Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство



Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
Антитело против gpr20 и конъюгаты антитело против gpr20-лекарственное средство
C07K2317/21 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2772804:

ДАЙИТИ САНКИО КОМПАНИ, ЛИМИТЕД (JP)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитело, специфически связывающееся с GPR20, и конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли, содержащий указанное антитело. Также предложены кодирующий указанное антитело полинуклеотид, вектор экспрессии, клетка-хозяин, способ получения антитела. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям и способам лечения опухоли с применением указанных антител и конъюгатов. Изобретение обеспечивает высокую активность интернализации антитела в GPR20-экспрессирующие клетки. 13 н. и 54 з.п. ф-лы, 41 ил., 1 табл., 9 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к антителу против GPR20, связывающемуся с GPR20 и обладающему эффектом интернализации, к способу получения антитела против GPR20, конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему это антитело, противоопухолевому средству, содержащему этот конъюгат антитело-лекарственное средство, и т.п.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Злокачественные опухоли занимают высокую позицию в причинах смерти. Хотя ожидается, что количество пациентов со злокачественной опухолью будет расти по мере старения популяции, потребности в лечении еще не в достаточной степени удовлетворены. Проблемы общепринятых химиотерапевтических средств являются следующими: вследствие низкой селективности эти химиотерапевтические средства являются токсичными не только для опухолевых клеток, но также и для нормальных клеток, и, таким образом, обладают неблагоприятными реакциями; и химиотерапевтические средства нельзя вводить в достаточных количествах и, таким образом, они не могут в достаточной степени производить их эффекты. Таким образом, в последние годы были разработаны более высокоселективные нацеленные на молекулы лекарственные средства или антительные лекарственные средства, которые нацелены на молекулы, имеющие мутации или демонстрирующие характеристики высокой экспрессии злокачественных клеток, или на конкретные молекулы, вовлеченные в злокачественную трансформацию клеток.

[0003] Желудочно-кишечная стромальная опухоль (GIST) представляет собой мезенхимную опухоль, которая развивается в желудочно-кишечном тракте от пищевода до прямой кишки и в брыжейке, и, согласно существующей информации, ее частота составляет от 1 до 2 человек на 100000 каждый год (непатентный документ 1). Активирующие мутации в рецепторной тирозинкиназе KIT или PDGFRA встречаются приблизительно у 86% пациентов с GIST, и эти мутации вносят вклад в пролиферацию опухолевых клеток. Лечение GIST основано на хирургической резекции. Между тем, при нерезектабельной или прогрессирующей или метастазирующей GIST назначают ингибиторы тирозинкиназ (TKI), такие как иматиниб, сунитиниб или регорафениб (непатентный документ 2). Эти TKI часто демонстрируют значительную эффективность против GIST, имеющей описанные выше мутации, однако их необходимо вводить длительное время. Кроме того, во многих случаях GIST не может быть устранена посредством TKI и в конечном итоге становится не отвечающей на лекарственные средства вследствие вторичных мутаций в мишенях KIT или PDGFRA, активирующих мутаций в RAS, BRAF и т.п., и активации других сигнальных путей, так что заболевание прогрессирует. Более того, эти TKI редко демонстрируют терапевтический эффект в отношении GIST дикого типа, для которой обнаружено, что она не имеет мутации в KIT или PDGFRA, хотя такая GIST дикого типа возникает только в небольшом числе случаев (непатентный документ 3). Таким образом, существует потребность в разработке способов лечения, эффективных против GIST, резистентной к TKI.

[0004] GPR20 (сопряженный с G-белком рецептор 20) представляет собой семь раз пересекающий мембрану белок, состоящий из 358 аминокислот, который принадлежит к классу A семейства сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), и этот белок имеет N-концевой внеклеточный и C-концевой внутриклеточный домены. Ген GPR20 человека впервые был клонирован в 1997 году (непатентный документ 4). Затем было обнаружено, что его предполагаемая аминокислотная последовательность частично отличается от аминокислотной последовательности, кодируемой геном GPR20 человека, клонированным другим исследователем в 2008 году (непатентный документ 5). Последняя из этих последовательностей, которая идентична последовательности, зарегистрированной в базе данных NCBI полногеномного анализа последовательностей человека, в настоящее время описана в качестве последовательности ДНК, кодирующей GPR20 человека, вместе с ее аминокислотной последовательностью, в общедоступной базе данных. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность могут упоминаться, например, под номерами доступа № NM_005293 и NP_005284 (NCBI).

[0005] GPR20 имеет аминокислотную последовательность, сходную с последовательностями семейства GPCR, представители которого распознают нуклеотид или липид. Однако ни физиологические функции, ни лиганды in vivo, не были идентифицированы для GPR20. Сообщалось, что в эксперименте, в котором GPR20 экзогенно экспрессировался в клетках HEK293, GPR20 конститутивно активирует тримерные G-белки Gi в условиях без стимуляции лигандом (непатентный документ 5).

[0006] Было подтверждено, что матричная РНК (мРНК) GPR20 экспрессируется в сердце, головном мозге, плаценте, легком, печени, скелетной мышце, почке, поджелудочной железе, селезенке, тимусе, предстательной железе, семеннике, яичнике, тонком кишечнике, прямой кишке и лейкоцитах, и, в частности, описана его высокая экспрессия в тонком кишечнике (непатентный документ 5). В головном мозге описана экспрессия в таламусе, скорлупе и хвостатом ядре (непатентный документ 4). Мыши с дефицитом GPR20 демонстрируют фенотип гиперактивного нарушения, характеризующегося увеличением общего пройденного расстояния в тестах открытого поля, что указывает на то, что GPR20 ассоциирован со спонтанной активностью в центральной нервной системе (патентный документ 1). Также было описано, что GPR20 на высоком уровне экспрессируется в GIST (непатентный документ 6). Сообщалось, что экспрессия GPR20 контролируется вариантом 1 ETS (ETV1), который является основным фактором транскрипции GIST (непатентный документ 7).

[0007] Антитела являются в высокой степени стабильными в крови и специфически связываются с их антигенами-мишенями. По этим причинам ожидается сниженный уровень неблагоприятных реакций, и было разработано большое количество антительных лекарственных средств, нацеленных на молекулы, которые на высоком уровне экспрессируются на поверхности злокачественных клеток. Примеры механизма действия антительных лекарственных средств, прямо нацеливающихся на опухолевые клетки, включают антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC), блокирование сигналов рецепторов, вовлеченных в рост опухоли, и индукцию апоптоза.

[0008] Одним из продуктов, в котором используется способность антител связывать антиген, является конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). ADC против злокачественной опухоли представляет собой антитело, конъюгированное с цитотоксическим лекарственным средством, в котором антитело способно связываться с антигеном, экспрессируемым на поверхности злокачественной клетки, и интернализовываться в клетку посредством указанного связывания с антигеном. ADC против злокачественной опухоли может эффективно доставлять лекарственное средство к злокачественным клеткам и, таким образом, можно ожидать, что оно будет уничтожать злокачественные клетки путем накопления лекарственного средства в злокачественных клетках (непатентный документ 8). Что касается ADC, например, Адцетрис (брентуксимаб ведотин), содержащий моноклональное антитело против CD30, конъюгированное с монометилауристатином E, одобрен в качестве терапевтического лекарственного средства против лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы. Также Кадсила (трастузумаб эмтанзин), содержащая моноклональное антитело против HER2, конъюгированное эмтанзином, используется для лечения HER2-положительного прогрессирующего или рецидивирующего рака молочной железы.

[0009] Признаки антигена-мишени, пригодного для ADC в качестве противоопухолевого лекарственного средства, являются следующими: антиген специфически экспрессируется на высоком уровне на поверхности злокачественных клеток, но имеет низкую экспрессию или не экспрессируется в нормальных клетках; антиген может интернализовываться в клетки; антиген не секретируется с поверхности клеток и т.д. Важными признаками антитела, пригодного для ADC, является то, что антитело специфически связывается с антигеном-мишенью, а также что оно обладает высокой способностью к интернализации. Способность антитела к интернализации зависит от свойств как антигена-мишени, так и антитела. Трудно спрогнозировать антигенсвязывающий центр, пригодный для интернализации, исходя из молекулярной структуры мишени, или легко спрогнозировать антитело, имеющее высокую способность к интернализации, исходя из силы связывания, физических свойств и т.п. антитела. Таким образом, важной проблемой в разработке ADC, имеющего высокую эффективность, является получение антитела, обладающего высокой способностью к интернализации, против антигена-мишени (непатентный документ 9).

[0010] На настоящий момент отсутствует известное терапевтическое лекарственное средство, нацеленное на GPR20. Более того, отсутствуют сообщения об антителе против GPR20, связывающемся с GPR20, экспрессируемым на поверхности клеточной мембране, и обладающем активностью интернализации, или об ADC, содержащем такое антитело.

Список литературы

Патентные документы

[0011]

Патентный документ 1: US 2003/0018989

Непатентный документ

[0012]

Непатентный документ 1: Corless C.L., et al., Nat Rev Cancer (2011) 11, 865-878

Непатентный документ 2: Demetri G. D., et al., NCCN Task Force report, J Natl Compr Canc Netw. (2010) 8, Suppl 2: S1-41

Непатентный документ 3: Bauer S., Joensuu H., Drug. (2015) 75, 1323-1334

Непатентный документ 4: O'Dowd B. F., Gene 187 (1997) 75-81

Непатентный документ 5: Hase M., et al., J Biol Chem. (2008) 283, 12747-12755

Непатентный документ 6: Allander S. V., et al., CANCER RESEARCH (2001) 61, 8624-8628

Непатентный документ 7: Chi P., et al., Nature. (2010) 467 (7317): 849-853

Непатентный документ 8: Heidi L. Perez, et al., Drug Discov. Today (2014) 19, 869-881

Непатентный документ 9: Peters C., Brown S., Bioscience Reports (2015) 35, e00225.

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0013] Задачей настоящего изобретения является предоставление антитела, специфически связывающегося с GPR20-положительными опухолевыми клетками, такими как GIST, конъюгата антитело-лекарственное средство, содержащего антитело, фармацевтического продукта, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство и имеющего терапевтические эффекты на опухоль, способа лечения опухоли с использованием вышеупомянутого фармацевтического продукта, способов получения антитела и конъюгата антитело-лекарственное средство, и т.п.

Решение проблемы

[0014] Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования, направленные на достижение описанной выше задачи, и предположили, что GPR20 является одной из молекул, характеризующих GIST, и эта молекула способна служить в качестве терапевтической мишени, специфической для GIST. В результате исследования активности интернализации и паттерна связывания антитела против GPR20 человека, авторы изобретения обнаружили антитело против GPR20, обладающее высокой активностью интернализации, среди антител, которые демонстрируют профиль специфического связывания. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство, содержащий вышеупомянутое антитело против GPR20, конъюгированное с лекарственным средством, проявляющим токсичность в клетках, через линкер, имеющий определенную структуру, демонстрирует противоопухолевый эффект на GPR20-положительную злокачественную опухоль, такую как GIST, экспрессирующую GPR20, тем самым осуществив настоящее изобретение. ВВ частности, настоящее изобретение включает следующие аспекты изобретения.

[0015] В частности, изобретение, описанное в настоящей заявке, относится к следующему:

(1) антитело или функциональный фрагмент антитела, имеющие следующие свойства (a)-(b):

(a) специфическое связывание с GPR20, и

(b) наличие способности к интернализации, которая позволяет клеточный захват после связывания с GPR20;

(2) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (1), где GPR20 представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1;

(3) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (1) или (2), которые специфически связываются с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и не связываются специфически с полипептидом с заменой аминокислоты Y (тирозин) в положении аминокислоты 113 на другую аминокислоту;

(4) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(3), которые специфически связываются с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и не связываются специфически с полипептидом с заменой аминокислоты Y (тирозин) в положении аминокислоты 113 на F (фенилаланин);

(5) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(4), которые специфически связываются с конформацией, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 1-48 и аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 108-125 в SEQ ID NO:1;

(6) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(5), которые специфически связываются по меньшей мере с одним аминокислотным остатком, выбранным из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 1-48, и по меньшей мере одним аминокислотным остатком, выбранным из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 108-125 в SEQ ID NO:1;

(7) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(6), где по меньшей мере одна из аминокислот, с которыми антитело или функциональный фрагмент специфически связываются, представляет собой аминокислоту в положении аминокислоты 113 SEQ ID NO:1;

(8) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(7), которые обладают ингибиторной активностью в отношении связывания с GPR20, конкурирующей с активностью любого из антител, выбранных из группы, состоящей из следующих антител (a)-(c):

(a) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:7,

(b) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:12, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:17, и

(c) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:22, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:27;

(9) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(8), которые содержат CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(c), и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из следующих комбинаций (d)-(h):

(a) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6,

(b) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16,

(c) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:26,

(d) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(e) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(f) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(g) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и

(h) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31;

(10) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(9), которые содержат CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(b) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(c) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(d) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и

(e) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:26, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31;

(11) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(10), которые имеют любую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (a)-(c), и любую вариабельную область легкой цепи, выбранную из следующих вариабельных областей (d)-(h):

вариабельная область тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из

(a) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3,

(b) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и

(c) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:23,

(d) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8,

(e) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(f) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(g) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, и

(h) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:28;

(12) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(11), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в любой комбинации, выбранной из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8,

(b) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(c) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(d) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, и

(e) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:28;

(13) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(12), где константная область представляет собой константную область человека;

(14) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (13), которые содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:44, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:45;

(15) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(14), которые являются гуманизированными;

(16) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (15), которые имеют вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из следующих аминокислотных последовательностей (a)-(h), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из следующих аминокислотных последовательностей (i)-(o):

(a) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48,

(b) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50,

(c) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52,

(d) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54,

(e) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56,

(f) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:44,

(g) аминокислотная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (a)-(f),

(h) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (a)-(g),

(i) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(j) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(k) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(l) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(m) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-128 в SEQ ID NO:45,

(n) аминокислотная последовательность, имеющая гомологию по меньшей мере 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (i)-(m), и

(o) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (i)-(n);

(17) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (16), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(t):

(a) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(b) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(c) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(d) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(e) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(f) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(g) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(h) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(i) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(j) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(k) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(l) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(m) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(n) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(o) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(p) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(q) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(r) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(s) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62, и

(t) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64;

(18) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно (16) или (17), которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь в любой комбинации, выбранной из следующих комбинаций (a)-(x):

(a) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(b) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(c) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(d) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(e) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(f) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(g) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(h) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(i) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(j) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(k) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(l) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(m) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(n) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(o) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(p) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(q) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(r) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(s) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(t) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(u) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(v) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(w) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62; и

(x) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64;

(19) функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(18), где функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)2, Fab' и Fv;

(20) полинуклеотид, кодирующий антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(19);

(21) полинуклеотид согласно (20), который содержит полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(b) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(c) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11,

(d) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:21, и

(e) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:26, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31;

(22) полинуклеотид согласно (20) или (21), который содержит полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8,

(b) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(c) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(d) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, и

(e) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:28;

(23) экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид согласно любому из (20)-(22);

(24) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором согласно (23);

(25) клетка-хозяин согласно (23), где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку;

(26) способ получения представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела, который включает стадию культивирования клетки-хозяина согласно (24) или (25), и стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной посредством вышеупомянутой стадии;

(27) антитело или функциональный фрагмент антитела, полученные способом получения согласно (26);

(28) функциональный фрагмент антитела согласно (27), где функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)2, Fab' и Fv;

(29) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(19), (27) и (28), которые содержат одну, или две, или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, O-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, C-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, присоединения остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, и тяжелую цепь, содержащую делецию одной или двух аминокислот на С-конце;

(30) антитело согласно (29), где на С-конце его тяжелой цепи удалены одна или две аминокислоты;

(31) антитело согласно (30), где на каждом С-конце обеих его тяжелых цепей удалена одна аминокислота;

(32) антитело согласно любому из (29)-(31), где остаток пролина на С-конце его тяжелой цепи дополнительно амидирован;

(33) антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(19) и (26)-(31), где модификация сахарной цепи регулируется для усиления антителозависимой клеточной цитотоксической активности;

(34) конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или функциональный фрагмент антитела согласно любому из (1)-(19) и (27)-(33), конъюгированный с лекарственным средством;

(35) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно (34), где лекарственное средство представляет собой противоопухолевое соединение;

(36) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно (35), где противоопухолевое соединение представляет собой противоопухолевое соединение, соответствующее следующей формуле:

[0016]

[Формула 1]

[0017]

(37) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно (36), где антитело конъюгировано с противоопухолевым соединением через линкер, имеющий структуру, соответствующую любой из следующих формул (a)-(f):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, и

(f) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

где антитело соединено с концом -(сукцинимид-3-ил-N), противоопухолевое соединение соединено с карбонильной группой части -(CH2)n2-C(=O)-, где атом азота аминогруппы в положении 1 выступает в качестве положения для присоединения, GGFG обозначает аминокислотную последовательность, состоящую из глицина-глицина-фенилаланина-глицина, связанных пептидными связями, и

-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, соответствующую следующей формуле:

[0018]

[формула 2]

[0019]

которая связана с антителом в его положении 3 и соединена с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру на атоме азота в положении 1;

(38) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(37), где линкер соответствует любой формуле, выбранной из следующих формул (a)-(c):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, и

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0020]

(39) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(38), где линкер соответствует следующей формуле (a) или (b):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, и

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0021]

(40) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(39), где линкер соответствует следующей формуле (a):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-;

(41) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(40), где антитело конъюгировано со структурой лекарственное средство-линкер, соответствующей следующей формуле [формула 3] (где A обозначает положения присоединения к антителу), через простую тиоэфирную связь:

[0022]

[формула 3]

[0023]

(42) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(40), который имеет структуру, соответствующую следующей формуле [формула 4],

где AB обозначает антитело или функциональный фрагмент антитела, n обозначает среднее количество элементов структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело, и антитело соединено с линкером через сульфгидрильную группу антитела:

[0024]

[Формула 4]

[0025]

(43) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(39), который соответствует следующей формуле [формула 5],

где AB обозначает антитело или функциональный фрагмент антитела, n обозначает среднее количество элементов структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело, и антитело соединено с линкером через сульфгидрильную группу антитела:

[0026]

[формула 5]

(44) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (41)-(43), где антитело представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(x), или функциональный фрагмент антитела:

(a) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(b) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(c) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(d) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(e) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(f) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(g) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(h) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(i) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(j) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(k) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(l) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(m) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(n) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(o) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(p) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(q) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(r) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(s) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(t) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(u) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(v) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(w) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62, и

(x) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64;

(45) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно (44), где тяжелая цепь антитела содержит одну, или две, или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, O-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, C-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, присоединения остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, и тяжелой цепи, содержащей делецию одной или двух аминокислот на С-конце;

(46) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(45), где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 1 до 10;

(47) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(46), где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 2 до 8;

(48) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(47), где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 3 до 8;

(49) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(48), где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 7 до 8;

(50) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно любому из (34)-(49), где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело равно 8;

(51) фармацевтическая композиция, содержащая любой компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител согласно (1)-(19) и (27)-(33) и конъюгатов антитело-лекарственное средство согласно (34)-(50), соли компонента или гидрата компонента или соли;

(52) фармацевтическая композиция согласно (51), которая представляет собой противоопухолевое лекарственное средство;

(53) противоопухолевое лекарственное средство согласно (52), где опухоль представляет собой опухоль, экспрессирующую GPR20;

(54) противоопухолевое лекарственное средство согласно (52) или (53), где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль;

(55) фармацевтическая композиция или противоопухолевое лекарственное средство согласно любому из (51)-(54), дополнительно содержащие дополнительное противоопухолевое лекарственное средство;

(56) способ лечения опухоли, который включает введение любого компонента, выбранного из антител или функциональных фрагментов антител согласно (1)-(19) и (27)-(33), конъюгатов антитело-лекарственное средство согласно (34)-(50), солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей индивидууму;

(57) способ лечения согласно (56), где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль;

(58) способ лечения согласно (56) или (57), где опухоль представляет собой опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы;

(59) способ лечения опухоли, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител согласно (1)-(19) и (27)-(33), конъюгатов антитело-лекарственное средство согласно (34)-(50), солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей, и по меньшей мере одного противоопухолевого лекарственного средства индивидууму одновременно, по отдельности или непрерывно;

(60) способ лечения опухоли согласно (59), где противоопухолевое лекарственное средство представляет собой ингибитор тирозинкиназы;

(61) способ лечения опухоли согласно (60), где ингибитор тирозинкиназы представляет собой по меньшей мере один ингибитор тирозинкиназы, выбранный из сунитиниба, иматиниба и регорафениба;

(62) способ лечения опухоли согласно любому из (56)-(61), где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы; и

(63) способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, который включает стадию культивирования клетки-хозяина согласно (24) или (25), стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной посредством вышеупомянутой стадии, и стадию реакции представляющего интерес антитела и функционального фрагмента антитела, полученных посредством вышеупомянутой стадии, с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер.

Преимущественные эффекты изобретения

[0027] Признаками антитела против GPR20 по настоящему изобретению являются распознавание конформации, состоящей из двух внеклеточных областей, имеющих аминокислотную последовательность в положениях 1-48 и аминокислотную последовательность в положениях 108-125, соответственно, на N-конце GPR20, и наличие активности интернализации. Можно ожидать, что конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство, содержащий антитело против GPR20 по настоящему изобретению, конъюгированное с лекарственным средством, которое демонстрирует токсичность в клетках, через линкер, имеющий определенную структуру, продемонстрирует превосходный противоопухолевый эффект и будет безопасным при введении пациентам, имеющим злокачественные клетки, экспрессирующие GPR20. В частности, конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению является пригодным в качестве противоопухолевого средства.

Краткое описание чертежей

[0028]

[Фигура 1] На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) тяжелой цепи антитела крысы против GPR20 04-046 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:32) кДНК, кодирующей тяжелую цепь.

[Фигура 2] На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:7) легкой цепи антитела крысы против GPR20 04-046 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:34) кДНК, кодирующей легкую цепь.

[Фигура 3] На фиг.3 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:12) тяжелой цепи антитела крысы против GPR20 04-079 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:36) кДНК, кодирующей тяжелую цепь.

[Фигура 4] На фиг.4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:17) легкой цепи антитела крысы против GPR20 04-079 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:38) кДНК, кодирующей легкую цепь.

[Фигура 5] На фиг.5 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:22) тяжелой цепи антитела крысы против GPR20 04-126 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:40) кДНК, кодирующей тяжелую цепь.

[Фигура 6] На фиг.6 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:27) легкой цепи антитела крысы против GPR20 04-126 и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:42) кДНК, кодирующей легкую цепь.

[Фигура 7] На фиг.7 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:44) тяжелой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:46) кДНК, кодирующей тяжелую цепь.

[Фигура 8] На фиг.8 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:45) легкой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch и нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:47) кДНК, кодирующей легкую цепь.

[Фигура 9] На фиг.9 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:48) гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b.

[Фигура 10] На фиг.10 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:50) гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e.

[Фигура 11] На фиг.11 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:52) гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b.

[Фигура 12] На фиг.12 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:54) гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8.

[Фигура 13] На фиг.13 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:56) гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10.

[Фигура 14] На фиг.14 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:58) гуманизированной легкой цепи типа h046-L1.

[Фигура 15] На фиг.15 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:60) гуманизированной легкой цепи типа h046-L2.

[Фигура 16] На фиг.16 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:62) гуманизированной легкой цепи типа h046-L6.

[Фигура 17] На фиг.17 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:64) гуманизированной легкой цепи типа h046-L7.

[Фигура 18] На фиг.18 представлены результаты анализа с использованием проточной цитометрии, когда культуральный супернатант гибридомы, продуцирующей антитело против GPR20 человека, подвергали реакции с клеточной линией, временно экспрессирующей GPR20 человека.

[Фигура 19-1] На фиг.19-1 представлено зависимое от концентрации связывание антитела крысы против GPR20 человека с клеточной линией, экспрессирующей GPR20 человека, в анализе с использованием проточной цитометрии.

[Фигура 19-2] На фиг.19-2 представлено зависимое от концентрации связывание антитела крысы против GPR20 человека с клеточной линией, экспрессирующей GPR20 человека, в анализе с использованием проточной цитометрии.

[Фигура 19-3] На фиг.19-3 представлено зависимое от концентрации связывание антитела крысы против GPR20 человека с клеточной линией, экспрессирующей GPR20 человека, в анализе с использованием проточной цитометрии.

[Фигура 20] На фиг.20 представлена способность антитела крысы против GPR20 к интернализации. По оси ординат представлен показатель выживаемости (относительное отношение к уровню выживаемости клеток без добавления, взятому за 100%), когда антитело крысы против GPR20 и меченное сапорином антитело крысы против IgG добавляли к клеточной линии, экспрессирующей GPR20 человека.

[Фигура 21] На фиг.21 представлена диаграмма сравнения между аминокислотными последовательностями GPR20 человека и GPR20 мыши. Аминокислотные последовательности, указанные как EC1, EC2, EC3 и EC4, обозначают внеклеточные области, и числа в скобках указывают на региональные участки, исходя из аминокислотных положений в GPR20 человека. Затененные символы обозначают одинаковые аминокислоты между человеком и мышью.

[Фигура 22-a] На фиг.22-a представлены свойства связывания различных антител против GPR20. На этом чертеже представлена активность связывания каждого антитела против GPR20 в отношении GPR20 человека, GPR20 мыши и химерных белков GPR20 человека/мыши, в которых одна из внеклеточных областей EC1, EC2, EC3 и EC4 GPR20 человека заменена соответствующей последовательностью GPR20 мыши.

[Фигура 22-b] На фиг.22-b представлены свойства связывания различных антител против GPR20. На этом чертеже представлена активность связывания каждого антитела против GPR20 в отношении GPR20 человека, GPR20 мыши и химерных белков GPR20 человека/мыши, в которых одна из внеклеточных областей EC1, EC2, EC3 и EC4 GPR20 человека заменена соответствующей последовательностью GPR20 мыши.

[Фигура 23-a] На фиг.23-a представлено специфическое в отношении GPR20 человека связывание химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch.

[Фигура 23-b] На фиг.23-b представлен отрицательный контроль.

[Фигура 24] На фиг.24 представлена активность связывания GPR20 у гуманизированного антитела против GPR20.

[Фигура 25] На фиг.25 представлена активность связывания GPR20 у гуманизированного антитела против GPR20 и конъюгата антитело-лекарственное средство.

[Фигура 26] На фиг.26 представлена активность подавления пролиферации клеток, экспрессирующих GPR20, in vitro у конъюгата антитело-лекарственное средство (1).

[Фигура 27] На фиг.27 представлена активность подавления пролиферации клеток, экспрессирующих GPR20, in vitro у конъюгатов антитело-лекарственное средство (7), (8) и (9).

[Фигура 28] На фиг.28 представлены противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство (1) и (2) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST-T1/GPR20.

[Фигура 29] На фиг.29 представлены противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство (1) и (2) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST430.

[Фигура 30] На фиг.30 представлены противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство (6) и (9) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST-T1/GPR20.

[Фигура 31] На фиг.31 представлены противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство (3), (5), (6), (10), (11) и (12) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST-T1/GPR20.

[Фигура 32] На фиг.32 представлены противоопухолевые эффекты конъюгата антитело-лекарственное средство (13) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST-T1/GPR20.

[Фигура 33] На фиг.33 представлены противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство (4) и (13) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST020.

[Фигура 34] На фиг.34 представлен противоопухолевый эффект конъюгата антитело-лекарственное средство (13) в моделях на мышах nude, которым подкожно трансплантировали клетки GIST1.

[Фигура 35] На фиг.35 представлены противоопухолевые эффекты конъюгата антитело-лекарственное средство (14) и конъюгата антитело-лекарственное средство, нацеленного на HER2, у мышей nude, которым подкожно трансплантировали клетки клеточной линии рака желудка NCI-N87.

[Фигура 36] На фиг.36 представлен противоопухолевый эффект конъюгата антитело-лекарственное средство (14) в моделях, полученных путем подкожной трансплантации мышам nude опухоли GIST074, полученной от пациента с желудочно-кишечной стромальной опухолью в желудке, который стал не отвечающим на лечение регорафенибом.

[Фигура 37] На фиг.37 представлен эффект комбинированного применения конъюгата антитело-лекарственное средство (3) и сунитиниба в моделях, полученных путем подкожной трансплантации мышам nude клеточной линии стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта GIST430/654, имеющей мутацию резистентности к иматинибу.

Описание вариантов осуществления

[0029] Далее предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны с отсылкой к чертежам. Следует отметить, что варианты осуществления, описанные ниже, только иллюстрируют репрезентативные варианты осуществления настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не следует узко интерпретировать ввиду этих примеров.

[0030] В настоящем описании термин "злокачественная опухоль" используют в том же значении, что и термин "опухоль".

[0031] В настоящем описании термин "ген" используют для обозначения не только ДНК, но также его мРНК и кДНК, и кРНК. В настоящем описании термин "полинуклеотид" используют в том же значении, что и термин "нуклеиновая кислота", и он также включает ДНК, РНК, зонд, олигонуклеотид и праймер.

[0032] В настоящем описании термины "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо.

[0033] В настоящем описании термин "клетка" включает клетки у отдельного животного и культивируемые клетки.

[0034] В настоящем описании термин "GPR20" используют в том же значении, что и белок GPR20.

[0035] В настоящем описании термин "цитотоксическая активность" используют, чтобы указать на то, что патологическое изменение возникает в клетках каким-либо данным образом. Термин не только означает прямое повреждение, но также означает все типы структурного или функционального повреждения клеток, такого как расщепление ДНК, образование димера оснований, хромосомное расщепление, повреждение митотического аппарата и уменьшение активности различных типов ферментов.

[0036] В настоящем описании выражение "демонстрирующий токсичность в клетках" используют для указания на то, что токсичность проявляется в клетках каким-либо данным образом. Термин означает не только прямую травму, но также все типы структурных, функциональных или метаболических влияний на клетки, таких как расщепление ДНК, образование димера оснований, хромосомное расщепление, повреждение митотического аппарата клеток, уменьшение активности различных типов ферментов и подавление эффектов клеточных факторов роста.

[0037] В настоящем описании термин "эпитоп" используют для обозначения частичного пептида или частичной трехмерной структуры GPR20, с которой связывается конкретное антитело против GPR20. Такой эпитоп, который представляет собой описанный выше неполный пептид GPR20, может быть определен способом, хорошо известным специалисту в данной области, таким как иммуноанализ. Сначала получают неполные структуры антигена. Что касается получения таких неполных структур, можно использовать известный способ синтеза олигопептидов. Например, серию полипептидов, в которых GPR20 последовательно укорочен на соответствующую длину с его C-конца или N-конца, получают способом генетической рекомбинации, хорошо известным специалисту в данной области. После этого исследуют реактивность антитела в отношении таких полипептидов, и грубо определяют участки распознавания. После этого синтезируют следующие более короткие пептиды, а затем исследуют реактивность в отношении этих пептидов, определяя таким образом эпитоп. Когда антитело, связывающееся с мембранным белком, имеющим множество внеклеточных доменов, направлено на трехмерную структуру, состоящую из множества доменов, в качестве эпитопа, домен, с которым связывается антитело, можно определять путем модификации аминокислотной последовательности конкретного внеклеточного домена и, тем самым, модификации трехмерной структуры. Эпитоп, который представляет собой неполную трехмерную структуру антигена, который связывается с конкретным антителом, также можно определять путем определения аминокислотных остатков антигена, соседних с описанным выше антителом, посредством рентгеноструктурного анализа.

[0038] В настоящем описании выражение "антитела, связывающиеся с тем же эпитопом" используют для обозначения антител, которые связываются с общим эпитопом. Если второе антитело связывается с неполным пептидом или неполной трехмерной структурой, с которой связывается первое антитело, то может быть определено, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом. Кроме того, подтверждая, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание первого антитела с антигеном (т.е. второе антитело препятствует связыванию первого антитела с антигеном), может быть определено, что первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не определена. Более того, когда первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом, и, кроме того, первое антитело обладает особыми эффектами, такими как противоопухолевая активность или активность интернализации, то можно ожидать, что второе антитело будет обладать той же активностью, что и первое антитело. Таким образом, подтверждая, что второе антитело против GPR20 конкурирует с первым антителом против GPR20 за связывание первого антитела против GPR20 с неполным пептидом GPR20, можно определить, что первое антитело и второе антитело представляют собой антитела, связывающиеся с тем же эпитопом GPR20.

[0039] В настоящем описании термин "CDR" используют для обозначения определяющей комплементарность области. Известно, что каждая тяжелая цепь и каждая легкая цепь молекулы антитела имеет три CDR. Такие CDR также называют гипервариабельными областями, и они расположены в вариабельных областях тяжелой цепи и легкой цепи антитела. Эти области имеют особенно высоко вариабельную первичную структуру и разделены участка в первичной структуре полипептидной цепи каждой тяжелой цепи и легкой цепи. В настоящем описании, что касается CDR антитела, CDR тяжелой цепи обозначают как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, соответственно, с N-конца аминокислотной последовательности тяжелой цепи, в то время как CDR легкой цепи обозначают как CDRL1, CDRL2 и CDRL3, соответственно, с N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи. Эти области расположены рядом на трехмерной структуре и определяют специфичность антитела к антигену, с которым связывается антитело.

[0040] В рамках настоящего изобретения выражение "гибридизующиеся в жестких условиях" используют для обозначения того, что гибридизацию проводят в коммерчески доступном растворе для гибридизации ExpressHyb Hybridization Solution (изготавливаемом Clontech Laboratories, Inc.) при 68°C, или что гибридизацию проводят в условиях, в которых проводят гибридизацию с использованием фильтра с иммобилизованной ДНК в присутствии 0,7-1,0 M NaCl при 68°C, а затем полученный материал промывают при 68°C посредством 0,1-2-кратной концентрации раствора SSC (где 1-кратная концентрация SSC состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия), или в условиях, эквивалентных этим условиям, для идентификации.

[0041] 1. GPR20

GPR20 представляет собой семь раз проходящий через мембрану белок, состоящий из 358 аминокислот, который принадлежит классу A семейства сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR), и этот белок имеет N-концевой внеклеточный и C-концевой внутриклеточный домены.

[0042] Белок GPR20, используемый в рамках настоящего изобретения, может быть очищен непосредственно из экспрессирующих GPR20 клеток человека или не являющегося человеком млекопитающего (например, крысы или мыши), а затем его можно использовать или можно получать фракцию клеточных мембран вышеупомянутых клеток и использовать в качестве белка GPR20. Альтернативно GPR20 также можно получать посредством синтеза его in vitro или позволяя клеткам-хозяевам продуцировать GPR20 путем генетической манипуляции. В соответствии с такой генетической манипуляцией, белок GPR20 можно получать, в частности, путем включения кДНК GPR20 в вектор, способный экспрессировать кДНК GPR20, а затем синтеза GPR20 в растворе, содержащем ферменты, субстрат и энергетические материалы, необходимые для транскрипции и трансляции, или путем трансформации клеток-хозяев других прокариот или эукариот, чтобы позволить им экспрессировать GPR20. Также в качестве белка GPR20 можно использовать GPR20-экспрессирующие клетки на основе описанной выше генетической манипуляции или клеточную линию, экспрессирующую GPR20. Альтернативно экспрессирующий вектор, в который включена кДНК GPR20, можно прямо вводить животному, подлежащему иммунизации, и GPR20 можно экспрессировать в организме животного, иммунизированного таким образом.

[0043] Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность GPR20 человека описаны в общедоступной базе данных, и они могут быть указаны, например, по номерам доступа № NM_005293 и NP_005284 (NCBI).

[0044] Более того, также GPR20 включает белок, который состоит из аминокислотной последовательности, содержащей замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот в описанную выше аминокислотную последовательность GPR20, и обладает биологической активностью, эквивалентной биологической активности белка GPR20.

[0045] Аминокислотная последовательность белка GPR20 человека представлена в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей. Внеклеточные области образованы внеклеточным доменом, состоящим из положений аминокислот 1-48 (EC1), внеклеточным доменом, состоящим из положений аминокислот 108-125 (EC2), внеклеточным доменом (EC3), состоящим из положений аминокислот 190-196, и внеклеточным доменом (EC4), состоящим из положений аминокислот 260-275, в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей.

[0046] 2. Получение антитела против GPR20

Один пример антитела против GPR20 по настоящему изобретению может включать антитело против GPR20, которое распознает конформацию, состоящую из двух внеклеточных областей, имеющих аминокислотную последовательность в положениях 1-48, и аминокислотную последовательность в положениях 108-125, соответственно, от N-конца GPR20, представленного в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, и обладает активностью интернализации.

[0047] Другой пример антитела против GPR20 по настоящему изобретению может включать антитело против GPR20, которое распознает конформацию, состоящую из двух внеклеточных областей, имеющих аминокислотную последовательность в положениях 1-48 и аминокислотную последовательность в положениях 108-125, соответственно, от N-конца GPR20, представленного в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, связывается по меньшей мере с одним остатком тирозина в положении 113 и обладает активностью интернализации.

[0048] Следующий пример антитела против GPR20 по настоящему изобретению может включать антитело против GPR20, которое специфически связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, не связывается с полипептидом с аминокислотой тирозином в положении аминокислоты 113 SEQ ID NO:1 в списке последовательностей, замененной другой аминокислотой (например, фенилаланин), и обладает активностью интернализации.

[0049] Антитело против GPR20 по настоящему изобретению может происходить из любого вида. Предпочтительные примеры вида могут включать человека, крыс, мышей и кроликов. Когда антитело против GPR20 по настоящему изобретению происходит из вида, отличного от человека, является предпочтительной химеризация или гуманизация антитела против GPR20 хорошо известным способом. Антитело по настоящему изобретению может представлять собой поликлональное антитело или может представлять собой моноклональное антитело, и предпочтительным является моноклональное антитело.

[0050] Антитело против GPR20 по настоящему изобретению представляет собой антитело, которое может нацеливаться на опухолевые клетки. В частности, антитело против GPR20 по настоящему изобретению обладает свойством, состоящим в том, что оно способно распознавать опухолевые клетки, свойством, состоящим в том, что оно способно связываться с опухолевыми клетками, свойством, состоящим в том, что оно интернализуется в опухолевые клетки посредством клеточного захвата, и т.п. Таким образом, антитело против GPR20 по настоящему изобретению можно конъюгировать с соединением, обладающим противоопухолевой активностью, через линкер, с получением конъюгата антитело-лекарственное средство.

[0051] Активность связывания антитела в отношении опухолевых клеток можно подтверждать посредством поточной цитометрии. Захват антитела в опухолевые клетки можно подтверждать посредством (1) анализа, визуализирующего захваченное клетками антитело под флуоресцентным микроскопом с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с терапевтическим антителом (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) анализа, определяющего величину флуоресценции в результате захвата клетками с использованием вторичного антитела (флуоресцентно меченного), связывающегося с терапевтическим антителом (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) или (3) анализа Mab-ZAP с использованием иммунотоксина, связывающегося с терапевтическим антителом, где токсин высвобождается при клеточном захвате, таким образом, подавляя клеточную пролиферацию (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000). В качестве иммунотоксина можно использовать рекомбинантный комплексный белок каталитической области дифтерийного токсина и белка G.

[0052] В настоящем описании термин "высокая способность к интернализации" используют для указания на то, что выживаемость (которая представляет собой соотношение относительно выживаемости клеток без добавления антитела, взятой за 100%) экспрессирующих GPR20 клеток, в которые вводили вышеупомянутое антитело и меченное сапорином антитело против IgG крысы предпочтительно составляет 70% или менее, и более предпочтительно 60% или менее.

[0053] Противоопухолевый конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению содержит конъюгированное соединение, демонстрирующее противоопухолевый эффект. Таким образом, предпочтительно, но не является необходимым, чтобы антитело само по себе обладало противоопухолевым эффектом. Для цели наличия специфической и селективной цитотоксичности противоопухолевого соединения в опухолевых клетках, важно и предпочтительно, чтобы антитело обладало свойством интернализации и перемещения в опухолевые клетки.

[0054] Антитело против GPR20 может быть получено путем иммунизации животного полипептидом, служащим в качестве антигена, способом, обычно используемым в данной области, а затем сбора и очистки антитела, продуцированного в живом организме. Поскольку GPR20 представляет собой семь раз проходящий через мембрану белок, в качестве антигена предпочтительно использовать GPCR, сохраняющий трехмерную структуру. Примеры такого способа могут включать способ иммунизации ДНК.

[0055] Источник антигена не ограничивается человеком, и, таким образом, животное также можно иммунизировать антигеном, происходящим из не являющегося человеком животного, такого как мышь или крыса. В этом случае антитело, пригодное для лечения заболевания человека, может быть выбрано путем исследования перекрестной реактивности полученного антитела, связывающегося с гетерологичным антигеном, в отношении антигена человека.

[0056] Более того, продуцирующие антитело клетки, которые продуцируют антитело против антигена, могут быть слиты с клетками миеломы согласно известному способу (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) получения гибридом, чтобы получить моноклональное антитело.

[0057] Далее способ получения антитела против GPR20 описан более подробно.

(1) Получение антигена

Антиген можно получать, позволяя клеткам-хозяевам экспрессировать ген, кодирующий антигенный белок, в зависимости от генетического манипулирования. В частности, получают вектор, способный экспрессировать ген антигена, а затем вектор вводят в клетки-хозяева, так что ген экспрессируется в них, а после этого экспрессированный антиген можно очищать. Антитело также можно получать способом иммунизации животного экспрессирующими антиген клетками посредством описанной выше генетической манипуляции, или клеточной линией, экспрессирующей антиген.

[0058] Альтернативно антитело также можно получать без использования антигенного белка путем включения кДНК антигенного белка в экспрессирующий вектор, затем введения экспрессирующего вектора животному, подлежащему иммунизации, и экспрессии антигенного белка в организме животного, иммунизированного таким образом, чтобы в нем продуцировалось антитело против антигенного белка.

[0059] (2) Получение моноклонального антитела против GPR20

Антитело против GPR20, используемое в рамках настоящего изобретения, конкретно не ограничено. Например, может использоваться антитело, определяемое аминокислотной последовательностью, представленной в списке последовательностей настоящей заявки. Антитело против GPR20, используемое в рамках настоящего изобретения, желательно представляет собой антитело, обладающее следующими свойствами:

(1) антитело, обладающее следующими свойствами:

(a) специфическое связывание с GPR20, и

(b) наличие активности интернализации в GPR20-экспрессирующие клетки путем связывания с GPR20;

(2) антитело согласно (1) выше или вышеупомянутое антитело, где GPR20 представляет собой GPR20 человека; и

(3) антитело, распознающее конформацию, состоящую из двух внеклеточных областей, имеющих аминокислотную последовательность в положениях 1-48 и аминокислотную последовательность в положениях 108-125, соответственно, от N-конца GPR20 человека, и обладающее активностью интернализации.

[0060] Способ получения антитела против GPR20 по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что может быть получено антитело против GPR20. Поскольку GPR20 представляет собой трансмембранный белок, предпочтительно использовать GPR20, сохраняющий конформацию в качестве антигена.

[0061] Один предпочтительный пример способа получения антитела может включать способ иммунизации посредством ДНК. Способ иммунизации посредством ДНК представляет собой подход, который вовлекает трансфекцию животного (например, мыши или крысы) экспрессирующей антиген плазмидой, а затем экспрессию антигена у индивидуума для индукции иммунитета против антигена. Подход трансфекции включает способ прямой инъекции плазмиды в мышцу, способ инъекции реагента для трансфекции, такого как липосома или полиэтиленимин, в вену, подход с использованием вирусного вектора, подход с инъекцией частиц, связанных с плазмидой, с использованием генной пушки, гидродинамический способ быстрой инъекции раствора плазмиды в большом количестве в вену и т.п. Что касается способа трансфекции для инъекции экспрессирующей плазмиды в мышцу, в качестве подхода для повышения уровней экспрессии известен способ, называемый электропорацией in vivo, который вовлекает применение электропорации к области внутримышечной инъекции плазмиды (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70 или Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7). В этом подходе дополнительно повышают уровни экспрессии путем обработки мышцы гиалуронидазой перед внутримышечной инъекцией плазмиды (McMahon JM, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70). Более того, получение гибридом можно проводить известным способом, а также его можно проводить с использованием, например, системы Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences, Inc.).

[0062] Конкретные примеры получения моноклонального антитела также могут включать следующие методики:

(a) иммунный ответ можно индуцировать путем включения кДНК GPR20 в экспрессирующий вектор (например, pcDNA3.1; Thermo Fisher Scientific Inc.), и прямого введения вектора животному (например, крысе или мыши) для иммунизации способом, таким как электропорация, или с использованием генной пушки, чтобы экспрессировать GPR20 в организме животного. Введение вектора посредством электропорации и т.п. можно проводить один или несколько раз, предпочтительно множество раз, если необходимо повысить титр антител;

(b) извлечение ткани (например, лимфатический узел), содержащей продуцирующие антитело клетки, из вышеупомянутого животного, у которого индуцирован иммунный ответ;

(c) получение клеток миеломы (далее называемых "миеломными клетками") (например, клетки миеломы мыши SP2/0-ag14);

(d) слияние клеток между продуцирующими антитело клетками и клетками миеломы;

(e) селекция группы гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело;

(f) разделение на отдельные клеточные клоны (клонирование);

(g) необязательно, культивирование гибридом для массовой продукции моноклональных антител, или выращивание животных, которым трансплантированы гибридомы; и

(h) исследование физиологической активности (активности интернализации) и специфичности связывания полученного таким образом моноклонального антитела или исследование свойств антитела в качестве реагента для мечения.

Примеры способа определения титра антитела, используемого в рамках в настоящего изобретения, могут включать, но не ограничиваются ими, проточную цитометрию и клеточный ELISA.

[0063] Примеры штамма гибридомы, полученного таким образом, могут включать гибридомы, продуцирующие антитело против GPR20, 04-046, 04-079 и 04-126. Следует отметить, что в настоящем описании антитело, продуцируемое гибридомой, продуцирующей антитело против GPR20, 04-046 обозначают как "антитело 04-046" или просто "04-046", антитело, продуцированное гибридомой 04-079, обозначают как "антитело 04-079" или просто "04-079", и антитело, продуцированное гибридомой 04-126, обозначают как "антитело 04-126" или просто "04-126".

[0064] Тяжелая цепь антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 45-54, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 118-131, в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-046 представлена на фиг.1.

[0065] Легкая цепь антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 108-116, в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-046 представлена на фиг. 2.

[0066] Тяжелая цепь антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 45-54, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 118-131, в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-079 представлена на фиг.3.

[0067] Легкая цепь антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 108-116, в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-079 представлена на фиг.4.

[0068] Тяжелая цепь антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 45-54, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 118-131, в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-126 представлена на фиг. 5.

[0069] Легкая цепь антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 108-116, в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:28 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-126 представлена на фиг.6.

[0070] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-046 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:32 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-046, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-046. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:32. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-046 представлена в SEQ ID NO:33 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:32 представлена на фиг.1.

[0071] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-046 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:34 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-046, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-046. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:34. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-046 представлена в SEQ ID NO:35 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:34 представлена на фиг. 2.

[0072] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-079 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:36 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-079, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-079. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:36. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-079 представлена в SEQ ID NO:37 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:36 представлена на фиг. 3.

[0073] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-079 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:38 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-079, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-079. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:38. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-079 представлена в SEQ ID NO:39 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:38 представлена на фиг. 4.

[0074] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-126 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:40 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426 кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-126, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-126. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:40. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-126 представлена в SEQ ID NO:41 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:40 представлена на фиг. 5.

[0075] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-126 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:42 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-126, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-126. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:42. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-126 представлена в SEQ ID NO:43 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:42 представлена на фиг. 6.

[0076] Более того, также в случае, когда стадии (a)-(h) в описанном выше разделе "(2) Получение моноклонального антитела против GPR20" проводят вновь для получения моноклонального антитела отдельно, и в случае, когда моноклональное антитело получают отдельно другими способами, можно получать антитело, обладающее активностью интернализации, эквивалентной активности интернализации антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126. Один пример такого антитела может включать антитело, связывающееся с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126. Если вновь полученное моноклональное антитело связывается с неполным пептидом или неполной трехмерной структурой, с которой связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126, может быть определено, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126. Более того, подтверждая, что моноклональное антитело конкурирует с антителом 04-046, антителом 04-079 или антителом 04-126 за связывание с GPR20 (т.е. моноклональное антитело препятствует связыванию антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126 с GPR20), может быть определено, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело против GPR20, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не определена. Когда подтверждают, что моноклональное антитело связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126, тогда можно с уверенностью ожидать, что моноклональное антитело обладает способностью связывать антиген, биологической активностью и/или активностью интернализации, эквивалентной активности интернализации антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126.

(3) Другие антитела

Антитело по настоящему изобретению также включает генетически рекомбинантные антитела, которые искусственным образом модифицированы для уменьшения гетерогенной антигенности у человека, такие как химерное антитело, гуманизированное антитело и антитело человека, а также описанное выше моноклональное антитело против GPR20. Эти антитела можно получать известными способами.

[0077] Примеры химерного антитела могут включать антитела, в которых вариабельная область и константная область являются гетерологичными друг для друга, такие как химерное антитело, образованное путем конъюгации вариабельной области антитела мыши или крысы с константной областью антитела человека (см. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).

[0078] Химерное антитело, происходящее из антитела крысы против GPR20 человека 04-046, представляет собой антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:8, и это химерное антитело может иметь любую данную константную область человека.

[0079] Химерное антитело, происходящее из антитела крысы против GPR20 человека 04-079, представляет собой антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:18, и это химерное антитело может иметь любую данную константную область человека.

[0080] Химерное антитело, происходящее из антитела крысы против GPR20 человека 04-126, представляет собой антитело, состоящее из тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:23, и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO:28, и это химерное антитело может иметь любую данную константную область человека.

[0081] Конкретные примеры химерного антитела, происходящего из антитела крысы против GPR20 человека 04-046, могут включать химерное антитело 04-046Ch (далее также обозначаемое как "04-046Ch"), образованное из антитела крысы против GPR20 человека 04-046. Аминокислотная последовательность антитела 04-046Ch может представлять собой антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 20-472 SEQ ID NO:44 в списке последовательностей, и легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, состоящую из положений 21-233 SEQ ID NO:45 в списке последовательностей. Следует отметить, что в последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:44 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из остатков в положениях 143-472, представляет собой константную область. Последовательность SEQ ID NO:44 представлена на фиг. 7. Более того, в последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:45 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128 представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Последовательность SEQ ID NO:45 представлена на фиг. 8.

[0082] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-046Ch кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:46 в списке последовательностей. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:46 в списке последовательностей, кодирует сигнальную последовательность антитела 04-046Ch. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:46 в списке последовательностей, кодирует последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-046Ch. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:46 в списке последовательностей, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-046Ch. Последовательность SEQ ID NO:46 представлена на фиг. 7. Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-046Ch кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:47 в списке последовательностей. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:47 в списке последовательностей, кодирует сигнальную последовательность антитела 04-046Ch. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:47 в списке последовательностей, кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-046Ch. Нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699 в нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:47 в списке последовательностей, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-046Ch. Последовательность SEQ ID NO:47 представлена на фиг. 8.

[0083] Примеры гуманизированного антитела могут включать антитело, полученное путем включения только определяющих комплементарность областей (CDR) в антитело человека (см. Nature (1986) 321, p. 522-525), антитело, полученное пересадкой аминокислотных остатков в некоторых каркасных областях, а также последовательностей CDR, в антитело человека в соответствии со способом пересадки CDR (международная публикация № WO90/07861), и антитело, полученное путем модификации аминокислотных последовательностей некоторых CDR при сохранении способности связывать антиген.

[0084] Однако гуманизированное антитело, происходящее из антитела 04-046, 04-079 или 04-126, не ограничивается конкретным гуманизированным антителом при условии, что оно сохраняет все 6 последовательностей CDR антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126 и обладает активностью интернализации. Более того, это гуманизированное антитело не ограничивается конкретным гуманизированным антителом при условии, что оно обладает активностью интернализации, в то время как аминокислотные последовательности некоторых CDR антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126 являются модифицированными.

[0085] Конкретные примеры гуманизированного антитела крысы 04-046 могут включать любую данную комбинацию: тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой из (1) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 20-142 в SEQ ID NO:48, 50, 52, 54 или 56 в списке последовательностей, (2) аминокислотной последовательности, обладающей гомологей по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (1); и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой из (4) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 21-129 в SEQ ID NO:58, 60, 62 или 64, (5) аминокислотной последовательности, обладающей гомологией по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанную выше аминокислотную последовательность (4).

Альтернативно также можно использовать антитело, имеющее гуманизированную тяжелую цепь или легкую цепь, и другую цепь, происходящую из антитела крысы или химерного антитела. Примеры такого антитела могут включать любую данную комбинацию: тяжелой цепи, состоящей из любой из (1) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 20-472 в SEQ ID NO:44 в списке последовательностей, (2) аминокислотной последовательности, обладающей гомологию по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (1); и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой из (4) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 21-129 в SEQ ID NO:58, 60, 62 или 64, (5) аминокислотной последовательности, обладающей гомологию по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (4). Другие примеры такого антитела могут включать любую данную комбинацию: тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи состоящий из любой из (1) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 20-142 в SEQ ID NO:48, 50, 52, 54 или 56 в списке последовательностей, (2) аминокислотной последовательности, обладающей гомологией по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (1); и легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой из (4) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 21-233 в SEQ ID NO:45 в списке последовательностей, (5) аминокислотной последовательности, обладающей гомологией по меньшей мере 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, содержащей делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (4). Следующие альтернативные его примеры могут включать антитело, состоящее из любой комбинации тяжелой цепи и легкой цепи, выбранной из следующих комбинаций (7)-(10): (7) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58, (8) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60, (9) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62, и (10) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64.

[0086] В SEQ ID NO:48 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 45-54 (GYTFTSYYIS), соответствует CDRH1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 69-78 (FINPGSGHTN), соответствует CDRH2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 118-131 (GAGGFLRIITKFDY), соответствует CDRH3. В SEQ ID NO:50 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 45-54 (GYTFTSYYIS), соответствует CDRH1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 69-78 (FINPGSGHTN), соответствует CDRH2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатки в положениях 118-131 (GAGGFLRIITKFDY), соответствует CDRH3. В SEQ ID NO:52 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 45-54 (GYTFTSYYIS), соответствует CDRH1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 69-78 (FINPGSGHTN), соответствует CDRH2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 118-131 (GAGGFLRIITKFDY), соответствует CDRH3. В SEQ ID NO:54 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 45-54 (GYTFTSYYIS), соответствует CDRH1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 69-78 (FINPGSGHTN), соответствует CDRH2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 118-131 (GAGGFLRIITKFDY), соответствует CDRH3. В SEQ ID NO:56 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 45-54 (GYTFTSYYIS), соответствует CDRH1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 69-78 (FINPGSGHTN), соответствует CDRH2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 118-131 (GAGGFLRIITKFDY), соответствует CDRH3.

[0087] В SEQ ID NO:58 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 44-54 (RASKSVSTYIH), соответствует CDRL1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 70-76 (SASNLES), соответствует CDRL2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях аминокислот 109-117 (QQINELPYT), соответствует CDRL3. В SEQ ID NO:60 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 44-54 (RASKSVSTYIH), соответствует CDRL1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 70-76 (SASNLES), соответствует CDRL2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях аминокислот 109-117 (QQINELPYT), соответствует CDRL3. В SEQ ID NO:62 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 44-54 (RASKSVSTYIH), соответствует CDRL1, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 70-76 (SASDRES), соответствует CDRL2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях аминокислот 109-117 (QQINELPYT), соответствует CDRL3. В SEQ ID NO:64 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 44-54 (RASKSVSTYIH), соответствует CDRL1 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 70-76 (SAGNLES), соответствует CDRL2, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях аминокислот 109-117 (QQINELPYT), соответствует CDRL3.

[0088] Следует отметить, что термин "несколько" используют в настоящем описании для обозначения от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, или 1 или 2.

[0089] Аминокислотная замена в настоящем описании предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, происходящую в пределах группы аминокислот, определяемой боковыми цепями аминокислот. Предпочтительными группами аминокислот являются следующие: кислотная группа = аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; основная группа = лизин, аргинин и гистидин; неполярная группа = аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан; и семейство незаряженных полярных аминокислот = глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин. Другие предпочтительные группы аминокислот являются следующими: алифатическая гидроксигруппа = серин и треонин; амидсодержащая группа = аспарагин и глутамин; алифатическая группа = аланин, валин, лейцин и изолейцин; и ароматическая группа = фенилаланин, триптофан и тирозин. Такую аминокислотную замену предпочтительно проводят без ухудшения свойств вещества, имеющего исходную аминокислотную последовательность.

[0090] Примеры антитела, имеющего предпочтительную комбинацию описанных выше тяжелых цепей и легких цепей, могут включать антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64, антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60, антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58, антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58, антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62, и антитело, состоящее из тяжелой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50, и легкой цепи, имеющей вариабельную область, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64.

[0091] Примеры антитела, имеющего более предпочтительную комбинацию, могут включать антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64, антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60, антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:54, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58, антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:56, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58, антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:56, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62, и антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64.

[0092] Путем комбинирования последовательностей, демонстрирующих высокую гомологию с описанными выше аминокислотными последовательностями тяжелой цепи и аминокислотными последовательностями легкой цепи, можно выбрать антитело, обладающее биологической активностью, эквивалентной биологической активности каждого из описанных выше антител. Такая гомология представляет собой гомологию, обычно составляющую 80% или более, предпочтительно 90% или более, более предпочтительно 95% или более, и наиболее предпочтительно 99% или более. Более того, также путем комбинирования друг с другом аминокислотных последовательностей, содержащих замену, делецию или вставку одного или нескольких аминокислотных остатков относительно аминокислотной последовательности тяжелой цепи или легкой цепи, можно выбрать антитело, обладающее биологической активностью, эквивалентной биологической активности каждого из описанных выше антител.

[0093] Гомология между двумя типами аминокислотных последовательностей может быть определена с использованием параметров по умолчанию алгоритма Blast версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, и David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Алгоритм Blast также можно использовать посредством доступа на www.ncbi.nlm.nih.gov/blast через интернет.

[0094] Следует отметить, что в аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:48, 50, 52, 54 или 56 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, представляет собой константную область. Последовательность SEQ ID NO:48 представлена на фиг. 9, последовательность SEQ ID NO:50 представлена на фиг. 10, последовательность SEQ ID NO:52 представлена на фиг. 11, последовательность SEQ ID NO:54 представлена на фиг. 12, и последовательность SEQ ID NO:56 представлена на фиг. 13.

[0095] Более того, в аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:58, 60, 62 или 64 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-129, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 130-234, представляет собой константную область. Последовательность SEQ ID NO:58 представлена на фиг. 14, последовательность SEQ ID NO:60 представлена на фиг. 15, последовательность SEQ ID NO:62 представлена на фиг. 16, и последовательность SEQ ID NO:64 представлена на фиг. 17.

[0096] Следующие примеры антитела по настоящему изобретению могут включать антитело человека, связывающееся с GPR20. Антитело человека против GPR20 означает антитело человека, имеющее только последовательность гена антитела, происходящую из хромосом человека. Антитело человека против GPR20 может быть получено способом с использованием мыши, продуцирующей антитела человека, имеющей хромосомный фрагмент человека, содержащий гены тяжелой цепи и легкой цепи антитела человека (см. Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. и Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727; и т.д.).

[0097] Такую продуцирующую антитело человека мышь, в частности, можно получить с использованием генетически модифицированного животного, эндогенные генные локусы тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина которого разрушены и вместо этого встроены генные локусы тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека с использованием вектора дрожжевой искусственной хромосомы (YAC) и т.п., затем получения животного с нокаутом и трансгенного животного из такого генетически модифицированного животного, а затем скрещивания таких животных друг с другом.

[0098] Альтернативно антитело человека против GPR20 также можно получать путем трансформации эукариотических клеток посредством кДНК, кодирующей каждую из тяжелой цепи и легкой цепи такого антитела человека, или предпочтительно вектора, содержащего кДНК, в соответствии со способами генетической рекомбинации, а затем культивирования трансформированных клеток, продуцирующих генетически модифицированное моноклональное антитело человека, таким образом, чтобы из культурального супернатанта можно было получить антитело.

[0099] В этом контексте в качестве хозяев можно использовать, эукариотические клетки, и предпочтительно клетки млекопитающих, например, такие как клетки CHO, лимфоциты или клетки миеломы.

[0100] Более того, также известен способ получения антитела человека, получаемого посредством фагового дисплея, которое отобрано из библиотеки антител человека (см. Wormstone, I.M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431; и т.д.).

[0101] Например, можно использовать способ фагового дисплея, который включает обеспечение экспрессии вариабельных областей антитела человека в качестве одноцепочечных антител (scFv) на поверхности фага, а затем селекцию фага, связывающегося с антигеном (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116).

[0102] Посредством анализа гена фага, который был отобран путем селекции вследствие его способности связываться с антигеном, можно определять последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антитела человека, связывающегося с антигеном.

[0103] После определения последовательности ДНК scFv, связывающегося с антигеном, получают экспрессирующий вектор, имеющий вышеупомянутую последовательность, а затем полученный экспрессирующий вектор встраивают в подходящего хозяина и позволяют ему экспрессироваться в нем, тем самым получая антитело человека (международные публикации № WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, и WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).

[0104] Если вновь полученное антитело человека связывается с неполным пептидом или неполной трехмерной структурой, с которой связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126, описанное в настоящем описании, может быть определено, что антитело человека связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126. Более того, подтверждая, что антитело человека конкурирует с антителом 04-046, антителом 04-079 или антителом 04-126 за связывание с GPR20 (т.е. антитело человека препятствует связыванию антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126 с GPR20), может быть определено, что антитело человека связывается с тем же эпитопом. с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126, даже если конкретная последовательность или структура эпитопа не определена. Когда подтверждают, что антитело человека связывается с тем же эпитопом, с которым связывается антитело 04-046, антитело 04-079 или антитело 04-126, тогда можно с уверенностью ожидать, что антитело человека должно иметь биологическую активность, эквивалентную биологической активности антитела 04-046, антитела 04-079 или антитела 04-126.

[0105] Химерные антитела, гуманизированные антитела или антитела человека, полученные описанными выше способами, оценивают в отношении их активности связывания антигена известным способом и т.д., так что можно отбирать предпочтительное антитело.

[0106] Один пример другого показателя для сравнения свойств антител может включать стабильность антитела. Дифференциальный сканирующий калориметр (DSC) представляет собой устройство, способное быстро и точно измерять среднюю температуру тепловой денатурации (Tm), которая служит хорошим индикатором относительной структурной стабильности белка. С использованием DSC для определения величин Tm и проведения сравнения в отношении полученных величин, можно сравнивать отличия в термической стабильности. Известно, что стабильность антитела при хранении имеет определенную корреляцию с термической стабильностью антитела (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273), и таким образом, предпочтительное антитело можно выбирать с использованием термической стабильности в качестве показателя. Другие примеры индикаторов для выбора антитела могут включать высокий выход в подходящих клетках-хозяевах и низкую агглютинацию в водном растворе. Например, поскольку антитело с наибольшим выходом не всегда демонстрирует наивысшую термическую стабильность, антитело, наиболее пригодное для введения человека, необходимо выбирать путем всестороннего его изучения на основе вышеупомянутых индикаторов.

[0107] Антитело по настоящему изобретению также включает модификацию антитела. Термин "модификация" используют для указания на антитело по настоящему изобретению, которое является химически или биологически модифицированным. Примеры такой химической модификации включают связывание химической части с аминокислотным скелетом и химическую модификацию N-связанной или O-связанной углеводной цепи. Примеры такой биологический модификации включают антитела, которые претерпели посттрансляционную модификацию (например, N-связанное или O-связанное гликозилирование, N-концевой или C-концевой процессинг, дезамидирование, изомеризация аспарагиновой кислоты и окисление метионина), и антитела, на N-конце которых добавлен остаток метионина в результате того, что его экспрессию обеспечивали с использованием прокариотических клеток-хозяев. Кроме того, подразумевается, что такая модификация также включает меченые антитела для обеспечения обнаружения и выделения антитела по настоящему изобретению или антигена, например, меченное ферментом антитело, флуоресцентно меченное антитело и меченное аффинной меткой антитело. Такая модификация антитела по настоящему изобретению является пригодной для повышения стабильности антитела и удержания его в крови, уменьшения антигенности, обнаружения или выделения антитела или антигена, и т.д.

[0108] Более того, посредством регуляции модификации сахарной цепи (гликозилирование, дефукозилирование и т.д.), которая связывается с антителом по настоящему изобретению, может быть усилена антителозависимая клеточная цитотоксическая активность. В качестве способов регуляции модификации сахарной цепи антитела, известны способы, описанные в международных публикациях № WO1999/54342, WO2000/61739 и WO2002/31140 и т.д., хотя эти способы не ограничиваются ими. Антитело по настоящему изобретению также включает антитела, в которых вышеупомянутая модификация сахарной цепи регулируется.

[0109] После выделения гена антитела ген можно вводить подходящему хозяину для продуцирования антитела с использованием подходящей комбинации хозяина и экспрессирующего вектора. Конкретным примером гена антитела может быть комбинация гена, кодирующего последовательность тяжелой цепи антитела, описанного в настоящем описании, и гена, кодирующего последовательность легкой цепи антитела, описанного в настоящем описании. При трансформации клеток-хозяев, такой ген последовательности тяжелой цепи и ген последовательности легкой цепи может встраиваться в один экспрессирующий вектор, или каждый из этих генов может встраиваться в различные экспрессирующие векторы.

[0110] Когда в качестве хозяев используют эукариотические клетки, можно использовать клетки животных, клетки растений или эукариотические микроорганизмы. В частности, примеры клеток животных могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки COS, которые представляют собой клетки обезьяны (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), фибробласты мыши NIH3T3 (ATCC № CRL-1658), линию клеток яичника китайского хомячка с дефицитом дигидрофолатредуктазы (клетки CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220) и клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.).

[0111] Когда в качестве хозяев используют прокариотические клетки, можно использовать, например, Escherichia coli или Bacillus subtilis.

[0112] Представляющий интерес ген антитела вводят в эти клетки для трансформации, а затем трансформированные клетки культивируют in vitro для получения антитела. При вышеупомянутом культивировании существуют случаи, когда выход различается в зависимости от последовательности антитела, и, таким образом, можно выбирать антитело, которое легко продуцируется, в качестве лекарственного средства, из антител, обладающих эквивалентной активностью связывания, с использованием выхода в качестве индикатора. Таким образом, антитело по настоящему изобретению также включает антитело, полученное описанным выше способом получения антитела, который включает стадию культивирования трансформированных клеток-хозяев и стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной на вышеупомянутой стадии.

[0113] Известно, что остаток лизина на С-конце тяжелой цепи антитела, продуцируемого в культивируемых клетках млекопитающих, удален (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), и также известно, что два аминокислотных остатка на С-конце тяжелой цепи: глицин и лизин, удалены, и что остаток пролина, расположенный на С-конце, является вновь амидированным (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Однако такая делеция и модификация этих последовательностей тяжелой цепи не влияет на активность связывания антигена и эффекторную функцию (активация комплемента, антителозависимая клеточная цитотоксичность и т.д.) антитела. Таким образом, антитело в соответствии с настоящим изобретением также включает антитело, которое подверглось вышеупомянутой модификации, и функциональный фрагмент антитела, и конкретные примеры такого антитела включают делеционный мутант, содержащий делецию 1 или 2 аминокислот на С-конце тяжелой цепи, и делеционный мутант, образованный амидированием вышеупомянутого делеционного мутанта (например, тяжелая цепь, в которой остаток пролина на С-конце амидирован). Однако делеционные мутанты, вовлекающие делецию на С-конце тяжелой цепи антитела в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются описанными выше делеционными мутантами при условии, что они сохраняют активность связывания антигена и эффекторную функцию. Две тяжелых цепи, составляющих антитело в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой любой тип тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из полноразмерного антитела и описанных выше делеционных мутаций, или они могут представлять собой комбинацию любых двух типов, выбранных из вышеупомянутой группы. На соотношение индивидуальных делеционных мутантов могут влиять типы культивируемых клеток млекопитающих, которые продуцируют антитело в соответствии с настоящим изобретением, и условия культивирования. Примеры основного ингредиента антитела в соответствии с настоящим изобретением могут включать антитела, где один аминокислотный остаток удален на каждом из С-концов двух тяжелых цепей.

[0114] Примеры изотипа антитела по настоящему изобретению могут включать IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Среди прочих, предпочтительными являются IgG1 и IgG2.

[0115] Примеры биологической активности антитела, обычно могут включать активность связывания антигена, активность интернализации в клетки, экспрессирующие антиген, посредством связывания с антигеном, активность нейтрализации антигена, активность усиления активности антигена, антителозависимую клеточную цитотоксическую (ADCC) активность, комплемент-зависимую цитотоксическую (CDC) активность, и антитело-зависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). Функцией антитела в соответствии с настоящим изобретением является активность связывания с GPR20 и предпочтительно активность интернализации в клетки, экспрессирующие GPR20, посредством связывания с GPR20. Более того, антитело по настоящему изобретению может обладать активностью ADCC, активностью CDC и/или активностью ADCP, а также активностью интернализации в клетки.

[0116] Полученное антитело можно очищать до однородного состояния. Для разделения и очистки антитела можно использовать способы разделения и очистки, используемые для обычных белков. Например, колоночную хроматографию, фильтрацию, ультрафильтрацию, высаливание, диализ, препаративный электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование надлежащим образом выбирают и комбинируют друг с другом, так что антитело можно выделять и очищать (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); и Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), хотя примеры способов разделения и очистки не ограничиваются ими.

[0117] Примеры хроматографии могут включать аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, обращено-фазовую хроматографию и абсорбционную хроматографию.

[0118] Эти способы хроматографии можно проводить с использованием жидкостной хроматографии, такой как ВЭЖХ или FPLC.

[0119] Примеры колонки, используемой для аффинной хроматографии, могут включать колонку с белком A и колонку с белком G. Примеры колонки, вовлекающей применение белка A, могут включать Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).

[0120] Также, используя носитель с иммобилизованным антигеном, антитело можно очищать на основе активности связывания антитела с антигеном.

[0121] 3. Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство

(1) Лекарственное средство

Антитело против GPR20, полученное согласно описанному выше разделу "2. Получение антитела против GPR20", можно конъюгировать с лекарственным средством через часть, представляющую собой линкерную структуру, с получением конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство. Лекарственное средство конкретно не ограничено при условии, что оно имеет заместитель или неполную структуру, которая может быть соединена с линкерной структурой. Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство можно использовать для различных целей в зависимости от конъюгированного лекарственного средства. Примеры такого лекарственного средства могут включать вещества, обладающие противоопухолевой активностью, вещества, эффективные от заболеваний крови, вещества, эффективные от аутоиммунных заболеваний, противовоспалительные вещества, противомикробные вещества, противогрибковые вещества, антипаразитарные вещества, противовирусные вещества и анестезирующие вещества.

[0122] (1)-1 Противоопухолевое соединение

Ниже описан пример применения противоопухолевого соединения в качестве соединения, подлежащего конъюгации в конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению. Противоопухолевое соединение конкретно не ограничено при условии, что соединение обладает противоопухолевым эффектом и имеет заместитель или неполную структуру, которая может быть соединена с линкерной структурой. При расщеплении части или целого линкера в опухолевых клетках часть, представляющая собой противоопухолевое соединение, высвобождается, так что противоопухолевое соединение демонстрирует противоопухолевый эффект. Когда линкер отщепляется в положении присоединения лекарственного средства, противоопухолевое соединение в его первоначальной структуре для осуществления его оригинального противоопухолевого эффекта.

[0123] Антитело против GPR20, полученное согласно описанному выше разделу "2. Получение антитела против GPR20", можно конъюгировать с противоопухолевым соединением через часть, представляющую собой линкерную структуру, с получением конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство.

[0124] В качестве одного примера противоопухолевого соединения, используемого в рамках настоящего изобретения, предпочтительно можно использовать экзатекан, производное камптотецина ((1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)-дион, соответствующий приведенной ниже формуле).

[0125]

[Формула 6]

[0126] Соединение можно без труда получать, например, способом, описанным в публикации патента США № US2016/0297890, или другими известными способами, и аминогруппу в положении 1 предпочтительно можно использовать в качестве положения для присоединения линкерной структуры. Кроме того, экзатекан может высвобождаться в опухолевых клетках, когда часть линкера все еще связана с ним. Однако соединение демонстрирует превосходный противоопухолевый эффект даже в таком состоянии.

[0127] Поскольку экзатекан обладает структурой камптотецина, известно, что в кислой водной среде (например, pH порядка 3) равновесие сдвигается в сторону структуры с образовавшимся кольцом лактона (закрытое кольцо), в то время как в щелочной водной среде (например, pH порядка 10) оно сдвигается в сторону структуры с открытым лактоновым кольцом (открытое кольцо). Ожидается, что конъюгат лекарственного средства, в который внесены остатки экзатекана, соответствующие такой структуре закрытого кольца и структуре открытого кольца, также обладает эквивалентным противоопухолевым эффектом, и само собой разумеется, что любой из таких конъюгатов лекарственного средства включен в объем настоящего изобретения.

[0128] Другие примеры противоопухолевого соединения могут включать противоопухолевые соединения, описанные в литературе (Pharmacological Reviews, 68, p. 3-19, 2016). Их конкретные примеры могут включать доксорубицин, калихеамицин, доластатин 10, ауристатины, такие как монометилауристатин E (MMAE) и монометилауристатин F (MMAF), майтанзиноиды, такие как DM1 и DM4, пирролобензодиазепин димер SG2000 (SJG-136), производное камптотецина SN-38, дуокармицины, такие как CC-1065, аманитин, даунорубицин, митомицин C, блеомицин, циклоцитидин, винкристин, винбластин, метотрексат, противоопухолевые средства на основе палладия (цисплатин и его производные), и таксол и его производные.

[0129] В конъюгате антитело-лекарственное средство количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела является ключевым фактором, влияющим на его эффективность и безопасность. Получение конъюгата антитело-лекарственное средство проводят путем точного установления условий реакции, таких как количества исходных материалов и реагентов, используемых для реакции, чтобы достигнуть постоянного количества конъюгированных молекул лекарственного средства. В отличие от химической реакции низкомолекулярного соединения, обычно получают смесь, содержащую различные количества конъюгированных молекул лекарственного средства. Количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела определяют и указывают в качестве средней величины, т.е. среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства. Если нет иных указаний, т.е. за исключением случая конъюгата антитело-лекарственное средство, имеющего определенное количество конъюгированных молекул лекарственного средства, которое включено в смесь конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих различные количества конъюгированных молекул лекарственного средства, количество конъюгированных молекул лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением обычно означает среднюю величину. Количество молекул экзатекана, конъюгированных с молекулой антитела, является контролируемым, и в качестве среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на антитело может быть конъюгировано приблизительно 1-10 молекул экзатекана. Количество молекул экзатекана предпочтительно составляет от 2 до 8, более предпочтительно от 5 до 8, еще более предпочтительно от 7 до 8, еще более предпочтительно 8. Следует отметить, что специалист в данной области может подобрать реакцию для конъюгации требуемого количества молекул лекарственного средства с молекулой антитела, исходя из описания примеров настоящей заявки, и может получить конъюгат антитело-лекарственное средство с контролируемым количеством конъюгированных молекул экзатекана.

[0130] (2) Линкерная структура

Ниже описана линкерная структура, которая конъюгирует лекарственное средство с антителом против GPR20 в конъюгате антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению.

[0131] В конъюгате антитело-лекарственное средство настоящей заявки линкерная структура, которая конъюгирует антитело против GPR20 с лекарственным средством, конкретно не ограничена при условии, что полученный конъюгат антитело-лекарственное средство можно использовать. Линкерную структуру можно выбирать соответствующим образом и использовать в соответствии с назначением. Один пример линкерной структуры может включать линкер, описанный в известной литературе (Pharmacol Rev 68: 3-19, January 2016, Protein Cell DOI 10,1007/s13238-016-0323-0 и т.д.). Следующие его примеры могут включать VC (валин-цитруллин), MC (малеимидокапроил), SMCC (сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат), SPP (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат, SS (дисульфид), SPDB (N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутират, SS/гидразон, гидразон и карбонат.

[0132] Другой пример линкерной структуры может включать линкерную структуру, описанную в публикации патента США № US2016/0297890 (в качестве одного примера, линкерные структуры, описанные в абзацах [0260]-[0289]). Предпочтительно можно использовать любую из линкерных структур, приведенных ниже. Следует отметить, что левый конец структуры представляет собой положение присоединения антитела, и его правый конец представляет собой положение присоединения лекарственного средства. Более того, GGFG в линкерных структурах, приведенных ниже, соответствует аминокислотной последовательности, состоящей из глицина-глицина-фенилаланина-глицина, связанных пептидными связями.

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0133] Более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

Еще более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

Антитело связано с концом -(сукцинимид-3-ил-N) (например, связь, противоположная (левая связь) связи, с которой соединен "-CH2CH2CH2CH2CH2-" в "-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-"), и противоопухолевое соединение связано с концом, противоположным концу, который образует -(сукцинимид-3-ил-N) (карбонильная группа CH2-O-CH2-C(=O)- на правом конце описанного выше примера). "-(сукцинимид-3-ил-N)-" имеет структуру, соответствующую следующей формуле:

[0134]

[Формула 7]

[0135] Положение 3 этой неполной структуры представляет собой положение присоединения антитела против GPR20. Это присоединение к антителу в положении 3 характеризуется образованием простой тиоэфирной связи. Атом азота в положении 1 этой части структуры соединен с атомом углерода метилена, который присутствует в линкере, включающем эту структуру.

[0136] В конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, имеющем экзатекан в качестве лекарственного средства, часть лекарственное средство-линкерная структура, имеющая любую структуру из приведенных ниже, является предпочтительной для конъюгации с антителом. Для этих частей лекарственное средство-линкерная структура, среднее количество конъюгированных молекул на антитело может составлять от 1 до 10 и предпочтительно составляет от 2 до 8, более предпочтительно от 5 до 8, еще более предпочтительно от 7 до 8, и еще более предпочтительно 8.

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX), и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

[0137] Более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

[0138] Еще более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).

[0139] Еще более предпочтительным является следующий:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)

[0140] (3) Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство

Антитело, которое можно использовать в конъюгате антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению, конкретно не ограничено при условии, что оно представляет собой антитело против GPR20, обладающее активностью интернализации, или функциональный фрагмент антитела, описанные в разделе "2. Получение антитела против GPR20" и в примерах.

[0141] Далее, способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению описан с помощью конкретных примеров. Следует отметить, что в приведенном ниже описании № соединения, показанный на каждой схеме реакции, используют для обозначения соединения. В частности, каждое соединение обозначают как "соединение формулы (1)", "соединение (1)" и т.п. То же самое справедливо для других №№ соединений.

[0142] (3)-1 Способ получения 1

Конъюгат антитело-лекарственное средство, соответствующий формуле (1), приведенной ниже, в котором антитело против GPR20 соединено с линкерной структурой через простой тиоэфир, можно получать путем реакции антитела, имеющего сульфгидрильную группу, конвертированную из дисульфидной связи посредством восстановления антитела против GPR20, с соединением (2), которое можно получить известным способом (например, которое можно получить способом, описанным в патентной публикации US2016/297890 (например, способ, описанный в абзацах с [0336] по [0374])). Этот конъюгат антитело-лекарственное средство можно получать, например, следующим способом.

[0143]

[Формула 8]

[0144]

где AB обозначает антитело с сульфгидрильной группой, где

L1 имеет структуру, соответствующую -(сукцинимид-3-ил-N)-, и

L1' обозначает малеимидильную группу, соответствующую следующей формуле.

[0145]

[Формула 9]

(3)

[0146] -L1-LX имеет структуру, соответствующую любой из следующих формул:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0147] Среди них более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0148] Еще более предпочтительными являются следующие:

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, и

-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

[0149] -(NH-DX) имеет структуру, соответствующую следующей формуле:

[0150]

[Формула 10]

[0151] и он обозначает группу, которая образована удалением одного атома водорода аминогруппы в положении 1 экзатекана. В описанной выше схеме реакции соединение формулы (1) можно интерпретировать как имеющее структуру, в которой одна часть структуры от лекарственного средства до конца линкера соединена с одним антителом. Однако это описание приведено только для удобства и в действительности существует множество случаев, в которых множество вышеупомянутых структурных частей соединены с одной молекулой антитела. То же самое справедливо для пояснения способа получения, описанного ниже.

[0152] В частности, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) можно получать путем реакции соединения (2), которое можно получать известным способом (например, получаемого способом, описанном в патентной публикации US2016/297890 (например, способ, описанный в абзацах с [0336] по [0374])), с антителом (3a), имеющим сульфгидрильную группу.

[0153] Сульфгидрильную группу на антителе (3a) можно обеспечивать способом, хорошо известным специалисту в данной области (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Примеры способа могут включать, но не ограничиваются ими, следующие: реагент Трота подвергают реакции с аминогруппой антитела; N-сукцинимидил S-ацетилтиоалканоаты подвергают реакции с аминогруппой антитела с последующей реакцией с гидроксиламином; N-сукцинимидил 3-(пиридилдитио)пропионат подвергают реакции с антителом с последующей реакцией с восстановителем; антитело подвергают реакции с восстановителем, таким как дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол или трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), для восстановления межцепочечной дисульфидной связи в антителе, с получением сульфгидрильной группы.

[0154] В частности, антитело с частично или полностью восстановленными межцепочечными дисульфидными связями, можно получать с использованием 0,3-3 молярных эквивалентов TCEP в качестве восстановителя на межцепочечную дисульфидную связь в антителе и реакции восстановителя с антителом в буферном растворе, содержащем хелатирующий агент. Примеры хелатирующего агента могут включать этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA). Хелатирующий агент можно использовать в концентрации от 1 мМ до 20 мМ. В качестве буферного раствора можно использовать раствор фосфата натрия, бората натрия, ацетата натрия и т.п. В качестве конкретного примера, антитело (3a), имеющее частично или полностью восстановленные сульфгидрильные группы, можно получать путем реакции антитела с TCEP при от 4°C до 37°C в течение от 1 до 4 часов.

[0155] Следует отметить, что путем проведения реакции присоединения сульфгидрильной группе к части лекарственное средство-линкер, часть лекарственное средство-линкер можно конъюгировать посредством простой тиоэфирной связи.

[0156] Затем с использованием 2-20 молярных эквивалентов соединения (2) на антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу, можно получать конъюгат антитело-лекарственное средство (1), в котором 2-8 молекул лекарственного средства конъюгированы на антитело. В частности, раствор, содержащий соединение (2), растворенное в нем, можно добавлять к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу, для реакции. В этом контексте в качестве буферного раствора можно использовать раствор ацетата натрия, раствор фосфата натрия, раствор бората натрия и т.п. Значение pH реакции составляет от 5 до 9, и более предпочтительно реакцию можно проводить при pH приблизительно 7. В качестве растворителя для растворения соединения (2) можно использовать органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), диметилацетамид (DMA) или N-метил-2-пирролидон (NMP). Реакцию можно проводить путем добавления раствора, содержащего соединение (2), растворенное в органическом растворителе в количестве от 1 до 20% об./об., к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу. Температура реакции составляет от 0 до 37°C, более предпочтительно от 10 до 25°C, и время реакции составляет от 0,5 до 2 часов. Реакцию можно останавливать инактивацией не вступившего в реакцию соединения (2) тиол-содержащим реагентом. Тиол-содержащий реагент представляет собой, например, цистеин или N-ацетил-L-цистеин (NAC). Более конкретно, реакцию можно останавливать добавлением от 1 до 2 молярных эквивалентов NAC к используемому соединению (2) и инкубации полученной смеси при комнатной температуре в течение от 10 до 30 минут.

[0157] (4) Идентификация конъюгата антитело-лекарственное средство

Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (например, конъюгат антитело-лекарственное средство (1)) можно подвергать концентрированию, замене буфера, очистке и определению концентрации антитела и среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в соответствии известными методиками, описанными ниже, для идентификации конъюгата антитело-лекарственное средство (1).

[0158] (4)- 1 Общая методика A: концентрирование водного раствора антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство

К контейнеру с Amicon Ultra (50000 MWCO, Millipore Corporation) добавляли раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство, и раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство концентрировали посредством центрифугирования (центрифугирование пи от 2000 G до 3800 G в течение от 5 до 20 минут) с использованием центрифуги (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)

[0159] (4)- 2 Общая методика B: Определение концентрации антитела

С использованием УФ-детектора (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) проводили определение концентрации антитела в соответствии с известным способом, определенным производителем. В этом отношении, использование коэффициент поглощения при 280 нм, различающийся среди антител (от 1,3 млмг-1см-1 до 1,8 млмг-1см-1).

[0160] (4)-3 Общая методика C: Замена буфера для антитела

Колонку NAP-25 (каталожный номер 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) с использованием носителя Sephadex G-25 уравновешивали фосфатным буфером (50 мМ, pH 6,0) (обозначаемый как PBS6,0/EDTA в настоящем описании), содержавшим хлорид натрия (50 мМ) и EDTA (2 мМ), в соответствии со способом, определенным изготовителем. Водный раствор антитела наносили в количестве 2,5 мл на колонку NAP-25, а после этого фракцию (3,5 мл), элюированную 3,5 мл PBS6,0/EDTA, собирали. Эту фракцию концентрировали с использованием общей методики A. После определения концентрации антитела с использованием общей методики B, концентрацию антитела доводили до 20 мг/мл с использованием PBS6,0/EDTA.

[0161] (4)-4 Общая методика D: очистка конъюгата антитело-лекарственное средство

Колонку NAP-25 уравновешивали любым коммерчески доступным буферным раствором, таким как ацетатный буфер, содержащий сорбит (5%) (10 мМ, pH 5,5; обозначаемый как ABS в настоящем описании). На колонку NAP-25 наносили водный реакционный раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (приблизительно 2,5 мл) и после этого проводили элюирование буферным раствором в количестве, указанном изготовителем, чтобы собрать фракцию антитела. Процесс гель-фильтрации, в котором собранную фракцию вновь наносили на колонку NAP-25 и проводили элюирование буферным раствором, повторяли всего 2 или 3 раза для получения конъюгата антитело-лекарственное средство, не включающего не конъюгированный линкер лекарственного средства и низкомолекулярные соединения (гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP), N-ацетил-L-цистеин (NAC) и диметилсульфоксид).

[0162] (4)-5 Общая методика E: определение концентрации антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство и среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела

Концентрацию конъюгированного лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство можно вычислять путем измерения УФ-поглощения водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при двух длинах волн, составляющих 280 нм и 370 нм, и проведения после этого вычисления, приведенного ниже.

[0163] Общее поглощение при любой данной длине волны равно сумме поглощений всех поглощающих свет химических структур, которые присутствуют в системе [аддитивность поглощения]. Таким образом, исходя из предположения, что коэффициенты молярного поглощения антитела и лекарственного средства не различаются до и после конъюгации между антителом и лекарственным средством, концентрация антитела и концентрация лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство определяется следующими уравнениями.

[0164]

A280=AD,280+AA,280D,280CD+εA,280CA, Уравнение (1)

A370=AD,370+AA,370D,370CDA,370CA, Уравнение (2)

[0165] В этом контексте A280 обозначает поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 280 нм, A370 обозначает поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 370 нм, AA,280 обозначает поглощение антитела при 280 нм, AA,370 обозначает поглощение антитела при 370 нм, AD,280 обозначает поглощение предшественника конъюгата при 280 нм, AD,370 обозначает поглощение предшественника конъюгата при 370 нм, εA,280 обозначает молярный коэффициент поглощения антитела при 280 нм, εA,370 обозначает молярный коэффициент поглощения антитела при 370 нм, εD,280 обозначает молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 280 нм, εD,370 обозначает молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 370 нм, CA обозначает концентрацию антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство, и CD обозначает концентрацию лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство.

[0166] В этом контексте, что касается εA,280, εA,370, εD,280 и εD,370, используют предварительно полученные величины (оцененные величины, исходя из вычисленных и измеренных величин, полученных путем УФ-измерения для соединения). Например, εA,280 можно оценивать из аминокислотной последовательности антитела известным способом вычисления (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). εA,370 обычно равен нулю. εD,280 и εD,370 можно получать в соответствии с законом Ламберта-Бэра (Поглощение = молярная концентрация × молярный коэффициент поглощения × длина пути в ячейке) путем определения поглощения раствора, в котором используемый предшественник конъюгата растворен в определенной молярной концентрации. CA и CD можно определять путем определения A280 и A370 водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство, а затем решения системы уравнений (1) и (2) путем вычитания этих величин. Кроме того, путем деления CD на CA можно определять среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства на антитело.

[0167] (4)-6 Общая методика F: определение среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство -(2)

Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство также можно определять с использованием анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) следующим способом в дополнение к вышеупомянутой "(4)-5 общей методике E". Далее описан способ определения среднего количества конъюгированных молекул лекарственного средства посредством ВЭЖХ, когда антитело конъюгируют со структурой лекарственное средство-линкер через дисульфидную связь. Специалист в данной области способен надлежащим образом измерить среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства посредством ВЭЖХ, в зависимости от паттерна соединения между антителом и линкером лекарственного средства, с помощью этого способа.

[0168] F-1. Получение образца для анализа посредством ВЭЖХ (восстановление конъюгата антитело-лекарственное средство)

Раствор конъюгата антитело-лекарственное средство (приблизительно 1 мг/мл, 60 мкл) смешивают с водным раствором дитиотреитола (DTT) (100 мМ, 15 мкл). Посредством инкубации смеси при 37°C в течение 30 минут расщепляют дисульфидную связь между легкой цепью и тяжелой цепью конъюгата антитело-лекарственное средство. Полученный образец используют в анализе ВЭЖХ.

[0169] F-2. Анализ ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ проводят в следующих условиях измерения.

[0170] Система ВЭЖХ: система ВЭЖХ Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.)

Детектор: Спектрометр поглощения в ультрафиолетовом излучении (длина волны измерения: 280 нм)

Колонка: ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2,1 × 50 мм, 1,7 мкм, 130 Ангстрем; Waters Corp., P/N 186002884)

Температура колонки: 80°C

Подвижная фаза A: водный раствор, содержащий 0,10% трифторуксусную кислоту (TFA) и 15% 2-пропанол

Подвижная фаза B: раствор в ацетонитриле, содержащий 0,075% TFA и 15% 2-пропанол

Программа градиента: 14%-36% (0 мин-15 мин), 36%-80% (15 мин-17 мин), 80%-14% (17 мин-17,01 мин) и 14% (17,01 мин-25 мин)

Инжектирование образца: 10 мкл

или

Система ВЭЖХ: система ВЭЖХ Agilent 1290 (Agilent Technologies, Inc.)

Детектор: Спектрометр поглощения в ультрафиолетовом излучении (длина волны измерения: 280 нм)

Колонка: PLRP-S (2,1 × 50 мм, 8 мкм, 1000 Ангстрем; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)

Температура колонки: 80°C

Подвижная фаза A: 0,04% водный раствор TFA

Подвижная фаза B: раствор в ацетонитриле, содержащий 0,04% TFA

Программа градиента: 29%-36% (0 мин-12,5 мин), 36%-42% (12,5 мин-15 мин), 42%-29% (15 мин-15,1 мин), и 29%-29% (15,1 мин-25 мин)

Инжектирование образца: 15 мкл

[0171] F-3. Анализ данных

F-3-1. Легкая цепь и тяжелая цепь антитела представлены как Li и Hi, соответственно, в соответствии с количеством конъюгированных молекул лекарственного средства (где i обозначает количество конъюгированных молекул лекарственного средства, т.е. количество конъюгированных молекул лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением обозначается как L0, L1, H0, H1, H2, H3 и т.д.)

По сравнению с неконъюгированной легкой (L0) и тяжелой (H0) цепями антитела, легкая цепь, связанная с одной молекулой лекарственного средства (L1), тяжелая цепь, связанная с одной молекулой лекарственного средства (H1), тяжелая цепь, связанная с двумя молекулами лекарственного средства (H2), и тяжелая цепь, связанная с тремя молекулами лекарственного средства (H3), демонстрируют более высокую гидрофобность пропорционально количеству конъюгированных молекул лекарственного средства и, таким образом, имеют большее время удержания. Таким образом, эти цепи элюируются в порядке L0 и L1, или H0, H1, H2 и H3. Пики обнаружения могут быть присвоены любому из L0, L1, H0, H1, H2 и H3 посредством сравнения времени удержания с L0 и H0.

[0172] F-3-2. Поскольку структура лекарственное средство-линкер поглощает УФ-излучение, в величины площади пика вносится поправка на количество конъюгированных молекул лекарственное средство-линкер в соответствии со следующим выражением с использованием молярных коэффициентов поглощения легкой цепи или тяжелой цепи и структуры лекарственное средство-линкер.

[0173]

[Выражение 1]

[0174]

[Выражение 2]

[0175] В этом контексте величину, оцененную из аминокислотной последовательности легкой цепи или тяжелой цепи каждого антитела с помощью известного способа вычисления (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423), можно использовать в качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) легкой цепи или тяжелой цепи антитела. В случае h046-H4e/L7, молярный коэффициент поглощения 26210 и молярный коэффициент поглощения 68990 использовали в качестве оцененных величин для легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно, в соответствии с аминокислотной последовательностью антитела. В качестве молярного коэффициента поглощения (280 нм) структуры лекарственное средство-линкер использовали фактически измеренный молярный коэффициент поглощения (280 нм) соединения, в котором малеинимидная группа конвертирована в простой тиоэфир сукцинимида посредством реакции каждой структуры лекарственное средство-линкер с меркаптоэтанолом или N-ацетилцистеином. Длина волны для измерения поглощения может быть надлежащим образом выбрана специалистом в данной области, однако предпочтительно она представляет собой длину волны, при которой может быть измерен пик антитела, и более предпочтительно 280 нм.

[0176] F-3-3. Соотношение площадей пиков (%) для каждой цепи вычисляют для всех величин площадей пика с внесенной поправкой в соответствии со следующим выражением.

[0177]

[Выражение 3]

[0178]

F-3-4. Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство вычисляют в соответствии со следующим выражением.

[0179] Среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства=(соотношение площадей пиков L0 × 0+соотношение площадей пиков L0 × 1+соотношение площадей пиков H0 × 0+соотношение площадей пиков H1 × 1+соотношение площадей пиков H2 × 2+соотношение площадей пиков H3 × 3)/100 × 2

[0180] Следует отметить, что для обеспечения требуемого количества конъюгата, множество конъюгатов, имеющих практически то же среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (например, порядка ±1), которые могут быть получены в сходных условиях, можно смешивать для получения новой партии. В этом случае среднее количество молекул лекарственного средства находится между средними количествами молекул лекарственного средства до смешения.

[0181] Один конкретный пример конъюгата антитело-лекарственное средство, используемый в рамках настоящего изобретения, может включать конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором часть лекарственное средство-линкерная структура, соответствующая формуле:

[0182]

[Формула 11]

[0183]

где A обозначает положение присоединения к антителу,

конъюгирована с антителом против GPR20, описанным в настоящем описании, через простую тиоэфирную связь.

В рамках настоящего изобретения, неполная структура, состоящая из линкера и лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство, также обозначается как "структура лекарственное средство-линкер", "часть лекарственное средство-линкерная структура" или "лекарственное средство-линкер". Эта структура лекарственное средство-линкер соединена с тиольной группой (иными словами, атом серы остатка цистеина), образованной в участке межцепочечной дисульфидной связи (два положения тяжелая цепь-тяжелая цепь и два положения тяжелая цепь-легкая цепь) антитела.

[0184] Один конкретный пример конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может включать конъюгат антитело-лекарственное средство, имеющий структуру, соответствующую следующей формуле:

[0185]

[Формула 12]

[0186]

или следующей формуле:

[0187]

[Формула 13]

[0188]

[0189] В этом контексте AB обозначает антитело против GPR20, описанное в настоящем описании, и антитело конъюгировано со структурой лекарственное средство-линкер через сульфгидрильную группу антитела. В этом контексте n имеет то же значение, что и так называемое DAR (соотношение лекарственного средства и антитела) и означает соотношение лекарственного средства и антитела на антитело. В частности, n обозначает количество конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела, которое представляет собой числовую величину, определенную и указанную в качестве средней величины, т.е. среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства. В случае конъюгата антитело-лекарственное средство, соответствующего [формуле 5 (т.е. формуле 13)] или [формуле 12] по настоящему изобретению, n может составлять от 2 до 8 и предпочтительно составляет от 5 до 8, более предпочтительно от 7 до 8, и еще более предпочтительно 8 при определении с использованием общей методики F.

[0190] Один пример конъюгата антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению может включать конъюгат антитело-лекарственное средство, имеющий структуру, соответствующую описанной выше формуле [формула 12] или [формула 13], где антитело, соответствующее AB, представляет собой антитело, имеющее тяжелую цепь и легкую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций с (a) по (y), или функциональный фрагмент антитела, или фармакологически приемлемую соль конъюгата антитело-лекарственное средство:

(a) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(b) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(c) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(d) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(e) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(f) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(g) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(h) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(i) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(j) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(k) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(l) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(m) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(n) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(o) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(p) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(q) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(r) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(s) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(t) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(u) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(v) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(w) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(x) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64, и

(y) антитело, имеющее любую комбинацию, выбранную из группы, состоящей из (a)-(x), где тяжелая цепь или легкая цепь содержит одну, или две, или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, O-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, C-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, присоединения остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина и делеции одной или двух аминокислот на С-конце.

[0191] 4. Лекарственное средство

Поскольку антитело против GPR20 по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела, описанные выше в разделе "2. Получение антитела против GPR20" и в примерах, связываются с GPR20 на поверхности опухолевых клеток и обладают активностью интернализации, их можно использовать в качестве лекарственного средства, и, в частности, в качестве терапевтического средства против злокачественной опухоли, такой как желудочно-кишечная стромальная опухоль, либо отдельно, либо в комбинации с дополнительным лекарственным средством.

[0192] Более того, антитело против GPR20 по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела можно использовать для обнаружения клеток, экспрессирующих GPR20.

[0193] Более того, поскольку антитело против GPR20 по настоящему изобретению или функциональный фрагмент антитела обладает активностью интернализации, его можно использовать в качестве антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство.

[0194] Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению, описанный выше в разделе "3. Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство" и в примерах, в котором в качестве лекарственного средства используется лекарственное средство, обладающее противоопухолевой активностью, такой как цитотоксическая активность, представляет собой конъюгат антитела против GPR20 и/или функционального фрагмента антитела, обладающего активностью интернализации, и лекарственного средства, обладающего противоопухолевой активностью, такой как цитотоксическая активность. Поскольку этот конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство демонстрирует противоопухолевую активность против злокачественных клеток, экспрессирующих GPR20, его можно использовать в качестве лекарственного средства и, в частности, в качестве терапевтического средства и/или профилактического средства против злокачественной опухоли.

[0195] Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению может поглощать влагу или преобразует адсорбированную воду, например, в гидрат, когда его оставляют на воздухе или подвергают методикам перекристаллизации или очистки. Такое соединение или его фармакологически приемлемая соль, содержащая воду, также включены в настоящее изобретение.

[0196] Когда конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению имеет основную группу, такую как аминогруппа, при желании он может образовывать фармакологически приемлемую кислотно-аддитивную соль. Примеры такой кислотно-аддитивной соли могут включать: гидрогалогениды, такие как гидрофторид, гидрохлорид, гидробромид и гидройодид; соли неорганических кислот, такие как нитрат, перхлорат, сульфат и фосфат; низшие алкансульфонаты, такие как метансульфонат, трифторметансульфонат и этансульфонат; арилсульфонаты, такие как бензолсульфонат и п-толуолсульфонат; соли органических кислот, такие как формиат, ацетат, трифторацетат, малат, фумарат, сукцинат, цитрат, тартрат, оксалат и малеат; и соли аминокислот, такие как соль орнитина, глутамат и аспартат.

[0197] Когда конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению имеет кислотную группу, такую как карбоксигруппа, при желании он может образовывать фармакологически приемлемую основно-аддитивную соль. Примеры такой основно-аддитивной соли могут включать: соли щелочных металлов, такие как соль натрия, соль калия и соль лития; соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция и соль магния; неорганические соли, такие как соль аммония; и соли органических аминов, такие как соли дибензиламина, соль морфолина, соль алкилового эфира фенилглицина, соль этилендиамина, соль N-метилглюкамина, соль диэтиламина, соль триэтиламина, соль циклогексиламина, соль дициклогексиламина, соль N,N'-дибензилэтилендиамина, соль диэтаноламина, соль N-бензил-N-(2-фенилэтокси)амина, соль пиперазина, соль тетраметиламмония исоль трис(гидроксиметил)аминометана.

[0198] Настоящее изобретение также может включать конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство, в котором один или несколько атомов, составляющих конъюгат антитело-лекарственное средство, заменены изотопами атомов. Существует два типа изотопов: радиоизотопы и стабильные изотопы. Примеры изотопа могут включать изотопы водорода (2H и 3H), изотопы углерода (11C, 13C и 14C), изотопы азота (13N и 15N), изотопы кислорода (15O, 17O и 18O) и изотопы фтора (18F). Композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный таким изотопом, является пригодной, например, в качестве терапевтического средства, профилактического средства, средства для научных исследований, реагента для анализа, диагностического средства и средства диагностической визуализации in vivo. Изобретение охватывает каждый конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный изотопом, и смеси конъюгатов антитело-лекарственное средство, меченных изотопом в любом данном соотношении. Конъюгат антитело-лекарственное средство, меченный изотопом, можно получать, например, с использованием исходного материала, меченного изотопом, вместо исходного материала для способа получения по настоящему изобретению, упомянутого выше, в соответствии со способом, известным в данной области.

[0199] Цитотоксичность in vitro можно определять, например, исходя из активности подавления пролиферативных ответов клеток. Например, линию злокачественных клеток, сверхэкспрессирующих GPR20, культивируют, и культивируемой системе добавляют конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство в различных концентрациях. После этого можно определять его активность супрессии в отношении образования очагов, образования колоний и сфероидного роста. В этом контексте, с использованием злокачественной клеточной линии, происходящей из желудочно-кишечной стромальной опухоли (GIST), можно исследовать активность подавления клеточной пролиферации против желудочно-кишечной стромальной опухоли.

Терапевтические эффекты in vivo в отношении злокачественной опухоли у экспериментального животного можно определять, например, путем введения конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство мышам nude, которым трансплантирована опухолевая клеточная линия, на высоком уровне экспрессирующая GPR20, а затем определения изменения в злокачественных клетках. В этом контексте, с использованием модели на животных на основе иммунодефицитных мышей с трансплантацией клеток, происходящих из желудочно-кишечной стромальной опухоли, можно определять терапевтические эффекты в отношении желудочно-кишечной стромальной опухоли.

[0200] Тип злокачественной опухоли, против которой применяют конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению, конкретно не ограничен при условии, что злокачественная опухоль экспрессирует GPR20 в злокачественных клетках, подлежащих устранению. Их примеры могут включать злокачественную опухоль органов пищеварительной системы, таких как пищевод, желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник, хотя злокачественная опухоль не ограничивается ими при условии, что злокачественная опухоль экспрессирует GPR20. Более предпочтительные примеры злокачественной опухоли могут включать желудочно-кишечную стромальную опухоль (GIST).

Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению предпочтительно можно вводить млекопитающему и более предпочтительно человеку.

[0201] Вещество, используемое в фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению, можно соответствующим образом выбирать и использовать подобно фармацевтическим добавкам или подобно тому, как обычно используют в данной области, с точки зрения введенной дозы или введенной концентрации.

[0202] Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить в качестве фармацевтической композиции, содержащей один или несколько фармацевтически совместимых компонентов. Например, фармацевтическая композиция обычно содержит один или несколько фармацевтических носителей (например, стерилизованные жидкости (например, вода и масло (в том числе минеральное масло и масло животного происхождения, растительного происхождения или синтетического происхождения (например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло)))). Когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно, более типичным носителем является вода. Также в качестве жидкого носителя можно использовать водный солевой раствор, водный раствор декстрозы и водный раствор глицерина, в частности, для инъекционного раствора. Подходящие фармацевтические носители известны в данной области. Если желательно, композиция также может содержать следовые количества увлажнителя, эмульгатора или pH-буферного средства. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin. Назначение соответствует пути введения.

[0203] Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению. Примеры пути введения могут включать, но не ограничиваются ими, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный пути. Введение можно проводить, например, посредством инъекции или болюсной инъекции. В соответствии с конкретным предпочтительным вариантом осуществления, введение описанного выше конъюгата антитело-лекарственное средство проводят посредством инъекции. Предпочтительным путем является парентеральное введение.

[0204] В соответствии с репрезентативным вариантом осуществления, фармацевтическую композицию назначают в качестве фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного введения человеку, в соответствии с общепринятыми методиками. Композиция для внутривенного введения, как правило, представляет собой раствор в стерильном и изотоническом водном буферном растворе. При необходимости лекарственное средство также может содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик для смягчения боли в области инъекции (например, лигнокаин). Как правило, описанные выше ингредиенты предоставляют, либо по отдельности, либо вместе в смеси, в единичной дозированной форме, в качестве лиофилизированного порошка или безводного концентрата, содержащегося в контейнере, который получают путем герметизации, например, в ампуле или саше с указанием количества активного вещества. Когда лекарственное средство подлежит введению путем инъекции, его можно вводить с использованием, например, бутылки для инъекций, содержащей воду или солевой раствор фармацевтической категории стерильности. Когда лекарственное средство подлежит введению посредством инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды или солевого раствора для инъекции, чтобы смешивать описанные выше ингредиенты друг с другом перед введением.

[0205] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую только конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство, описанный в настоящей заявке, или может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство и по меньшей мере одно другое терапевтическое средство против злокачественной опухоли. Конъюгат антитело против GPR20-лекарственное средство по настоящему изобретению также можно вводить вместе с дополнительным терапевтическим средством против злокачественной опухоли и, тем самым, можно усиливать эффект против злокачественной опухоли. Дополнительное средство против злокачественной опухоли, используемое для такой цели, можно вводить индивидууму одновременно, отдельно или непрерывно с конъюгатом антитело-лекарственное средство. В остальном, каждый из дополнительного средства против злокачественной опухоли и конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство можно вводить индивидууму с различными интервалами между введениями. Примеры такого терапевтического средства против злокачественной опухоли могут включать ингибиторы тирозинкиназы, включающие иматиниб, сунитиниб и регорафениб, ингибиторы CDK4/6, включающие пальбоциклиб, ингибиторы HSP90, включающие TAS-116, ингибиторы MEK, включающие MEK162, и ингибиторы иммунной точки контроля, включающие ниволумаб, пембролизумаб и ипилимумаб, хотя терапевтическое средство против злокачественной опухоли не ограничивается ими при условии, что лекарственное средство обладает противоопухолевой активностью.

[0206] Такую фармацевтическую композицию можно получать в качестве состава, имеющего определенную композицию и необходимую чистоту, в форме лиофилизированного состава или жидкого состава. Фармацевтическая композиция, полученная в качестве лиофилизированного состава, может представлять собой состав, содержащий соответствующую фармацевтическую добавку, используемую в данной области. Аналогично, жидкий состав можно получать таким образом, чтобы жидкий состав содержал различные фармацевтические добавки, используемые в данной области.

[0207] Композиция и концентрация фармацевтической композиции также варьируются в зависимости от способа введения. Что касается аффинности конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в отношении антигена, т.е. константы диссоциации (величины Kd) конъюгата антитело против GPR20-лекарственное средство в отношении антигена, по мере возрастания аффинности (т.е. величина Kd является низкой) фармацевтическая композиция может демонстрировать медицинские эффекты, даже если ее примененная доза снижается. Таким образом, примененная доза конъюгата антитело-лекарственное средство также может быть определена путем выбора применяемой дозы, исходя из аффинности конъюгата антитело-лекарственное средство в отношении антигена. Когда конъюгат антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению вводят человеку, его можно вводить в дозе, например, приблизительно от 0,001 до 100 мг/кг один раз или несколько раз с интервалами от 1 до 180 суток. Предпочтительно его можно вводить в дозе от 0,1 до 50 мг/кг и более предпочтительно от 1 до 15 мг/кг несколько раз с интервалами 2-3 недели.

Примеры

[0208] Далее настоящее изобретение подробно описано с помощью следующих примеров. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Более того, эти примеры не следует истолковывать как ограниченные каким-либо образом. Следует отметить, что в приведенных ниже примерах, если нет иных указаний, отдельные действия, касающиеся генетического манипулирования, проводились в соответствии со способом, описанным в "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., опубликована Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989), или другими способами, описанными в справочниках, используемых специалистами в данной области, или когда использовались коммерчески доступные реагенты или наборы, примеры проводились в соответствии с инструкциями, включенными в коммерчески доступные продукты. В настоящем описании реагенты, растворители и исходные материалы являются легко доступными из коммерческих источников, если нет иных указаний.

[0209] Пример 1: Получение антитела крысы против GPR20 человека, обладающего активностью интернализации

1)-1 Конструирование вектора, экспрессирующего GPR20 человека

С использованием кДНК, происходящей из головного мозга человека, в качестве матрицы амплифицировали кДНК, кодирующую белок GPR20 человека (NP_005284), посредством ПЦР в соответствии со способом, известным специалисту в данной области, и продукт амплификации встраивали в вектор для экспрессии у млекопитающих с получением экспрессирующего GPR20 человека вектора pcDNA3.1-hGPR20. Аминокислотная последовательность GPR20 человека представлена в SEQ ID NO:1 в списке последовательностей. Для крупномасштабного получения плазмидной ДНК of pcDNA3.1-hGPR20 использовали EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen N.V.).

[0210] 1)-2 Иммунизация крыс

Для иммунизации использовали самок крыс WKY/Izm в возрасте 6 недель (Japan SLC, Inc.). Сначала нижние конечности каждой крысы предварительно обрабатывали гиалуронидазой (Sigma-Aldrich Co. LLC), а после этого в те же области внутримышечно вводили экспрессирующий GPR20 человека вектор pcDNA3.1-hGPR20. Затем с использованием ECM830 (BTX) проводили электропорацию in vivo в тех же областях с использованием двухигольного электрода. Через две недели повторяли такую же электропорацию in vivo. На 79-е сутки из крысы извлекали лифматические узлы, а затем использовали для получения гибридомы.

[0211] 1)-3 Получение гибридомы

Клетки лимфатических узлов подвергали электрослиянию с клетками миеломы мыши SP2/0-ag14 с использованием Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences, Inc.), а затем клетки суспендировали и разбавляли средой ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies Inc.), а затем культивировали в условиях 37°C и 5% CO2. Индивидуальные колонии гибридом, которые появлялись в культуре, собирали в качестве моноклональных гибридом, затем суспендировали в среде ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies Inc.), а затем культивировали в условиях 37°C и 5% CO2. После умеренной пролиферации клеток получали замороженный исходный материал отдельных клеток гибридома, в то время как культуральный супернатант собирали с каждой гибридомы и использовали для скрининга гибридом, продуцирующих антитело против GPR20.

[0212] 1)-4 Скриринг продуцирующих антитела гибридом способом клеточного ELISA

1)-4-1 Получение клеток, экспрессирующих ген антигена, для применения в клеточном ELISA

Клетки 293α (стабильная экспрессирующая клеточная линия, происходящая из клеток HEK293, экспрессирующих интегрин αv и интегрин β3), получали в количестве 5×105 клеток/10 мл в среде DMEM, дополненной 10% FBS. В соответствии с методиками трансфекции с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.), ДНК pcDNA3.1-hGPR20 или pcDNA3.1 в качестве отрицательного контроля вводили в клетки 293α и клетки распределяли в количестве 100 мкл/лунка в 96-луночный планшет (Corning Inc.). После этого клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO2 в среде DMEM, дополненной 10% FBS, в течение от 24 до 27 часов. Полученные трансфицированные клетки использовали для клеточного ELISA в прикрепленном состоянии.

[0213] 1)-4-2 Клеточный ELISA

Культуральный супернатант клеток 293α, трансфицированных экспрессирующим вектором, полученным согласно примеру 1)-4-1, извлекали, а затем культуральный супернатант каждой гибридомы добавляли к клеткам 293α, трансфицированным либо pcDNA3.1-hGPR20, либо pcDNA3.1. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки в лунках промывали один раз посредством PBS (+), дополненного 5% FBS, и после этого в лунки добавляли антитело против IgG крысы с пероксидазой, продуцированное кроликом (Sigma-Aldrich Co. LLC), которое было разбавлено в 500 раз посредством PBS (+), дополненного 5% FBS. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки в лунках промывали три раза посредством PBS (+), дополненного 5% FBS, и после этого добавляли хромогенный раствор OPD (который был получен растворением o-фенилендиамина дигидрохлорида (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и H2O2 в растворе OPD (0,05 M трицитрат натрия, 0,1 M гидрофосфат натрия 12-вода; pH 4,5), чтобы концентрация вещества становилась 0,4 мг/мл и 0,6% (об./об.), соответственно) в количестве 100 мкл/лунка. Реакцию окрашивания проводили при периодическом перемешивании. После этого в планшет добавляли 1 M HCl (100 мкл/лунка) для остановки реакции окрашивания, а затем проводили измерение поглощения при 490 нм с использованием устройства для считывания планшетов (ENVISION: PerkinElmer, Inc.). Для селекции гибридом, которые продуцируют антитело, специфически связывающееся с GPR20 человека, экспрессируемым на поверхности клеточной мембраны, отбирали гибридомы, которые продуцировали культуральный супернатант, демонстрирующий более высокое поглощение в клетках 293α, трансфицированных экспрессирующим вектором pcDNA3.1-hGPR20, чем в клетках 293α, трансфицированных контрольной pcDNA3.1.

[0214] 1)-5 Скрининг антител, связывающих GPR20 человека, посредством проточной цитометрии

1)-5-1 Получение клеток, экспрессирующих ген антигена, для применения в анализе с использованием проточной цитометрии

Клетки 293T высевали в колбу объемом 225 см2 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) в количестве 5×104 клеток/см2, а затем клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2 в среде DMEM, дополненной 10% FBS. В клетки 293T вводили pcDNA3.1-hGPR20 или pcDNA3.1 в качестве отрицательного контроля с использованием Lipofectamine 2000, и клетки далее культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2. Клетки 293T, трансфицированные каждым экспрессирующим вектором, обрабатывали посредством TrypLE Express (Life Technologies Corp.) и клетки промывали DMEM, дополненной 10% FBS, а затем суспендировали в PBS, дополненном 5% FBS. Полученную суспензию клеток использовали в анализе с использованием проточной цитометрии.

[0215] 1)-5-2 Анализ с использованием проточной цитометрии

Специфичность связывания с GPR20 у антитела, продуцированного из гибридом, которые были определены как положительные посредством клеточного ELISA согласно примеру 1)-4-2, далее подтверждали проточной цитометрией. Суспензию клеток 293T с временной экспрессией, полученных согласно примеру 1)-5-1, центрифугировали, а затем супернатант удаляли. После этого клетки суспендировали добавлением культурального супернатанта из каждой гибридомы. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза посредством PBS, дополненного 5% FBS, и после этого клетки суспендировали добавлением конъюгата антитело против IgG крысы с FITC (Sigma-Aldrich Co. LLC), разбавленного в 500 раз посредством PBS, дополненного 5% FBS. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза PBS, дополненным 5% FBS, а затем ресуспендировали в PBS, дополненном 5% FBS и 2 мкг/мл 7-аминоактиномицина D (Molecular Probes, Inc.), с последующей детекцией с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали с использованием Flowjo (Tree Star, Inc.). После удаления погибших клеток из анализа путем гейтирования положительных по 7-аминоактиномицину D клеток, строили гистограмму интенсивности флуоресценции FITC в живых клетках. Гибридомы, продуцирующие антитела, связывающие GPR20 человека (178 клонов), отбирали, исходя из результатов, где гистограмма для антитела сдвигалась в сторону сильной интенсивности флуоресценции в клетках 293T, трансфицированных pcDNA3.1-hGPR20, по сравнению с клетками 293T, трансфицированными контрольной pcDNA3.1. На фиг. 18 представлены результаты для клонов № 04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-020, 04-021, 04-037, 04-046, 04-047, 04-060, 04-067, 04-068, 04-079, 04-084, 04-114, 04-115, 04-117, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139, 04-143, 04-145, 04-151 и 04-163, и контроля (без 1-го Ab) в качестве примеров антител, специфически связывающихся с GPR20 человека. По оси абсцисс на фиг. 18 представлен № клона, и по оси ординат представлено количество связавшегося антитела, исходя из MFI (средняя интенсивность флуоресценции).

[0216] 1)-6 Скрининг гибридомы, продуцирующей антитело против GPR20, обладающее активностью интернализации

Активность интернализации антител против GPR20 оценивали с использованием реагента антитела против IgG крысы Rat-ZAP (Advanced Targeting Systems), конъюгированного с токсином (сапорин), ингибирующим синтез белка. В частности, клетки 293α с индуцированной временной экспрессией GPR20 человека, высевали в количестве 3×103 клеток/лунка в 96-луночный планшет, а затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2. После охлаждения планшета на льду в каждую лунку добавляли 20 мкл культурального супернатанта каждой гибридомы, продуцирующей антитело против GPR20, и планшет оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. После удаления культурального супернатанта аспирированием в планшет добавляли DMEM, дополненную 10% FBS и 500 нг/мл Rat-ZAP, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO2 в течение 3 суток. Количество живых клеток определяли посредством количественного определения ATP с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак). В этом скрининге Rat-ZAP захватывается в клетки в зависимости от активности интернализации антитела крысы против GPR20, так что в клетках запускается синтез ингибирующего белка сапорина, подавляя пролиферацию клеток. В результате проведения селекции с использованием скорости подавления пролиферации клеток 60% или более в качестве индикатора было отобрано 19 гибридом (№ клонов: 04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-021, 04-037, 04-046, 04-047, 04-067, 04-068, 04-079, 04-114, 04-115, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139 и 04-163), продуцирующих антитела против GPR20, обладающие активностью интернализации.

[0217] 1)-7 Определение подкласса и типа моноклонального антитела крысы

Подклассы тяжелых цепей и типы легких цепей моноклональных антител крысы против GPR20 человека определяли с использованием набора RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). В результате было подтверждено, что клоны № 04-047 и 04-068 имели цепи IgG2a и κ, и что клоны № 04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-021, 04-037, 04-046, 04-067, 04-079, 04-114, 04-115, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139 и 04-163 имели цепи IgG2b и κ.

[0218] 1)-8 Получение антитела крысы против GPR20 человека

Моноклональные антитела крысы против GPR20 человека очищали из супернатантов гибридом.

[0219] Сначала объем каждой гибридомы, продуцирующей моноклональное антитело крысы против GPR20, в достаточной степени увеличивали с помощью среды ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies Inc.), и после этого среду заменяли на Hybridoma SFM (Life Technologies Corp.), дополненную 20% Ultra Low IgG FBS (Life Technologies Corp.). После этого гибридому культивировали в течение 4-5 суток. Полученный культуральный супернатант собирали и нерастворимый материал извлекали из него, пропуская через 0,8-мкм фильтр и через 0,2-мкм фильтр.

[0220] Антитело очищали из супернатанта гибридомы посредством аффинной хроматографии с белком G (от 4 до 6°C) за одну стадию. Стадию замены буфера после очистки посредством аффинной хроматографии с белком G проводили при 4-6°C. Сначала на колонку наносили культуральный супернатант гибридомы, которую затем заполняли белком G (GE Healthcare Biosciences Corp.), уравновешенным посредством PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора, колонку промывали PBS в количестве, в два или более раз превышающем объем колонки. Затем антитело элюировали посредством водного раствора 0,1 M глицин/HCl (pH 2,7), собирая фракцию, содержащую антитело. Сразу после этого pH собранной фракции доводили до 7,0-7,5 посредством добавления 1 M Tris-HCl (pH 9,0). После этого с использованием Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (предел молекулярной массы: UF30K, Sartorius Inc., от 4 до 6°C) буфер заменяли на PBS, одновременно концентрируя антитело, так что концентрацию антитела доводили до 0,2 мг/мл или более. Наконец, антитело фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.) с получением очищенного образца антитела.

[0221] Пример 2: оценка in vitro антитела крысы против GPR20

2)-1 Оценка способности связывания у антитела крысы против GPR20 посредством проточной цитометрии

Для оценки способности связывания GPR20, суспензию клеток 293T, трансфицированных pcDNA3.1-hGPR20, полученную способом, представленным в 1)-5-1, центрифугировали, а затем супернатант удаляли. После этого клетки суспендировали добавлением каждого из 19 моноклональных антител крысы против GPR20 человека (клоны №: 04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-021, 04-037, 04-046, 04-047, 04-067, 04-068, 04-079, 04-114, 04-115, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139 и 04-163), обладающих активностью интернализации, и 2 моноклональных антител крысы против GPR20 человека (13-024 и 13-048), полученных согласно примеру 1)-8, или контроля в виде IgG крысы (R&D Systems, Inc.). Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза посредством PBS, дополненного 5% FBS, а затем суспендировали добавлением конъюгата антитела козы против IgG крысы (H+L) с PE (Beckman Coulter, Inc.), разбавленного в 320 раз посредством PBS, дополненного 5% FBS. клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза PBS, дополненным 5% FBS, а затем подвергали детекции с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Результаты представлены на фиг. 19. На фиг. 19 по оси абсцисс представлена концентрация антитела (нМ), а по оси ординат представлено количество связавшегося антитела, исходя из MFI (средняя интенсивность флуоресценции). Как показано на фиг. 19, все количества антител крысы против GPR20 человека, связавшихся с клетками 293T, трансфицированными pcDNA3.1-hGPR20, возрастали зависимым от концентрации образом. С другой стороны, изотипические контрольные антитела крысы IgG2a и IgG2b не демонстрировали активности связывания GPR20.

[0222] 2)-2 Активность интернализации у антител крысы против GPR20

Активность интернализации у очищенных антител крысы против GPR20 оценивали с использованием реагента антитела против IgG крысы Rat-ZAP (Advanced Targeting Systems), конъюгированного с токсином (сапорин), ингибирующим синтез белка, аналогично тому, как в примере 1)-6. В частности, клетки HEK293, стабильно экспрессирующие белок GPR20-EGFP, содержащий GPR20 человека, связанный на его C-конце с EGFP, высевали в количестве 2,5×103 клеток/лунка, а затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2. После этого к культуре добавляли каждое антитело крысы против GPR20 (конечная концентрация: от 0,012 до 1 мкг /мл) и Rat-ZAP (конечная концентрация: 0,5 мкг/мл). Клетки культивировали в течение 5 суток и после этого количество живых клеток количественно определяли путем количественного определения ATP с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак). На эффект подавления пролиферации клеток, обеспечиваемый добавлением каждого антитела против GPR20, указывала относительная активность в отношении количества живых клеток без добавления антитела, принимаемая за 100%. Каждое антитело против GPR20 демонстрировало максимальное подавление пролиферации клеток, когда его добавляли в конечной концентрации 0,11 или 0,33 мкг/мл. На фиг. 20 представлена выживаемость клеток при концентрации, при которой каждое антитело демонстрировало максимальное подавление пролиферации клеток. Полагают, что антитела, обладающие высокой активностью интернализации в этом эксперименте, демонстрируют низкую выживаемость клеток. Изотипические контрольные антитела крысы IgG2a и IgG2b (R&D Systems, Inc.) использовали в качестве отрицательных контрольных антител, распознающих антиген, неродственный GPR20.

[0223] Пример 3: Определение нуклеотидной последовательности кДНК, кодирующей вариабельную область антитела крысы против GPR20

Нуклеотидную последовательность кДНК, кодирующую каждую из вариабельных областей 21 антитела крысы против GPR20 (04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-021, 04-037, 04-046, 04-047, 04-067, 04-068, 04-079, 04-114, 04-115, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139, 04-163, 13-024 и 13-048), оцененного в отношении его активности интернализации в примере 2, определяли следующим способом.

[0224] 3)-1 Синтез кДНК

Клеточный лизат каждой гибридомы, продуцирующей антитело против GPR20 (50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 250 мМ LiCl, 5 мМ EDTA (pH 8), 0,5% додецилсульфат лития (LiDS), 2,5 мМ дитиотреитол (DTT)) смешивали с конъюгированными с олигонуклеотидом dT25 магнитными гранулами (Dynabeads mRNA DIRECT Kit, Life Technologies Corp.), так что мРНК связывалась с магнитными гранулами. Затем магнитные гранулы промывали один раз раствором для промывания мРНК A (10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M LiCl, 1 мМ EDTA, 0,1% LiDS, 0,1% Triton X-100) и раствором для синтеза кДНК (50 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 5 мМ DTT, 0,5 мМ dNTP, 0,2% Triton X-100, 1,2 единицы ингибитора РНК-азы (Life Technologies Corp.)), с последующим синтезом кДНК в растворе для синтеза кДНК, в который добавлено 12 единиц обратной транскриптазы SuperScript III (Life Technologies Corp.). Затем магнитные гранулы промывали наращивающим 3'-конец реакционным раствором (50 мМ фосфат калия, 4 мМ MgCl2, 0,5 мМ dGTP, 0,2% Triton X-100, 1,2 единицы ингибитора РНК-азы (Life Technologies Corp.)), и после этого проводили реакцию наращивания 3'-конца с использованием реакционного раствора, в который добавлено 48 единиц рекомбинантной терминальной трансферазы (F. Hoffmann-La Roche, Ltd.).

[0225] 3)-2 Амплификация и секвенирование фрагментов генов вариабельной области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина крысы

Магнитные гранулы промывали раствором TE (10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ EDTA, 0,1% Triton X-100), и после этого гены тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина крысы амплифицировали посредством ПЦР 5'-RACE. В частности, магнитные гранулы переносили в реакционный раствор для ПЦР (0,2 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,25 единицы ДНК-полимераза PrimeSTAR HS (Takara Bio Inc.)), и реакцию проводили в течение 35 циклов, вовлекающих 94°C в течение 30 секунд и 68°C в течение 90 секунд. Использованные наборы праймеров были такими, как описано ниже. В последовательностях праймеров D обозначает смешанное основание, состоящее из A, G или T, и N обозначает смешанное основание из A, C, G или T.

[0226] Набор праймеров ПЦР (для тяжелой цепи)

5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-polyC-S) (SEQ ID NO:66)

5'-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS1) (SEQ ID NO:67)

5'-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3' (rIgγ-AS2) (SEQ ID NO:68)

Набор праймеров ПЦР (для легкой цепи)

5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3' (Nhe-polyC-S) (SEQ ID NO:66) (который был таким же, как и для тяжелой цепи)

5'-TCAGTAACACTGTCCAGGACACCATCTC-3' (rIgκ-AS) (SEQ ID NO:69)

[0227] Фрагменты, амплифицированные посредством описанной выше реакции ПЦР, секвенировали для анализа их нуклеотидных последовательностей. Олигонуклеотиды, имеющие нуклеотидные последовательности 5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3' (rIgγ-seq) (SEQ ID NO:70) и 5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCC-3' (rIgκ-seq) (SEQ ID NO:71), использовали в качестве праймера для секвенирования тяжелой цепи и праймера для секвенирования легкой цепи, соответственно.

Секвенирование проводили с использованием устройства для анализа последовательности генов ("ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems, Inc." или "Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems, Inc."). В реакции секвенирования использовали систему Dye Terminator Cycle Sequencing System с ДНК-полимеразой AmpliTaq (Life Technologies Corp.) и GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).

[0228] В результате сравнения аминокислотных последовательностей, спрогнозированных из определенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи 22 антител крысы против GPR20, антитела подразделяли на следующие 3 группы:

группа A (04-002, 04-006, 04-013, 04-014, 04-037, 04-046, 04-047, 04-067, 04-068, 04-079, 04-114, 04-125, 04-126, 04-127, 04-133, 04-139 и 04-163), группа B (04-021 и 04-115) и группа C (13-024 и 13-048).

Полноразмерные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи каждого антитела определяли путем связывания их с известными последовательностями константной области. Нуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность константной области IgG2b тяжелой цепи крысы использовали на основе нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности AABR03048905 (IGHG2B*01), описанной в IMGT, международной информационной системе ImMunoGeneTics (зарегистрированный торговый знак). Нуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность константной области IgK легкой цепи крысы использовали на основе нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности V01241 (IGKC*01), также описанной в этой системе.

[0229] Тяжелая цепь антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 45-54, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 118-131, в SEQ ID NO:2 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-046 представлена на фиг. 1.

[0230] Легкая цепь антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 108-116, в SEQ ID NO:7 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-046 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-046 представлена на фиг. 2.

[0231] Тяжелая цепь антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 45-4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 118-131, в SEQ ID NO:12 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:13 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:14 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:15 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:16 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-079 представлена на фиг. 3.

[0232] Легкая цепь антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 108-116, в SEQ ID NO:17 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-079 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:19 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:20 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:21 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-079 представлена на фиг. 4.

[0233] Тяжелая цепь антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-475, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 45-54, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-78, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 118-131, в SEQ ID NO:22 в списке последовательностей. Вариабельная область тяжелой цепи антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:23 в списке последовательностей. CDRH1 антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:24 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRH2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:25 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRH3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:26 в списке последовательностей. Более того, последовательность тяжелой цепи антитела 04-126 представлена на фиг. 5.

[0234] Легкая цепь антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 129-233, представляет собой константную область. Вышеупомянутая вариабельная область имеет CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 43-53, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 69-75, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях 108-116, в SEQ ID NO:27 в списке последовательностей. Вариабельная область легкой цепи антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:28 в списке последовательностей. CDRL1 антитела 04-126 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:29 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность CDRL2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:30 в списке последовательностей, и аминокислотная последовательность CDRL3 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:31 в списке последовательностей. Более того, последовательность легкой цепи 04-126 представлена на фиг. 6.

[0235] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-046 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:32 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:32 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-046, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-046. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:32. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-046 представлена в SEQ ID NO:33 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:32 представлена на фиг. 1.

[0236] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-046 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:34 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:34 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-046, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-046. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:34. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-046 представлена в SEQ ID NO:35 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:34 представлена на фиг. 2.

[0237] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-079 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:36 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:36 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-079, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-079. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:36. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-079 представлена в SEQ ID NO:37 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:37 представлена на фиг. 10.

[0238] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-079 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:38 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:38 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-079, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-079. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:38. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-079 представлена в SEQ ID NO:39 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:38 представлена на фиг. 4.

[0239] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела 04-126 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:40 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:40 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи антитела 04-126, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1425, кодирует константную область тяжелой цепи антитела 04-126. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 133-162, кодирующей CDRH1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-234, кодирующей CDRH2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 352-393, кодирующей CDRH3, в SEQ ID NO:40. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела 04-126 представлена в SEQ ID NO:41 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:40 представлена на фиг. 5.

[0240] Аминокислотная последовательность легкой цепи антитела 04-126 кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:42 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:42 в списке последовательностей, нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-384, кодирует вариабельную область легкой цепи антитела 04-126, и нуклеотидная последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 385-699, кодирует константную область легкой цепи антитела 04-126. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеупомянутую вариабельную область, имеет полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 127-159, кодирующей CDRL1, полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 205-225, кодирующей CDRL2, и полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности в положениях нуклеотидов 322-348, кодирующей CDRL3, в SEQ ID NO:42. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела 04-126 представлена в SEQ ID NO:43 в списке последовательностей. Более того, последовательность SEQ ID NO:42 представлена на фиг. 6.

[0241] Пример 4: Анализ участка связывания с GPR20 моноклонального антитела против GPR20

Участки связывания антител против GPR20 человека классифицировали путем определения их активности связывания с GPR20 мыши, меченным FLAG на N-конце GPR20 человека, и химерным GPR20 человека/мыши, в котором каждая из четырех внеклеточных областей (EC1, EC2, EC3, и EC4) GPR20 человека была заменена происходящей из GPR20 мыши последовательностью, соответственно, посредством клеточного ELISA. На фиг. 21 представлена диаграмма сравнения аминокислотных последовательностей GPR20 человека (NP_005284) и GPR20 мыши (NP_775541). Четыре внеклеточных области с EC1 по EC4 представлены посредством положений в аминокислотной последовательности GPR20 человека. EC1 соответствует положениям 1-48, EC2 соответствует положениям 108-125, EC3 соответствует положениям 190-196, и EC4 соответствует положениям 260-275.

[0242] 4)-1 Конструирование вектора, экспрессирующего GPR20 мыши

В соответствии со способом, известным специалисту в данной области, кДНК искусственно синтезировали на основе последовательности GPR20 мыши Ref Seq NM_173365, а затем клонировали в экспрессирующий вектор pcDNA-DEST40 (Invitrogen Corp.) для конструирования вектора pcDNA-mGPR20, экспрессирующего GPR20 мыши.

[0243] 4)-2 Конструирование векторов, экспрессирующих меченный FLAG на N-конце GPR20 человека и химерный GPR20 человека-мыши

4)-2-1

При конструировании экспрессирующих векторов, приведенных ниже, с использованием вектора pcDNA3.1-hGPR20, экспрессирующего полноразмерный GPR20 человека, полученного согласно примеру 1, в качестве матрицы, каждую реакцию ПЦР проводили с набором праймеров, указанным ниже. В этой реакции использовали ДНК-полимеразу KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) и реакцию проводили в течение 15 циклов или 10 циклов, вовлекающих в каждом случае 98°C в течение 10 секунд, 58°C в течение 30 секунд, и 68°C в течение 7 минут. После этого полученный продукт ПЦР обрабатывали ферментом рестрикции DpnI. Escherichia coli TOP10 (Invitrogen Corp.) трансформировали этой расщепленной DpnI ДНК для конструирования экспрессирующих векторов для меченного FLAG на N-конце GPR20 человека и GPR20 человека с EC2, или EC3, или EC4, замененным на последовательность, происходящую из GPR20 мыши. Набор праймеров, использованный в каждой реакции ПЦР, был следующим.

[0244] Набор праймеров для ПЦР (для меченного FLAG на N-конце GPR20 человека)

5'-GACTACAAAGACGATGACGACAAGCCCTCTGTGTCTCCAGC-3' (NFLAG-1; SEQ ID NO:72)

5'-CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGGTGGAGCCTGC-3' (NFLAG-2; SEQ ID NO:73)

Набор праймеров для ПЦР (для GPR20 человека с заменой EC2 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши)

5'-ACGCGCTTCGCTGTGTTCTACGGCGCCAG-3' (mEC2-1; SEQ ID NO:74)

5'-CTGGCGCCGTAGAACACAGCGAAGCGCGT-3' (mEC2-2; SEQ ID NO:75)

Набор праймеров для ПЦР (для GPR20 человека с заменой EC3 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши)

5'-TGTCGGTGCTGGGCGTGAAGTCGGGTGGACGATCATGCTGCCGTGTCTT-3' (mEC3-1; SEQ ID NO:76)

5'-AAGACACGGCAGCATGATCGTCCACCCGACTTCACGCCCAGCACCGACA-3' (mEC3-2; SEQ ID NO:77)

Набор праймеров для ПЦР для GPR20 человека с заменой EC4 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши)

5'-TGGCGCTGTGGCCCAACGTACCTAAGCACACGAGCCTCGTGGT-3' (mEC4-1; SEQ ID NO:78)

5'-ACCACGAGGCTCGTGTGCTTAGGTACGTTGGGCCACAGCGCCA-3' (mEC4-2; SEQ ID NO:79)

[0245] 4)-2-2

Экспрессирующий вектор для GPR20 человека с заменой EC1 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши, конструировали с использованием набора In-Fusion (зарегистрированный торговый знак) HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). В частности, с использованием вектора pcDNA3.1-hGPR20, экспрессирующего полноразмерный GPR20 человека, полученного согласно примеру 1, в качестве матрицы, реакцию ПЦР проводили с использованием набора праймеров, приведенного ниже, и ДНК-полимеразы KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) в течение 10 циклов, каждый из которых вовлекал 98°C в течение 10 секунд, 58°C в течение 30 секунд, и 68°C в течение 7 минут, для амплификации фрагмента ДНК, содержащего последовательность вектора.

Набор праймеров для ПЦР (для GPR20 человека с заменой EC1 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши - 1)

5'-GCGCTGATGGCGGTGCACGGAGCCATCT-3' (mEC1-1; SEQ ID NO:80)

5'-AGAGGGCATGGTGGAGCCTGCTTT-3' (mEC1-2; SEQ ID NO:81)

[0246] Также с использованием вектора pcDNA-mGPR20, экспрессирующего полноразмерный GPR20 мыши, сконструированного согласно 4)-1, в качестве матрицы, проводили реакцию ПЦР с набором праймеров, приведенным ниже, в течение 20 циклов, аналогично тому, как описано выше, для амплификации фрагмента ДНК, кодирующего область EC1 GPR20 мыши.

Набор праймеров для ПЦР (для GPR20 человека с заменой EC1 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши - 2)

5'-AGGCTCCACCATGCCCTCTGCGTTGTCTATGA-3' (mEC1-3; SEQ ID NO:82)

5'-CACCGCCATCAGCGCTTGCCACAGGCTGGGGAAGGTGGCTTGCA-3' (mEC1-4; SEQ ID NO:83)

Описанные выше два фрагмента ДНК подвергали агарозному гель-электрофорезу в соответствии со стандартным способом, и фрагменты ДНК, имеющие представляющий интерес размер, выделяли с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Promega Corp.). Эти два фрагмента ДНК подвергали отжигу посредством реакции фермента In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Inc.), и Escherichia coli TOP10 (Invitrogen Corp.) трансформировали продуктом лигирования для конструирования экспрессирующего вектора для GPR20 человека с заменой EC1 на последовательность, происходящую из GPR20 мыши.

[0247] 4)-3 Оценка свойств связывания у антитела против GPR20 человека посредством клеточного ELISA

Активность связывания антител против GPR20 04-046, 04-079, 04-126, 04-021, 13-024 и 13-048 с клетками 293α, в которые были временно введены различные векторы, экспрессирующие GPR20, исследовали тем же способом, что и способ клеточного ELISA, представленный в примере 1. Результаты определения представлены на фиг. 22(a) и 22(b). По оси абсцисс на фиг. 22, EV обозначает контроль, GPR20 человека обозначает клетки, экспрессирующие полноразмерный GPR20 человека, FLAG-huGPR20 обозначает клетки, экспрессирующие меченный FLAG на N-конце GPR20, GPR20 мыши обозначает клетки, экспрессирующие GPR20 мыши, hGPR20_mECD1 обозначает клетки, экспрессирующие химерный GPR20, в котором ECD1 человека GPR20 заменен на ECD1 GPR20 мыши, hGPR20_mECD2 обозначает клетки, экспрессирующие химерный GPR20, в котором ECD2 GPR20 человека заменен на ECD2 GPR20 мыши, hGPR20_mECD3 обозначает клетки, экспрессирующие химерный GPR20, в котором ECD3 GPR20 человека заменен на ECD3 GPR20 мыши, и hGPR20_mECD4 обозначает клетки, экспрессирующие химерный GPR20, в котором ECD4 GPR20 человека заменен на ECD4 GPR20 мыши.

[0248] Среди трех классификаций на основе сходства последовательностей антител, представленных в примере 3, 04-046, 04-079 и 04-126 в группе A не связывались с GPR20 мыши, и утрачивали активность связывания в результате замены EC1 (также обозначаемого как ECD1) или EC2 (также обозначаемого ECD2) GPR20 человека на последовательности, происходящие из GPR20 мыши. Это указывает на то, что 04-046, 04-079 и 04-126 распознают конформацию, состоящую из EC1 и EC2 GPR20.

[0249] 04-021 в группе B демонстрировало слабую активность связывания с GPR20 мыши, и активность связывания ослабевала до того же уровня, что и активность связывания с GPR20 мыши, в результате замены EC1 GPR20 человека на последовательность, происходящую из GPR20 мыши. Более того, 04-021 не демонстрировало активности связывания с меченным посредством FLAG на N-конце GPR20 человек, что указывает на то, что это антитело распознает N-конец EC1 GPR20 или соседние с ним области.

[0250] 13-024 и 13-048 в группе C не связывались с GPR20 мыши, и активность связывания значительно снижалась в результате замены EC1 GPR20 человека на происходящую из GPR20 мыши последовательность, что указывает на то, что эти антитела связываются с EC1.

[0251] Из описанного выше эксперимента, в таблице 1 представлено соответствие между внеклеточной областью GPR20, распознаваемой каждым антителом, и активностью интернализации (активность интернализации является более высокой, если выживаемость является более низкой) антитела, представленного на фиг. 20.

[0252]

[Таблица 1]

Классификация на группы на основе аминокислотной последовательности антитела № антитела Подкласс Выживаемость клеток (%) при оценке активности интернализации Распознаваемая внеклеточная область GPR20
A 04-126 IgG2b 54 EC1, EC2
A 04-114 IgG2b 57 EC1, EC2
A 04-046 IgG2b 57 EC1, EC2
A 04-067 IgG2b 58 EC1, EC2
A 04-002 IgG2b 60 EC1, EC2
A 04-014 IgG2b 60 EC1, EC2
A 04-163 IgG2b 61 EC1, EC2
A 04-139 IgG2b 61 EC1, EC2
A 04-079 IgG2b 62 EC1, EC2
A 04-006 IgG2b 63 EC1, EC2
A 04-127 IgG2b 63 EC1, EC2
A 04-125 IgG2b 64 EC1, EC2
A 04-013 IgG2b 67 EC1, EC2
A 04-133 IgG2b 67 EC1, EC2
A 04-047 IgG2a 69 EC1, EC2
B 04-021 IgG2b 70 N-конец EC1
A 04-037 IgG2b 71 EC1, EC2
C 13-048 IgG2b 74 EC1
A 04-068 IgG2a 76 EC1, EC2
C 13-024 IgG2b 77 EC1
B 04-115 IgG2b 86 N-конец EC1

[0253] Когда "распознаваемая внеклеточная область GPR20" в таблице указана посредством серии аминокислотных последовательностей GPR20 человека, EC1 соответствует положениям 1-48, EC2 соответствует положениям 108-125, EC3 соответствует положениям 190-196, и EC4 соответствует положениям 260-275. В результате исследования взаимосвязи между активностью интернализации (активность интернализации является более высокой, когда выживаемость клеток является более низкой) каждого антитела, и области, распознаваемой антителом против GPR20, было обнаружено, что все антитела, которые демонстрировали выживаемость клеток менее 70% и, таким образом, по-видимому имели высокую активность интернализации, представляли собой антитела группы A. Таким образом, было продемонстрировано, что антитела, которые демонстрируют высокую активность интернализации, сосредоточены в группе A антител, которые распознают конформацию, состоящую из EC1 и EC2 GPR20 человека. EC2 GPR20 человека отличался только остатком тирозина в положении 113 от остатка (фенилаланин) GPR20 мыши, что указывает на то, что антитела группы A, которые распознают конформацию, состоящую из EC1 и EC2, распознают этот остаток тирозина.

[0254] Пример 5: Получение химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch

5)-1 Конструирование вектора, экспрессирующего химерное антитело человека против GPR20

5)-1-1 Конструирование вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела

Фрагмент размером приблизительно 5,4 т.п.н., полученный путем расщепления плазмиды pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) ферментами рестрикции XbaI и PmeI, лигировали с фрагментом ДНК, содержащим последовательность ДНК (SEQ ID NO:84), кодирующую секреторный сигнал κ-цепи человека и константную область κ-цепи человека, с использованием набора для клонирования In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.) с получением pcDNA3.3/LK.

[0255] С использованием pcDNA3.3/LK в качестве матрицы ПЦР проводили с использованием набора праймеров, приведенного ниже, и полученный фрагмент размером приблизительно 3,8 т.п.н. фосфорилировали, а затем он самолигировался с образованием вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела, имеющего сигнальную последовательность, участок клонирования и последовательность ДНК константной области κ-цепи человека ниже промотора CMV.

Набор праймеров

5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3' (3.3-F1; SEQ ID NO:85)

5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3' (3.3-R1; SEQ ID NO:86)

[0256] 5)-1-2 Конструирование вектора pCMA-G1, экспрессирующего тяжелую цепь типа IgG1 гуманизированного антитела

Фрагмент ДНК, полученный путем расщепления pCMA-LK посредством XbaI и PmeI для удаления последовательности ДНК, кодирующей секреторный сигнал κ-цепи и константную область κ-цепи человека из него, лигировали с фрагментом ДНК, содержавшим последовательность ДНК (SEQ ID NO:87), кодирующую сигнальную последовательность тяжелой цепи человека и аминокислоты константной области IgG1 человека, с использованием набора для клонирования In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.), конструируя вектор pCMA-G1, экспрессирующий тяжелую цепь IgG1-типа химерного гуманизированного антитела, имеющий сигнальную последовательность, участок клонирования и последовательность ДНК константной области тяжелой цепи IgG1 человека ниже промотора CMV.

[0257] 5)-1-3 Конструирование вектора, экспрессирующего тяжелую цепь химерного антитела человека против GPR20

Вектор, экспрессирующий тяжелую цепь химерного антитела человека, конструировали на основе аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:3) вариабельной области тяжелой цепи антитела крысы против GPR20 04-046, определенной согласно примеру 3)-2. Синтезировали фрагмент ДНК, соответствующий нуклеотидным положениям 36-443, включающий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область, в нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO:46) тяжелой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК в качестве матрицы, фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи химерного антитела человека против GPR20, амплифицировали с использованием KOD -Plus-(Toyobo Co., Ltd.) и набора праймеров, приведенного ниже. С использованием набора In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.), амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в участок вектора pCMA-G1, экспрессирующего тяжелую цепь типа IgG1 химерного и гуманизированного антитела, расщепленную ферментом рестрикции BlpI, конструируя вектор, экспрессирующий тяжелую цепь химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/04-046Ch-H". Аминокислотная последовательность тяжелой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch представлена в SEQ ID NO:44. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:46 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:44 также представлены на фиг. 7.

Набор праймеров

5'-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3' (EG-Inf-F; SEQ ID NO:88)

5'-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3' (EG1-Inf-R; SEQ ID NO:89)

[0258] 5)-1-4 Конструирование вектора, экспрессирующего легкую цепь химерного антитела человека против GPR20

Вектор, экспрессирующий легкую цепь химерного антитела человека, конструировали на основе аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:8) вариабельной области легкой цепи антитела крысы против GPR20 04-046, определенной согласно примеру 3)-2. Синтезировали фрагмент ДНК, соответствующий нуклеотидным положениям 38-399, включая последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область в нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO:47) легкой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК в качестве матрицы, фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи химерного антитела человека против GPR20, амплифицировали с использованием KOD -Plus-(Toyobo Co., Ltd.) и набора праймеров, приведенного ниже. С использованием набора In-Fusion HD PCR cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.), амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в участок вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела, расщепленного ферментом рестрикции BsiWI, конструируя вектор, экспрессирующий легкую цепь химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/04-046Ch-L". Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch представлена в SEQ ID NO:45. Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:47 и аминокислотная последовательность SEQ ID NO:45 также представлены на фиг. 8.

Набор праймеров

5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (CM-LKF; SEQ ID NO:90)

5'-GGAGGGGGCGGCCACGGCTCTCTTCAGTTC-3' (046L-R; SEQ ID NO:91)

5)-2 Экспрессия и очистка химерного антитела человека против GPR20

5)-2-1 Экспрессия химерного антитела человека против GPR20

В соответствии с руководством, клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) культивировали и пассировали. 1,2×109 клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) на логарифмической фазе роста высевали в 3-л колбу Фернбаха-Эрленмейера (Corning Inc.), затем разбавляли средой для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) до 2,0×106 клеток/мл, и культивировали при встряхивании со скоростью 90 об/мин в инкубаторе с 8% CO2 при 37°C в течение 1 часа. 1,8 мг полиэтиленимина (Polyscience #24765) растворяли в 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Между тем, вектор, экспрессирующий тяжелую цепь (0,24 мг), и вектор, экспрессирующий легкую цепь (0,36 мг), полученные с использованием NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.) добавляли к 20 мл среды Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). К 20 мл смешанного раствора полиэтиленимин/Opti-Pro SFM добавляли 20 мл смешанного раствора экспрессирующий вектор/Opti-Pro SFM, и полученную смесь осторожно перемешивали. После инкубации в течение 5 минут смесь добавляли к клеткам FreeStyle 293F. Клетки культивировали при встряхивании со скоростью 90 об/мин в инкубаторе с 8% CO2 при 37°C в течение 4 часов, и после этого к культуре добавляли 600 мл среды EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences Inc.), 18 мл GlutaMAX I (GIBCO) и 30 мл дрожжевого ультрафильтрата (GIBCO). Клетки дополнительно культивировали при встряхивании со скоростью 90 об/мин в инкубаторе с 8% CO2 при 37°C в течение 7 суток. Полученный культуральный супернатант фильтровали через одноразовый капсульный фильтр (Advantec #CCS-045-E1H).

[0259] Химерное антитело человека против GPR20, полученное посредством комбинирования pCMA/04-046Ch-H и pCMA/04-046Ch-L, было названо "04-046Ch".

[0260] 5)-2-2 очистка 04-046Ch посредством двухстадийного процесса

Антитело очищали из культурального супернатанта, полученного согласно примеру 5)-2-1, посредством двухстадийного процесса, а именно аффинной хроматографии с rProtein A (при от 4 до 6°C) и с керамическим гидроксиапатитом (при комнатной температуре). Замену буфера после очистки посредством аффинной хроматографии с rProtein A и после очистки с использованием керамического гидроксиапатита проводили при от 4 до 6°C. Культуральный супернатант загружали в MabSelectSuRe (GE Healthcare Biosciences Corp., колонка HiTrap), уравновешенную PBS. После того, как весь культуральный раствор поступал в колонку, колонку промывали PBS в количестве, в два или более раз превышающем объем колонки. Затем проводили элюирование с использованием 2 M раствора гидрохлорида аргинина (pH 4,0), таким образом, чтобы собрать фракцию, содержавшую антитело. Эту фракцию подвергали диализу (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), заменяя буфер на PBS. После этого раствор антитела, разбавленный в 5 раз буфером 5 мМ фосфат натрия/50 мМ MES/pH 7,0, загружали в колонку с керамическим гидроксиапатитом (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column), уравновешенную буфером 5 мМ NaPi/50 мМ MES/30 мМ NaCl/pH 7,0. Элюирование проводили в линейном градиенте концентрации хлорида натрия, собирая фракцию, содержащую антитело. Эту фракцию подвергали диализу (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), заменяя буфер на HBSor (25 мМ гистидин/5% сорбит, pH 6,0). Антитело концентрировали с использованием центрифужного устройства с УФ-фильтром VIVASPIN20 (предел молекулярной массы: UF10K, Sartorius Inc., 4°C), тем самым доводя концентрацию IgG до 20 мг/мл или более. Наконец, антитело фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.) с получением очищенного образца.

[0261] 5)-3 Оценка активности связывания химерного антитела человека против GPR20

Активность связывания с GPR20 у полученного химерного антитела человека против GPR20 04-046Ch подтверждали проточной цитометрией. С использованием Lipofectamine 2000 pcDNA3.1-hGPR20 или pcDNA3.1 временно вводили в клетки 293T тем же способом, который использовался в примере 1)-5-1. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2, и после этого получали суспензию клеток. К полученной суспензии клеток добавляли химерное антитело человека против GPR20 04-046Ch или IgG человека в качестве отрицательного контроля, и полученную смесь оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. После этого клетки промывали два раза посредством PBS, дополненного 5% FBS, а затем суспендировали добавлением меченного PE-меченным F(ab')2 фрагментом антитела против IgG человека, специфичным к Fcγ (Jackson ImmunoResearch Inc.), разбавленным в 320 раз посредством PBS, дополненного 5% FBS. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза посредством PBS, дополненного 5% FBS, а затем ресуспендировали в PBS, дополненном 5% FBS, с последующей детекцией с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали с использованием Flowjo (Tree Star, Inc.). 04-046Ch связывалось с клетками 293T, трансфицированными pcDNA3.1-hGPR20, зависимым от концентрации антитела образом (фиг. 23(a)), без связывания с клетками 293T, трансфицированными отрицательным контролем pcDNA3.1 (фиг. 23(b)). По оси абсцисс на фиг. 23 представлена концентрация антитела, и по оси ординат представлена средняя интенсивность флуоресценции, указывающая на количество связанного антитела.

[0262] Пример 6: Получение гуманизированного антитела против GPR20

6)-1 Конструирование гуманизированной формы антитела против GPR20 04-046

6)-1-1 Молекулярное моделирование вариабельной области 04-046

Молекулярное моделирование вариабельных областей 04-046 проводили в соответствии со способом, известным в качестве моделирования по гомологии (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Первичные последовательности вариабельных областей иммуноглобулинов человека, зарегистрированных в банке данных Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) (доступны трехмерные структуры, установленные на основе рентгеновских кристаллических структур) сравнивали с вариабельными областями 04-046, определенными согласно примеру 3)-2. 1SY6 и 1LK3 выбирали в качестве последовательностей, обладающих наиболее высокой идентичностью последовательности с вариабельными областями тяжелой цепи и легкой цепи 04-046. Трехмерные структуры каркасных областей получали путем комбинирования друг с другом координат 1SY6 и 1LK3, соответствующих тяжелой цепи и легкой цепи 04-046, с получением "модели каркаса". После этого репрезентативную конформацию каждой CDR включали в модель каркаса. Наконец, для получения молекулярной модели с возможными вариабельными областями 04-046, проводили вычисление энергии для устранения атомного контакта, который был неблагоприятным с точки зрения энергии. Описанные выше методики проводили с использованием коммерчески доступной программы для анализа трехмерной структуры белка Discovery Studio (Accelrys Inc.).

[0263] 6)-1-2 Конструирование аминокислотной последовательности гуманизированного h046

Гуманизированное антитело 04-046 (далее называемое "гуманизированным h046") конструировали способом, общеизвестным как пересадка CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Акцепторное антитело выбирали на основе идентичности аминокислот в каркасных областях.

Последовательности каркасных областей 04-046 сравнивали с каркасными областями консенсусных последовательностей подгруппы последовательностей человека, определенных KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Консенсусные последовательности подгруппы 1 γ-цепей человека и подгруппы 1 κ-цепей человека обладали идентичностью последовательностей в их каркасных областях тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, и, исходя из этого, они были выбраны в качестве акцепторов. Что касается акцепторов, аминокислотные остатки в каркасных областях выравнивали с аминокислотными остатками 04-046, так что идентифицировали положения, в которых использовались различающиеся аминокислоты. Положения этих остатков анализировали с использованием трехмерной модели 04-046, сконструированной выше, и отбирали донорные остатки, подлежащие пересадке в акцепторы, исходя из критериев, приведенных в Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Отобранные таким образом несколько донорных остатков вносили в акцепторное антитело, конструируя последовательность гуманизированного h046, как описано в приведенных ниже примерах.

[0264] 6)-2 Гуманизация тяжелой цепи 04-046

6)-2-1 Гуманизированная тяжелая цепь типа h046-H4b

Гуманизированная тяжелая цепь h046, сконструированная путем замены глутамина в положении аминокислоты 24 на валин, лейцина в положении аминокислоты 30 на валин, аланина в положении аминокислоты 31 на лизин, серина в положении аминокислоты 35 на аланин, изолейцина в положении аминокислоты 39 на валин, лизина в положении аминокислоты 57 на аргинин, треонина в положениях аминокислот 40 и 59 на аланин, треонина в положении аминокислоты 60 на пролин, изолейцина в положении аминокислоты 67 на метионин, лизина в положении аминокислоты 86 на аргинин, аланина в положении аминокислоты 87 на валин, лейцина в положении аминокислоты 89 на изолейцин, валина в положении аминокислоты 91 на аланин, фенилаланина в положении аминокислоты 99 на треонин, глутамина в положении аминокислоты 101 на глутаминовую кислоту, треонина в положении аминокислоты 106 на аргинин, пролина в положении аминокислоты 107 на серин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 108 на глутаминовую кислоту, серина в положении аминокислоты 120 на треонин, изолейцина в положении аминокислоты 122 на валин, валина в положении аминокислоты 136 на треонин, и метионина в положении аминокислоты 137 на лейцин в SEQ ID NO:44 для части в виде вариабельной области (аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:44) в тяжелой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, была названа "гуманизированной тяжелой цепью типа h046-H4b" (также обозначаемой как "h046-H4b").

[0265] Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b представлена в SEQ ID NO:48 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности, представленной в последовательности SEQ ID NO:48, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 1-19, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, соответствует вариабельной области тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, соответствует константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:48, представлена в SEQ ID NO:49 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:49, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, соответствует последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416, соответствует последовательности, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:48 также представлена на фиг. 9.

[0266] 6)-2-2 Гуманизированная тяжелая цепь типа h046-H4e

Гуманизированная тяжелая цепь h046, сконструированная путем замены глутамин в положении аминокислоты 20 на глутаминовую кислоту, глутамина в положении аминокислоты 24 на валин, лейцина в положении аминокислоты 30 на валин, аланина в положении аминокислоты 31 на лизин, серина в положении аминокислоты 35 на аланин, изолейцина в положении аминокислоты 39 на валин, лизина в положении аминокислоты 57 на аргинин, треонина в положении аминокислоты 59 на аланин, треонина в положении аминокислоты 60 на пролин, изолейцина в положении аминокислоты 67 на метионин, лизина в положении аминокислоты 86 на аргинин, аланина в положениях аминокислот 68 и 87 на валин, лейцина в положении аминокислоты 89 на изолейцин, валина в положении аминокислоты 91 на аланин, фенилаланина в положении аминокислоты 99 на треонин, глутамина в положении аминокислоты 101 на глутаминовую кислоту, треонина в положении аминокислоты 106 на аргинин, пролина в положении аминокислоты 107 на серин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 108 на глутаминовую кислоту, серина в положении аминокислоты 120 на треонин, изолейцина в положении аминокислоты 122 на валин, валина в положении аминокислоты 136 на треонин, и метионина в положении аминокислоты 137 на лейцин в SEQ ID NO:44 для части в виде вариабельной области в тяжелой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, была названа "гуманизированной тяжелой цепью типа h046-H4e" (также обозначаемой как "h046-H4e").

Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e представлена в SEQ ID NO:50 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:50 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, соответствует вариабельной области тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, соответствует константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:50, представлена в SEQ ID NO:51 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:51, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, соответствует последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416, соответствует последовательности, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:50 также представлена на фиг. 10.

[0267] 6)-2-3 Гуманизированная цепь типа h046-H5b

Гуманизированная тяжелая цепь h046, сконструированная путем замены глутамина в положении аминокислоты 24 на валин, лейцина в положении аминокислоты 30 на валин, аланина в положении аминокислоты 31 на лизин, серина в положении аминокислоты 35 на аланин, изолейцина в положении аминокислоты 39 на валин, лизина в положении аминокислоты 57 на аргинин, треонина в положении аминокислоты 59 на аланин, треонина в положении аминокислоты 60 на пролин, изолейцина в положении аминокислоты 67 на метионин, лизина в положении аминокислоты 86 на аргинин, аланина в положении аминокислоты 87 на валин, лейцина в положении аминокислоты 89 на изолейцин, валина в положении аминокислоты 91 на аланин, фенилаланина в положении аминокислоты 99 нааспарагин, глутамина в положении аминокислоты 101 на глутаминовую кислоту, треонина в положении аминокислоты 106 на аргинин, пролина в положении аминокислоты 107 на серин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 108 на глутаминовую кислоту, серина в положении аминокислоты 120 на треонин, изолейцина в положении аминокислоты 122 на валин, валина в положении аминокислоты 136 на треонин, и метионина в положении аминокислоты 137 на лейцин в SEQ ID NO:44 для части в виде вариабельной области в тяжелой цепи химерного антитела 04-046Ch, была названа "гуманизированной тяжелой цепью типа h046-H5b" (также обозначаемой как "h046-H5b").

Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b представлена в SEQ ID NO:52 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:52 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, соответствует вариабельной области тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, соответствует константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:52, представлена в SEQ ID NO:53 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:53 последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, соответствует последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416, соответствует последовательности, кодирующей константную область тяжелой цепи. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:52 также представлена на фиг. 11.

[0268] 6)-2-4 Гуманизированная тяжелая цепь типа h046-H8

Гуманизированная тяжелая цепь h046, сконструированная путем замены фенилаланина в положении аминокислоты 80 на аспарагин относительно части в виде вариабельной области в тяжелой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, представленного в SEQ ID NO:44, была названа "гуманизированной тяжелой цепью типа h046-H8" (также обозначаемой как "h046-H8").

Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 представлена в SEQ ID NO:54 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:54 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, соответствует сигнальной последовательности, вариабельной области тяжелой цепи и константной области тяжелой цепи, соответственно. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:54, представлена в SEQ ID NO:55 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:55, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416, кодирует сигнальную последовательность, последовательность вариабельной области тяжелой цепи, и последовательность константной области тяжелой цепи, соответственно. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:54 также представлена на фиг. 12.

[0269] 6)-2-5 Гуманизированная тяжелая цепь типа h046-H10

Гуманизированная тяжелая цепь h046, сконструированная путем замены изолейцина в положении аминокислоты 39 на валин и фенилаланина в положении аминокислоты 99 на аспарагин в SEQ ID NO:44 относительно части в виде вариабельной области в тяжелой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, представленного в SEQ ID NO:44, была названа "гуманизированной тяжелой цепью типа h046-H10" (также обозначаемой как "h046-H10").

[0270] Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 представлена в SEQ ID NO:56 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:56 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-19, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 20-142, соответствует вариабельной области тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 143-472, соответствует константной области тяжелой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:56, представлена в SEQ ID NO:57 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:57 последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-57, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 58-426, кодирует вариабельную область тяжелой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 427-1416, кодирует константную область тяжелой цепи последовательность. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:56 также представлена на фиг. 13.

[0271] 6)-3 Гуманизация легкой цепи 04-046

6)-3-1 Гуманизированная легкая цепь типа h046-L1

Гуманизированная легкая цепь h046, сконструированная путем замены треонина в положении аминокислоты 22 на изолейцин, валина в положении аминокислоты 23 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 24 на метионин, аланина в положении аминокислоты 29 на серин, аланина в положении аминокислоты 31 на серин, валина в положении аминокислоты 32 на аланин, лейцина в положении аминокислоты 34 на валин, глутамина в положении аминокислоты 36 на аспарагиновую кислоту, серина в положении аминокислоты 41 на треонин, аргинина в положении аминокислоты 58 на лизин, серина в положении аминокислоты 59 на пролин, глутамина в положении аминокислоты 61 на лизин, глутамина в положении аминокислоты 62 на аланин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 95 на серин, пролина в положении аминокислоты 96 на серин, валина в положении аминокислоты 97 на лейцин, глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 98 на глутамин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 100 на глутаминовую кислоту, изолейцина в положении аминокислоты 102 на фенилаланин, аспарагина в положении аминокислоты 104 на треонин, аланина в положении аминокислоты 119 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 123 на валин, лейцина в положении аминокислоты 125 на изолейцин, и аланина в положении аминокислоты 128 на треонин, и встраивания серина между аминокислотами в положениях 29 и 30 в SEQ ID NO:45 для части в виде вариабельной области в легкой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, была названа "гуманизированной легкой цепью типа h046-L1" (также обозначаемой как "h046-L1)").

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа h046-L1 представлена в SEQ ID NO:58 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:58 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-129, соответствует вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 130-234, соответствует константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:58, представлена в SEQ ID NO:59 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:58, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-387, кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 388-702, кодирует последовательность константной области легкой цепи. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:58 также представлена на фиг. 14.

[0272] 6)-3-2 Гуманизированная легкая цепь типа h046-L2

Гуманизированная легкая цепь h046, сконструированная путем замены треонина в положении аминокислоты 22 на изолейцин, валина в положении аминокислоты 23 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 24 на метионин, аланина в положении аминокислоты 29 на серин, аланина в положении аминокислоты 21 на серин, валина в положении аминокислоты 32 на аланин, лейцина в положении аминокислоты 34 на валин, глутамина в положении аминокислоты 36 на аспарагиновую кислоту, серина в положении аминокислоты 41 на треонин, аргинина в положении аминокислоты 58 на лизин, серина в положении аминокислоты 59 на пролин, глутамина в положении аминокислоты 61 на лизин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 95 на серин, пролина в положении аминокислоты 96 на серин, валина в положении аминокислоты 97 на лейцин, глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 98 на глутамин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 100 на глутаминовую кислоту, изолейцина в положении аминокислоты 102 на фенилаланин, аспарагина в положении аминокислоты 104 на треонин, аланина в положении аминокислоты 119 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 123 на валин, лейцина в положении аминокислоты 125 на изолейцин, и аланина в положении аминокислоты 128 на треонин, и встраивания серина между аминокислотами в положениях 29 и 30, в SEQ ID NO:45 для части в виде вариабельной области в легкой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, была названа "гуманизированной легкой цепью типа h046-L2" (также обозначаемой как "h046-L2)").

Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа h046-L2 представлена в SEQ ID NO:60 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:60 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-129, соответствует вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 130-234, соответствует константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60, представлена в SEQ ID NO:61 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:61 последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-387, кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 388-702, кодирует последовательность константной области легкой цепи. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:60 также представлена на фиг. 15.

[0273] 6)-3-3 Гуманизированная легкая цепь типа h046-L6

Гуманизированная легкая цепь h046, сконструированная путем замены валина в положении аминокислоты 23 на глутамин, аланина в положении аминокислоты 29 на серин, аланина в положении аминокислоты 31 на серин, валина в положении аминокислоты 32 на аланин, лейцина в положении аминокислоты 34 на валин, глутамина в положении аминокислоты 36 на аспарагиновую кислоту, серина в положении аминокислоты 41 на треонин, аргинина в положении аминокислоты 58 на лизин, серина в положении аминокислоты 59 на пролин, глутамина в положении аминокислоты 61 на лизин, аспарагина в положении аминокислоты 72 на аспарагиновую кислоту, лейцина в положении аминокислоты 73 на аргинин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 95 на серин, пролина в положении аминокислоты 96 на серин, валина в положении аминокислоты 97 на лейцин, глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 98 на глутамин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 100 на глутаминовую кислоту, изолейцина в положении аминокислоты 102 на фенилаланин, аланина в положении аминокислоты 119 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 123 на валин, лейцина в положении аминокислоты 125 на изолейцин, и аланина в положении аминокислоты 128 на треонин, и встраивания серина между аминокислотами в положениях 29 и 30, в SEQ ID NO:45 для части в виде вариабельной области в легкой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, была названа "гуманизированной легкой цепью типа h046-L6" (также обозначаемой как "h046-L6").

[0274] Аминокислотная последовательность гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, представлена в SEQ ID NO:62 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:62 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-129, соответствует вариабельной вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 130-234, соответствует константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62, представлена в SEQ ID NO:63 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:63, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-387, кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 388-702, кодирует последовательность константной области легкой цепи. Аминокислотная последовательность CDRL2 (SASDRES) представлена в SEQ ID NO:92 в списке последовательностей.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:62 также представлена на фиг. 16.

6)-3-4 Гуманизированная легкая цепь типа h046-L7

Гуманизированная легкая цепь h046, сконструированная путем замены валина в положении аминокислоты 23 на глутамин, аланина в положении аминокислоты 29 на серин, аланина в положении аминокислоты 31 на серин, валина в положении аминокислоты 32 на аланин, лейцина в положении аминокислоты 34 на валин, глутамина в положении аминокислоты 36 на аспарагиновую кислоту, серина в положении аминокислоты 41 на треонин, аргинина в положении аминокислоты 58 на лизин, серина в положении аминокислоты 59 на пролин, глутамина в положении аминокислоты 61 на лизин, серина в положении аминокислоты 71 на глицин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 95 на серин, пролина в положении аминокислоты 96 на серин, валина в положении аминокислоты 97 на лейцин, глутаминовой кислоты в положении аминокислоты 98 на глутамин, аспарагиновой кислоты в положении аминокислоты 100 на глутаминовую кислоту, изолейцина в положении аминокислоты 102 на фенилаланин, аланина в положении аминокислоты 119 на глутамин, лейцина в положении аминокислоты 123 на валин, лейцина в положении аминокислоты 125 на изолейцин, и аланина в положении аминокислоты 128 на треонин, и встраивания серина между аминокислотами в положениях 29 и 30 для части в виде вариабельной области в легкой цепи химерного антитела человека 04-046Ch, представленной в SEQ ID NO:45, была названа "гуманизированной легкой цепью типа h046-L7" (также обозначаемой как "h046-L7)").

[0275] Аминокислотная последовательность гуманизированноя легкой цепи типа h046-L7 представлена в SEQ ID NO:64 в списке последовательностей. В аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64 последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 1-20, соответствует сигнальной последовательности, последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 21-129, соответствует вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 130-234, соответствует константной области легкой цепи. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность SEQ ID NO:64, представлена в SEQ ID NO:65 в списке последовательностей. В нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:65 последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 1-60, кодирует сигнальную последовательность, последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 61-387, кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи, и последовательность, состоящая из нуклеотидов в положениях 388-702, кодирует последовательность константной области легкой цепи. Аминокислотная последовательность CDRL2 (SAGNLES) представлена в SEQ ID NO:93 в списке последовательностей.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:64 также представлена на фиг. 17.

[0276] 6)-4 Конструирование гуманизированного h046 путем комбинирования тяжелой цепи и легкой цепи

Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4e/L1" (также обозначаемым как "h046-H4e/L1"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4e/L2" (также обозначаемым как "h046-H4e/L2"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4e/L6" (также обозначаемым как "h046-H4e/L6"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4e и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4e/L7" (также обозначаемым как "h046-H4e/L7"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4b/L1" (также обозначаемым как "h046-H4b/L1"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4b/L2" (также обозначаемым как "h046-H4b/L2"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4b/L6" (также обозначаемым как "h046-H4b/L6"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H4b/L7" (также обозначаемым как "h046-H4b/L7"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H5b/L1" (также обозначаемым как "h046-H5b/L1"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H5b/L2" (также обозначаемым как "h046-H5b/L2"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H5b/L6" (также обозначаемым как "h046-H5b/L6"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H5b/L7" (также обозначаемым как "h046-H5b/L7"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H8/L1" (также обозначаемым как "h046-H8/L1"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H8/L2" (также обозначаемым как "h046-H8/L2"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H8/L6" (также обозначаемым как "h046-H8/L6"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H8/L7" (также обозначаемым как "h046-H8/L7"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H10/L1" (также обозначаемым как "h046-H10/L1"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H10/L2" (также обозначаемым как "h046-H10/L2"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H10/L6" (также обозначаемым как "h046-H10/L6"). Антитело, состоящее из гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "гуманизированным h046-H10/L7" (также обозначаемым как "h046-H10/L7"). Антитело, состоящее из химерной тяжелой цепи человека c046 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L1, было сконструировано и названо "химерным c046/L1 человека" (также обозначаемым как "h046-Hwt/L1"). Антитело, состоящее из химерной тяжелой цепи человека c046 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L2, было сконструировано и названо "химерным c046/L2 человека" (также обозначаемым как "h046-Hwt/L2"). Антитело, состоящее из химерной тяжелой цепи человека c046 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L6, было сконструировано и названо "химерным c046/L6 человека" (также обозначаемым как "h046-Hwt/L6"). Антитело, состоящее из химерной тяжелой цепи человека c046 и гуманизированной легкой цепи типа h046-L7, было сконструировано и названо "химерным c046/L7 человека" (также обозначаемым как "h046-Hwt/L7"). Антитела, сконструированные таким образом, можно получать в соответствии с примерами 6)-5 и 6)-7, и можно оценивать в соответствии с примерами 6)-6, 8) и 9).

[0277] 6)-5 Экспрессия гуманизированного антитела против GPR20 -(1)

6)-5-1 Конструирования вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь h046

6)-5-1-1 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H4b

Синтезировали фрагмент A ДНК, представленный в SEQ ID NO:94 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). Синтезированный фрагмент ДНК встраивали в участок вектора pCMA-G1, экспрессирующего тяжелую цепь типа IgG1 химерного и гуманизированного антитела, расщепленного ферментом рестрикции BlpI, тем же способом, который использовался в соответствии с примером 5)-1-3, конструируя плазмиду A. Вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H4b, конструировали путем внесения мутации с использованием набора KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.) с использованием плазмиды A в качестве матрицы и с использованием набора праймеров, приведенного ниже. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-H4b". Нуклеотидная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H4b представлена в SEQ ID NO:49, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:48.

Набор праймеров:

5'-ATCAACCCTGGCAGCGGCCACACCAACTAC-3' (Hb-F; SEQ ID NO:95)

5'-GAAGCCCATGTACTTCAGGCCCTGTCCAGGGG-3' (Hb-R; SEQ ID NO:96)

6)-5-1-2 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H5b

Синтезировали фрагмент B ДНК, представленный в SEQ ID NO:97 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). Синтезированный фрагмент ДНК встраивали в участок вектора pCMA-G1, экспрессирующего тяжелую цепь типа IgG1 химерного и гуманизированного антитела, расщепленного ферментом рестрикции BlpI, тем же способом, который использовался в соответствии с примером 5)-1-3, конструируя плазмиду B. В плазмиду B в качестве матрицы вносили мутацию тем же способом, который использовался в соответствии с 6)-5-1-1, конструируя вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H5b. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-H5b". Нуклеотидная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H5b представлена в SEQ ID NO:53, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:52.

[0278] 6)-5-1-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H8

В pCMA/04-046Ch-H, сконструированный согласно примеру 5)-1-3, в качестве матрицы вносили мутацию с использованием набора праймеров, приведенного ниже, и набора KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.), конструируя вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H8. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-H8". Нуклеотидная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H8 представлена в SEQ ID NO:55, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:54.

Набор праймеров:

5'-AACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCCCCGACGAC-3' (H08-F; SEQ ID NO:98)

5'-GGCGGTGCTGCTGCTCTTGTCCACGGTCAG-3' (H08-R; SEQ ID NO:99)

6)-5-1-4 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H10

В pCMA/h046-H8, сконструированный согласно примеру 6)-5-1-3, в качестве матрицы, вносили мутацию с использованием набора праймеров, приведенного ниже, и набора KOD -Plus- Mutagenesis Kit (Toyobo Co., Ltd.), конструируя вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H10. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-H10". Нуклеотидная последовательность гуманизированной тяжелой цепи типа h046-H10 представлена в SEQ ID NO:57, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO:56.

5'-GTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACC-3' (H10-F; SEQ ID NO:100)

5'-CTTCACGCTGCTGCCAGGCTTGGCCAGTTC-3' (H10-R; SEQ ID NO:101).

[0279] 6)-5-2 Конструирование вектора, экспрессирующего легкую цепь h046

6)-5-2-1 Конструирования вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L1

Синтезировали фрагмент ДНК, соответствующий положениям нуклеотидов 37-402, включающий последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область в нуклеотидной последовательности гуманизированной h046-L1, представленной в SEQ ID NO:59 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК в качестве матрицы, фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующий вариабельную область гуманизированной h046-L1, амплифицировали с использованием KOD -Plus-(Toyobo Co., Ltd.) и набора праймеров, приведенного ниже. С использованием набора для клонирования In-Fusion HD PCR Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.), амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в участок вектора pCMA-LK, экспрессирующего легкую цепь химерного и гуманизированного антитела, сконструированного согласно примеру 5)-1-1, расщепленного ферментом рестрикции BsiWI, конструируя гуманизированный вектор, экспрессирующий h046-L1. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-L1". Аминокислотная последовательность гуманизированной h046-L1 представлена в SEQ ID NO:58.

Набор праймеров

5'-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3' (CM-LKF; SEQ ID NO:90)

5'-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3' (KCL-Inf-R; SEQ ID NO:102)

[0280] 6)-5-2-2 Конструирование гуманизированного вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L2

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую гуманизированную вариабельную область h046-L2, соответствующую нуклеотидным положениям 37-402 в гуманизированной нуклеотидной последовательности h046-L2, представленной, в SEQ ID NO:61 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). Вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-L2, конструировали тем же способом, который использовался в примере 6)-5-2-1. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-L2". Аминокислотная последовательность гуманизированной h046-L2 представлена в SEQ ID NO:60.

[0281] 6)-5-2-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L6

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую гуманизированную вариабельную область h046-L6, соответствующую нуклеотидным положениям 37-402 в гуманизированной нуклеотидной последовательности h046-L6, представленной, в SEQ ID NO:63 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). Вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-L6, конструировали тем же способом, который использовался в примере 6)-5-2-1. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-L6". Аминокислотная последовательность гуманизированной h046-L6 представлена в SEQ ID NO:62.

[0282] 6)-5-2-4 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L7

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность ДНК, кодирующую гуманизированную вариабельную область h046-L2, соответствующую нуклеотидным положениям 37-402 в гуманизированной нуклеотидной последовательности h046-L6, представленной, в SEQ ID NO:65 (GENEART, служба синтеза искусственных генов). Вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-L7, конструировали тем же способом, который использовался в примере 6)-5-2-1. Полученный экспрессирующий вектор был назван "pCMA/h046-L7". Аминокислотная последовательность гуманизированной h046-L6 представлена в SEQ ID NO:64.

[0283] 6)-5-3 Мелкомасштабное продуцирование гуманизированного антитела h046

В соответствии с руководством, клетки FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) культивировали и пассировали. 1×107 клеток FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) на логарифмической фазе роста разбавляли в 9,6 мл посредством среды для экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.), а затем высевали в 30-мл квадратную бутылку для хранения (Nalgene), и культивировали при встряхивании при 90 об/мин в инкубаторе с 8% CO2 при 37°C в течение 1 часа. 30 мкг полиэтиленимина (Poltscience #24765) растворяли в 200 мкл Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Между тем, вектор, экспрессирующий легкую цепь (6 мкг), и вектор, экспрессирующий вектор тяжелую цепь (4 мкг), полученные с использованием NucleoBond Xtra (Takara Bio Inc.), добавляли к 200 мкл Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). К 200 мкл смешанного раствора полиэтиленимин/Opti-Pro SFM добавляли 200 мкл смешанного раствора экспрессирующий вектор/Opti-Pro SFM, и полученную смесь осторожно перемешивали. После инкубации в течение 5 минут смесь добавляли к клеткам FreeStyle 293F. Клетки культивировали при встряхивании при 90 об/мин в инкубаторе с 8% CO2 при 37°C в течение 7 суток. Полученный культуральный супернатант фильтровали через фильтр Minisart-Plus (Sartorius Inc.) с получением образца для оценки.

[0284] Гуманизированную h046-H4b/L7 получали путем комбинирования pCMA/h046-H4b и pCMA/h046-L7. Гуманизированную h046-H5b/L2 получали путем комбинирования pCMA/h046-H5b и pCMA/h046-L2. Гуманизированную h046-Hwt/L6 получали путем комбинирования pCMA/04-046Ch-H и pCMA/h046-L6. Гуманизированную h046-H8/L1 получали путем комбинирования pCMA/h046-H8 и pCMA/h046-L1. Гуманизированную h046-H10/L1 получали путем комбинирования pCMA/h046-H10 и pCMA/h046-L1. Гуманизированную h046-H10/L6 получали путем комбинирования pCMA/h046-H10 и pCMA/h046-L6.

[0285] 6)-6 Оценка in vitro гуманизированного антитела против GPR20

6)-6-1 Оценка активности связывания у гуманизированного антитела против GPR20

Активность связывания GPR20 у гуманизированных антител против GPR20, полученных согласно примеру 6)-5-3, подтверждали проточной цитометрией. С использованием Lipofectamine 2000, pcDNA3.1-hGPR20 временно вводили в клетки 293T тем же способом, который использовали в примере 1)-5-1. Клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2, и после этого получали суспензию клеток. К полученной суспензии клеток добавляли каждое гуманизированное антитело против GPR20 и полученную смесь оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. После этого клетки промывали два раза PBS, дополненным 5% FBS, а затем суспендировали добавлением меченного PE-меченным F(ab')2 фрагментом антитела против IgG человека, специфичным к Fcγ (Jackson ImmunoResearch Inc.), разбавленным в 320 раз посредством PBS, дополненного 5% FBS. Клетки оставляли стоять при 4°C в течение 1 часа. Клетки промывали два раза посредством PBS, дополненного 5% FBS, а затем ресуспендировали в PBS, дополненном 5% FBS, с последующей детекцией с использованием проточного цитометра (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Данные анализировали с использованием Flowjo (Tree Star, Inc.). В результате, было подтверждено, что продуцированные гуманизированные антитела против GPR20 связывались с клетками 293T, трансфицированными pcDNA3.1-hGPR20. На фиг. 24 представлены результаты для гуманизированных антител против GPR20, специфически связывающихся с GPR20 человека. На гистограммах, приведенных на фиг. 24, по оси абсцисс представлена интенсивность флуоресценции PE, указывающая на количество связавшегося антитела, и по оси ординат представлено количество клеток. Закрашенная гистограмма демонстрирует отрицательный контроль, который не реагировал с антителом против GPR20, и не закрашенная гистограмма демонстрирует, что, когда каждое антитело против GPR20 вступало в реакцию, интенсивность флуоресценции усиливалась посредством связывания антитела с GPR20 на клеточной поверхности.

[0286] 6)-6-2 Оценка активности интернализации у гуманизированного антитела против GPR20

Активность интернализации у гуманизированного антитела против GPR20, полученного согласно примеру 6)-5-3, оценивали с использованием реагента антитела против IgG человека Hum-ZAP (Advanced Targeting Systems), конъюгированного с токсином (сапорин), ингибирующим синтез белка, аналогично тому, как в примере 1)-6. В частности, клетки HEK293, стабильно экспрессирующие белок GPR20-EGFP, содержащий GPR20 человека, связанный на его C-конце с EGFP, высевали в количестве 2,5×103 клеток/лунка, а затем культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2. После этого к культуре добавляли каждое антитело крысы против GPR20 (конечная концентрация: от 0,015 до 1,27 мкг /мл) и Hum-ZAP (конечная концентрация: 1 мкг/мл). Клетки культивировали в течение 4 суток и после этого количество живых клеток количественно определяли путем количественного определения ATP с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак). В результате, гуманизированные антитела против GPR20, гуманизированное h046-H4b/L7, гуманизированное h046-H5b/L2, гуманизированное h046-Hwt/L6, гуманизированное h046-H8/L1, гуманизированное h046-H10/L1 и гуманизированное h046-H10/L6, продуцированные согласно примеру 6)-5-3, демонстрировали эффект подавления пролиферации клеток посредством интернализации антитела.

[0287] 6)-7 Крупномасштабная продукция гуманизированного антитела против GPR20 -(2)

6)-7-1 Конструирования вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь h046

6)-7-1-1 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H4b

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H4b, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной тяжелой цепи типа h046_H4b, представленной в SEQ ID NO:103 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H4b. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_H4b".

[0288] 6)-7-1-2 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H5b

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H5b, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной тяжелой цепи типа h046_H5b, представленной в SEQ ID NO:104 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H5b. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_H5b".

[0289] 6)-7-1-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-Hwt

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_Hwt, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной тяжелой цепи типа h046_Hwt, представленной в SEQ ID NO:105 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_Hwt. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_Hwt".

[0290] 6)-7-1-4 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H8

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H8, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной тяжелой цепи типа h046_H8, представленной в SEQ ID NO:106 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H8. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_H8".

[0291] 6)-7-1-5 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H10

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H10, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной тяжелой цепи типа h046_H10, представленной в SEQ ID NO:107 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H10. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_H10".

[0292] 6)-7-1-6 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную тяжелую цепь типа h046-H4e

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H4e, соответствующую нуклеотидным положениям 58-1416 нуклеотидной последовательности гуманизированной тяжелой цепи типа h046_H4e, представленной в SEQ ID NO:51 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную тяжелую цепь типа h046_H4e. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_H4e".

[0293] 6)-7-2 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь h046

6)-7-2-1 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L1

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную легкую цепь типа h046_L1, соответствующую нуклеотидным положениям 61-702 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной легкой цепи типа h046_L1, представленной в SEQ ID NO:108 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную легкую цепь типа h046_L1. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_L1".

[0294] 6)-7-2-2 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L2

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную легкую цепь типа h046_L2, соответствующую нуклеотидным положениям 61-702 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной легкой цепи типа h046_L2, представленной в SEQ ID NO:109 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную легкую цепь типа h046_L2. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_L2".

[0295] 6)-7-2-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L6

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную легкую цепь типа h046_L6, соответствующую нуклеотидным положениям 61-702 нуклеотидной последовательности (2) гуманизированной легкой цепи типа h046_L6, представленной в SEQ ID NO:110 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную легкую цепь типа h046_L6. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_L6".

[0296] 6)-7-2-4 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную легкую цепь типа h046-L7

Синтезировали фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую гуманизированную легкую цепь типа h046_L7, соответствующую нуклеотидным положениям 61-702 нуклеотидной последовательности гуманизированной легкой цепи типа h046_L7, представленной в SEQ ID NO:111 в списке последовательностей (GENEART, служба синтеза искусственных генов). С использованием синтезированного фрагмента ДНК, в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструировали вектор, экспрессирующий гуманизированную легкую цепь типа h046_L7. Сконструированный экспрессирующий вектор был назван "GSV-h046_L7".

[0297] 6)-7-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированное антитело против GPR20

6)-7-3-1 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H4b/L7

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H4b/L7, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H4b" и "GSV-h046_L7". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H4bL7-GS".

[0298] 6)-7-3-2 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H5b/L2

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H5b/L2, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H5b" и "GSV-h046_L2". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H5bL2-GS".

[0299] 6)-7-3-3 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-Hwt/L6

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-Hwt/L6, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_Hwt" и "GSV-h046_L6". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_HwtL6-GS".

[0300] 6)-7-3-4 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H8/L1

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H8/L1, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H8" и "GSV-h046_L1". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H8L1-GS".

[0301] 6)-7-3-5 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H10/L1

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H10/L1, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H10" и "GSV-h046_L1". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H10L1-GS".

[0302] 6)-7-3-6 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H10/L6

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H10/L6, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H10" и "GSV-h046_L6". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H10L6-GS".

[0303] 6)-7-3-7 Конструирование вектора, экспрессирующего гуманизированную h046-H4e/L7

В соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, вектор, экспрессирующий гуманизированную h046-H4e/L7, конструировали из сконструированных экспрессирующих векторов "GSV-h046_H4e" и "GSV-h046_L7". Полученный экспрессирующий вектор был назван "DGV-h046_H4eL7-GS".

[0304] 6)-7-4 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное антитело против GPR20

6)-7-4-1 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H4b/L7

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H4b/L7, DGV-h046_H4bL7-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-1 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H4b/L7. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR1-12".

[0305] 6)-7-4-2 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H5b/L2

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H5b/L2, DGV-h046_H5bL2-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-2 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H5b/L2. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR2-15".

[0306] 6)-7-4-3 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-Hwt/L6

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-Hwt/L6, DGV-h046_H4wtL6-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-3 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-Hwt/L6. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR3-2".

[0307] 6)-7-4-4 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H8/L1

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H8/L1, DGV-h046_H8L1-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-4 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H8/L1. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR4-1".

[0308] 6)-7-4-5 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H10/L1

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H10/L1, DGV-h046_H10L1-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-5 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H10/L1. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR5-10".

[0309] 6)-7-4-6 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H10/L6

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H10/L6, DGV-h046_H10L6-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-6 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H10/L6. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPR6-7".

[0310] 6)-7-4-7 Получение клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H4e/L7

Клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали вектором, экспрессирующим гуманизированное h046-H4e/L7, DGV-h046_H4eL7-GS, сконструированным согласно примеру 6)-7-3-7 в соответствии с протоколами GS Gene Expression System (зарегистрированный торговый знак) от Lonza, конструируя таким образом клеточную линию, продуцирующую гуманизированное h046-H4e/L7. Полученная продуцирующая клеточная линия была названа "GPE-23".

[0311] 6)-7-5 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное антитело против GPR20

6)-7-5-1 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H4b/L7

Клеточную линию "GPR1-12", продуцирующую гуманизированное h046-H4b/L7, полученную согласно примеру 6)-7-4-1, культивировали с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Продуцирующую клеточную линию "GPR1-12" размораживали в среде C36 (JX Energy), а затем культивировали при 120 об/мин в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Полученный раствор разбавляли средой C36, а затем культивировали для увеличения в количестве при 120 об/мин в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Полученный культуральный раствор разбавляли средой C36 до плотности клеток 30×104 клеток/мл, а затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Biosciences Corp.), а затем культивировали при 37°C в 5% CO2 со скоростью поступления воздуха 0,3 л/мин при скорости вращения от 18 до 24 об/мин, под углом от 6 до 8°, в течение 10 суток. Начиная с 3-х суток после начала культивирования к культуре добавляли среду FM4Ae2 (самостоятельно приготовленную) каждые сутки в количестве 6% от первоначального объема культуры в сутки. Полученный культуральный раствор подвергали грубой фильтрации через глубинный фильтр Millistak MC0HC054H1 (Merck Millipore), а затем фильтровали через 0,22-мкм фильтр (Sartorius Inc.), подсоединенный к Flexboy Bags. Этот фильтрат был назван "культуральным супернатаном h046-H4b/L7".

[0312] 6)-7-5-2 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H5b/L2

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, клеточную линию "GPR2-15", продуцирующую гуманизированное h046-H5b/L2, полученную согласно примеру 6)-7-4-2, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30×104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 11 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "h046-H5b/L2 culture супернатант".

[0313] 6)-7-5-3 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-Hwt/L6

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, the humanized h046-Hwt/L6-producing cell line "GPR3-2" полученную согласно примеру 6)-7-4-3, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30×104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 14 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "культуральным супернатантом h046-Hwt/L6".

[0314] 6)-7-5-4 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H8/L1

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, клеточную линию "GPR4-1", продуцирующую гуманизированное h046-H8/L1, полученную согласно примеру 6)-7-4-4, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30×104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 11 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "культуральный супернатант h046-H8/L1".

[0315] 6)-7-5-5 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H10/L1

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, клеточную линию "GPR5-10", продуцирующую гуманизированное h046-H10/L1, полученную согласно примеру 6)-7-4-5, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30×104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 10 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "культуральным супернатантом h046-H10/L1".

[0316] 6)-7-5-6 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H10/L6

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, клеточную линию "GPR6-7", продуцирующую гуманизированное h046-H10/L6, полученную согласно примеру 6)-7-4-6, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30 × 104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 12 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "культуральным супернатантом h046-H10/L6".

[0317] 6)-7-5-7 Культура клеток, которые продуцируют гуманизированное h046-H4e/L7

Аналогично тому, как в примере 6)-7-5-1, клеточную линию "GPE-23", продуцирующую гуманизированное h046-H4e/L7, полученную согласно примеру 6)-7-4-7, культивировали и увеличивали в количестве, а затем клетки подвергали периодическому культивированию с подпиткой с использованием устройства для культивирования Wave reactor (GE Healthcare Japan Corp.). Полученную культуру разбавляли средой C36 до плотности клеток 30 × 104 клеток/мл, затем переносили в WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), а затем культивировали в течение 11 суток. Полученный культуральный раствор фильтровали, и полученный фильтрат был назван "культуральным супернатантом h046-H4e/L7".

[0318] 6)-7-6 Очитка гуманизированного антитела против GPR20

6)-7-6-1 Очистка гуманизированного h046-H4b/L7

"Культуральный супернатант h046-H4b/L7", полученный согласно примеру 6)-7-5-1, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером, а затем подвергали грубой фильтрации через фильтр со стекловолокном AP20 (Merck Millipore). После этого раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0319] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержавшего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 20 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046_H4b/L7".

[0320] 6)-7-6-2 Очистка гуманизированного h046-H5b/L2

"Культуральный супернатант h046-H5b/L2", полученный согласно примеру 6)-7-5-2, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером, а затем подвергали грубой фильтрации через фильтр со стекловолокном AP20 (Merck Millipore). После этого раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0321] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

[0322] Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046_H5b/L2".

[0323] 6)-7-6-3 Очистка гуманизированного h046-Hwt/L6

"Культуральный супернатант h046-Hwt/L6", полученный согласно примеру 6)-7-5-3, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером. Раствор фильтровали через Millipore Express SHC (Merck Millipore), который представлял собой 0,5/0,2-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0324] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046-Hwt/L6".

[0325] 6)-7-6-4 Очистка гуманизированного h046-H8/L1

"Культуральный супернатант h046-H8/L1", полученный согласно примеру 6)-7-5-4, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0326] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046-H8/L1".

[0327] 6)-7-6-5 Очистка гуманизированного h046-H10/L1

"Культуральный супернатант h046-H10/L1", полученный согласно примеру 6)-7-5-5, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером, а затем подвергали грубой фильтрации через фильтр со стекловолокном AP20 (Merck Millipore). После этого раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0328] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046-H10/L1".

[0329] 6)-7-6-6 Очистка гуманизированного h046-H10/L6

"Культуральный супернатант h046-H10/L6", полученный согласно примеру 6)-7-5-6, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0330] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046-H10/L6".

[0331] 6)-7-6-7 Очистка гуманизированного h046-H4e/L7

"Культуральный супернатант h046-H4e/L7", полученный согласно примеру 6)-7-5-7, очищали посредством трехстадийного процесса, а именно, посредством аффинной хроматографии с rProtein A, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. Сначала культуральный супернатант наносили на смолу аффинной хроматографии с rProtein A, уравновешенную PBS. После поступления в колонку всего культурального раствора колонку промывали PBS, буферным раствором, содержавшим аргинин, и PBS. Затем оставшееся в колонке вещество элюировали ацетатным буфером, а затем получали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор нейтрализовывали Tris-буфером. Раствор фильтровали через Millipore Express SHC (Merck Millipore) that was a 0,5/0,2-μm фильтр, и полученный фильтрат определяли как совокупность, очищенная с помощью rProtein A.

[0332] Затем объединенный материал, очищенный посредством rProtein A, наносили на анионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную PBS. После поступления всего раствора в колонку подавали PBS. Собирали прошедшую фракцию и вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Значение pH собранного раствора корректировали уксусной кислотой. Раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством AEX.

Затем объединенный материал, очищенный посредством AEX, наносили на катионообменную хроматографическую смолу, уравновешенную ацетатным буфером. После поступления в колонку всего используемого раствора колонку промывали ацетатным буфером. После этого проводили элюирование с использованием ацетатного буфера, содержащего высокую концентрацию NaCl, и собирали вещество, имеющее пик поглощения при 280 нм. Собранный раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, и полученный фильтрат определяли как объединенный материал, очищенный посредством CEX.

Объединенный материал, очищенный посредством CEX, концентрировали до концентрации антитела 40 мг/мл с использованием Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore), а затем буфер заменяли на гистидиновый буфер (25 мМ гистидин, 5% сорбит, pH 6,0). Наконец, раствор фильтровали через Stericup-GV (Merck Millipore), который представлял собой 0,22-мкм фильтр, получая таким образом очищенный образец. Этот очищенный образец был назван "h046-H4e/L7".

[0335] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (1)

Восстановление антитела: 04-046Ch, полученное согласно примеру 5)-2, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общих методик B (с использованием 1,47 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (3,40 мл) добавляли водный раствор 9,4 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,104 мл; 5,0 эквивалентов на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,170 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,4±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0336] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 10 мМ раствор N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамида в диметилсульфоксиде (0,189 мл; 8,6 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0284 мл; 12,9 эквивалента на молекулу антитела), и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0337] Очистка: описанный выше раствор очищали в соответствии с общей методикой D, описанной для способа получения 1, с получением 14,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "046Ch-ADC2".

[0338] Охарактеризация: с использованием общей методики E (с использованием εD,280=4964 и εD,370=18982), описанной для способа получения 1, получали следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,26 мг/мл, выход антитела: 31,6 мг (93%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,6.

7)-2 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (2)

[0339]

[Формула 15]

[0340] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (2)

Восстановление антитела: 04-046Ch, полученное согласно примеру 5)-2, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общих методик B (с использованием 1,47 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (3,40 мл) добавляли водный раствор 9,4 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,104 мл; 5,0 эквивалентов на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0, 0509 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,4±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0341] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 9,3 M раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,176 мл; 8,6 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0284 мл; 12,9 эквивалента на молекулу антитела), и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0342] Очистка: описанный выше раствор очищали в соответствии с общей методикой D, описанной для способа получения 1, с получением 14,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "046Ch-ADC1".

[0343] Охарактеризация: с использованием общей методики E (с использованием εD,280=5178 и εD,370=20217), описанной для способа получения 1, получали следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,23 мг/мл, выход антитела: 31,2 мг (92%) и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,6.

7)-3 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (3)

[0344]

[Формула 16]

[0345] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3)

Восстановление антитела: h046-H4b/L7 полученное согласно примеру 6)-7-6-1, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общих методик B (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (6,25 мл) добавляли водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,237 мл; 5,5 эквивалентов на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0, 0509 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0346] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 10 M раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида в диметилсульфоксиде (0,388 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0390 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела), и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0347] Очистка: описанный выше раствор очищали в соответствии с общей методикой D, описанной для способа получения 1, с получением 30,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H4b/L7-ADC1".

Охарактеризация: с использованием общих методик E и F ((с использованием εD,280=5178 и εD,370=20217), описанных для способа получения 1, получали следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,03 мг/мл, выход антитела: 61,0 мг (97%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное с использованием общей методики E: 5,5, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное с использованием общей методики F: 7,8.

[0348] 7)-4 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (4)

[0349]

[Формула 17]

[0350] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (4)

Восстановление антитела: h046-H4b/L7, полученное согласно примеру 6)-7-6-1, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общей методики B (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. Этот раствор (300 мл) помещали в 1000-мл поликарбонатную колбу Эрленмейера, затем добавляли 1 М водный раствор гидрофосфата калия (4,80 мл), а затем 10 мМ водный раствор TCEP (11,3 мл; 5,5 эквивалента на молекулу антитела) при комнатной температуре при перемешивании с использованием магнитной мешалки. После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,0±0,1, перемешивание прекращали и межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 2 часов.

[0351] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор охлаждали до 15°C. Затем к нему постепенно капельно добавляли раствор DMSO, содержащий 10 мМ N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамид (18,5 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) при перемешивании. Полученную смесь перемешивали при 15°C в течение 30 минут для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли 100 мМ водный раствор NAC (1,85 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) при перемешивании, и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции не вступившей в реакцию структуры лекарственное средство-линкер.

[0352] Очистка: Полученный раствор очищали ультрафильтрацией с использованием устройства для ультрафильтрации, состоящего из мембраны для ультрафильтрации (Merck Japan, Ltd., Pellicon XL Cassette, Ultracell 30 KDa), трубчатого насоса (Cole-Parmer International, USA, модель насоса MasterFlex 77521-40, модель головки насоса 7518-00), и трубки (Cole-Parmer International, USA, MasterFlex tube L/S16). В частности, очистку посредством ультрафильтрации проводили в ходе капельного добавления к реакционному раствору ABS (всего 3,00 л) в качестве буферного раствора для очистки, заменяя буфер на ABS и далее концентрируя раствор, удаляя неконъюгированные структуры лекарственное средство-линкер и другие низкомолекулярные реагенты. Полученный очищенный раствор подвергали микрофильтрации (0,22 мкм, мембрана PVDF, два раза) с получением 83,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H4b/L7-ADC1".

[0353] Охарактеризация: с использованием общих методик E и F (с использованием εD,280=5178 и εD,370=20217) были получены следующие характеристические значения.

[0354] Концентрация антитела: 23,1 мг/мл, выход антитела: 2,94 г (98%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,8, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,4.

[0355] 7)-5 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (5)

[0356]

[Формула 18]

[0357] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (5)

С использованием h046-H5b/L2 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученное согласно примеру 6)-7-6-2, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H5b/L2-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7-3.

[0358] Концентрация антитела: 2,04 мг/мл, выход антитела: 61,3 мг (98%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,4, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,9.

[0359] 7)-6 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (6)

[0360]

[Формула 19]

[0361] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (6)

С использованием h046-Hwt/L6 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученное согласно примеру 6)-7-6-3, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-Hwt/L6-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7-3.

[0362] Концентрация антитела: 2,03 мг/мл, выход антитела: 60,9 мг (95%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,6, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,8.

[0363] 7)-7 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (7)

[0364]

[Формула 20]

[0365] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)

Восстановление антитела: h046-H4b/L7, полученное согласно примеру 6)-7-6-1, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общей методики B (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (5,00 мл) добавляли водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,193 мл; 5,5 эквивалента на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0752 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0366] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 10 мМ N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид в диметилсульфоксиде (0,315 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела), и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0316 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0367] Очистка: Описанный выше раствор очищали по общей методике D, описанной для способа получения 1, с получением 24,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H4b/L7-ADC2".

[0368] Охарактеризация: С использованием общих методик E и F (с использованием εD,280=4964 и εD,370=18982), описанных для способа получения 1, были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,07 мг/мл, выход антитела: 49,6 мг (99%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 6,1, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,6.

[0369] 7)-8 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (8)

[0370]

[Формула 21]

[0371] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (8)

Восстановление антитела: h046-H5b/L2, полученное согласно примеру 6)-7-6-2, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общей методики B (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (6,25 мл) добавляли водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,237 мл; 5,5 эквивалента на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0940 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0372] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 10 мМ раствор N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамида В диметилсульфоксиде (0,388 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0390 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0373] Очистка: Описанный выше раствор очищали по общей методике D, описанной для способа получения 1, с получением 30,0 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H5b/L2-ADC2".

Охарактеризация: с использованием общих методик E и F (с использованием εD,280=4964 и εD,370=18982), описанных для способа получения 1, были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 2,07 мг/мл, выход антитела: 62,2 мг (99%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 6,0, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,7.

[0374] 7)-9 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (9)

[0375]

[Формула 22]

[0376] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (9)

С использованием h046-Hwt/L6 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученного согласно примеру 6)-7-6-3, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-Hwt/L6-ADC2" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7)-8.

[0377] Концентрация антитела: 2,10 мг/мл, выход антитела: 62,9 мг (99%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 6,1, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,4.

[0378] 7)-10 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (10)

[0379]

[Формула 23]

[0380] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10)

С использованием h046-H8/L1 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученного согласно примеру 6)-7-6-4, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H8/L1-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7)-3.

[0381] Концентрация антитела: 1,75 мг/мл, выход антитела: 52,6 мг (86%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,6, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,9.

[0382] 7)-11 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (11)

[0383]

[Формула 24]

[0384] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (11)

С использованием h046-H10/L1 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученного согласно примеру 6)-7-6-5, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H10/L1-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7)-3.

[0385] Концентрация антитела: 1,85 мг/мл, выход антитела: 55,6 мг (90%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,6, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,9.

[0386] 7)-12 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (12)

[0387]

[Формула 25]

[0388] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (12)

С использованием h046-H10/L6 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученного согласно примеру 6)-7-6-6, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H10/L6-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7)-3.

[0389] Концентрация антитела: 1,83 мг/мл, выход антитела: 55,0 мг (87%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,5, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 8,0.

[0390] 7)-13 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (13)

[0391]

[Формула 26]

[0392] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13)

Восстановление антитела: h046-H4e/L7, полученное согласно примеру6)-7-6-7, доводили до 10 мг/мл посредством PBS6,0/EDTA с использованием общей методики B (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм) и C, описанных для способа получения 1. К этому раствору (11,0 мл) добавляли водный раствор 10 мМ TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,412 мл; 5,5 эквивалента на молекулу антитела) и 1 M водный раствор гидрофосфата калия (Nacalai Tesque, Inc.; 0,165 мл). После подтверждения того, что раствор имел pH в пределах 7,0±0,1, межцепочечную дисульфидную связь в антителе восстанавливали путем инкубации раствора при 37°C в течение 1 часа.

[0393] Конъюгация антитела и структуры лекарственное средство-линкер: Описанный выше раствор инкубировали при 15°C в течение 10 минут. Затем к нему добавляли 10 мМ раствор N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамида В диметилсульфоксиде (0,674 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь инкубировали при 15°C в течение 1 часа для конъюгации структуры лекарственное средство-линкер с антителом. Затем к ней добавляли водный раствор 100 мМ NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) (0,0674 мл; 9,0 эквивалента на молекулу антитела) и полученную смесь дополнительно перемешивали при комнатной температуре в течение 20 для остановки реакции структуры лекарственное средство-линкер.

[0394] Очистка: Описанный выше раствор очищали по общей методике D, описанных для способа получения 1, с получением 34,5 мл раствора, содержащего конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H4e/L7-ADC1".

Охарактеризация: С использованием общих методик E и F (с использованием εD,280=5178 и εD,370=20217), описанных для способа получения 1, были получены следующие характеристические значения.

Концентрация антитела: 3,01 мг/мл, выход антитела: 104 мг (95%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,6, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,7.

[0395] 7)-14 Получение конъюгата антитело-лекарственное средство (14)

[0396]

[формула 27]

[0397] Стадия 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (14)

С использованием h046-H4e/L7 (с использованием 1,31 млмг-1см-1 в качестве коэффициента поглощения при 280 нм), полученного согласно примеру 6)-7-6-7, конъюгат антитело-лекарственное средство "h046-H4e/L7-ADC1" получали тем же способом, который использовался для стадии 1 примера 7-13.

[0398] Концентрация антитела: 3,14 мг/мл, выход антитела: 108 мг (99%), среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике E: 5,6, и среднее количество конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела, определенное по общей методике F: 7,6.

[0399] Пример 8: Оценка активности конъюгатов антитело-лекарственное средство in vitro

8)-1-1 Оценка активности связывания у гуманизированного антитела против GPR20 и конъюгата антитело-лекарственное средство

Активность связывания GPR20 у гуманизированного антитела против GPR20, полученного согласно примеру 6)-7-6, и конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных согласно примеру 7, оценивали с использованием проточной цитометрии. В результате анализа с использованием проточного цитометра (BD FACSCant II; BD Biosciences) их связывания с клетками 293T, временно трансфицированными pcDNA3.1-hGPR20 тем же способом, который использовался в примере 6)-6-1, была подтверждена зависимая от концентрации антитела активность связывания. Репрезентативные примеры их реакции представлены на фиг. 25. На фиг. 25 по оси абсцисс представлена концентрация антитела (нМ), и по оси ординат представлено количество связавшегося антитела, исходя из MFI (средняя интенсивность флуоресценции). Как показано на фиг. 25, количества гуманизированных антител против GPR20 h046-H4b/L7 и h046-H4e/L7, и конъюгатов антитело-лекарственное средство (4) и (13), связанных с клетками 293T, трансфицированными pcDNA3.1-hGPR20, возрастали зависимым от концентрации образом.

[0400] 8)-2 Получение клеточной линии GIST-T1/GPR20 со стабильной экспрессией

Стабильную клеточную линию GIST-T1/GPR20 получали путем инфицирования клеток GIST-T1 (доступных от Cosmo Bio Co., Ltd.) рекомбинантным ретровирусом для экспрессии GPR20 человека.

[0401] 8)-2-1 Получение ретровирусного вектора, экспрессирующего GPR20 человека

Ретровирусный вектор, экспрессирующий GPR20 человека, получали с использованием набора In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.). В частности, с использованием ветора pcDNA3.1-hGPR20, экспрессирующего GPR20 человека, полученного согласно примеру 1, в качестве матрицы, проводили реакцию ПЦР с использованием набора праймеров, приведенного ниже. В этой реакции использовали ДНК-полимеразу KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) и реакцию проводили на протяжении 30 циклов, каждый из которых вовлекал 98°C в течение 10 секунд, 58°C в течение 30 секунд и 68°C в течение 2 минут. После этого полученный продукт ПЦР, содержащий фрагмент кДНК GPR20, подвергали агарозному гель-электрофорезу, и ДНК, имеющую представляющий интерес размер, экстрагировали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen N.V.). С использованием предварительной смеси In-Fusion HD Enzyme premix, этот фрагмент ДНК смешивали с ретровирусным вектором pLPCX (Clontech Laboratories, Inc.), расщепленным ферментами рестрикции EcoRI и NotI. После реакции лигирования Escherichia coli TOP10 (Invitrogen Corp.) трансформировали продуктом лигирования, конструируя ретровирусный вектор pLPCX-GPR20, экспрессирующий GPR20 человека. Набор праймеров, использованный в ПЦР, был следующим.

[0402] Набор праймеров для ПЦР (для клонирования In-Fusion фрагмента кДНК pLPCX и GPR20)

5'-CTCAAGCTTCGAATTCACCATGCCCTCTGTGTCTCCA-3' (LPCX-1; SEQ ID NO:112)

5'-TTGGCCGAGGCGGCCTCCTAAGCCTCGGGCCCATTAG-3' (LPCX-1; SEQ ID NO:113)

8)-2-2 Получение клеточной линии GIST-T1/GPR20 со стабильной экспрессией

С использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) pLPCX-GPR20 временно вводили в упаковывающие ретровирус клетки 293-10A1. Через 72 часа культуральный супернатант, содержавший рекомбинантный ретровирус, собирали, а затем добавляли в систему для культивирования клеток GIST-T1, инфицируя клетки вирусом. Через 3 суток после инфицирования высевали клетки GIST-T1 в количестве 1 клетка/лунка в 96-луночный планшет, а затем культивировали в условиях 37°C и 5% CO2 в течение длительного периода в среде, в которую было добавлено от 0,3 до 1 мкг/мл пуромицина, с получением клеточной линии GIST-T1/GPR20, стабильно экспрессирующей GPR20.

[0403] 8)-3 Оценка активности ADC в отношении подавления пролиферации клеток GIST-T1/GPR20 in vitro

Клетки GIST-T1/GPR20 высевали в 96-луночный планшет в количестве 2,5×103 клеток/100 мкл/лунка в среде DMEM, дополненной 10% FBS, а затем клетки культивировали в течение ночи в условиях 37°C и 5% CO2. Каждый конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный согласно примеру 7, добавляли к клеткам, так чтобы конечные концентрации составляли от 0,032 до 100 нМ. После культивирования в течение от 7 до 11 суток определяли количество живых клеток посредством количественного определения ATP с использованием люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (зарегистрированный торговый знак). На фиг. 26 представлена зависимая от концентрации активность подавления пролиферации клеток, когда клеткам добавляли конъюгат антитело-лекарственное средство (1), полученный из химерного антитела человека, и на фиг. 27 представлена зависимая от концентрации активность подавления пролиферации клеток, когда к клеткам добавляли каждый из конхюгатов антитело-лекарственное средство (7), (8) и (9), полученных из гуманизированных антител. hIgG-ADC2 в этом эксперименте представлял собой конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный из IgG человека, распознающего антиген, неродственный GPR20, и его использовали в качестве отрицательного контроля.

[0404] Пример 9: Противоопухолевый эффект конъюгата антитело-лекарственное средство in vivo

Противоопухолевые эффекты конъюгатов антитело-лекарственное средство оценивали с использованием моделей на животных на основе иммунодефицитных мышей с трансплантацией клеток, происходящих из желудочно-кишечной стромальной опухоли человека. Перед использованием в эксперименте самок мышей BALB/c nude в возрасте от пяти до 6 недель (CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan Inc.) подвергали акклиматизации в течение от 4 до 7 суток в условиях SPF. Мышей кормили стерилизованным твердым кормом (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd), и им давали стерилизованную водопроводную воду (полученную добавлением раствора гипохлорита натрия в количестве от 5 до 15 м.д. в водопроводную вощу). Наибольший диаметр и наименьший диаметр трансплантированной опухоли определяли один раз или два раза в неделю с использованием электронного толщиномера (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), а затем вычисляли объем опухоли по следующему уравнению.

Объем опухоли (мм3) = 1/2 × наибольший диаметр (мм) × [наименьший диаметр (мм)]2

Каждый конъюгат антитело-лекарственное средство разбавляли буфером ABS (10 мМ ацетатный буфер, 5% сорбит, pH 5,5) (Nacalai Tesque, Inc.), и разбавленный раствор вводили внутривенно в объеме 10 мл/кг в хвост каждой мыши. Контрольной группе вводили буфер ABS, аналогично тому, как описано выше (группа носителя). В эксперименте использовали пять или шесть мышей на группу.

[0405] 9)-1 Противоопухолевый эффект -(1)

Клетки GIST-T1/GPR20, полученные согласно 8)-1-2, суспендировали в матригеле (Corning Inc.), и суспензию клеток подкожно трансплантировали в дозе 5×106 клеток в область правого бока каждой самки мышей nude (сутки 0). На 14 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 14 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (1) или (2) вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. В качестве отрицательного контроля конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный с использованием IgG человека, вводили в дозе 10 мг/кг аналогично тому, как описано выше. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (1) или (2) значительно уменьшало объем опухоли и оба конъюгата антитело-лекарственное средство были эффективными в отношении регрессии опухоли (фиг. 28). Следует отметить, что на чертежах по оси абсцисс представлено количество дней, а по оси ординат представлен объем опухоли. hIgG-ADC1 и hIgG-ADC2 представляли собой конъюгаты антитело-лекарственное средство конъюгаты, полученные из IgG человека, распознающего антиген, неродственный GPR20, и их использовали в качестве отрицательных контролей.

[0406] 9)-2 Противоопухолевый эффект -(2)

2×107 клеток клеточной линии желудочно-кишечной стромальной опухоли человека GIST430 (полученных от Brigham Women's Hospital) подкожно трансплантировали в область правого бока каждой самки мышей nude (сутки 0). На 29 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 29, 36 и 43 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (1) или (2) вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (1) или (2) значительно уменьшало объем опухоли по сравнению с контрольной группой, и оба конъюгата антитело-лекарственное средство демонстрировали эффект подавления роста опухоли (фиг. 29).

[0407] 9)-3 Противоопухолевый эффект -(3)

Аналогично тому, как в примере 9)-1, клетки GIST-T1/GPR20 подкожно трансплантировали самкам мышей nude (сутки 0). На 24 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 24 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (6) или (9) внутривенно вводили в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (6) или (9) значительно уменьшало объем опухоли и оба конъюгата антитело-лекарственное средство были эффективными в отношении регрессии опухоли (фиг. 30).

[0408] 9)-4 Противоопухолевый эффект -(4)

Аналогично тому, как в примере 9)-1, клетки GIST-T1/GPR20 подкожно трансплантировали самкам мышей nude (сутки 0). На 17 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 17 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (3), (5), (6), (10), (11) или (12) внутривенно вводили в дозе 1 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (3), (5), (6), (10), (11) или (12) значительно уменьшало объем опухоли, и все конъюгаты антитело-лекарственное средство демонстрировали эффект подавления роста опухоли (фиг. 31).

[0409] 9)-5 Противоопухолевый эффект -(5)

Аналогично тому, как в примере 9)-1, клетки GIST-T1/GPR20 подкожно трансплантировали самкам мышей nude (сутки 0). На 17 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 17 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (13) внутривенно вводили в дозе 0,3, 1 или 3 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (13) уменьшало объем опухоли дозозависимым образом, и конъюгат антитело-лекарственное средство был эффективным в отношении регрессии опухоли в дозе 1 мг/кг или более (фиг. 32).

[0410] 9)-6 Противоопухолевый эффект -(6)

GIST020 (полученные от National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition), которые пассировали и поддерживали посредством подкожной трансплантации блока опухоли, вырезанного у пациента с желудочно-кишечной стромальной опухолью в тонком кишечнике, иммунодефицитным мышам, подкожно трансплантировали в области правого бока самок мышей nude (сутки 0). На 55 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 55 и 75 сутки внутривенно вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (4) или (13) в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (4) или (13) значительно уменьшало объем опухоли по сравнению с контрольной группой, и оба конъюгата антитело-лекарственное средство обладали эффектом подавления роста опухоли (фиг. 33).

[0411] 9)-7 Противоопухолевый эффект -(7)

GIST1 (полученные от University of Toyama), которые пассировали и поддерживали посредством подкожной трансплантации блока опухоли, вырезанного у пациента с желудочно-кишечной стромальной опухолью в пищеводе, иммунодефицитным мышам, подкожно трансплантировали в области правого бока самок мышей nude (сутки 0). На 38 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 38 и 59 сутки внутривенно вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (13) в дозе 3 или 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (13) значительно уменьшало объем опухоли по сравнению с контрольной группой, и конъюгат антитело-лекарственное средство обладал эффектом подавления роста опухоли (фиг. 34).

[0412] 9)-8 Противоопухолевый эффект -(8)

1×107 клеток клеточной линии рака желудка NCI-N87 с высокой экспрессией молекулы HER2, но без экспрессии GPR20, подкожно трансплантировали в области правого бока самок мышей nude (сутки 0). На 6 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 6 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (14) внутривенно вводили в дозе 3 или 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Однако конъюгат антитело-лекарственное средство (14) продемонстрировало отсутствие значительного эффекта подавления роста опухоли. С другой стороны, введение конъюгата лекарственного средства, полученного из антитела против HER2, значительно уменьшало объем опухоли по сравнению с контрольной группой, и конъюгат антитело-лекарственное средство демонстрировал эффект подавления роста опухоли (фиг. 35).

9)-9 Противоопухолевый эффект -(9)

GIST074 (полученные от National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition), которые пассировали и поддерживали посредством подкожной трансплантации блока опухоли, полученного от пациента с желудочно-кишечной стромальной опухолью в желудке, не отвечающего на лечение регорафенибом, иммунодефицитным мышам, подкожно трансплантировали в области правого бока самкам мышей nude (сутки 0). На 29 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. На 29 и 50 сутки, конъюгат антитело-лекарственное средство (14) внутривенно вводили в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (14) полностью подавляло рост опухоли (фиг. 36). С другой стороны, когда иматиниб, сунитиниб и регорафениб перорально вводили один раз в сутки в дозах 90, 30 и 4 мг/кг, соответственно, в дни, указанные треугольными звездочками на фиг. 36, рост опухоли подавлялся не полностью. Как понятно из этих результатов, конъюгат антитело-лекарственное средство (14) демонстрировал противоопухолевый эффект даже в отношении желудочно-кишечной стромальной опухоли, которая демонстрировала резистентность к 3 ингибиторам тирозинкиназы, которые служили в качестве стандартных терапевтических лекарственных средств.

[0413] 9)-10 Противоопухолевый эффект - (10)

Эффект комбинированного применения с сунитинибом оценивали в моделях на клеточной линии желудочно-кишечной стромальной опухоли человека GIST430/654 (полученной от Brigham Women's Hospital), имеющей мутацию резистентности к иматинибу V654A в гене KIT. 2×107 клеток GIST430/654 подкожно трансплантировали в область правого бока каждой самки мышей nude (сутки 0). На 21 сутки мышей случайным образом распределяли на группы. Как показано на фиг. 37, на 21 сутки конъюгат антитело-лекарственное средство (3) внутривенно вводили в однократной дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши. Иматиниб и сунитиниб перорально вводили один раз в сутки в дозах 150 и 40 мг/кг, соответственно, в дни, указанные треугольными звездочками. В моделях GIST430/654 иматиниб не подавлял рост опухоли, в то время как подавление роста опухоли наблюдалось в группе, в которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (3) или сунитиниб. В группе комбинированного применения конъюгата антитело-лекарственное средство (3) и сунитиниба наблюдались более выраженные медицинские эффекты, чем эффекты, обеспечиваемые отдельными средствами, и обнаруживалась регрессия опухоли.

Промышленная применимость

[0414] Настоящее изобретение относится антителу против GPR20, обладающему активностью интернализации, и к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело. Конъюгат антитело-лекарственное средство можно использовать в качестве терапевтического лекарственного средства против желудочно-кишечной стромальной опухоли, и т.п.

Свободный текст списка последовательностей

[0415]

SEQ ID NO:44: Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 04-046Ch

SEQ ID NO:45: Аминокислотная последовательность 04-046Ch легкой цепи

SEQ ID NO:46: Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела 04-046Ch

SEQ ID NO:47: Нуклеотидная последовательность легкой цепи 04-046Ch

SEQ ID NO:48: Аминокислотная последовательность h046-H4b

SEQ ID NO:49: Нуклеотидная последовательность (1) h046-H4b

SEQ ID NO:50: Аминокислотная последовательность h046-H4e

SEQ ID NO:51: Нуклеотидная последовательность h046-H4e

SEQ ID NO:52: Аминокислотная последовательность h046-H5b

SEQ ID NO:53: Нуклеотидная последовательность (1) h046-H5b

SEQ ID NO:54: Аминокислотная последовательность h046-H8

SEQ ID NO:55: Нуклеотидная последовательность (1) h046-H8

SEQ ID NO:56: Аминокислотная последовательность h046-H10

SEQ ID NO:57: Нуклеотидная последовательность (1) h046-H10

SEQ ID NO:58: Аминокислотная последовательность h046-L1

SEQ ID NO:59: Нуклеотидная последовательность (1) h046-L1

SEQ ID NO:60: Аминокислотная последовательность h046-L2

SEQ ID NO:61: Нуклеотидная последовательность (1) h046-L2

SEQ ID NO:62: Аминокислотная последовательность h046-L6

SEQ ID NO:63: Нуклеотидная последовательность (1) h046-L6

SEQ ID NO:64: Аминокислотная последовательность h046-L7

SEQ ID NO:65: Нуклеотидная последовательность (1) h046-L7

SEQ ID NO:66: Праймер ПЦР Nhe-поли-C-S

SEQ ID NO:67: Праймер ПЦР rIgγ-AS1

SEQ ID NO:68: Праймер ПЦР rIgγ-AS2

SEQ ID NO:69: Праймер ПЦР rIgκ-AS

SEQ ID NO:70: Праймер ПЦР rIgγ-seq

SEQ ID NO:71: Праймер ПЦР rIgκ-seq

SEQ ID NO:72: Праймер ПЦР NFLAG-1

SEQ ID NO:73: Праймер ПЦР NFLAG-2

SEQ ID NO:74: Праймер ПЦР mEC2-1

SEQ ID NO:75: Праймер ПЦР mEC2-2

SEQ ID NO:76: Праймер ПЦР mEC3-1

SEQ ID NO:77: Праймер ПЦР mEC3-2

SEQ ID NO:78: Праймер ПЦР mEC4-1

SEQ ID NO:79: Праймер ПЦР mEC4-2

SEQ ID NO:80: Праймер ПЦР mEC1-1

SEQ ID NO:81: Праймер ПЦР mEC1-2

SEQ ID NO:82: Праймер ПЦР mEC1-3

SEQ ID NO:83: Праймер ПЦР mEC1-4

SEQ ID NO:85: Праймер ПЦР 3,3-F1

SEQ ID NO:86: Праймер ПЦР 3,3-R1

SEQ ID NO:88: Праймер ПЦР EG-Inf-F

SEQ ID NO:89: Праймер ПЦР EG1-Inf-R

SEQ ID NO:90: Праймер ПЦР CM-LKF

SEQ ID NO:91: Праймер ПЦР 046L-R

SEQ ID NO:92: Аминокислотная последовательность h046-L6 CDRL2

SEQ ID NO:93: Аминокислотная последовательность h046-L7 CDRL2

SEQ ID NO:94: Фрагмент ДНК A

SEQ ID NO:95: Праймер ПЦР Hb-F

SEQ ID NO:96: Праймер ПЦР Hb-R

SEQ ID NO:97: Фрагмент ДНК B

SEQ ID NO:98: H08-F

SEQ ID NO:99: H08-R

SEQ ID NO:100: H10-F

SEQ ID NO:101: H10-R

SEQ ID NO:102: Праймер ПЦР KCL-Inf-R

SEQ ID NO:103: Нуклеотидная последовательность (2) h046-H4b

SEQ ID NO:104: Нуклеотидная последовательность (2) h046-H5b

SEQ ID NO:105: Нуклеотидная последовательность (2) h046-Hwt

SEQ ID NO:106: Нуклеотидная последовательность (2) h046-H8

SEQ ID NO:107: Нуклеотидная последовательность (2) h046-H10

SEQ ID NO:108: Нуклеотидная последовательность (2) h046-L1

SEQ ID NO:109: Нуклеотидная последовательность (2) h046-L2

SEQ ID NO:110: Нуклеотидная последовательность (2) h046-L6

SEQ ID NO:111: Нуклеотидная последовательность (2) h046-L7

SEQ ID NO:112: Праймер ПЦР LPCX-1

SEQ ID NO:113: Праймер ПЦР LPCX-2

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ДАЙИТИ САНКИО КОМПАНИ, ЛИМИТЕД

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ GPR20 И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО ПРОТИВ GPR20-

ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

<130> DSPCT-FP1801

<150> JP2017-6004

<151> 2017-01-17

<160> 113

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 358

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Pro Ser Val Ser Pro Ala Gly Pro Ser Ala Gly Ala Val Pro Asn

1 5 10 15

Ala Thr Ala Val Thr Thr Val Arg Thr Asn Ala Ser Gly Leu Glu Val

20 25 30

Pro Leu Phe His Leu Phe Ala Arg Leu Asp Glu Glu Leu His Gly Thr

35 40 45

Phe Pro Gly Leu Trp Leu Ala Leu Met Ala Val His Gly Ala Ile Phe

50 55 60

Leu Ala Gly Leu Val Leu Asn Gly Leu Ala Leu Tyr Val Phe Cys Cys

65 70 75 80

Arg Thr Arg Ala Lys Thr Pro Ser Val Ile Tyr Thr Ile Asn Leu Val

85 90 95

Val Thr Asp Leu Leu Val Gly Leu Ser Leu Pro Thr Arg Phe Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Gly Ala Arg Gly Cys Leu Arg Cys Ala Phe Pro His Val Leu

115 120 125

Gly Tyr Phe Leu Asn Met His Cys Ser Ile Leu Phe Leu Thr Cys Ile

130 135 140

Cys Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val Arg Pro Glu Gly Ser Arg Arg

145 150 155 160

Cys Arg Gln Pro Ala Cys Ala Arg Ala Val Cys Ala Phe Val Trp Leu

165 170 175

Ala Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Val Leu Gly Val Thr Gly Ser Arg

180 185 190

Pro Cys Cys Arg Val Phe Ala Leu Thr Val Leu Glu Phe Leu Leu Pro

195 200 205

Leu Leu Val Ile Ser Val Phe Thr Gly Arg Ile Met Cys Ala Leu Ser

210 215 220

Arg Pro Gly Leu Leu His Gln Gly Arg Gln Arg Arg Val Arg Ala Met

225 230 235 240

Gln Leu Leu Leu Thr Val Leu Ile Ile Phe Leu Val Cys Phe Thr Pro

245 250 255

Phe His Ala Arg Gln Val Ala Val Ala Leu Trp Pro Asp Met Pro His

260 265 270

His Thr Ser Leu Val Val Tyr His Val Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu

275 280 285

Asn Ser Cys Met Asp Pro Ile Val Tyr Cys Phe Val Thr Ser Gly Phe

290 295 300

Gln Ala Thr Val Arg Gly Leu Phe Gly Gln His Gly Glu Arg Glu Pro

305 310 315 320

Ser Ser Gly Asp Val Val Ser Met His Arg Ser Ser Lys Gly Ser Gly

325 330 335

Arg His His Ile Leu Ser Ala Gly Pro His Ala Leu Thr Gln Ala Leu

340 345 350

Ala Asn Gly Pro Glu Ala

355

<210> 2

<211> 475

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 2

Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Ile Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln

130 135 140

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr

145 150 155 160

Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser

195 200 205

Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val

210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg

225 230 235 240

Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys

245 250 255

Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser

290 295 300

Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

325 330 335

Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys

355 360 365

Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu

370 375 380

Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe

385 390 395 400

Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu

405 410 415

Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg

435 440 445

Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His

450 455 460

Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 3

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu Lys Tyr Ile

35 40 45

Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 5

Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 7

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val

35 40 45

Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

85 90 95

Val Glu Pro Asp Asp Ile Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Glu

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp

165 170 175

Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His

195 200 205

Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val

210 215 220

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 8

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Pro Asp

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 9

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 9

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 10

Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 11

Gln Gln Ile Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 12

<211> 475

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 12

Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Val

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Thr Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln

130 135 140

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr

145 150 155 160

Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser

195 200 205

Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val

210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg

225 230 235 240

Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys

245 250 255

Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser

290 295 300

Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

325 330 335

Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys

355 360 365

Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu

370 375 380

Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe

385 390 395 400

Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu

405 410 415

Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg

435 440 445

Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His

450 455 460

Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 13

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Thr Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu Lys Tyr Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 14

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 15

Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn

1 5 10

<210> 16

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 17

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val

35 40 45

Ser Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

85 90 95

Val Lys Ala Asp Asp Ile Thr Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp

165 170 175

Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His

195 200 205

Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val

210 215 220

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 18

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Lys Ala Asp

65 70 75 80

Asp Ile Thr Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 19

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 19

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 20

Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 21

Gln Gln Ser Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 22

<211> 475

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 22

Met Glu Trp Asn Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Glu

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ile Trp Met Lys Gln Thr Ala Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Gln Tyr Val Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln

130 135 140

Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr

145 150 155 160

Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser

195 200 205

Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val

210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg

225 230 235 240

Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr Cys His Lys

245 250 255

Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser

290 295 300

Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile

325 330 335

Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys

355 360 365

Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu

370 375 380

Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe

385 390 395 400

Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu

405 410 415

Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg

435 440 445

Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His

450 455 460

Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 23

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 23

Gln Val Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile Ile Trp Met Lys Gln Thr Ala Gly Gln Gly Leu Gln Tyr Val

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 24

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 24

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile Ile

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 25

Tyr Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn

1 5 10

<210> 26

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 26

Gly Thr Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Ser Lys Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 27

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val

35 40 45

Ser Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

85 90 95

Val Glu Ala Asp Asp Ile Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu

130 135 140

Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp

165 170 175

Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His

195 200 205

Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val

210 215 220

Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 28

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 28

Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

100 105

<210> 29

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 29

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 30

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 30

Ser Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 31

Gln Gln Ser Asn Glu Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 32

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 32

atggaatgga actgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcagaggt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagtctgg agctgaactg gcaaagcctg gctcttcagt gaagatttcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatataa gctggataaa gcagacgact 180

ggacagggcc ttaagtatat tggatttatt aatccgggaa gtggacatac taactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctctagcac agccttcatg 300

caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcgatctatt actgtgcaag aggggctggg 360

ggttttctac ggattattac taagtttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 420

tcctcagccc aaacaacagc cccatctgtc tatccactgg ctcctggatg tggtgataca 480

accagctcca cggtgactct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtcacc 540

gtgacctgga actctggagc cctgtccagc gatgtgcaca cctttccagc tgtcctgcag 600

tctgggctct acactctcac cagctcagtg acctccagca cctggcccag ccagaccgtc 660

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaagt tgagcgcaga 720

aatggcggca ttggacacaa atgccctaca tgccctacat gtcacaaatg cccagttcct 780

gaactcttgg gtggaccatc tgtcttcatc ttcccgccaa agcccaagga catcctcttg 840

atctcccaga acgccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga ggagccggac 900

gtccagttca gctggtttgt gaacaacgta gaagtacaca cagctcagac acaaccccgt 960

gaggagcagt acaacagcac cttcagagtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 1020

tggatgagcg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagccctccc aagccccatc 1080

gagaaaacca tctcaaaacc caaagggcta gtcagaaaac cacaggtata cgtcatgggt 1140

ccaccgacag agcagttgac tgagcaaacg gtcagtttga cctgcttgac ctcaggcttc 1200

ctccctaacg acatcggtgt ggagtggacc agcaacgggc atatagaaaa gaactacaag 1260

aacaccgagc cagtgatgga ctctgacggt tctttcttca tgtacagcaa gctcaatgtg 1320

gaaaggagca ggtgggatag cagagcgccc ttcgtctgct ccgtggtcca cgagggtctg 1380

cacaatcacc acgtggagaa gagcatctcc cggcctccgg gtaaa 1425

<210> 33

<211> 369

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 33

caggtccaac tgcagcagtc tggagctgaa ctggcaaagc ctggctcttc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata taagctggat aaagcagacg 120

actggacagg gccttaagta tattggattt attaatccgg gaagtggaca tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctctag cacagccttc 240

atgcaactca gcagcctgac acctgacgac tctgcgatct attactgtgc aagaggggct 300

gggggttttc tacggattat tactaagttt gattactggg gccaaggagt catggtcaca 360

gtctcctca 369

<210> 34

<211> 699

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 34

atggagacag acagactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 120

tcctgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatacact ggtaccaaca gaggtcggga 180

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgca tccaacctag aatctggagt cccttccagg 240

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt ggagcctgat 300

gacatagcaa actattactg tcagcagatt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 360

accaagctgg aactgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatctatctt cccaccatcc 420

acggaacagt tagcaactgg aggtgcctca gtcgtgtgcc tcatgaacaa cttctatccc 480

agagacatca gtgtcaagtg gaagattgat ggcactgaac gacgagatgg tgtcctggac 540

agtgttactg atcaggacag caaagacagc acgtacagca tgagcagcac cctctcgttg 600

accaaggctg actatgaaag tcataacctc tatacctgtg aggttgttca taagacatca 660

tcctcacccg tcgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 699

<210> 35

<211> 324

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 35

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatacact ggtaccaaca gaggtcggga 120

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgca tccaacctag aatctggagt cccttccagg 180

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt ggagcctgat 240

gacatagcaa actattactg tcagcagatt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 300

accaagctgg aactgaaacg ggct 324

<210> 36

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 36

atggagtgga actgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcagtcgt ccactcccag 60

gtccagctgc agcagtctgg agctgagctg gcaaagcctg gctcttcagt gaagatttcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatataa cctggataaa gcagacgact 180

ggacagggcc ttaagtatat tggatatatt aatccgggaa gtggacatac taactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agccttcatg 300

caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag aggggctggg 360

ggttttctac ggattattag taagtttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 420

tcctcagccc aaacaacagc cccatctgtc tatccactgg ctcctggatg tggtgataca 480

accagctcca cggtgactct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtcacc 540

gtgacctgga actctggagc cctgtccagc gatgtgcaca cctttccagc tgtcctgcag 600

tctgggctct acactctcac cagctcagtg acctccagca cctggcccag ccagaccgtc 660

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaagt tgagcgcaga 720

aatggcggca ttggacacaa atgccctaca tgccctacat gtcacaaatg cccagttcct 780

gaactcttgg gtggaccatc tgtcttcatc ttcccgccaa agcccaagga catcctcttg 840

atctcccaga acgccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga ggagccggac 900

gtccagttca gctggtttgt gaacaacgta gaagtacaca cagctcagac acaaccccgt 960

gaggagcagt acaacagcac cttcagagtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 1020

tggatgagcg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagccctccc aagccccatc 1080

gagaaaacca tctcaaaacc caaagggcta gtcagaaaac cacaggtata cgtcatgggt 1140

ccaccgacag agcagttgac tgagcaaacg gtcagtttga cctgcttgac ctcaggcttc 1200

ctccctaacg acatcggtgt ggagtggacc agcaacgggc atatagaaaa gaactacaag 1260

aacaccgagc cagtgatgga ctctgacggt tctttcttca tgtacagcaa gctcaatgtg 1320

gaaaggagca ggtgggatag cagagcgccc ttcgtctgct ccgtggtcca cgagggtctg 1380

cacaatcacc acgtggagaa gagcatctcc cggcctccgg gtaaa 1425

<210> 37

<211> 369

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 37

caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcaaagc ctggctcttc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata taacctggat aaagcagacg 120

actggacagg gccttaagta tattggatat attaatccgg gaagtggaca tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagccttc 240

atgcaactca gcagcctgac acctgacgac tctgcggtct attactgtgc aagaggggct 300

gggggttttc tacggattat tagtaagttt gattactggg gccaaggagt catggtcaca 360

gtctcctca 369

<210> 38

<211> 699

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 38

atggagacag acagactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 120

tcttgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatgcact ggtaccaaca gaggtcggga 180

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgca tccaacctag aatctggagt cccttccagg 240

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt gaaggctgat 300

gacataacaa actattactg tcagcagagt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 360

accaagctgg aactgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatctatctt cccaccatcc 420

acggaacagt tagcaactgg aggtgcctca gtcgtgtgcc tcatgaacaa cttctatccc 480

agagacatca gtgtcaagtg gaagattgat ggcactgaac gacgagatgg tgtcctggac 540

agtgttactg atcaggacag caaagacagc acgtacagca tgagcagcac cctctcgttg 600

accaaggctg actatgaaag tcataacctc tatacctgtg aggttgttca taagacatca 660

tcctcacccg tcgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 699

<210> 39

<211> 324

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 39

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatgcact ggtaccaaca gaggtcggga 120

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgca tccaacctag aatctggagt cccttccagg 180

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt gaaggctgat 240

gacataacaa actattactg tcagcagagt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 300

accaagctgg aactgaaacg ggct 324

<210> 40

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 40

atggaatgga actgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcagaagt ccactcccag 60

gtccagctgc ggcagtctgg agctgagttg gctaagcctg gctcttcagt gaagatttcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatataa tctggatgaa acagacggct 180

ggccagggcc ttcagtatgt tggatatatt aatccgggaa gtggacatac taactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agccttcatg 300

caactcagca gcctgacacc tgacgactct gcggtctatt actgtgcaag agggactggg 360

ggttttctac ggattattag taagtttgat tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 420

tcctcagccc aaacaacagc cccatctgtc tatccactgg ctcctggatg tggtgataca 480

accagctcca cggtgactct gggatgcctg gtcaagggct atttccctga gccagtcacc 540

gtgacctgga actctggagc cctgtccagc gatgtgcaca cctttccagc tgtcctgcag 600

tctgggctct acactctcac cagctcagtg acctccagca cctggcccag ccagaccgtc 660

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaagt tgagcgcaga 720

aatggcggca ttggacacaa atgccctaca tgccctacat gtcacaaatg cccagttcct 780

gaactcttgg gtggaccatc tgtcttcatc ttcccgccaa agcccaagga catcctcttg 840

atctcccaga acgccaaggt cacgtgtgtg gtggtggatg tgagcgagga ggagccggac 900

gtccagttca gctggtttgt gaacaacgta gaagtacaca cagctcagac acaaccccgt 960

gaggagcagt acaacagcac cttcagagtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 1020

tggatgagcg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca aagccctccc aagccccatc 1080

gagaaaacca tctcaaaacc caaagggcta gtcagaaaac cacaggtata cgtcatgggt 1140

ccaccgacag agcagttgac tgagcaaacg gtcagtttga cctgcttgac ctcaggcttc 1200

ctccctaacg acatcggtgt ggagtggacc agcaacgggc atatagaaaa gaactacaag 1260

aacaccgagc cagtgatgga ctctgacggt tctttcttca tgtacagcaa gctcaatgtg 1320

gaaaggagca ggtgggatag cagagcgccc ttcgtctgct ccgtggtcca cgagggtctg 1380

cacaatcacc acgtggagaa gagcatctcc cggcctccgg gtaaa 1425

<210> 41

<211> 369

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 41

caggtccagc tgcggcagtc tggagctgag ttggctaagc ctggctcttc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata taatctggat gaaacagacg 120

gctggccagg gccttcagta tgttggatat attaatccgg gaagtggaca tactaactac 180

aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagccttc 240

atgcaactca gcagcctgac acctgacgac tctgcggtct attactgtgc aagagggact 300

gggggttttc tacggattat tagtaagttt gattactggg gccaaggagt catggtcaca 360

gtctcctca 369

<210> 42

<211> 699

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 42

atggagacag acagactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 120

tcttgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatgcact ggtaccaaca gaggtcggga 180

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgct tccaccctag aatctggagt cccttccagg 240

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt ggaggctgat 300

gacatagcaa actattactg tcagcagagt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 360

accaagctgg aactgaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatctatctt cccaccatcc 420

acggaacagt tagcaactgg aggtgcctca gtcgtgtgcc tcatgaacaa cttctatccc 480

agagacatca gtgtcaagtg gaagattgat ggcactgaac gacgagatgg tgtcctggac 540

agtgttactg atcaggacag caaagacagc acgtacagca tgagcagcac cctctcgttg 600

accaaggctg actatgaaag tcataacctc tatacctgtg aggttgttca taagacatca 660

tcctcacccg tcgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 699

<210> 43

<211> 324

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 43

gacactgtgc tgacccagtc tcctgctttg gctgtgtctc tagggcagag ggtcaccatc 60

tcttgtaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tatatgcact ggtaccaaca gaggtcggga 120

cagcaaccca aactcctgat ctatagtgct tccaccctag aatctggagt cccttccagg 180

ttcagtggga gtgggtctgg gacagacttt accctcacca tagatcctgt ggaggctgat 240

gacatagcaa actattactg tcagcagagt aatgaacttc cgtacacgtt tggagctggg 300

accaagctgg aactgaaacg ggct 324

<210> 44

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи 04-046Ch

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 44

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Ile Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 45

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность легкой цепи 04-046Ch

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 45

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val

35 40 45

Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Gln Gln Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

85 90 95

Val Glu Pro Asp Asp Ile Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn Glu

100 105 110

Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 46

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность тяжелой цепи 04-046Ch

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 46

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgaactg gccaagcctg gcagcagcgt gaagatcagc 120

tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tactacatca gctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggca gcggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgccttcatg 300

cagctgtcca gcctgacccc cgacgacagc gccatctact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtc 420

agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540

gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416

<210> 47

<211> 699

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность легкой цепи 04-046Ch

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 47

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gataccgtgc tgacacagtc tccagccctg gccgtgtccc tgggccagag agtgaccatc 120

agctgcagag ccagcaagag cgtgtccacc tacatccact ggtatcagca gcggagcggc 180

cagcagccca agctgctgat ctacagcgcc agcaacctgg aaagcggcgt gcccagcaga 240

ttttccggca gcggctctgg caccgacttc accctgacca tcgaccccgt ggaacccgac 300

gatatcgcca actactactg ccagcagatc aacgagctgc cctacacctt cggagccggc 360

accaagctgg aactgaagag agccgtggcc gccccctccg tgttcatctt ccccccctcc 420

gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480

agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccgggaa ctcccaggag 540

agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600

agcaaagccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660

agctcccccg tcaccaagag cttcaacagg ggggagtgt 699

<210> 48

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-H4b

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Met Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 49

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H4b (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 49

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcca gcggctacac ctttaccagc tactacatca gctggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tgaagtacat gggcttcatc aaccctggca gcggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcagagt gaccatcacc gccgacaaga gcagcagcac cgccaccatg 300

gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact actgcgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 420

agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540

gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416

<210> 50

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-H4e

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 50

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Met Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Thr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 51

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H4e

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 51

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctgaa 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tgaagtacat gggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcagagt gaccattacc gccgacaagt cctcctccac cgctaccatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 420

tcctctgctt ctaccaaggg cccctccgtg ttccctctgg ccccttccag caagtctacc 480

tctggcggca cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcccgtgaca 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacctcc ggcgtgcaca catttccagc tgtgctgcag 600

tcctccggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgactgtgc cctccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggaccca gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggctctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 52

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-H5b

<400> 52

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Met Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Asn Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 53

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H5b (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 53

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcca gcggctacac ctttaccagc tactacatca gctggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tgaagtacat gggcttcatc aaccctggca gcggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcagagt gaccatcacc gccgacaaga gcagcagcac cgccaacatg 300

gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 420

agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540

gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416

<210> 54

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-H8

<400> 54

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Ile Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Asn Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 55

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H8 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 55

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgaactg gccaagcctg gcagcagcgt gaagatcagc 120

tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tactacatca gctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggca gcggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgccaacatg 300

cagctgtcca gcctgacccc cgacgacagc gccatctact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtc 420

agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540

gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416

<210> 56

<211> 472

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-H10

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(19)

<400> 56

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys

20 25 30

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Tyr Ile Ser Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Lys Tyr Ile Gly Phe Ile Asn Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Asn Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Asp Asp Ser Ala Ile

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Gly Phe Leu Arg Ile Ile Thr Lys

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 57

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H10 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 57

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgaactg gccaagcctg gcagcagcgt gaaggtgagc 120

tgcaaggcca gcggctacac cttcaccagc tactacatca gctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggca gcggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgccaacatg 300

cagctgtcca gcctgacccc cgacgacagc gccatctact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtc 420

agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480

tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 540

gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag 600

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg 780

gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag 960

tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140

gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct 1260

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320

aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380

tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1416

<210> 58

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-L1

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 58

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Val Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn

100 105 110

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 59

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L1 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 59

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggccagcaa gagcgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcaacc tggaaagcgg cgtgcccagc 240

agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480

cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540

gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660

ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702

<210> 60

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-L2

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 60

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Val Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn

100 105 110

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 61

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L2 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 61

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggccagcaa gagcgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctacagc gccagcaacc tggaaagcgg cgtgcccagc 240

agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480

cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540

gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660

ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702

<210> 62

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-L6

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 62

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Val Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn

100 105 110

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 63

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L6 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 63

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gatacccagc tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggccagcaa gagcgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctacagc gccagcgaca gagaaagcgg cgtgcccagc 240

agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccaactacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480

cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540

gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660

ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702

<210> 64

<211> 234

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-L7

<220>

<221> СИГНАЛЬНАЯ

<222> (1)..(20)

<400> 64

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Thr Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Val Ser Thr Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Gly Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Asn

100 105 110

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 65

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L7 (1)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 65

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60

gatacccagc tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggccagcaa gagcgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctacagc gccggcaacc tggaaagcgg cgtgcccagc 240

agattttccg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccaactacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480

cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540

gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600

ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660

ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702

<210> 66

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР Nhe-polyC-S

<220>

<221> дополнительный признак

<222> (37)..(37)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 66

gctagcgcta ccggactcag atcccccccc cccccdn 37

<210> 67

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР rIg gamma-AS1

<400> 67

tcactgagct ggtgagagtg tagagccc 28

<210> 68

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР rIg gamma-AS2

<400> 68

tcaccgagct gctgagggtg tagagccc 28

<210> 69

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР rIg kappa-AS

<400> 69

tcaccgagct gctgagggtg tagagccc 28

<210> 70

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР rIg gamma-seq

<400> 70

ctggctcagg gaaatagcc 19

<210> 71

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР rIg kappa-seq

<400> 71

tccagttgct aactgttcc 19

<210> 72

<211> 41

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР NFLAG-1

<400> 72

gactacaaag acgatgacga caagccctct gtgtctccag c 41

<210> 73

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР NFLAG-2

<400> 73

cttgtcgtca tcgtctttgt agtccatggt ggagcctgc 39

<210> 74

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC2-1

<400> 74

acgcgcttcg ctgtgttcta cggcgccag 29

<210> 75

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC2-2

<400> 75

ctggcgccgt agaacacagc gaagcgcgt 29

<210> 76

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC3-1

<400> 76

tgtcggtgct gggcgtgaag tcgggtggac gatcatgctg ccgtgtctt 49

<210> 77

<211> 49

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC3-2

<400> 77

aagacacggc agcatgatcg tccacccgac ttcacgccca gcaccgaca 49

<210> 78

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC4-1

<400> 78

tggcgctgtg gcccaacgta cctaagcaca cgagcctcgt ggt 43

<210> 79

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC4-2

<400> 79

accacgaggc tcgtgtgctt aggtacgttg ggccacagcg cca 43

<210> 80

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC1-1

<400> 80

gcgctgatgg cggtgcacgg agccatct 28

<210> 81

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC1-2

<400> 81

agagggcatg gtggagcctg cttt 24

<210> 82

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC1-3

<400> 82

aggctccacc atgccctctg cgttgtctat ga 32

<210> 83

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР mEC1-4

<400> 83

caccgccatc agcgcttgcc acaggctggg gaaggtggct tgca 44

<210> 84

<211> 449

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 84

gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60

gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120

cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180

cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240

gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300

cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360

cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420

ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449

<210> 85

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР 3.3-F1

<400> 85

tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30

<210> 86

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР 3.3-R1

<400> 86

gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30

<210> 87

<211> 1132

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 87

gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60

tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120

ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180

ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240

gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300

ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360

gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420

aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780

cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900

gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080

tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132

<210> 88

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР EG-Inf-F

<400> 88

agctcccaga tgggtgctga gc 22

<210> 89

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР EG1-Inf-R

<400> 89

gggcccttgg tggaggctga gc 22

<210> 90

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР CM-LKF

<400> 90

ctgtggatct ccggcgcgta cggc 24

<210> 91

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР 046L-R

<400> 91

ggagggggcg gccacggctc tcttcagttc 30

<210> 92

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность h046-L6 CDRL2

<400> 92

Ser Ala Ser Asp Arg Glu Ser

1 5

<210> 93

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность CDRL2 h046-L7

<400> 93

Ser Ala Gly Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 94

<211> 408

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент A ДНК

<400> 94

agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca gctggtgcag tctggcgccg aagtgaagaa 60

accaggcgcc agcgtgaagg tgtcctgcaa ggccagcggc tacaccttta ccagctacta 120

catcagctgg atccggcagg cccctggaca gggcctgaag tacatgggct ggatcaaccc 180

tggcagcggc cacaccaact acaacgagaa gttcaagggc agagtgacca tcaccgccga 240

caagagcagc agcaccgcca ccatggaact gagcagcctg agaagcgagg acaccgccgt 300

gtactactgc gctagaggcg ctggcggctt cctgcggatc atcaccaagt tcgactactg 360

gggccagggc accctcgtga ccgtcagctc agcctccacc aagggccc 408

<210> 95

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР Hb-F

<400> 95

atcaaccctg gcagcggcca caccaactac 30

<210> 96

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР Hb-R

<400> 96

gaagcccatg tacttcaggc cctgtccagg gg 32

<210> 97

<211> 408

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент B ДНК

<400> 97

agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca gctggtgcag tctggcgccg aagtgaagaa 60

accaggcgcc agcgtgaagg tgtcctgcaa ggccagcggc tacaccttta ccagctacta 120

catcagctgg atccggcagg cccctggaca gggcctgaag tacatgggct ggatcaaccc 180

tggcagcggc cacaccaact acaacgagaa gttcaagggc agagtgacca tcaccgccga 240

caagagcagc agcaccgcca acatggaact gagcagcctg cggagcgagg acaccgccgt 300

gtactattgt gctagaggcg ctggcggctt cctgcggatc atcaccaagt tcgactactg 360

gggccagggc accctcgtga ccgtcagctc agcctccacc aagggccc 408

<210> 98

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H08-F

<400> 98

aacatgcagc tgtccagcct gacccccgac gac 33

<210> 99

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H08-R

<400> 99

ggcggtgctg ctgctcttgt ccacggtcag 30

<210> 100

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H10-F

<400> 100

gtgagctgca aggccagcgg ctacaccttc acc 33

<210> 101

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> H10-R

<400> 101

cttcacgctg ctgccaggct tggccagttc 30

<210> 102

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР KCL-Inf-R

<400> 102

ggagggggcg gccaccgtac g 21

<210> 103

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H4b (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 103

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctcag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tgaagtacat gggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcagagt gaccattacc gccgacaagt cctcctccac cgctaccatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 420

tcctctgctt ctaccaaggg cccctccgtg ttccctctgg ccccttccag caagtctacc 480

tctggcggca cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcccgtgaca 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacctcc ggcgtgcaca catttccagc tgtgctgcag 600

tcctccggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgactgtgc cctccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggaccca gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggctctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 104

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H5b (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 104

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctcag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggctt ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatccg gcaggcccct 180

ggacagggcc tgaagtacat gggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcagagt gaccattacc gccgacaagt cctcctccac cgccaacatg 300

gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 420

tcctctgctt ctaccaaggg cccctccgtg ttccctctgg ccccttccag caagtctacc 480

tctggcggca cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcccgtgaca 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacctcc ggcgtgcaca catttccagc tgtgctgcag 600

tcctccggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgactgtgc cctccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggaccca gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggacaagtcc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 105

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-Hwt (2)

<400> 105

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctcag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgagctg gctaagcctg gctcctccgt gaagatctcc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgccttcatg 300

cagctgtcct ccctgacccc tgacgactcc gccatctact actgcgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtg 420

tcctctgctt ccaccaaggg cccctccgtg tttcctctgg ccccttccag caagtccacc 480

tctggcggaa cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcctgtgacc 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacatcc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtgctgcag 600

tctagcggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgaccgtgc cttccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca aagcccaagg ataccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggataagagc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 106

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H8 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 106

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctcag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgagctg gctaagcctg gctcctccgt gaagatctcc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgccaacatg 300

cagctgtcct ccctgacccc tgacgactcc gccatctact actgcgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtg 420

tcctctgctt ccaccaaggg cccctccgtg tttcctctgg ccccttccag caagtccacc 480

tctggcggaa cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcctgtgacc 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacatcc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtgctgcag 600

tctagcggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgaccgtgc cttccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca aagcccaagg ataccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggataagagc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 107

<211> 1416

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-H10 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(57)

<400> 107

atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctcag 60

gtgcagctgc agcagtctgg cgccgagctg gctaagcctg gctcctctgt gaaggtgtcc 120

tgcaaggcct ccggctacac ctttaccagc tactacatct cctggatcaa gcagaccacc 180

ggccagggcc tgaagtacat cggcttcatc aaccccggct ccggccacac caactacaac 240

gagaagttca agggcaaggc caccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgccaacatg 300

cagctgtcct ccctgacccc tgacgactcc gccatctact actgcgctag aggcgctggc 360

ggcttcctgc ggatcatcac caagttcgac tactggggcc agggcgtgat ggtcaccgtg 420

tcctctgctt ccaccaaggg cccctccgtg tttcctctgg ccccttccag caagtccacc 480

tctggcggaa cagccgctct gggctgcctc gtgaaggact acttccccga gcctgtgacc 540

gtgtcttgga actctggcgc cctgacatcc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtgctgcag 600

tctagcggcc tgtactccct gtcctccgtc gtgaccgtgc cttccagctc tctgggcacc 660

cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccctccaaca ccaaggtgga caagcgggtg 720

gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgaactgctg 780

ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca aagcccaagg ataccctgat gatctcccgg 840

acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 900

aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag 960

tacaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020

ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggctctgc ctgcccccat cgaaaagacc 1080

atctccaagg ccaagggcca gccccgggaa ccccaggtgt acacactgcc ccctagccgg 1140

gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgtctcg tgaaaggctt ctacccctcc 1200

gatatcgccg tggaatggga gtccaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 1260

cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtacagca agctgacagt ggataagagc 1320

cggtggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1380

tacacccaga agtccctgtc cctgagcccc ggcaaa 1416

<210> 108

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L1 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 108

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60

gacatccaga tgacccagag cccttccagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggcctccaa gtccgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc gcctccaacc tggaatccgg cgtgccctcc 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702

<210> 109

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L-2 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 109

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60

gacatccaga tgacccagag cccttccagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggcctccaa gtccgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctactcc gcctccaacc tggaatccgg cgtgccctcc 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702

<210> 110

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L6 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 110

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60

gatacacagc tgacccagag cccttccagc ctgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggcctccaa gtccgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctactct gcctccgacc gcgagtctgg cgtgccctct 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccaactacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702

<210> 111

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность h046-L7 (2)

<220>

<221> сигнальный пептид

<222> (1)..(60)

<400> 111

atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60

gatacacagc tgacccagag cccttccagc ctgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120

atcacctgtc gggcctccaa gtccgtgtcc acctacatcc actggtatca gcagaagccc 180

ggcaagcagc ccaagctgct gatctactct gccggcaacc tggaatccgg cgtgccctcc 240

agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 300

gaggacttcg ccaactacta ctgccagcag atcaacgagc tgccctacac cttcggccag 360

ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420

tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480

ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540

gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600

ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660

ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702

<210> 112

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР LPCX-1

<400> 112

ctcaagcttc gaattcacca tgccctctgt gtctcca 37

<210> 113

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер ПЦР LPCX-2

<400> 113

ttggccgagg cggcctccta agcctcgggc ccattag 37

<---

1. Антитело со следующими свойствами (a), (b) и (с) или функциональный фрагмент этого антитела; где функциональный фрагмент имеет следующие свойства (а), (b) и (c):

(a) специфически связывается с конформацией, состоящей из аминокислотной последовательности c аминокислотами в положениях 1-48 и аминокислотной последовательности с аминокислотами в положениях 108-125 в GPR20,

где GPR20 представляет собой молекулу, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1;

(b) обладает способностью к интернализации, которая обеспечивает клеточный захват после связывания с GPR20, и

(с) содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (i)-(iii), и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (iv)-(viii):

(i) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6,

(ii) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16,

(iii) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26,

(iv) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(v) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(vi) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(vii) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:21, и

(viii) CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31.

2. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, которые обладают конкурирующей активностью за связывание с GPR20 с любым из антител, выбранных из группы, состоящей из следующих антител (a)-(c):

(a) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:7,

(b) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:12, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:17, и

(c) антитело, имеющее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-475 SEQ ID NO:22, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-233 SEQ ID NO:27.

3. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, которые содержат CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3 в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(b) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(c) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(d) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:21, и

(e) CDRH1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26, и CDRL1, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31.

4. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, которое имеет любую вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из следующих вариабельных областей (a)-(c), и любую вариабельную область легкой цепи, выбранную из следующих вариабельных областей (d)-(h):

вариабельная область тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из

(a) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3,

(b) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и

(c) вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23,

(d) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8,

(e) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(f) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(g) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

(h) вариабельной области легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28.

5. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8,

(b) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(c) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(d) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

(e) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28.

6. Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.1-5, где константная область представляет собой константную область человека.

7. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.6, которые содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:44, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:45.

8. Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.1-5, которые являются гуманизированными.

9. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.8, которые имеет вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислотных последовательностей (a)-(h), и вариабельную область легкой цепи, состоящую из любой из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислотные последовательности (i)-(o):

(a) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48,

(b) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50,

(c) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52,

(d) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54,

(e) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56,

(f) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:44,

(g) аминокислотная последовательность с гомологией по меньшей мере 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (a)-(f),

(h) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой из последовательностей CDR в последовательностях (a)-(g),

(i) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(j) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(k) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(l) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(m) аминокислотная последовательность в положениях аминокислот 21-128 в SEQ ID NO:45,

(n) аминокислотная последовательность с гомологией по меньшей мере 95% или более с последовательностью каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (i)-(m), и

(o) аминокислотная последовательность, содержащая делецию, замену или вставку одной или нескольких аминокислот в последовательности каркасной области, отличной от каждой последовательности CDR в последовательностях (i)-(n).

10. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.9, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в любой из комбинаций, выбранных из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(t):

(a) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(b) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(c) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(d) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:48, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(e) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(f) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(g) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(h) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:50 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(i) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(j) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(k) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(l) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:52 и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(m) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(n) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(o) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(p) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:54, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(q) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:58,

(r) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:60,

(s) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62, и

(t) вариабельная область тяжелой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-142 в SEQ ID NO:56, и вариабельная область легкой цепи, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64.

11. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.9, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(x):

(a) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(b) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(c) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(d) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(e) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(f) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(g) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(h) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(i) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(j) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(k) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(l) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(m) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(n) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(o) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(p) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(q) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(r) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(s) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(t) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(u) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(v) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(w) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62; и

(x) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64.

12. Функциональный фрагмент антитела по п.1, где функциональный фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)2, Fab' и Fv.

13. Полинуклеотид, кодирующий антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.1-12.

14. Полинуклеотид по п.13, который содержит полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(b) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:92, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(c) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:93, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:11,

(d) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:14, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:19, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:20, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:21, и

(e) полинуклеотид, кодирующий CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:24, CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:25, и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26, и полинуклеотид, кодирующий CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29, CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30, и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31.

15. Полинуклеотид по п.13, который содержит полинуклеотиды в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(e):

(a) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8,

(b) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:62,

(c) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-129 в SEQ ID NO:64,

(d) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:13, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18, и

(e) полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:23, и полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28.

16. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп.13-15.

17. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его фрагмента по любому из пп.1-12, трансформированная вектором экспрессии по п.16.

18. Клетка-хозяин по п.17, где клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

19. Способ получения антитела или его фрагмента по любому из пп.1-12, который включает стадию культивирования клетки-хозяина по п.17, и стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной посредством вышеупомянутой стадии,

где антитело или его функциональный фрагмент специфически связываются с GPR20.

20. Антитело или функциональный фрагмент антитела по любому из пп.1-12, которые содержат одну, или две, или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, O-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, C-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, присоединения остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, и тяжелую цепь, содержащую делецию одной или двух аминокислот на С-конце.

21. Антитело по п.20, где одна или две аминокислоты удалены на С-конце его тяжелой цепи.

22. Антитело по п.21, где одна аминокислота удалена на каждом из С-концов обеих его тяжелых цепей.

23. Антитело по п.20, где остаток пролина на С-конце его тяжелой цепи является дополнительно амидированным.

24. Антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, где модификация сахарной цепи регулируется для усиления антителозависимой клеточной цитотоксической активности.

25. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения опухоли, содержащий антитело или функциональный фрагмент антитела по п.1, конъюгированные с лекарственным средством.

26. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где лекарственное средство представляет собой противоопухолевое соединение.

27. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.26, где противоопухолевое соединение представляет собой противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:

[Формула 1]

.

28. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.26, где антитело конъюгировано с противоопухолевым соединением через линкер, имеющий любую структуру, выбранную из группы, состоящей из следующих формул (a)-(f):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

(d) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,

(e) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, и

(f) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,

где антитело соединено с концом -(сукцинимид-3-ил-N), противоопухолевое соединение соединено с карбонильной группой части -(CH2)n2-C(=O)- с атомом азота аминогруппы в положении 1 в качестве положения для присоединения, GGFG представляет аминокислотную последовательность, состоящую из глицина-глицина-фенилаланина-глицина, связанных пептидными связями, и

-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:

[Формула 2]

которая связана с антителом в его положении 3 и соединена с метиленовой группой в линкерной структуре, содержащей эту структуру на атоме азота в положении 1.

29. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где линкер представлен любой формулой, выбранной из группы, состоящей из следующих формул (a)-(c):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-, и

(c) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

30. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где линкер представлен следующей формулой (a) или (b):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, и

(b) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.

31. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где линкер представлен следующей формулой (a):

(a) -(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-.

32. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где антитело конъюгировано со структурой лекарственное средство-линкер, соответствующей следующей формуле [формула 3] (где A обозначает положение присоединения к антителу) посредством простой тиоэфирной связи:

[Формула 3]

.

33. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, который имеет структуру, представленную следующей формулой [формула 4],

где AB представляет антитело или функциональный фрагмент антитела, n обозначает среднее количество элементов структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело, и антитело соединено с линкером через сульфгидрильную группу антитела

[Формула 4]

34. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, который представлен следующей формулой [формула 5],

где AB обозначает антитело или функциональный фрагмент антитела, n обозначает среднее количество элементов структуры лекарственное средство-линкер, конъюгированных с антителом, на антитело, и антитело соединено с линкером через сульфгидрильную группу антитела:

[Формула 5]

35. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.32-34, где антитело представляет собой антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь в любой комбинации, выбранной из группы, состоящей из следующих комбинаций (a)-(x), или функциональный фрагмент антитела:

(a) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(b) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(c) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(d) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:48, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(e) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(f) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(g) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(h) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:50, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(i) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(j) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(k) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(l) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:52, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(m) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(n) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(o) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(p) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:54, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(q) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(r) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(s) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62,

(t) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-474 в SEQ ID NO:56, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64,

(u) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:58,

(v) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:60,

(w) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:62, и

(x) тяжелая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-472 в SEQ ID NO:44, и легкая цепь, состоящая из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 21-234 в SEQ ID NO:64.

36. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.35, где тяжелая цепь антитела содержит одну, или две, или более модификаций, выбранных из группы, состоящей из N-связанного гликозилирования, O-связанного гликозилирования, N-концевого процессинга, C-концевого процессинга, дезамидирования, изомеризации аспарагиновой кислоты, окисления метионина, присоединения остатка метионина к N-концу, амидирования остатка пролина, и тяжелой цепи, содержащей делецию одной или двух аминокислот на С-конце.

37. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 1 до 10.

38. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 2 до 8.

39. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 3 до 8.

40. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело находится в диапазоне от 7 до 8.

41. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.25, где среднее количество отдельных конъюгированных структур лекарственное средство-линкер на антитело равно 8.

42. Фармацевтическая композиция для лечения опухоли, содержащая любой компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, и конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-34 и 37-41, соль компонента или гидрат компонента или соли.

43. Фармацевтическая композиция по п.42, которая представляет собой противоопухолевое лекарственное средство.

44. Фармацевтическая композиция по п.43, где опухоль представляет собой опухоль, экспрессирующую GPR20.

45. Фармацевтическая композиция по п.43, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль.

46. Фармацевтическая композиция по п.42, также содержащая дополнительное противоопухолевое лекарственное средство.

47. Способ лечения опухоли, который включает введение любого компонента, выбранного из антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-34 и 37-41, солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей индивидууму.

48. Способ по п.47, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль.

49. Способ по п.47, где опухоль представляет собой опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

50. Применение антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-41, солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей для производства лекарственного средства для лечения опухоли.

51. Применение по п.50, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль.

52. Применение по п.50, где опухоль представляет собой опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

53. Применение по п.51, где опухоль представляет собой опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

54. Способ лечения опухоли, который включает введение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-34 и 37-41, солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей и по меньшей мере одного противоопухолевого лекарственного средства индивидууму одновременно, по отдельности или непрерывно.

55. Способ по п.54, где противоопухолевое лекарственное средство представляет собой ингибитор тирозинкиназы.

56. Способ по п.55, где ингибитор тирозинкиназы представляет собой по меньшей мере один ингибитор тирозинкиназы, выбранный из сунитиниба, иматиниба и регорафениба.

57. Способ по п.47, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

58. Способ по п.54, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

59. Применение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-41, солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей для производства лекарственного средства для лечения опухоли посредством одновременного, раздельного или непрерывного введения по меньшей мере с одним противоопухолевым лекарственным средством.

60. Применение по п.59, где противоопухолевое средство представляет собой ингибитор тирозинкиназы.

61. Применение по п.60, где ингибитор тирозинкиназы представляет собой по меньшей мере один ингибитор тирозинкиназы, выбранный из сунитиниба, иматиниба и регорафениба.

62. Применение по п.59, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

63. Применение по меньшей мере одного противоопухолевого лекарственного средства для производства лекарственного средства для лечения опухоли посредством одновременного, раздельного или непрерывного введения с фармацевтическими композициями, содержащими по меньшей мере один компонент, выбранный из антител или функциональных фрагментов антител по пп.1-12 и 20-24, конъюгатов антитело-лекарственное средство по пп.25-41, солей этих компонентов и гидратов этих компонентов или солей.

64. Применение по п.63, где противоопухолевое лекарственное средство представляет собой ингибитор тирозинкиназы.

65. Применение по п.64, где ингибитор тирозинкиназы представляет собой по меньшей мере один ингибитор тирозинкиназы, выбранный из сунитиниба, иматиниба и регорафениба.

66. Применение по п.63, где опухоль представляет собой желудочно-кишечную стромальную опухоль, которая демонстрирует резистентность к ингибитору тирозинкиназы.

67. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.25-41, который включает стадию культивирования клетки-хозяина по п.17 или 18, стадию сбора представляющего интерес антитела или функционального фрагмента антитела из культуры, полученной посредством вышеупомянутой стадии, и стадию реакции представляющего интерес антитела и функционального фрагмента антитела, полученных посредством вышеупомянутой стадии, с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер,

где антитело или его функциональный фрагмент специфически связываются с GPR20.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к искусственной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания и по меньшей мере один 3'-UTR-элемент и необязательно меньшей мере один 5'-UTR-элемент, где указанная искусственная молекула нуклеиновой кислоты отличается высокой эффективностью трансляции по сравнению с эффективностью трансляции референс-молекулы нуклеиновой кислоты, которая идентична искусственной молекуле нуклеиновой кислоты за исключением 3’-UTR-элемента.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к человеческой клетке - естественному киллеру (NK), генетически модифицированной для экспрессии варианта TRAIL, включающего мутацию D269H/E195R. Изобретение эффективно для лечения рака.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело, которое связывает внеклеточный домен человеческого полипептида SIRP–α человека.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела, которые связываются с триптазой бета 1 человека, и включающие их фармацевтические композиции.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к нуклеиновой кислоте, содержащей регуляторный полинуклеотид, содержащий минимальный промотор и от одной до двадцати нуклеиновых кислот AARE (элемент отклика на аминокислоту), и нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазу Cas, которая находится под контролем указанного регуляторного полинуклеотида.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена связывающая молекула, содержащая первый, второй, третий и четвертый полипептиды.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к варианту аденилосукцинат-синтетазы, к микроорганизму, содержащему его, и к способу получения пуриновых нуклеотидов с использованием такого микроорганизма. Изобретение позволяет с высокой степенью эффективности получать пуриновые нуклеотиды.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывает фактор IX Padua, полипептид, который связывает фактор IX Padua, конъюгат, который связывает фактор IX Padua, содержащий вышеуказанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент или полипептид, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетку-хозяин, набор для детекции фактора IX Padua, композиция для детекции фактора IX Padua (варианты), применение антител, или антигенсвязывающего фрагмента, полипептида, конъюгата, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и набора для детекции фактора IX Padua в образце и способ детекции фактора IX Padua в полученном от субъекта образце.

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и молекулярной биологии, в частности к клетке, которая экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR), IL-7 и CCL19, а также к вектору экспрессии, способу получения клетки и фармацевтической композиции для лечения или профилактики опухолей. Клетка содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор, полинуклеотид, включающую последовательность оснований, кодирующую IL-7, и полипептид, включающий последовательность оснований, кодирующую CCL19.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полипептиду, содержащему связывающий домен человека, способный связываться с эпитопом СD3(эпсилон)-цепи человека и Callithrix jacchus, Saguinus oedipus или Saimiri sciureus, и дополнительно содержит второй связывающий домен, который связывается с клеточным поверхностным антигеном, представляющим собой опухолевый антиген.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая антигенсвязывающую молекулу для элиминации антигенов из плазмы, способ уменьшения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы, способ получения антигенсвязывающей молекулы для уменьшения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме (варианты).
Наверх