Способ определения хромосомных аномалий методом fish при множественной миеломе

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается определения хромосомных аномалий при множественной миеломе. Способ заключается в приготовлении препарата для FISH-исследования из аспирата костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток, проведении FISH-анализа интерфазных ядер с диаметром не менее 9 мкм в препарате на наличие хромосомных аномалий и подсчете процента хромосомных аномалий. Использование способа позволяет повысить информативность определения хромосомных аномалий методом FISH в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток при множественной миеломе. 3 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и предназначено для диагностики хромосомных аномалий в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клетках при множественной миеломе (ММ).

ММ или плазмоклеточная миелома (в редакции ВОЗ 2017 г.) - это В-клеточная злокачественная опухоль, морфологическим субстратом которой являются плазматические клетки (ПК), продуцирующие моноклональный иммуноглобулин (Менделеева Л.П., Вотякова О.М., Рехтина И.Г. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению злокачественных лимфопролиферативных заболеваний / под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. - М., 2018. - С. 213-241). Заболеваемость ММ составляет приблизительно 1% среди всех злокачественных опухолей и до 10-15% всех опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. Заболевают преимущественно люди старшей возрастной группы (Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018). За последнее десятилетие накоплен большой объем данных, указывающих на значительные различия в клинических проявлениях, прогнозе и ответе на терапию у пациентов ММ с различными цитогенетическими подтипами, что привело к значительному пересмотру клинического, прогностического и терапевтического значения генетических аномалий при ММ. В результате систематизации этих данных Международная рабочая группа по миеломе (International Myeloma Working Group, IMWG) предложила классификацию MM, выделив несколько неперекрывающихся молекулярных подтипов, определенных на основе конкретных цитогенетических аномалиий (Fonseca R. International Myeloma Working Group molecular classification of multiple myeloma: spotlight review / R. Fonseca, P.L. Bergsagel [et al.] // Leukemia. - 2009. - Vol. 23(12). - № 2210-21). В дальнейшем эта классификация была усовершенствована и включена в системы стратификации риска. При ММ выделяют первичные и вторичные цитогенетические аномалии. Большинство первичных цитогенетических аномалий у пациентов с ММ являются транслокациями либо трисомиями.

Первичные транслокации у пациентов с ММ обычно включают локус гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) на хромосоме 14 и один из нескольких партнерских хромосом. Пять партнерских хромосом, наиболее часто встречающихся у пациентов с ММ, представляют собой хромосомы 4, 6, 11, 14 и 20. Первичные трисомии обычно включают нечетные хромосомы 5, 7, 9, 11, 13 и 15, приводящие к гипердиплоидному кариотипу. Первичные цитогенетические аномалии обнаруживаются почти у всей популяции клональных клеток в пределах клинического образца. Напротив, вторичные цитогенетические аномалии обычно субклональные.

Классическим способом, позволяющим выявлять хромосомные аномалии, является стандартное цитогенетическое исследование, которое основано на структурном и количественном анализе всех хромосом клетки (кариотип), дифференциально окрашенных в результате обработки трипсином с последующей окраской красителем Гимзы или Райта. (Seabright, М. A rapid banding technique for human chromosomes / M. Seabright // Lancet. - 1971. - Vol. 2. - № 7731. - P. 971-972). Данный методический подход имеет 2 существенных недостатка. Один из них связан с низкой информативностью цитогенетического исследования плазматических клеток ввиду их низкой митотической активности и часто незначительного содержания в аспирате костного мозга. Так, согласно литературным данным с использованием стандартного цитогенетического исследования нарушения кариотипа выявляются у 30-50% больных ММ (Бессмельцев, С.С. Множественная миелома (Патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть 1 / С.С. Бессемельцев // Клиническая онкогематология. - 2013. - Т. 6, № 3. - С. 237-259). Второй существенный недостаток указанного метода заключается в его недостаточно высокой разрешающей способности идентифицировать структурные перестройки хромосом. Разрешающая способность светового микроскопа позволяет идентификацию только хромосомных изменений размером не менее 4 Mb (Czepulkowski В. Analyzing Chromosomes / В. Czepulkowski. - Oxford: BIOS Scientific Publishers Limited, 2001. - p. 162-182). При этом низкокачественные хромосомные препараты значительно снижают разрешающую способность стандартного цитогенетического метода выявлять небольшие делеции или дупликации. Проблемы возникают также при перестройках хромосом. Перестроенные сегменты не всегда возможно идентифицировать по картине G-бэндинга. Особенно часто с такими проблемами приходится сталкиваться при идентификации небольших дополнительных маркерных хромосом. К числу критических перестроек относятся также такие прогностически значимые при ММ транслокации, как t(4;14) (p16.3;q32) и t(14;16)(q32;q23).

Отмеченных недостатков лишен другой способ обнаружения хромосомных аномалий - метод флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH). В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных и интерфазных клеток. Визуализация ДНК-зондов, гибридизованных с соответствующим участком ДНК мишени, осуществляют с помощью простого люминесцентного микроскопа, оснащенного фильтрами, адекватными для оценки соответствующих ДНК-зондов. Клинико-диагностические исследования при ММ обычно проводят с помощью стандартизованных коммерческих ДНК-зондов и в соответствии с протоколами, рекомендуемых фирмами-производителями этих зондов, применяя интерфазный вариант FISH. Интерфазная FISH не зависит от пролиферации клеток, но ее чувствительность обнаружения ограничена процентным содержанием ПК в цельном костном мозге. Поликлональные ПК обычно составляют от 0,2% до 2,2% (в среднем 1,8%) костного мозга (Jandl, J.H. Blood: Textbook of Hematology / J.H. Jandl. - New York: Little, Brown, 1996. - p. 47). Хотя этот процент может увеличиваться у пациентов с ММ, концентрация моноклонального ПК может быть близка к этому низкому уровню в начале заболевания или после лечения. В случаях низкой моноклональной опухолевой нагрузки ПК аномальные клетки могут быть слишком редкими для обнаружения во время анализа, что приводит к ложноотрицательному результату, т.е. результату оценки FISH, который находится ниже установленных в лаборатории пороговых значений определения хромосомных аномалий. Обычно низкая медианная доля плазматических клеток в аспиратах костного мозга, составляющая от 1 до 20% по данным InterGroupe Francophone du Myelome (IFM), LLR UK Myeloma Forum Cytogenetic Database и Nordic Myeloma Study Group (NMSG) указывает на то, что методика FISH не может выполняться напрямую как при других гематологических злокачественных новообразованиях. Согласно Европейской сети по миеломе FISH-исследование в таких случаях необходимо проводить на селектированных ПК (Ross F.M. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders / F.M. Ross, H. Avet-Loiseau [et al.] // Haematologica. - 2012. - Vol 97(8). - p. 1272-1277). Известен способ определения хромосомных аномалий методом интерфазной FISH после предварительной иммуномагнитной сепарации ПК. Эти клетки метятся с помощью магнитных наночастиц, которые конъюгированы с высокоспецифичными антителами к CD 138. При нанесении суспензии меченых клеток на колонку, помещенную в магнитное поле сепаратора, на колонке фиксируются клетки даже с минимальным количеством наночастиц на их поверхности. Затем элюируются сепарированные плазматические клетки. Процедуры, связанные с приготовлением препаратов для FISH-исследования проводятся стандартно с той лишь разницей, что фиксированный в растворе Карнуа (смесь метанол / уксусная кислота в соотношении 3:1) осадок, полученный на последнем этапе, ресуспендируется в фиксирующем растворе и центрифугируется. Последующие процедуры, связанные с предобработкой предметных стекол с фиксированным образцом к этапу денатурации / гибридизации ДНК-зонда и ДНК-мишени, проводятся согласно протоколу производителя. Контрастное окрашивание процессированных ядер и их анализ под люминесцентным микроскопом осуществляются стандартно. Значительно повышая чувствительность определения хромосомных аномалий при ММ, данный методический подход позволяет анализировать аспираты костного мозга с низким (не более 20%) содержанием плазматических клеток. К существенным недостаткам приведенного подхода относятся значительная потеря клеток в процессе очистки ПК, уменьшение их выхода при иммуномагнитной сепарации с увеличением возраста образца, что препятствует возможности выполнять дополнительные тесты в более позднее время и благодаря этому получать уточненные результаты FISH. Кроме того, данный подход нуждается в дополнительном оборудовании и дорогостоящих расходных материалах (дополнительно 35-40 долларов за каждую процедуру сепарации ПК).

Известен еще один способ идентификации хромосомных аномалий методом интерфазной FISH при низком содержании ПК у больных ММ. Данный способ основан на анализе ПК, селектированных в костном мозге путем сопутствующего FISH-анализу иммунофенотипирования цитоплазматических иммуноглобулиновых легких цепей типа к или X с помощью антител, меченных флуорохромом. Комбинированное применение FISH и указанного иммунофенотипирования, обозначаемое как clg-FISH, повышает чувствительность определения хромосомных аномлий, сопоставимую с FISH-анализом после предварительной иммуномагнитной очистки ПК. Вместе с тем по сравнению со стандартным FISH-тестированием методический подход, основанный на clg-FISH, имеет ряд недостатков, связанных с трудоемкостью определения хромосомных аномалий с помощью данного подхода, дополнительными финансовыми затратами, вызванными закупкой дорогостоящих меченных флуорохромом антител к иммуноглобулиновым легким цепям, неинформативностью подхода в случаях непродуцирующей миеломы (без синтеза clg), сложностью выявления ПК, несущих t(11;14) с лимфоплазмоцитарной морфологической картиной.

В качестве прототипа изобретения выбран стандартный способ определения хромосомных аномалий методом интерфазной FISH, основанный на рутинном приготовлении препаратов для FISH-исследования и анализе флуоресцентных гибридизационных сигналов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа со специальными фильтрами, оснащенного камерой с устройством с зарядовой связью (CCD), позволяющую создавать цифровые изображения даже при слабом флуоресцентом гибридизационном сигнале, и компьютерного программоного обеспечения для анализа изображений (Swansbury J. Fluorescence in situ hybridization methods and troubleshooting applied to fixed cell suspensions / J. Swansbury, T. Min [et al.] // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol 730. - p. 13-31). Как уже отмечалось выше, основным недостатком указанного способа является неспособность выявления хромосомных аномалий при низком содержании опухолевых плазматических клеток при ММ.

В связи с вышеизложенным, технической задачей предлагаемого изобретения является разработка простого и экономичного способа определения хромосомных аномалий методом FISH в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток при ММ.

Технический результат заключается в повышении информативности определения хромосомных аномалий методом FISH в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток при ММ.

Указанный технический результат достигается разработанным способом, включающим в себя:

- приготовление препарата для FISH-исследования из аспирата костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток,

- избирательный FISH-анализ ядер с диаметром не менее 9 мкм в препарате на наличие хромосомных аномалий.

Сущность предложенного изобретения заключается в том, что избирательный FISH-анализ относительно мономорфных по размерам интерфазных ядер с диаметром не менее 9 мкм позволяет многократно увеличить чувствительность обнаружения целевых цитогенетических аномалий по сравнению с неизбирательной оценкой исходного гетерогенного препарата методом сплошного просмотра. При этом в основе наблюдаемой разной частоты встречаемости целевых FISH-маркеров в различных по размерам популяциях интерфазных ядер могут лежать как клонально-генетические причины, так и технологические, связанные с разведением аспирата костного мозга периферической кровью в процессе его забора.

Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России.

Способ осуществляется следующим образом.

Переносят 1 мл костного мозга в центрифужную пробирку, доводят объем средой RPMI-1640 до 10 мл. Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. Удаляют большую часть супернатанта, оставив его примерно 1,0 мл в пробирке. Суспендируют осадок и добавляют 9 мл нагретого до 37°С гипотонического (0,075 М) раствора KCl, клетки инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Далее добавляют 0,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1), перемешивают пипетированием и центрифугируют суспензию при 1000 об/мин в течение 10 минут. Удаляют большую часть супернатанта, оставив его примерно 0,5 мл в пробирке. Тщательно суспендируют осадок, добавляют по каплям при перемешивании 9-10 мл фиксатора и выдерживают суспензию в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, осадок суспендируют в 5 мл фиксатора и выдерживают в течение 10 минут при комнатной температуре. После проводят центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяют еще 2 раза, затем суспендируют осадок в 0,1-0,4 мл свежего фиксатора.

Раскапывают суспензию фиксированных клеток на чистое предметное стекло, добавляют 3-4 капли свежего фиксатора и дают сохнуть на воздухе. После с помощью фазово-контрастной микроскопии оценивают качество приготовленного препарата. Фиксированные клетки (ядра) должны быть распределены равномерно, без наложений друг на друга (при большой плотности клеточного материала на стекле гибридизация может быть неэффективной и/или может наблюдаться интенсивный фон вследствие неспецифического связывания ДНК-зонда). Перед проведением процедур, связанных непосредственно с FISH, выдерживают стекла в течение часа в термостате при 37°С.

Для надежного обеспечения высококачественных FISH-сигналов применяется следующая предварительная обработка свежеприготовленных препаратов фиксированных клеток. Инкубируют препарат в течение 15 минут при 37°С в 2xSSC / 0,5% Igepal (рН=7,0±0,01). Проводят дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом; высушивают препарат на воздухе при комнатной температуре. Далее наносят готовый ДНК-зонд, закрывают покровным стеклом (диаметр 10 мм), края герметизируют резиновым клеем. Препарат помещают в гибридайзер. Согласно протоколу производителя ДНК-зондов, режим денатурации проводится при 75°С в течение 5-10 минут, гибридизация осуществляется при 37°С не менее 12 часов.

После завершения гибридизации с целью удаления избытка ДНК-зонда препарат обрабатывают следующим образом. Готовят раствор Wash Buffer I (0,4 х SSC / 0,3% Igepal) и нагревают его до температуры 72°С (±1°С) в водяной бане. Удаляют клей с предметных стекол, выдерживают препараты в растворе Wash Buffer II (2 х SSC / 0,1% Igepal) при комнатной температуре в течение 2 минут, затем убирают покровные стекла. Препараты помещают на 2 минуты в раствор Wash Buffer I при температуре 72°С (±1°С), далее - выдерживают в растворе Wash Buffer II при комнатной температуре в течение 1 минуты. Проводят дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом. Высушивают препарат при комнатной температуре в темноте. Для визуализации клеточных ядер на препарат наносят раствор DAPI в концентрации 1 мкг/мл, затем исследуемую зону накрывают покровным стеклом.

Анализ препаратов осуществляют с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием компьютерных программ обработки изображений. Получают фотографии интерфазных ядер клеток костного мозга с четкими сигналами в FISH-препарате. Фотографии загружают в программу обработки изображений и измеряют диаметры ядер всех клеток в поле зрения. Изображения препарата с измеренными диаметрами ядер используют для избирательного FISH-анализа. Проводят подсчет процента хромосомной аномалии только в тех ядрах, которые имеют диаметр ≥ 9 мкм.

Критерий предложенного способа оценки интерфазных ядер был разработан на основании данных FISH-анализа более 12 000 ядер у 50 больных с ММ (34 пациента - с впервые выявленной ММ, 16 - на стадии мониторинга). Исследовались 50 FISH-образцов со следующими генетическими аномалиями: t(4;14), t(14;16), t(11;14), amplq21, del(13)(ql4), del(17)(p13). Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность применения способа избирательной FISH-диагностики хромосомных аномалий у больных ММ при низком содержании опухолевых клеток в аспирате костного мозга.

Пример 1. Больная В., 55 лет. Поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 12.05.2020. Установлен диагноз «Множественная миелома». Пациентке проведена пункция костного мозга, аспират которого имел низкую долю плазматических клеток по результатам миелограммы - 12,4% (менее 20%). Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-исследования. В результате FISH-анализа 200 интерфазных ядер клеток костного мозга стандартным способом, выявлено 11 ядер (5,5%), имеющих хромосомную аномалию - амплификацию локуса lq21. Полученный результат не превышает порог чувствительности зонда (10%). Для регистрации хромосомной аномалии был применен способ избирательного FISH-анализа. Проанализировано 200 ядер с диаметром ≥ 9 мкм. В 30 ядрах (15%) выявлена амплификация локуса lq21.

Пример 2. Больная Г., 58 лет. Диагноз «Множественная миелома» установлен в 2013 г. В декабре 2019 г. - прогрессирование заболевания. Пациентке проведена пункция костного мозга. В миелограмме от 19.12.19 содержание плазматических клеток - 13,2%. Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-исследования. В результате FISH-анализа 200 интерфазных ядер клеток костного мозга стандартным способом, выявлено 18 ядер (9,0%) с транслокацией t(11;14)(q13;q32). Полученный результат не превышает порог чувствительности зонда (10%). Был применен способ избирательного FISH-анализа. Проанализировано 200 ядер с диаметром ≥ 9 мкм, в 35 (17,5%) из них выявлена транслокация t(11;14)(q13;q32).

Пример 3. Больной Ш., 65 лет. Поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России 11.08.2020. Установлен диагноз «Множественная миелома». Пациенту проведена пункция костного мозга. По результатам миелограммы отмечено повышенное относительное число плазматических элементов (36,5%). Аспират костного мозга обработан в соответствии со стандартной методикой, получен препарат для FISH-анализа. В результате FISH-исследования 200 интерфазных ядер клеток костного стандартным способом, в 71 ядре (35,5%) выявлена делеция 13q14. В результате применения способа избирательного FISH-анализа делеция 13q14 выявлена 91 ядре (45,5%). Оба результата отражают наличие одной и той же перестройки, превышают порог чувствительности зонда (10%); проведение избирательного FISH-анализа в данном случае необязательно.

Заявляемое изобретение дает при использовании положительный результат, заключающийся в возможности диагностировать хромосомные аномалии в аспирате костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток. Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, патоморфологических и молекулярно-генетических лабораториях.

Способ определения хромосомных аномалий при множественной миеломе, заключающийся в приготовлении препарата для FISH-исследования из аспирата костного мозга с низким содержанием опухолевых плазматических клеток, проведении FISH-анализа интерфазных ядер с диаметром не менее 9 мкм в препарате на наличие хромосомных аномалий и подсчете процента хромосомных аномалий.