Способ анализа митохондриальной днк для неинвазивного пренатального тестирования

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ анализа митохондриальной ДНК для неинвазивного пренатального тестирования, в котором путем массового параллельного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови матери при помощи полупроводниковой технологии получают bam-файлы с выравниванием чтений на геном человека. При этом используют дополнительные модули анализа, использующие чтения митохондриальной ДНК, в которых производят извлечение митохондриальных чтений из общего объема секвенированных данных, подсчет доли мтДНК в образце по формуле

Для последующего выявления уровня контаминации образца материнским материалом и определения образца в группу повышенного риска по получению ложноотрицательного результата НИПТ в случае получения значения доли мтДНК, превышающего 0,0005 (5×10^-4), подсчет процента покрытия мтДНК по формуле

Фильтрацию bam-файлов с покрытием мтДНК ниже 50% как непригодных для митохондриального анализа, поиск вариантов мтДНК, а именно инделов и однонуклеотидных замен, и их аннотацию для выявления патогенных и условно патогенных вариантов ClinVar, полный до уровня отдельных клад в случае достаточного уровня покрытия не менее 80% митохондриальной ДНК или ориентировочный до уровня суперклады для образцов с покрытием мтДНК ниже 80% анализ гаплогрупп мтДНК. Изобретение решает задачу расширения функциональных возможностей НИПТ и повышения качества диагностики путем введения этапов контроля контаминации и качества транспортировки образцов. Изобретение позволяет проводить более полный анализ данных массового параллельного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови, включая анализ гаплогрупп мтДНК и поиск нуклеотидных вариантов. 2 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, и может быть использовано для расширения возможности неинвазивного пренатального тестирования (НИПТ) с помощью биоинформатического анализа митохондриальной ДНК (мтДНК). Изобретение позволяет напрямую анализировать чтения мтДНК из секвенированных данных НИПТ и не требует дополнительных лабораторных этапов пробоподготовки.

В настоящий момент существует два основных метода получения данных для проведения НИПТ: таргетное секвенирование, направленное на отдельные локусы, и массовое параллельное секвенирование всей доступной внеклеточной ДНК плазмы крови матери.

В ходе массового параллельного секвенирования мы получаем большое количество секвенированного материала, что позволяет не ограничиваться анализом фетальной фракции для выявления анеуплоидий плода и использовать данные в дополнительных модулях анализа. Однако, внеклеточная ДНК плазмы крови фрагментарна, поэтому при секвенировании всей внеклеточной ДНК плазмы мы не получаем полного покрытия всего генома, что не мешает поиску анеуплоидий, основанном на подсчете фракций чтений, картируемых на каждую из хромосом, но в то же время затрудняет использование полученного секвенированного материала в других тестах. В то же время, несмотря на неполное покрытие хромосом, в секвенированных образцах внеклеточной ДНК плазмы крови наблюдается полное покрытие митохондриальной ДНК, что обеспечивается ее небольшой длиной (16568 п.н) и высокой копийностью. Таким образом, в ходе массового параллельного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови пациенток для проведения НИПТ мы получаем полное прочтение мтДНК, что открывает дорогу к разработке дополнительных диагностических модулей НИПТ.

Целесообразность использования анализа митохондриальной ДНК как дополнительного модуля НИПТ обусловлена рядом факторов:

• Прежде всего, повышенный уровень митохондриальной ДНК может быть индикатором контаминации образца материнским материалом (Meagan Smith, Kimberly М. Lewis, Alexandrea Holmes, Jeannie Visootsak, "A Case of False Negative NIPT for Down Syndrome-Lessons Learned", Case Reports in Genetics, vol. 2014, Article ID 823504, 3 pages, 2014. https://doi.org/10.1155/2014/823504), что может затруднить оценку фетальной фракции и, следовательно, привести к ложноотрицательным результатам. Одной из причин такой контаминации может быть деградация клеток крови матери с высвобождением ДНК в плазму в ходе долгой транспортировки образцов. Мы показали, что при долгой транспортировке возрастает содержание мтДНК в образцах (фиг. 1А), что, в свою очередь, ассоциировано со снижением показателей фетальной фракции (фиг. 1Б). Таким образом, разработанный модуль особенно актуален для качественной работы с образцами, поставляемыми из удаленных регионов.

• Кроме того, при наличии достаточного количества митохондриального материала (покрытие мтДНК более 80%), возможно проведение анализа гаплогрупп мтДНК, обычно проводимого в виде отдельных генетических тестов.

• Также, митохондриальная ДНК может использоваться для поиска нуклеотидных вариантов - SNPs, инсерции и делеции. Клиническое применение таких тестов ограничено ввиду их низкой предсказательной силы, связанной с проблемой гетероплазмии, эффектом бутылочного горлышка и текущим состоянием баз данных о клинически значимых мутациях. Тем не менее, наша методика позволяет выявлять патологические мутации в данных. Обычно для выявления таких вариантов используют таргетное секвенирование и ПЦР-диагностику как описано в патенте (CN 201510116090 20150317, C12Q 1/68, опубл. 15.07.2015) посвященному диагностике болезни Лебера на основе ПНР-анализа варианта Т3394С. Этот и другие потенциально патологические варианты митохондриальной ДНК могут быть выявлены в ходе предлагаемой методики без дополнительных этапов лабораторного анализа, основываясь только на данных массового параллельного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы, выполняемого в рамках неинвазивного пренатального скрининга. Методики поиска митохондриальных вариантов, ассоциированных с заболеваниями, использующие данные массового параллельного секвенирования известны, например, описанная в патенте 2013 года (CN 201310257788 20130626, C12Q 1/68, опубл. 18.09.2013), однако все они включают этап амплификации ДНК, тогда как в нашей методике мы работаем с неамплифицированной внеклеточной ДНК, выделенной из плазмы крови. Впрочем, реальное клиническое значение обнаруживаемых вариантов требует, проверки другими методами анализа, а потому предложенный метод несет не диагностический, а лишь скрининговый характер.

Метод скрининга и предсказания физиологических и патологических состояний на основе подсчета соотношения митохондриальной и ядерной ДНК в плазме крови был предложен в патентах 2015 (CN 201510126196 20150320, С12М 1/34, опубл. 10.06.2015) и 2017 года (CN 20168005411 20160113, C12Q 1/68, опубл. 26.09.2017), однако численный показатель относительного количества мтДНК является в данных методиках самостоятельным и единственным диагностическим признаком. Ранее мы проверяли возможность использования показателя уровня мтДНК в диагностике, исследуя его связь с различными акушерскими патологиями, однако не обнаружили значимой взаимосвязи. В связи с этим, в предлагаемой нами методике показатель соотношения митохондриальной и ядерной ДНК используется лишь косвенно для контроля качества образцов, тогда как в модуле митохондриального анализа проводится качественный, а не количественный анализ митохондриальной ДНК.

Данное изобретение решает задачу расширения диагностических возможностей неинвазивного пренатального тестирования, основанного на массовом параллельном секвенировании внеклеточной ДНК плазмы матери, и повышения качества проводимой диагностики. В данном изобретении для достижения обозначенной задачи мы предлагаем использовать митохондриальную ДНК, входящую в состав фракции внеклеточной ДНК и секвенируемую в составе образца НИПТ.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в методе неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода путем массового параллельного секвенирования при помощи полупроводниковой технологии, получают bam-файлы с выравниванием чтений на геном человека (hg19), как описано в прошлом патенте, раскрывающем способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода (RU 2712175, опубл. 24.01.2020), после чего извлекают из общего файла чтения митохондриальной ДНК (chrM), подсчитывают их долю относительно общего количества чтений в barn-файлах по формуле

и процент покрытия митохондриальной ДНК по формуле

Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показано влияние времени транспортировки на показатели уровня мтДНК (А) и зависимость уровня фетальной фракции, нормированной на срок гестации, от уровня мтДНК (р=0.007) (Б), фиг. 2, на которой приведено распределение показателей процента покрытия (А) мтДНК и доли мтДНК относительно общего числа чтений (Б) в данных секвенирования образцов, обрабатываемых в пробирках различных типов (EDTA и STRECK).

Мы показали, что процент покрытия мтДНК значительно выше в секвенированных образцах из пробирок Streck, что делает такие образцы более пригодными для проведения дальнейшего анализа, однако образцы, обрабатываемые в пробирках с ЭДТА также потенциально интересны для анализа, несмотря на более низкие значения уровня и покрытия мтДНК (фиг. 2).

На основе анализа распределения показателей уровня мтДНК и процента покрытой мтДНК для Streck и EDTA выбраны пороговые значения уровня мтДНК в 1.5×10^-4 и значение покрытия мтДНК в 50% для фильтрации bam-файлов мтДНК, пригодных для дальнейшего анализа.

После этого проводят поиск нуклеотидных вариантов (однонуклеотидных замен, инсерций и делеций), отбрасывают варианты, локализованные в гомополимерных регионах, при этом гомополимерным вариант считается, если ему предшествуют 2 и более одноименных нуклеотида, проводят на фильтрованном наборе обнаруженных вариантов анализ гаплогрупп мтДНК и аннотацию вариантов для выявления мутаций с потенциальной клинической значимостью.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Процесс биоинформатического анализа результатов секвенирования включает следующие стадии.

А) Предобработка образцов

Предобработка образцов осуществляется согласно протоколу, описанному в патенте, раскрывающем способ неинвазивного пренатального скрининга анеуплоидий плода (RU 2712175, опубл. 24.01.2020).

Б) Отбор чтений митохондриальной ДНК

Отбор чтений митохондриальной ДНК из общего количество чтений секвенированного образца внеклеточной ДНК из плазмы крови матери. Отбор проводится после выравнивания чтений в формате bam-файлов на референсный геном человека (сборка hg19). Чтения с выравниванием на митохондриальную ДНК (chrM) отбираются для последующего анализа.

В) Подсчет доли чтений мтДНК

Подсчет количества чтений в полученных в шаге Б bam-файлах и чтений митохондриальной ДНК и в общих bam-файлах осуществлялся с помощью программы Samtools (Li, Н.; Handsaker, В.; Wysoker, A.; Fennell, Т.; Ruan, J.; Homer, N.; Marth, G.; Abecasis, G.; Durbin, R.; 1000 Genome Project Data Processing Subgroup.The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 2009, 25, 2078-2079, doi:10.1093/bioinformatics/btp352.), уровень мтДНК вычислялся как соотношение чтений, приходящихся на мтДНК (chrM) к общему числу чтений в bam-файле по формуле

Увеличение доли мтДНК (mtDNA Rate) в образце является косвенным признаком контаминации образца материнским материалом, а потому образцы с повышенным содержанием мтДНК должны быть отнесены к группе повышенного риска получения ложноотрицательного результата НИПТ. По результатам статистического анализа было выбрано значение порога фильтрации для доли мтДНК, отклоняющееся от среднего значения на величину одного стандартного отклонения (1а), в нашей выборке равное 0.0005 (5×10^-4), при котором в группу повышенного риска ложноотрицательного результата теста попадают образцы, превышающие пороговое значение содержания мтДНК.

Г) Анализ уровня покрытия мтДНК

Процент покрытия вычислялся для каждого bam-файла как процент позиций с ненулевым покрытием. Для получения информации по покрытию мтДНК в каждой из позиций в полученных в шаге Б bam-файлах использовался инструмент Samtools depth. Процент покрытой мтДНК вычислялся по формуле

Мы показали, что 500 чтений мтДНК достаточно, чтобы получить покрытие митохондриального генома, превышающее 90%. Для покрытия выше 95% требуется как минимум 600-700 чтений.

Для дальнейшего анализа отбирались образцы с уровнем покрытия, превышающим 50% (не менее 125 чтений мтДНК).

Д) Поиск и аннотация вариантов мтДНК

Поиск инделов и однонуклеотидных замен (SNPs) с использованием программ MuTect от GATK (McKenna, A.; Hanna, М.; Banks, Е.; Sivachenko, А.; Cibulskis, К.; Kernytsky, A.; Garimella, K.; Altshuler, D.; Gabriel, S.; Daly, M.; et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce Framework for Analyzing next-Generation DNA Sequencing Data. Genome Res. 2010, 20, 1297-1303, doi:10.1101/gr.107524.110.) в режиме анализа митохондриальной ДНК (MITOCHONDRIA).

Для минимизации влияния ошибок секвенирования проводился поиск вариантов, локализованных в гомополимерных регионах. Поиск осуществлялся с помощью программы VCFPolyX (Lindenbaum, P. JVarkit: Java-Based Utilities for Bioinformatics. 2015, doi:10.6084/m9.figshare.1425030.v1.), вычисляющей для каждого варианта показатель PolyX - количество одноименных нуклеотидов, предшествующих варианту. Варианты с показателем PolyX более 2 отсеивались как гомополимерные..

Аннотация вариантов проводилась с использованием модуля VariantAnnotator от GATK и баз данных ClinVar и dbSNP.

Е) Анализ гаплогрупп мтДНК

Анализ проводился на основе набора обнаруженных вариантов с использованием программы HAPLOGREP (Weissensteiner, Н.; Pacher, D.; , A.; Forer, L.; Specht, G.; Bandelt, H.-J.; Kronenberg, F.; Salas, A.; , S. HaploGrep 2: Mitochondrial Haplogroup Classification in the Era of High-Throughput Sequencing. Nucleic Acids Res 2016, 44, W58-W63, doi:10.1093/nar/gkw233.): определение суперклады мтДНК и более точное определение клады (при покрытии мтДНК выше 80%). Фильтрация результатов по показателю качества определения гаплогруппы (более 0.5), формирование отчета с полной гаплогруппой для образцов с показателем выше 0.8 и суперкладой для остальных образцов.

Предложенный способ анализа митохондриальной ДНК приложим к пренатальному тестированию следующим образом:

1) обнаружение мутаций мтДНК может быть использовано в качестве предварительного скрининга митохондриальных патологий Например, обнаружение с помощью нашего метода анализа точечной мутации, ассоциированной с тем или иным митохондриальным заболеванием, может стать для врача основанием к назначению дополнительных (традиционных) диагностических тестов для проверки отсутствия/наличия патологии, что будет способствовать повышению диагностической мощности пренатального тестирования.

2) обнаружение избытка митохондриального материала (равное избытку материнского материала), препятствующего корректной диагностике патологий плода, позволит снизить вероятность ложноотрицательных результатов (и тем самым повысить качество и точность неинвазивного пренатального теста). 'Избыток материнского материала чаще всего обнаруживается в образцах в случае длительной транспортировки вследствие деградации клеток крови и высвобождения их ДНК в плазму крови, а также у пациенток с высоким индексом массы тела (ИМТ). В таких случаях при неинвазивном пренатальном тестировании анеуплодии плода могут показывать значения из диапазона нормальных (часто пограничные значения), что приведет к ложноотрицательному результату теста. Количественный анализ митохондриальной ДНК в данном случае даст возможность выделить группу риска образцов с высоким содержанием митохондриальной ДНК и, соответственно, высокой вероятностью ложноотрицательного результата. Получение на таких образцах значений, попадающих в диапазон нормальных, однако превышающих среднестатистические, может служить основанием для проверки результата с помощью повторного неинвазивного/инвазивного тестирования. Дополнительным приложением может быть также анализ гаплогруппы мтДНК (анализ родословной по материнской линии), что не имеет непосредственной диагностической ценности, но является интересной и новой опцией в рамках неинвазивного пренатального тестирования.

Способ анализа митохондриальной ДНК для неинвазивного пренатального тертирования, в котором путем массового параллельного секвенирования внеклеточной ДНК плазмы крови матери при помощи полупроводниковой технологии получают bam-файлы с выравниванием чтений на геном человека, включающим дополнительные модули анализа, использующие чтения митохондриальной ДНК, в которых производят извлечение митохондриальных чтений из общего объема секвенированных данных, подсчет доли мтДНК в образце по формуле

для последующего выявления уровня контаминации образца материнским материалом и определения образца в группу повышенного риска по получению ложноотрицательного результата НИПТ в случае получения значения доли мтДНК, превышающего 0.0005 (5×10^-4), подсчет процента покрытия мтДНК по формуле

фильтрацию bam-файлов с покрытием мтДНК ниже 50% как непригодных для митохондриального анализа, поиск вариантов мтДНК, а именно инделов и однонуклеотидных замен, и их аннотацию для выявления патогенных и условно патогенных вариантов ClinVar, полный до уровня отдельных клад в случае достаточного уровня покрытия не менее 80% митохондриальной ДНК или ориентировочный до уровня суперклады для bam-файлов с покрытием мтДНК ниже 80% анализ гаплогрупп мтДНК.