Способ создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма



Способ создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма
Способ создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма

Владельцы патента RU 2770558:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) (RU)

Изобретение относится к медицине и касается способа создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма, включающего приготовление биочернил, которые получают непосредственно перед процессом 3D-биопечати, и далее используют для создания тканеинженерной конструкции, где биочернила включают в себя следующие компоненты: коллаген, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и порошок децеллюляризованного внеклеточного матрикса (дВКМ), причем дВКМ получали из реберных хрящей самок крыс, которые подвергали децеллюляризации и лиофилизации, полученный порошок просеивают через сито и до использования хранят при +4°С, при приготовлении биочернил используют стерильный ателоколлаген свиньи I типа, который смешивают с МСК, с буферным раствором и порошком дВКМ, далее скаффолд печатают и заливают теплой питательной средой, после чего проводят процесс инкубации в CO2-инкубаторе. Изобретение обеспечивает создание тканеинженерных конструкций, воссоздающих клеточное строение и функцию заменяемой хрящевой ткани, а также высокую точность создания тканеинженерной конструкции посредством 3D-биопечати. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к тканевой инженерии и 3D-биопечати, может быть использовано для создания тканеинженерных конструкций (скаффолдов).

3D-биопечать – перспективная технология изготовления тканевых конструкций сложной внешней геометрии и/или внутренней структуры, со строго определенными механическими свойствами,с персонализированным составом. Основным компонентом в 3D-биопечати являются биочернила, которые представляют собой биоматериал в форме гидрогеля, содержащим определенное количество и типы клеток. Биочернила должны обладать такими биологическими характеристиками как биосовместимость, цитосовместимость, биодеградация с контролируемой скоростью, близкой к скорости регенерации замещаемой ткани. Приготовление биочернил осуществляется с использованием различных природных и синтетических материалов и их комбинаций, таких как коллаген, желатин, агароза, фиброин шёлка, альгинат и т.д.Однако большинство этих материалов не способно воссоздать микроокружение, типичное для живых тканей, внутреннюю клеточную морфологию и функции.

Идеальным образцом такого материала может являться основа самой целевой ткани – ее внеклеточный матрикс (ВКМ). Состав ВКМ каждой ткани уникален. Он представлен сложной сетью компонентов, основными из которых являются волокнообразующие белки, такие как коллагены, эластин, фибронектин, ламинины, гликопротеины, протеогликаны и гликозаминогликаны [Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016, 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001.].ВКМ регулирует многие клеточные процессы, включая рост, миграцию, дифференцировку, гомеостаз и морфогенез [K.C. Clause, T.H. Barker. Extracellular matrix signaling in morphogenesis and repair. Curr. Opin. Biotechnol.,2013,24: 830-833; Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016; 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001.]. Он является основным источником и проводником биохимических и биомеханических сигналов, для обеспечения организации и функционирования ткани в целом [Herrera J, Henke CA, Bitterman PB. Extracellular matrix as a driver of progressive fibrosis. J Clin Invest. 2018, 128(1): 45-53. DOI: 10.1172/JCI93557.], обеспечивая физико-механическое микроокружение клеток [Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016, 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001].

В последнее время появляются данные о применении гидрогелей на основе децеллюляризованного ВМК (дВКМ) в биопечати. Биочернила на основе дВКМ изначально обладают тканеспецифичными свойствами.

Однако использование дВКМв форме гидрогеля ограничено слабыми механическими свойствами получаемых тканеинженерных конструкций и низкой точностью самого процесса печати.

Известен вариант создания биочернил на основе фибринового геля с добавлением микрочастиц дВКМ для реконструкции роговицы глаза.[H. Yin, Q. Lu, X Wang, et al. Tissue-derived microparticles reduce inflammation and fibrosis in cornea wounds. Acta Biomater. 2019, 85:192-202. doi: 10.1016/j.actbio.2018.12.027; A Chandru, P Agrawal , SK Ojha , et al. Human Cadaveric Donor Cornea Derived Extra Cellular Matrix Microparticles for Minimally Invasive Healing/Regeneration of Corneal Wounds Biomolecules 2021, 11(4). 10.3390/biom11040532].В данных работах гидрогель применяли без 3D-биопечати.

Недостатком представленных выше способов является неприменимость данных гидрогелей для биопечати из-за реологических свойств гидрогелей.

Наиболее близким к заявляемому изобретению(прототип) является способ применения биочернил представленный в работе M. Kimetal. [Kim MK, Jeong W, Lee SM, et al. Decellularized extracellular matrix-based bio-ink with enhanced 3D printability and mechanical properties. Biofabrication 2020; 12: 025003], где дВКМ использовали в виде микрочастиц в составе желатинового гидрогеля (гиалуроновая кислота 3 мг/мл + желатин 37,5 мг/мл + фибриноген 3мг/мл). Полученные формуляции биочернил исследовали на цитосовместимость в условиях in vitro. Данное исследование в первую очередь направлено на создание биочернил, которые могут исправить дефекты печени, для исправления дефектов хрящевой ткани они не могут быть применимы.

Техническим результатом является создание тканеинженерных конструкций, воссоздающие клеточное строение и функцию заменяемой хрящевой ткани, а также обеспечение высокой точность создания тканеинженерной конструкции посредством 3D-биопечати

Технический результат решается тем, что так же, как и в известном способе приготавливают биочернила, которые получают непосредственно перед процессом 3D-биопечати и осуществляют биопечать тканеинженерной конструкции, способной воссоздать клеточное строение и функцию заменяемой ткани, экструзионной насадкой.

Особенностью заявляемого способа является то, что биочернила включают в себя следующие компоненты: коллаген, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и порошок децеллюляризованного внеклеточного матрикса (дВКМ), причем дВКМ получали из реберных хрящей самок крыс линии Wistar, которые подвергали децеллюляризации и лиофилизации, полученный порошок просеивают через сито с диаметром пор 280 мкм и до использования хранят при +4°С, при приготовлении биочернил с концентрацией коллагена 4% используют стерильный ателоколлаген свиньи I типа – 80 мг/мл, который смешивают с МСК – 5×106 в мл, с буферным раствором – 250 мкл на мл и порошком дВКМ – 25 мг/мл, далее скаффолд печатают изаливают теплой питательной средой t37°C, после чего проводят процесс инкубации при 37°C в CO2-инкубаторе.

Изобретение поясняется подробным описанием, примерами использования и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 – Тестовая печать для оценки печатопригодности биочернил (схематическое изображение напечатанного объекта).

Фиг. 2 – Скаффолд через 1 неделю после имплантации, об. ×10.

Фиг. 3 – Формирование хрящевой ткани через 2 недели после имплантации, об. ×10.

Способ осуществляют следующим образом.

Для создания тканеинженерных конструкций используют коллагеновый гидрогель, порошкообразный ВКМ и культуру МСК. Порошкообразный ВКМ представлен в виде сухих лиофилизированных гранул, их диаметр не превышает диаметр сопла биопринтера. При необходимости клеточных факторов роста, их добавление в биочернила осуществляют на этапе смешивания. Печать производят на лабораторную культуральную посуду (например, чашки Петри, луночные планшеты) или на стекло, находящиеся сверху печатного столика. После процесса биопечати скаффолд заливают теплой питательной средой (от 25 до 37°C), например, RPMI-1640, DMEM, F-12.Процесс инкубации проводят при 37°C в CO2-инкубаторе. Замену среды в процессе инкубации производят один раз в сутки.

Для оценки печатопригодности биочернил на основе 4% коллагена и порошка дВКМ была проведена печать в тестовом режиме (Фиг.1), после которой появляется возможность оценки толщины линии (3 слоев филамента) в 12 местах и площади формируемых ниш в 8 местах (указывает на продолжающийся процесс полимеризации). Оба параметра оценивали в динамике: сразу после печати и через 24 часовой инкубации в буферном растворе PBS. Данные по биочернилам и гидрогелю на основе коллагена (без дВКМ) представлены в табл.1.

Таблица 1

Результаты тестовой печати биочернилами на основе 4% коллагена с и без гранул дВКМ

Коллаген Коллаген + дВКМ
X±Sx [доверительный интервал]
После печати После инкубации После печати После инкубации
Ниши, мм2 1,516±0,125
[1,427÷1,605]
1,411±0,103
[1,338÷1,485]
1,286±0,126
[1,195÷1,376]
1,097±0,094
[1,030÷1,164]
Линии, мм 0,886±0,017
[0,874÷0,898]
0,901±0,027
[0,882÷0,920]
0,920±0,036
[0,894÷0,946]
0,957±0,027
[0,938÷0,976]

Пример создания тканеинженерной конструкции in vivo для создания полноценной ткани de novo.

ВКМ получали из реберных хрящей крыс линии Wistar, самок, возрастом от 1 до 1,5 месяцев, которые предварительно обрабатывали, децеллюляризировали и лиофилизировали. Лиофилизированный хрящ размалывали пестиком в ступке. Полученный порошок просеивали через сито из нержавеющей стали с диаметром пор 280 мкм и до использования хранили в герметичной упаковке при +4°С. Для приготовления биочернил с концентрацией коллагена 4% использовали стерильный ателоколлаген свиньи I типа – 80 мг/мл, который смешивали с МСК – 5×106 в мл, буферным раствором трис-HCl – 250 мкл на мл, порошком дВКМ – 25 мг/мл. После приготовления бичернил осуществляли биопечать скаффолда. Скаффолд залили теплой (37°C) питательной средой DMEM. Далеев CO2-инкубаторе провели процесс инкубации при 37°C.

Скаффолды были имплантированы беспородным белым крысам-самцам. Через 1 и 2 недели животных подвергли эвтаназии и отбирали материал для гистологического исследования. Через одну неделю после имплантации вокруг скаффолдов была сформирована соединительнотканная капсула, которая прорастала в коллаген, разделяя его на отдельные фрагменты, клетки располагались неравномерно, в отдельных участках скаффолдов сформировалась хрящевая ткань (Фиг. 2). Между пучками коллагена волокон также визуализировались клетки соединительной ткани. Через две недели после имплантации у животных скаффолды замещались вновь образованной хрящевой тканью (Фиг.3).

Предложенный способ позволяет создавать тканеинженерные конструкции, воссоздающие клеточное строение и функцию заменяемой хрящевой ткани.

Способ создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма, включающий приготовление биочернил, которые получают непосредственно перед процессом 3D-биопечати, и далее используют для создания тканеинженерной конструкции, отличающийся тем, что биочернила включают в себя следующие компоненты: коллаген, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и порошок децеллюляризованного внеклеточного матрикса (дВКМ), причем дВКМ получали из реберных хрящей самок крыс линии Wistar, которые подвергали децеллюляризации и лиофилизации, полученный порошок просеивают через сито с диаметром пор 280 мкм и до использования хранят при +4°С, при приготовлении биочернил с концентрацией коллагена 4% используют стерильный ателоколлаген свиньи I типа – 80 мг/мл, который смешивают с МСК – 5×106 в мл, с буферным раствором – 250 мкл на мл и порошком дВКМ – 25 мг/мл, далее скаффолд печатают и заливают теплой питательной средой t 37°C, после чего проводят процесс инкубации при 37°C в CO2-инкубаторе.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к комплексу, содержащему полмакоксиб и трамадол. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции и лекарственному средству или анальгетическому средству, каждый из которых содержит два типа активных ингредиентов, полмакоксиб и трамадол, и, более конкретно, к действию и применениям активных ингредиентов в лекарственном средстве или анальгетическом средстве для лечения умеренной острой и хронической боли, вызываемой воспалительными и множественными факторами.

Изобретение относится к восстановительной медицине, в частности к лечебной физкультуре, и касается применения биологически пищевой добавки, улучшающей координацию опорно-двигательного аппарата человека при ожирении 2 степени. Биологически пищевая добавка содержит оксиэтиламмония метилфеноксиацетат, бета-каротин, альфа-токоферол, чеснок и лактозу.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и может быть использовано для хирургического замещения полнослойных костно-хрящевых дефектов суставной поверхности таранной кости у пациентов с хондропатией и асептическим некрозом. В предоперационном периоде определяют методом магнитно-резонансной томографии локализацию, площадь поражения суставной поверхности и глубину поражения субхондральной кости, выполняют забор венозной крови пациента для приготовления аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы, на основе которой интраоперационно изготавливают фибриновый гель с клеющей способностью.

Изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения патологического состояния у пациента, обусловленного наличием образуемых из кислорода свободных радикалов. Фармацевтическая композиция образована путем объединения смешанного комплексного соединения с металлами соединения формулы I или его соли, с одним или более физиологически приемлемыми эксципиентами, где по меньшей мере один эксципиент выбран из группы, состоящей из стабилизаторов, антиоксидантов, средств регуляции осмоляльности, буферов, средств регуляции pH, связывающих средств и наполнителей, где смешанные металлы включают кальций и марганец.
Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии. Предложенная система внешней фиксации из биосовместимого композиционного полимерного материала для чрескостного остеосинтеза характеризуется тем, что элементы конструкции изготовлены из биосовместимого композиционного полимерного материала на основе полиэфирного компаунда, включающего полиэтилентерефталат с содержанием поликарбоната от 12 до 24 масс.

Изобретение относится к медицине, а именно травматологии и ортопедии, и может быть использовано для лечения несращений длинных костей, сопровождающихся дефектами костной ткани. Из латерального доступа длиной 10,0 см и медиального доступа длиной 8,0 см в области средней и нижней трети бедра выделяют из рубцовой ткани отломки бедренной кости.
Группа изобретений относится к области медицины, а именно ветеринарии, и предназначена для лечения и профилактики инфекционных заболеваний копыт животных. Предложена водная бактерицидная композиция для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний копыт у животных на основе соли меди, которая содержит следующее соотношение компонентов, мас.

Изобретение относится к области медицины. Предложена композиция биорезорбируемого 3D-матрикса для восстановления дефектов костной ткани.

Изобретение относится к области медицины, в частности к травматологии и ортопедии. Для лечения частичных повреждений передней крестообразной связки у пациентов выполняют артроскопию в водной среде при давлении 60-80 Па.
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к лечебной физкультуре, и касается применения биологически активной пищевой добавки, содержащей оксиэтиламмония метилфеноксиацетат, бета-каротин, альфа-токоферол, чеснок и лактозу, для улучшения координации опорно-двигательного аппарата человека с ожирением 1 степени.

Изобретение относится к ортопедическому имплантату. Ортопедический имплантат содержит металлическую поверхность, активированную травлением гидроксидом натрия, и слой фосфата кальция, нанесенный осаждением из пересыщенного раствора на по меньшей мере часть металлической поверхности.
Наверх