Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (brassica oleracea l.) в культуре изолированных микроспор

Авторы патента:

Синицина Анастасия Александровна (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2769815:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева" (ФГБОУ ВО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева) (RU)

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использован для снижения трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор. Способ, характеризующийся тем, что выделение и очистку микроспор осуществляют с использованием 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8), инициирующий стресс оказывают инкубированием выделенных и очищенных микроспор в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) в темноте при температуре 32,5±0,1°С в течение 48 часов, после воздействия инициирующего стресса раствор сахарозы заменяют на питательную среду NLN-13 (рН 5,8), затем определяют плотность суспензии микроспор, доводят ее до 4×10⁴ микроспор/мл и инкубируют до формирования эмбриоидов в климатической комнате. Изобретение позволяет снизить трудоемкость получения удвоенных гаплоидов капусты с сохранением частоты эмбриогенеза микроспор на уровне стандартного протокола. 1 табл.

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для снижения трудозатрат и себестоимости при производстве удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (B. oleracea L.) в культуре изолированных микроспор.

Известные способы получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор у капусты белокочанной (Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z, Romanian Biotechnological Letters, 2013, 18, pp. 8677-8684, DOI - нет). Использование питательной среды на этапе выделения, очистки и индукции эмбриогенеза делает технологию более дорогой.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому решению является технология производства эмбриоидов Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z. Выделение микроспор из пыльников проводят в охлажденной до 4°С питательной среде В5 (Gamborg et al., 1968) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры очищают фильтрованием через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратным центрифугированием суспензии микроспор при 4°С, 1000 оборотов/мин. в течение трех минут, заменяя питательную среду на свежую после каждого цикла. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендируют в 2 мл охлажденной до 4°С среды NLN-13 (Lichter, 1982) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. Плотность микроспор определяют в камере Фукса-Розенталя и средой NLN-13 с добавлением 130 г/л сахарозы и рН 5,8 доводят плотность микроспор в суспензии до 4×10⁴ микроспор/мл. Суспензию микроспор разливают в чашки Петри диаметром 60 мм по 3 мл. Чашки Петри с суспензией микроспор инкубируют в темноте в течение 72 ч. при 32±0,1°С, или 24 ч. при 32±0,1°С, затем температуру снижают до 25±1°С и продолжают инкубировать в темноте до появления эмбриоидов.

Использование питательной среды NLN-13 для выделения и очистки микроспор делает технологию производства удвоенных гаплоидов более трудоемкой и дорогостоящей, так как используется холодная фильтр-стерилизация питательной среды. Выделение и очистка микроспор с использованием питательной среды В5 с добавлением маннитола менее трудоемко и менее затратно, чем использование среды NLN-13, так как для ее стерилизации используется автоклавирование и не требуется использование дорогостоящих одноразовых стерильных фильтров и шприцов. В среднем выделение и очистка микроспор одного образца с использованием питательной среды В5 (Gamborg et al., 1968) обходится в 33-35 рублей, с использованием питательной среды NLN-13 - 37-40 руб., с использованием 13%-ного раствора сахарозы - 13-15 руб., таким образом снижение себестоимости выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза может составить 60-65%.

Технический результат предлагаемого изобретения - снижение трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты при снижении себестоимости процесса с сохранением частоты эмбриогенеза микроспор на уровне стандартного протокола.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной выделение и очистку микроспор осуществляют в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, индукцию эмбриогенеза осуществляют в условиях инициирующего стресса в темноте при температуре 32,5±0,1°С, инкубируя микроспоры в течение 48 часов в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, после воздействия инициирующего стресса питательную среду заменяют на питательную среду NLN-13, рН 5,8, затем определяют плотность микроспор, доводят ее до 4×10⁴ микроспор/мл и инкубируют в темноте до образования эмбриоидов при 25±1°С в климатической комнате.

В предложенном способе выделение, очистка микроспор и индукция эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной проводится в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, что снижает себестоимость данных этапов технологии на 70-75% и не оказывает негативного влияния на частоту эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются выделение и очистка микроспор с использованием 13% раствора сахарозы, индукция эмбриогенеза в 13% растворе сахарозы в условиях стандартного инициирующего стресса в течение 48 часов при 32,5±0,5°С.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1

Микроспоры 7 генотипов капусты белокочанной выделяли в охлажденном до 4°С 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры фильтровали через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратно центрифугировали суспензию микроспор при 4°С, 800 об/мин в течение четырех минут, заменяя раствор сахарозы на свежий после каждого цикла центрифугирования. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендировали в пробирках объемом 15 мл в 10 мл 13% раствора сахарозы (рН 5,8) после чего инкубировали микроспоры в 13%) растворе сахарозы в темноте при температуре 32,5±0,5°С в течение 48 часов. После этого микроспоры в пробирках осаждали центрифугированием в течение 4 минут при 800 оборотов/мин., сливали надосадочную жидкость и добавляли 2 мл свежей питательной среды NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы (рН 5,8), в которой ресуспендировали микроспоры. С помощью камеры Фукса-Розенталя определяли плотность микроспор в суспензии и доводили плотность до 4×10⁴ микроспор/мл, питательной средой NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы, рН 5,8. Далее суспензию микроспор разливали по чашкам Петри диаметром 60 мм по 3 мл в каждую, и инкубировали микроспоры в климатической комнате в темноте при 25±1°С до образования эмбриоидов.

Описанным выше способом были произведены эмбриоиды у следующих генотипов/образцов капусты белокочанной № 1 с, № 2 с, № 3 с, № 4 с и № 5 с.

В таблице 1 представлена частота эмбриогенеза микроспор (число эмбриоидов в 1 мл питательной среды) образцов капусты белокочанной (B. oleracea L.): 1) при использовании питательной среды В5 (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза микроспор в питательной среде NLN-13 (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час (контроль); 2) при использовании 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час.

По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет снизить затраты этапов выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза микроспор на 63% за счет замены дорогостоящих питательных сред 13%-ном раствором сахарозы.

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор, включающий выделение микроспор из пыльников, их очистку, определение плотности суспензии микроспор, доведение ее до 4×10⁴ микроспор/мл, инициацию эмбриогенеза и последующее инкубирование в темноте до появления эмбриоидов, отличающийся тем, что выделение и очистку микроспор осуществляют в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, индукцию эмбриогенеза осуществляют в условиях инициирующего стресса в темноте при температуре 32,5±0,1°С, инкубируя микроспоры в течение 48 часов в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, после воздействия инициирующего стресса раствор сахарозы заменяют на питательную среду NLN-13, рН 5,8, определяют плотность микроспор, доводят ее до 4×10⁴ микроспор/мл и инкубируют в темноте до образования эмбриоидов при 25±1°С в климатической комнате.

Изобретение относится к области биотехнологии. Клубнепочки гладиолуса гибридного подвергают двухэтапной стерилизации.

Способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro // 2764104

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ формирования коллекции и длительного депонирования винограда in vitro, относится к сельскому хозяйству, в частности к виноградарству, и может быть использован для длительного хранения ценных и редких сортов винограда в коллекции in vitro.

Способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro // 2762979

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что у укорененных микрорастений в период с начала августа по февраль месяц, с периодичностью 1-1,5 месяца полностью удаляют сформировавшиеся и начинающие отмирать корни и листья, а их в виде вегетирующих почек высаживают повторно и дифференцированно на питательные среды, содержащие ауксин, учитывая при этом диаметр почки.

Способ клонального микроразмножения бельвалии сарматской (bellevalia sarmatica (pall. ex georgi) woronow) // 2762417

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения растений бельвалии сарматской В.

Способ стимулирования образования и развития микроклубней картофеля в условиях in vitro // 2762416

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению микроклубней от размножаемых и культивируемых в условиях in vitro растений картофеля. Изобретение представляет собой способ стимулирования образования микроклубней картофеля в условиях in vitro, характеризующийся тем, что микрочеренки после высадки на питательную среду выдерживают в темноте при +4…+5°С в течение 5 суток для максимальной синхронизации митотических делений, а затем культивируют в течение 10 суток при +24…+25°С и воздействии искусственным светом с интенсивностью спектральных линий 70-310 мВт/м2 в диапазоне длин волн 640-670 нм при уровне освещенности 2400-2600 лк, после чего данный цикл повторяют еще дважды.

Способ культивирования растений винограда в коллекции in vitro // 2760944

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ сохранения микрорастений винограда в условиях in vitro, включающий культивирование растений на безгормональной среде в разных режимах и в разных физиологических состояниях, перевод растений в состояние глубокого покоя моделируется на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода и температуры, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур (2-4°С) в темноте без пересадок в течение одного-двух лет.

Питательная среда для размножения in vitro косточковой культуры вц-13 (вишня) на стадии ризогенеза // 2760740

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагается питательная среда, содержащая (мг/л): неорганические соединения из группы: аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, борная кислота, калий йодистый, а также комплексы марганца (II), цинка(II), молибдена (VI), меди(П), кобальта(П) с оксиэтилидендифосфоновой кислотой (ОЭДФ), комплекс железа (III) с трилоном Б, и органическую составляющую, включающую миоинозит, тиамин гидрохлорид, пиродоксин гидрохлорид, никотинамид, индолилмасляную кислоту, при следующем весовом соотношении компонентов смеси, мг/л: аммоний азотнокислый 825.0, калий азотнокислый 950.0, кальций хлористый 220.0, магний сернокислый 185.0, калий фосфорнокислый 85.0, борную кислоту 6.2, калий йодистый 0.83, комплексы микроэлементов с оксиэтилидендифосфоновой кислотой: железный(III) 24.5- 27.6, марганцевый 26.4-29.3, цинковый 8.2- 9.1, молибденовокислый 0.33-0.37, медный 0.027-0.030, кобальтовый 0.029 -0.032, а также органическую составляющую, включающую миоинозит 0.5, тиамин гидрохлорид 0.5, пиродоксин гидрохлорид 0.5, индолилмасляную кислоту 0.2, сахарозу 15000, агар-агар 6000 и остальное - вода до 1 л.

Способ стимуляции прорастания микроклубней картофеля in vitro с помощью ультразвука без нарушения стерильности // 2760213

Изобретение относится к области биотехнологии. В способе стерильные микроклубни картофеля в стерильных условиях разрезают на две равные части, помещают в жидкую среду MS (Мурасиге-Скуга) в стерильную трубчатую насадку, обеспечивающую объемное облучение, и обрабатывают ультразвуком мощностью 2,7-8,0 Вт/см2 в течение 10-120 секунд.

Способ получения растений-регенерантов brassica oleracea l. in vitro // 2759735

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов Brassica oleracea L.

Способ повышения эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов рододендрона // 2759451

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона, включающий культивирование одноузловых эксплантов, представляющих собой части микропобегов, содержащие одну пазушную почку, на питательной среде, дополненной 0,25 мкМ ТДЗ, в течение 8 недель, с последующим культивированием 6 недель на безгормональной среде.

Способ введения в культуру in vitro, получения каллусов и растений-регенерантов вздутоплодника сибирского (phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol.), с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов // 2771960

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к области введения в культуру in vitro, получения каллусных культур и растений-регенерантов на твердых агаризованых средах, с использованием в качестве первичных эксплантов вегетативных и генеративных органов Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol. Изобретение представляет собой способ, включающий установление оптимальных условий стерилизации первичных эксплантов, определение потенциала каллусообразования различных органов и тканей в зависимости от типа эксплантов и среды культивирования, способствующей индукции каллусогенеза, морфогенеза и органогенеза. Время жизни каллусов вне зависимости от первичного типа экспланта составляет около 45 суток. Цвет каллуса имеет различную окраску: светло-желтый, светло-зеленый, светло-зеленый с фиолетовыми вкраплениями, фиолетовый. По мере отмирания каллус приобретает коричневую окраску. По консистенции морфогенные каллусные культуры рыхлые, плотные, глобулярные. Органогенез наблюдается на средах Мурасиге-Скуга с широким диапазоном концентраций (0.1–2.0 мг/мл) фитогормонов и их сочетаний (нафтилуксусная кислота, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота, индолилуксусная кислота, индоли-3-масляная кислота (ИМК), кроме 6-бензиламинопурина, добавление которого вызывает индукцию каллусогенеза. Укоренение побегов целесообразно проводить с использованием среды, содержащей ИМК, ускоренного размножения вздутоплодника сибирского в условиях in vitro. Изобретение позволяет использовать в качестве эксплантов соцветия, оберточные листы, корень, позволяющие вне зависимости от сезона года получать растения-регенеранты редкого лекарственного вида. 4 ил.