2PO4, 440 - CaCl2 2H2O, 370 - MgSO4 7H2O, 37,3 - Na2EDTA 2H2O, 27,8 – FeSO4 7H2O, 6,2 - H3BO3, 22,3 - MnSO4 4H2O, 0,025 - CuSO4 5H2O, 0,025 - CoCl2 2H2O, 8,6 - ZnSO4 7H2O, 0,25 - Na2MoO4 2H2O, 0,83 – KI, 100 - мезоинозит, 100 – пептон, 0,5 - никотиновая кислота, 0,5 - пиридоксин гидрохлорид, 0,2 – тиамин гидрохлорид, 1 - цистеин, 25000 - сахароза, 7000 – агар. В заявленном способе весь процесс от этапа получения первичного каллуса из листового экспланта до высадки сформированных микрорастений в грунт занимает не более 21-24 недели, включает в себя смену трех вариантов питательных сред: индукционную (W2,4D (жидкая)), морфогенную (WB/А (жидкая)) и безгормональную (W0 (твердая)), что более чем в 3 раза ускоряет процесс получения микрорастений и значительно сокращает трудозатраты, кроме того, обеспечивает стабильное формирование микрорастений S. glabra за счет сохранения эмбриогенности клеточных культур на всем протяжении технологического процесса. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 ил.