Фильтруемые композиции дуокармицин-содержащих конъюгатов антитело-лекарственное средство и связанные с ними способы

Изобретение относится к композициям, включающим дуокармицин-содержащие конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) и необязательно линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме, которые обеспечивают легкую фильтрацию ADC и отделение его от линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме, где композиции содержат систему растворителей из воды и ацетонитрила, с содержанием ацетонитрила от 30 до 60% (об/об). Также предложен способ обнаружения и/или количественного определения содержания свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина и выделения/одобрения партии дуокармицин-содержащего ADC. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, включающим дуокармицин-содержащие конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) и необязательно линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме. В частности, композиции обеспечивают легкую фильтрацию ADC и отделение его от линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме (если присутствует).

Настоящее изобретение также относится к способам получения композиции и одобрения партии дуокармицин-содержащего ADC.

Уровень изобретения

Моноклональные антитела (mAbs) являются одним из важнейших агентов в фармацевтической промышленности. Также mAbs были конъюгированы с рядом цитотоксических лекарственных средств с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство или «ADC». Обычно с mAb цитотоксическое лекарственное средство связывает линкер. Следовательно, ADC содержит моноклональное антитело, линкер и цитотоксическое лекарственное средство. Линкерное лекарственное средство может быть конъюгирован с антителом с использованием боковых цепочек либо поверхностно-экспонированных лизинов (P. M. LoRusso et al., Clinical Cancer Research, 2011, 17 (20), 6437-6447), либо свободных цистеинов, образованных в результате восстановления межцепочечных дисульфидных связей (J. Katz et al., Clinical Cancer Research, 2011, 17 (20), 6428-6436; P. D Senter et al., Nature Biotechnology 2012, 30 (7), 631-637). С другой стороны, конъюгация может представлять собой сайт-специфическую конъюгацию через боковые цепочки сконструированного цистеинового остатка в подходящем положении мутантного mAb (C. R. Behrens, B. Liu, MAbs, 2014, 6(1), 46-53).

Дуокармицины были использованы в качестве цитотоксических лекарств в ADC (WO 2008/083312, WO 2010/062171, WO 2011/133039, WO 2015/177360). Дуокармицины, впервые выделенные из культурального бульона видов Streptomyces, являются представителями семейства противоопухолевых антибиотиков, которые включают дуокармицин A, дуокармицин SA и CC-1065. Дуокармицины связываются с малой бороздкой ДНК и впоследствии вызывают необратимое алкилирование ДНК. Это нарушает архитектуру нуклеиновых кислот, что в конечном итоге приводит к гибели опухолевых клеток.

В последние годы дуокармицин-содержащие ADC, такие как трастузумаб дуокармазин (SYD985, трастузумаб vc-seco-DUBA), были включены в доклиническую и клиническую разработку (M.M.C. van der Lee et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2015, 14(3), 692-703; J. Black et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2016, 15 (8), 1900-1909; Clinical Trials. gov NCT02277717). Исходя из их потенциальной противоопухолевой активности ожидают дальнейшее исследование дуокармицин-содержащих ADC.

В промышленных способах производства ADC после конъюгации линкерного лекарственного средства с mAb проводят различные стадии очистки. Также имеют место процедуры контроля качества, чтобы гарантировать воспроизводимость этих биотерапевтических молекул от партии к партии. Вследствие ее токсичности одной из примесей, содержание которой необходимо строго контролировать в композиции ADC, является свободное линкерное лекарственное средство; то есть линкерное лекарственное средство в неконъюгированной форме.

Для определения содержания линкерного лекарственного средства на практике часто вначале снижают концентрацию ADC относительно свободного линкерного лекарственного средства и затем измеряют количество свободного линкерного лекарственного средства. В противном случае высокая концентрация ADC делает трудным определение очень незначительного содержания линкерного лекарственного средства. На практике количество ADC может составлять около 10 мг/мл, тогда как количество свободного линкерного лекарственного средства обычно составляет меньше чем 10 мкг/мл и часто намного меньше, например, 0,2 мкг/мл или 0,1 мкг/мл. Большой избыток ADC часто маскирует очень небольшое содержание (при наличии) свободного линкерного лекарственного средства при проведении обычной хроматографической аналитической методики; например, очень низкая концентрация приводит к тому, что свободное линкерное лекарственное средство скрывается за другими компонентами и/или, другими словами, находится ниже предела обнаружения.

Таким образом, обычно содержание свободного линкерного лекарственного средства может быть определено путем отделения ADC от остальной части водного образца и затем путем анализирования образца в присутствии (свободного) линкерного лекарственного средства. Например, прямое фильтрование водного образца с использованием центрифужного фильтрования с фильтром, имеющим отсечение по молекулярной массе приблизительно 30 кДа, часто позволяет получать фильтрат, содержащий свободное линкерное лекарственное средство, при этом ADC остается на фильтре (см. WO 2015/095953, р. 194, Cathepsin B linker cleavage assay (Анализ расщепления линкера катепсина B)). С другой стороны, свободное линкерное лекарственное средство отделяли от ADC путем обработки образца холодным метанолом и его центрифугированием, так что ADC будет осаждаться, тогда как линкерное лекарственное средство в неконъюгированной форме будет оставаться в надосадочной жидкости (см. L. Chen et al., MAbs, 2016, 8 (7), 1210-1223).

Однако установлено, что линкерные лекарственные средства дуокармицина создают необычные трудности. Типичная методика фильтрования или прямое осаждение, раскрытые в данной области техники, оказались неспособными адекватно отделять свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина от дуокармицин-содержащего ADC. Например, в процессе фильтрования свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина, как правило, не проходит через фильтр в фильтрат, а вместо этого остается на фильтре вместе с дуокармицин-содержащим ADC. Это приводит к тому, что недостаточное количество свободного линкерного лекарственного средства захватывается в фильтрат и делает неточным определение содержания линкерного лекарственного средства. Следовательно, имеется потребность в способе отделения свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина от дуокармицин-содержащего ADC. Аналогично, существует потребность в методе обнаружения и количественного определения линкерного лекарственного средства дуокармицина в образце, включающем дуокармицин-содержащий ADC и линкерное лекарственное средство дуокармицина (при его наличии).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии, что ацетонитрил может способствовать отделению линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме от дуокармицин-содержащего ADC посредством фильтрования.

Таким образом, первый аспект изобретения относится к композиции, содержащей (a) систему растворителей, содержащую воду и ацетонитрил; (b) кислоту; (c) конъюгат антитело-лекарственное средство формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L-D представляет собой линкерное лекарственное средство дуокармицина, и m означает среднее DAR от 1 до 12; и необязательно (d) линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме;

где указанная композиция содержит от 30% до 60% (об./об.) указанного ацетонитрила, предпочтительно от 35 до 55% указанного ацетонитрила.

Другой аспект изобретения относится к способу, который включает объединение (i) водного раствора или лиофилизированного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L-D представляет собой линкерное лекарственное средство дуокармицина, и m означает среднее DAR от 1 до 12, и необязательно дополнительно содержащего линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме, с (ii) разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением композиции, где указанная композиция содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила.

Еще один аспект изобретения относится к способу выделения/одобрения партии конъюгата антитело-лекарственное средство, который включает:

1) получение образца из партии конъюгата антитело-лекарственное средство, где указанная партия содержит антитело, конъюгированное с линкерным лекарственным средством дуокармицина, и необязательно линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме;

2) объединение указанного образца с разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением фильтруемой композиции, которая содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила;

3) фильтрование указанной фильтруемой композиции с получением фильтрата, который по существу свободен от указанного конъюгата антитело-лекарственное средство;

4) анализирование указанного фильтрата и определение, содержит ли указанный фильтрат указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме ниже заранее заданного уровня; и

5) выделение/одобрение указанной партии конъюгата антитело-лекарственное средство, если указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме присутствует ниже заранее заданного уровня.

Краткое описание чертежей

ФИГ. 1 представляет собой хроматограмму неконъюгированного линкерного лекарственного средства дуокармицина, vc-seco-DUBA, в соответствии с примером 1.

ФИГ. 2 представляет собой хроматограмму примера 2, где проанализирован образец из партии трастузумаба дуокармазина и установлено, что он не имеет обнаруживаемого свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, и, следовательно, представляет собой партию, соответствующую условию выделения/одобрения.

ФИГ. 3 показывает три хроматограммы из примера 3, где процент ацетонитрила растет по мере спуска хроматограмм, так что верхняя хроматограмма получена при использовании 30% ацетонитрила, средняя - при использовании 40% ацетонитрила, а нижняя - при использовании 55% ацетонитрила.

Подробное описание изобретения

Настоящее относится к композиции, содержащей (a) систему растворителей, содержащую воду и ацетонитрил; (b) кислоту; (c) конъюгат антитело-лекарственное средство формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L-D представляет собой линкерное лекарственное средство дуокармицина, и m означает среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) от 1 до 12; и необязательно (d) линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме;

где указанная композиция содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила.

Система растворителей, используемая в изобретении, содержит воду и ацетонитрил. В данном случае термин «система растворителей» относится к смеси растворителей, которая может растворять линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме. Как правило, система растворителей состоит из воды и ацетонитрила, но дополнительные растворители могут присутствовать в некоторых вариантах осуществления. Например, другие смешивающиеся с водой органические растворители, такие как C₁-C₆-спирты (например, метанол или этанол) или полиолы, необязательно могли бы присутствовать. Обычно любые дополнительные растворители составляют меньше чем 20% (об./об.), как правило, меньше чем 10%, и часто меньше чем 5% композиции. Обычно система растворителей состоит из воды и ацетонитрила. Вода не имеет особенных ограничений с точки зрения качества, хотя по практическим соображениям предпочтительно использовать относительно чистую воду, такую как деионизированная (ДИ (DI) вода, и более предпочтительно воду Milli-Q.

Ацетонитрил используют в концентрации от 30 до 60% (об./об.). Концентрация свыше 60%, как правило, приводит к слишком большой утечке дуокармицин-содержащего ADC через фильтр. Такая утечка может приводить к тому, что фильтрат будет иметь слишком высокую концентрацию ADC по сравнению с низкой концентрацией свободного линкерного лекарственного средства и, следовательно, будет мешать точным определениям количества свободного линкерного лекарственного средства, например, маскировать его. Обычно степень утечки является слишком высокой, когда больше чем 1,0% ADC в образце проходит в фильтрат и, как правило, приемлемо не более чем 0,5%. Часто, когда утечка имеет место, количество ADC, которое проходит в фильтрат, составляет 0,3% или меньше, чаще 0,2% или меньше и обычно 0,1% или меньше. С другой стороны, концентрация ацетонитрила ниже 30% обычно приводит к недостаточному разделению; то есть, линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме (по большей части) не проходит через фильтр и, следовательно, отделение считается неудачным. Без желания быть связанными с теорией, полагают, что гидрофобные взаимодействия между линкерным лекарственным средством дуокармицина (в неконъюгированной форме) и дуокармицин-содержащим ADC препятствуют или задерживают разделение. Добавление достаточного количества ацетонитрила в виде части системы растворителей помогает преодолевать эти силы в достаточной степени, чтобы облегчить разделение с помощью фильтрования. Без добавления слишком большого количества ацетонитрила можно избежать повреждения фильтра и минимизировать или предотвратить утечку дуокармицин-содержащего ADC. Более того, ацетонитрил в концентрации от 30 до 60% (об./об.) не влияет на стабильность ни ADC, ни антитела, ни линкерного лекарственного средства дуокармицина. Таким образом, неожиданно установлено, что свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина может быть легко и эффективно отфильтровано, когда его помещают в композицию, которая содержит воду, кислоту и ацетонитрил в концентрации от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, наиболее предпочтительно 40%.

Подходящими кислотами для использования в настоящем изобретении являются органические кислоты или неорганические минеральные кислоты. Как правило, кислоту для использования в настоящем изобретении выбирают из группы, включающей трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту и соляную кислоту. Количество кислоты не является критическим, просто композиция должна быть кислой, даже если и слегка кислой. Как правило, кислоту используют так, чтобы композиция имела pH ниже 7. Композиция может содержать кислоту в концентрации от 0,01 до 5% (об./об.), или от 0,05 до 2%, или от 0,05 до 1.5%, или от 0,1 до 1%.

Содержание ADC в композиции по настоящему изобретению особенно не ограничено. Как правило, композиция содержит ADC в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл, более типично от 0,5 до 50 мг/мл и обычно от 1,0 до 10 мг/мл. Количество неконъюгированного (свободного) линкерного лекарственного средства дуокармицина составляет, как правило, от 0 до 100 мкг/мл, более типично от 0 до 10 мкг/мл и часто от 0 до 1 мкг/мл. Во многих вариантах осуществления концентрация ADC, по меньшей мере, в 1000 раз больше, чем концентрация свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина.

Композиция может содержать дополнительные ингредиенты. Например, буферы и/или соли, такие как буферы и соли, обычно используемые в колоночной хроматографии или при ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF), или сахара, такие как маннит, и/или другие наполнители, которые могут присутствовать в готовой дозированной лекарственной форме, также известной как лекарственный препарат.

В ADC формулы (I) Ab может представлять собой любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, фрагмент F(ab’)₂ или фрагмент Fab’, одноцепочечное (sc) антитело, scFv, однодоменное (sd) антитело, диатело или миниантитело. Обычно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладают терапевтической активностью, но такая независимая эффективность не требуется обязательно, как это известно в области ADC. Антитела могут быть любого изотипа, такие как антитела IgG, IgA или IgM. Предпочтительно антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно антитело IgG₁ или IgG₂. Антитела могут быть химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно антитела являются гуманизированными. Даже более предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно гуманизированное или человеческое моноклональное антитело IgG₁ (mAb). Предпочтительно указанное антитело имеет κ (каппа) легкую цепь, то есть, гуманизированное или человеческое антитело IgG₁-κ.

Для ясности, «гуманизированное» антитело относится к антителу, имеющему антигенсвязывающие комплементарно определяемые области (CDR), полученные из антител от не относящихся к человеку видов, обычно мышей, крыс или кроликов, но имеющих каркас, который, по меньшей мере, частично является человеческим. Например, нечеловеческие CDR могут быть помещены в человеческий каркас (каркасная область (FR) FR1, FR2, FR3 и FR4) вариабельных областей тяжелой цепи (ТЦ (HC)) и легкой цепи (ЛЦ (LC)); то есть, полностью человеческий каркас, поддерживающий нечеловеческие CDR. Однако выбранные аминокислоты в человеческих FR могут быть заменены на соответствующие нечеловеческие каркасные аминокислоты, например, для повышения аффинности связывания при сохранении низкой иммуногенности. Далее, нечеловеческие каркасные области могут быть в значительной степени сохранены, и только выбранные аминокислоты нечеловеческих видов FR могут быть заменены на их соответствующие человеческие аминокислоты для снижения иммуногенности при сохранении аффинности связывания антитела. Применительно к настоящему изобретению все эти варианты рассматривают как «гуманизированные» вариабельные области. Гуманизированные таким образом вариабельные области объединяют с человеческими константными областями с получением гуманизированного антитела.

Эти антитела можно получить рекомбинантно, синтетически или с помощью других подходящих способов, известных в данной области техники.

Антитело может быть моноспецифическим (т.е. специфичным для одного антигена; такой антиген может быть общим для разных видов или иметь сходные аминокислотные последовательности между видами) или биспецифическим (то есть, специфичным для двух разных антигенов вида) и содержать, по меньшей мере, одну вариабельную область ТЦ и ЛЦ, связывающуюся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из: аннексина Al, B7H4, CA6, CA9, CA15-3, CA19-9, CA27-29, CA125, CA242 (раковый антиген 242), CCR2, CCR5, CD2, CD19, CD20, CD22, CD30 (фактор некроза опухолей 8), CD33, CD37, CD38 (циклическая АДФ-рибозогидролаза), CD40, CD44, CD47 (ассоциированный с интегринами белок), CD56 (молекула адгезии нервных клеток), CD70, CD74, CD79, CD115 (рецептор колониестимулирующего фактора 1), CD123 (рецептор интерлейкина-3), CD138 (синдекан 1), CD203c (ENPP3), CD303, CD333, CEA, CEACAM, CLCA-1 (лектиноподобная молекула-1 С типа), CLL-1, c-MET (рецептор фактора роста гепатоцитов), Cripto, DLL3, EGFL, EGFR, EPCAM, EPh (например, EphA2 или EPhB3), ETBR (рецептор эндотелина типа B), FAP, FcRL5 (Fc-рецептор-подобный белок 5, CD307), FGFR (например, FGFR3), FOLR1 (рецептор фолиевой кислоты альфа), GCC (гуанилатциклаза C), GPNMB, HER2, HMW-MAA (высокомолекулярный антиген, ассоциированный с меланомой), интегрин α (например, αvβ3 и αvβ5), IGF1R, TM4SF1(или антиген L6), антиген Lea-подобный белок, антиген Lex, антиген Ley (CD174), LIV1, мезотелин (MSLN), MN (CA9), MUC1, MUC16, NaPi2b, нектин-4, PD-1, PD-L1, PSMA, PTK7, SLC44A4, STEAP-1, антиген 5T4 (или TPBG, гликопротеин трофобласта), TF (тканевой фактор, тромбопластин, CD142), TF-Ag, Tag72, TNFR, TROP2 (опухолеассоциированный кальциевый сигнальный трансдуктор 2), VEGFR и VLA.

Примеры подходящих антител включают блинатумомаб (CD19), эпратузумаб (CD22), иратумумаб и брентуксимаб (CD30), вадастуксимаб (CD33), тетулумаб (CD37), изатуксимаб (CD38), биватузумаб (CD44), лорвотузумаб (CD56), ворсетузумаб (CD70), милатузумаб (CD74), полатузумаб (CD79), ровалпитузумаб (DLL3), футуксимаб (EGFR), опортузумаб (EPCAM), фарлетузумаб (FOLR1), глембатумумаб (GPNMB), трастузумаб и пертузумаб (HER2), этарацизумаб (интегрин), анетумаб (мезотелин), панкомаб (MUC1), энфортумаб (Нектин-4), а также H8, A1 и A3 (антиген 5T4).

В предпочтительном варианте осуществления Ab в соединении формулы (I) представляет собой анти-HER2 антитело, еще более предпочтительным Ab является анти-HER2 антитело трастузумаб.

В контексте настоящего изобретения -L-D в соединении формулы (I) может представлять собой любой фрагмент линкерного лекарственного средства дуокармицина. Фрагмент дуокармицина предпочтительно представлен одной из следующих формул:

,

где

заместители R¹, R² и R³ независимо выбирают из H, OH, SH, NH₂, N₃, NO₂, NO, CF₃, CN, C(O)NH₂, C(O)H, C(O)OH, галогена, R^a, SR^a, S(O)R^a, S(O)₂R^a, S(O)OR^a, S(O)₂OR^a, OS(O)R^a, OS(O)₂R^a, OS(O)OR^a, OS(O)₂OR^a, OR^a, NHR^a, N(R^a)R^b, ⁺N(R^a)(R^b)R^c, P(O)(OR^a)(OR^b), OP(O)(OR^a)(OR^b), SiR^aR^bR^c, C(O)R^a, C(O)OR^a, C(O)N(R^a)R^b, OC(O)R^a, OC(O)OR^a, OC(O)N(R^a)R^b, N(R^a)C(O)R^b, N(R^a)C(O)OR^b, N(R^a)C(O)N(R^b)R^c и водорастворимой группы, причем заместители R^a, R^b и R^c независимо выбирают из H и необязательно замещенных (CH₂CH₂O)_aaCH₂CH₂X¹R^a1, C_1-15-алкила, C_1-15-гетероалкила, C_3-15-циклоалкила, C_1-15-гетероциклоалкила, C_5-15-арила или C_1-15-гетероарила, где aa выбирают из значений от 1 до 1000, X¹ выбирают из O, S и NR^b1, и заместители R^b1 и R^a1 независимо выбирают из H и C_1-3-алкила, и дополнительно при условии, что один или несколько необязательных заместителей в R^a, R^b и/или R^c необязательно могут представлять собой водорастворимую группу и два или несколько заместителей из числа R^a, R^b и R^c необязательно могут быть объединены с помощью одной или более связей с образованием одного или нескольких необязательно замещенных карбоциклов и/или гетероциклов.

Линкерный фрагмент (-L-) может представлять собой любой известный или подходящий фрагмент для прикрепления лекарственного средства к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту. Обычно линкер может быть расщеплен при определенных условиях, так чтобы высвобождать лекарственное средство из антитела, как это известно в данной области техники.

Конец линкера, который будет связан с антителом (или его фрагментом), как правило, содержит функциональную группу, которая может реагировать с природной или искусственной аминокислотой Ab при относительно мягких условиях. Эту функциональную группу в данном документе называют реакционно-способным фрагментом (РФ (RM)). Примеры реакционноспособных фрагментов включают, но без ограничения ими, карбамоилгалогенид, ацилгалогенид, активный сложный эфир, ангидрид, α—галоацетил, α-галоацетамид, малеиимид, изоцианат, изоцианурат, дисульфид, тиол, гидразин, гидразид, сульфонилхлорид, альдегид, метилкетон, винилсульфон, галометил и метилсульфонат.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения РФ (RM) представляет собой:

где

X⁵ выбирают из -Cl, -Br, -I, -F, -OH, -O-N-сукцинимида, -O-(4-нитрофенила), -O-пентафторфенила, -O-тетрафторфенила, -O-C(O)-R⁴ и -O-C(O)-OR⁴;

X⁶ выбирают из -Cl, -Br, -I, -O-мезила, -O-трифлила и -O-тозила;

Заместитель R⁴ представляет собой разветвленный или неразветвленный C₁-C₁₀-алкил или арил.

Линкерное лекарственное средство дуокармицина может быть представлено в конъюгированной форме (-L-D) или неконъюгированной форме (L-D), также называемой «свободным» линкерным лекарственным средством. Соответственно, приведенные ниже формулы (II) и (IV) означают предпочтительные линкерные лекарственные средства дуокармицина в конъюгированной и неконъюгированной формах, соответственно. Аналогично, формулы (III) и (V) означают альтернативные предпочтительные линкерные лекарственные средства дуокармицина в конъюгированной и неконъюгированной формах, соответственно:

где

n имеет значения 0-3,

заместитель R⁵ выбирают из:

,

y имеет значения 1-16, и

заместитель R⁶ выбирают из:

.

Альтернативные линкерные лекарственные средства дуокармицина, представленные формулой (III) для конъюгированной формы и формулой (V) для неконъюгированной формы, показаны ниже:

где

V¹ представляет собой условно-расщепляемый или условно-преобразуемый фрагмент, который может быть расщеплен или преобразован за счет химического, фотохимического, физического, биологического или ферментативного процесса; Z представляет собой производное дуокармицина, n имеет значения 0, 1, 2 или 3; и p имеет значения 0 или 1.

Предпочтительно Z представляет собой фрагмент дуокармицина формулы:

,

как описано (и определено) выше. Конкретные примеры таких фрагментов дуокармицина (например, Z) для использования в настоящем изобретении включают:

.

Особенно предпочтительный вид линкерного лекарственного средства дуокармицина показан ниже в конъюгированной форме:

;

и в соответствующей неконъюгированной форме (то есть vc-seco-DUBA):

.

Для краткости следующие виды линкерного лекарственного средства дуокармицина показаны только в конъюгированной форме, но следует понимать, что соответствующая неконъюгированная форма также подразумевается, как это должно быть понятно специалисту в данной области техники:

Композиция по настоящему изобретению полезна для облегчения отделения посредством простого фильтрования дуокармицин-содержащего ADC от свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина. Такое отделение позволяет проводить анализ фильтрата в случае очень малых количеств свободного линкерного лекарственного средства без обременения большими количествами ADC. В более широком смысле композиция по настоящему изобретению делает проверку на присутствие и/или количество свободного линкерного лекарственного средства в композиции ADC более точной, удобной и практичной.

Обнаружение и/или количественное определение содержания свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина может быть полезно в разных функциях, включая в качестве нескольких областей применения разработку обоснованного процесса очистки ADC, контроль качества лекарственной субстанции или лекарственного препарат на основе ADC и тестирование стабильности лекарственной субстанции или лекарственного препарата. Следует понимать, что в большинстве фармацевтических областей применения ADC цель состоит в том, чтобы иметь содержание свободного линкерного лекарственного средства от незначительного количества до его отсутствия. Лекарственное средство дуокармицин является сильнодействующим лекарством. При конъюгации с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом лекарство дуокармицин доставляют в виде цитотоксической полезной нагрузки к сайту-мишени антитела. Однако в случае свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина могут быть разрушены случайные здоровые клетки; следовательно, необходимо строго контролировать на низких уровнях количество свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина. Предоставление дуокармицин-содержащего ADC со значительными количествами свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина может создавать неприемлемый риск для пациента. Соответственно, свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина только необязательно присутствует в фильтруемой композиции по изобретению, так как протокол очистки, как мы надеемся, удаляет все свободное линкерное лекарственное средство. Независимо от того, присутствует оно или нет, важно иметь способ, который может подтвердить отсутствие и/или количественно определить содержание свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина (при наличии) в композиции до очень низких уровней определения.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена любым способом, который объединяет растворители, кислоту и ADC. Порядок добавления ингредиентов и делается ли это последовательно или одновременно особенно не ограничены. Часто, однако, ADC в форме водного раствора или лиофилизированного продукта объединяют с разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением фильтруемой композиции по настоящему изобретению.

Таким образом, другой аспект изобретения относится к способу, который включает объединение (i) водного раствора (или лиофилизированного продукта) ADC формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

необязательно дополнительно содержащего соответствующее линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме, с (ii) разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением фильтруемой композиции по настоящему изобретению, которая содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила.

Водный раствор ADC может происходить от разных источников. Например, водный раствор ADC может быть взять из реакционной среды, где происходит реакция конъюгации, которая соединяет линкерное лекарственное средство с антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), или из по существу очищенного или выделенного продукта реакции конъюгации, то есть, ADC на основе дуокармицина в очищенной форме, например, в виде лиофилизированного продукта.

Необязательное свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина в таких водных растворах ADC представляет собой, как правило, непрореагировавшее линкерное лекарственное средство. Так как в реакции конъюгации часто используют молярный избыток линкерного лекарственного средства, часто применяют очистку, чтобы гарантировать удаление любого свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина. Соответственно, водные растворы от этих источников могут подразумевать мониторинг степени протекания реакции конъюгации или оценку протокола очистки.

Другим источником водного раствора ADC является отбор образца из готовой лекарственной субстанции или готового лекарственного препарата ADC. ADC, как правило, поставляют в виде инъецируемой композиции и, следовательно, лекарственная субстанция, а также лекарственный препарат часто находятся в форме водного раствора. Свободное линкерное лекарственное средство дуокармицина, при наличии, в таких водных растворах может появляться из-за неполного удаления во время очистки свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина и/или из-за непредусмотренного отщепления линкерного лекарственного средства дуокармицина от ADC. Такими источниками могут быть образцы для тестирования стабильности и/или эталонные образцы для определения или мониторинга стабильности композиции ADC во времени, например, чтобы подтвердить, что свободное линкерное лекарственное средство не образуется/не отщепляется в условиях хранения.

С другой стороны, лекарственная субстанция или лекарственный препарат могут находиться в лиофилизированной форме («лиофилизированный продукт»). Лиофилизированный продукт, как правило, восстанавливают водой с образованием водного раствора ADC. Вся или часть этой восстановленной жидкой композиции могут служить в качестве водного раствора ADC. Другой вариант состоит в объединении непосредственно лиофилизированного продукта с разбавляющей средой по изобретению без приготовления промежуточного восстановленного водного раствора.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, водный раствор ADC может содержать дополнительные ингредиенты, учитывая разные источники раствора, например, буферы, соли, сахара (например, маннит), агенты, препятствующие слеживанию и комкованию при лиофилизации, и т.д. Аналогично лиофилизированный продукт может содержать дополнительные ингредиенты, такие как буферный агент, лиопротектор, поверхностно-активное вещество, стабилизатор и др.

Добавление одной разбавляющей среды к водному раствору ADC или лиофилизированному продукту представляет собой удобный путь для получения фильтруемой композиции по настоящему изобретению. Разбавляющая среда содержит воду, ацетонитрил и кислоту в достаточных количествах, чтобы получить желаемую концентрацию ацетонитрила; например, от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55% и наиболее предпочтительно 40%. За счет добавления достаточных количеств разбавляющей среды для получения желаемой концентрации ацетонитрила, фильтруемую композицию по изобретению получают на одной стадии.

Композиция по изобретению может быть профильтрована через фильтр с получением фильтрата, который по существу свободен от ADC. Как используется в настоящем изобретении, термин «по существу свободен» относится к фильтрату, который содержит не более чем 1% от количества ADC, присутствующего в композиции по изобретению. Как правило, это количество равно 0,5% или меньше, более типично 0,2% или меньше, и часто 0,1% или меньше. Для понимания, если композиция по изобретению содержит 2,5 мг/мл ADC, то в фильтрате может присутствовать не более чем 1% или 0,025 мг/мл ADC.

Как будет понятно специалисту в данной области техники, фильтр имеет отсечение по молекулярной массе, которая в 3-6 раз меньше, чем молекулярная масса антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Практически фильтр имеет отсечение по молекулярной массе в пределах интервала от 1 до 100 кДа, более предпочтительно от 3 до 50 кДа, даже более предпочтительно от 10 до 30 кДа. Особенно предпочтительным в случае ADC формулы (I) является фильтр с отсечением по молекулярной массе 10 кДа.

Методика фильтрования особенно не ограничена, хотя обычно центрифужное фильтрование считают наиболее удобным. Гравитационное фильтрование могло бы быть использовано, но для него требуется больше времени. Различные промышленные устройства центрифужного фильтрования известны и доступны. Например, компания PALL Corporation выпускает центрифужные устройства Nanosep^® (Omega) и Microsep^®. Такие устройства отличаются по объему фильтруемого образца. В случае настоящего изобретения часто предпочтительно устройство Nanosep^® меньшего размера (например, объем 0,5 мл). Как правило, продолжительность центрифугирования составляет от 10 до 30 мин, а скорость от 12000 до 15000 g.

Любой подходящий фильтрующий материал, который обеспечивает отделение ADC от соответствующего свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, может быть использован и может быть установлен специалистом в данной области техники. Некоторые фильтрующие материалы более надежны, чем другие, в том что органический растворитель (ацетонитрил) может вызывать повреждение фильтра. Это повреждение может приводить к тому, что фильтрующий материал становится неприемлемым для отделения, например, из-за образования отверстий или мест протечки, которые допускают слишком большую утечку ADC через фильтр. Промышленный фильтрующий материал обычно представляет собой мембрану, изготовленную из модифицированного нейлона, гидрофильного полипропилена, полиэфирсульфонового материала или модифицированного полиэфирсульфонового материала. Применительно к настоящему изобретению предпочтительный фильтрующий материал содержит модифицированный полиэфирсульфоновый материал, такой как, коммерчески доступная фильтрующая среда Nanosep^® Omega от компании PALL Corp.

Перед фильтрованием может быть полезно гомогенизировать композицию. Гомогенизация может быть проведена с помощью любого подходящего устройства, которое обеспечивает равномерное распределение ацетонитрила в композиции. Гомогенизация может дополнительно облегчить отделение дуокармицин-содержащего ADC от свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина путем простого фильтрования.

После нанесения композиции по изобретению на фильтр жидкость, которая проходит через фильтр, то есть, «фильтрат» будет по существу свободна от ADC (I). Фильтрат затем может быть проанализирован для обнаружения линкерного лекарственного средства дуокармицина, если таковое имеется, и необязательно определения, в какой концентрации он присутствует в фильтрате. Может быть использована любая подходящая методика. Как правило, используют (жидкостной) хроматографический процесс, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ (HPLC)) или сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография (СВЭЖХ (UPLC)). Обычно используемая хроматография является хроматографией с обращенной фазой; например, обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ (RP-HPLC)) или, более предпочтительно, обращенно-фазовая сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-СВЭЖХ (RP-UPLC)). Как известно специалисту в данной области техники, выбор подходящих условий хроматографии, в том числе материала наполнителя колонки, подвижной фазы, используемого градиента и общих условий загрузки/связывания и условий элюирования, является рутинной процедурой. Для обнаружения линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме в настоящем изобретении может быть использован любой подходящий детектор. Обычно используют УФ детектор. Преимущественно ВЭЖХ в сочетании с УФ детектором обеспечивает хорошее решение для анализа образцов, содержащих небольшое количество линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме.

Результат измерения количества, при его наличии, линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме, присутствующего в указанном фильтрате (количественное определение), как правило, коррелирует с количеством свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, находящимся в водном растворе. При использовании композиции по изобретению в процессе фильтрования для получения фильтрата, по существу свободного от ADC, хроматографическое разделение и обнаружение может иметь предел количественного определения свободного линкерного лекарственного средства 0,2 мкг/мг ADC или меньше. То есть, путем корреляции количественного определения к исходному водному раствору ADC, например, лекарственной субстанции, количество свободного линкерного лекарственного средства может быть определено вплоть до, по меньшей мере, 0,2 мкг на 1 мг ADC. Фактически, предел количественного определения может быть ниже, например, 0,1 мкг/мг или 0,01 мкг/мг и т.д.

Специальное применение настоящего изобретения относится к способу выделения/ободрения партии ADC, который включает:

1) получение образца из партии ADC, где указанная партия содержит антитело, конъюгированное с линкерным лекарственным средством дуокармицина, и необязательно линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме;

2) объединение указанного образца с разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением фильтруемой композиции, которая содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила;

3) фильтрование указанной фильтруемой композиции с получением фильтрата, который по существу свободен от указанного ADC;

4) анализирование указанного фильтрата и определение, содержит ли указанный фильтрат указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме ниже заранее заданного уровня; и

5) выделение/одобрение указанной партии ADC, если указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме присутствует ниже заранее заданного уровня.

Как используется в данном случае, термин «партия конъюгата антитело-лекарственное средство» или «партия ADC» относится к производству в промышленном масштабе партии ADC, которая прошла все технологические стадии, так что она находится в очищенной форме и необязательно содержит наполнители, такие как наполнители, подходящие для парентерального препарата или лиофилизированного препарата. Практически размер партии ADC обычно составляет, по меньшей мере, 30 л. Регулирующие органы, такие как EMA, FDA и др., требуют, чтобы такая промышленная партия фармацевтического продукта соответствовала различным стандартам чистоты и качества. В случае ADC одним из таких стандартов чистоты является количество свободного линкерного лекарственного средства. Описанный выше способ внедряет композицию по изобретению и ее удобное использование при отделении дуокармицинового ADC от свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина для лучшего обнаружения присутствия, при наличии, такого свободного линкерного лекарственного средства. Таким образом, фильтрат анализируют обычно с помощью ОФ-СВЭЖХ для определения, находится ли количество неконъюгированного линкерного лекарственного средства дуокармицина ниже нормативного показателя (то есть, «заранее заданного уровня»). Заранее заданный уровень обычно довольно низок и часто требует максимального количества свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина относительно количества ADC 0,2 мгк/мг, предпочтительно 0,1 мгк/мг, более предпочтительно 0,02 мгк/мг. Определение заранее заданного уровня может быть выполнено с помощью числового значения или в виде предела обнаружения (LOD) теста. В последнем случае предел обнаружения может находиться на заранее заданном уровне или быть меньше заранее заданного уровня, и, следовательно, отрицательный результат (отсутствие свободного линкерного лекарственного средства), как считают, удовлетворяет (меньше чем) заранее заданному уровню. Аналогичная стратегия может быть применена при использовании предела количественного обнаружения (LOQ), где присутствие свободного линкерного лекарственного средства наблюдают, но оно находится ниже предела количественного обнаружения. Так как предел количественного обнаружения находится на уровне или ниже заранее заданного уровня, любое обнаруженное количество ниже предела количественного обнаружения, как считают, находится ниже заранее заданного уровня. В любом случае партия может быть одобрена, даже если числовое значение не определено, поскольку количество все равно находится ниже заранее заданного уровня.

Как только образец показывает, что количество неконъюгированного линкерного лекарственного средства дуокармицина находится ниже заранее заданного значения, то партия ADC может быть выделена или одобрена для продажи, перевозки, применения пациентами и т.д. Термин «выделение/одобрение» в контексте изобретения относится к соответствию партии ADC относительно, по меньшей мере, требования для свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина. Образец, в котором количество свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина выше заранее заданного уровня, не будет приемлем для выделения для клинических испытаний или не может быть одобрен в качестве коммерческого фармацевтического препарата (не пригоден для продажи или применения). Такая партия не будет выделена или одобрена. Обычно фармацевтический продукт должен пройти много измерений качества и плохой результат любого из них будет блокировать конечное выделение или разрешение на применение. Таким образом, выделение/одобрение, как используется в контексте настоящего изобретения, относится к выделению или одобрению партии продукта ADC в отношении содержания свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, но не факт, что к конечному или окончательному выделению и/или одобрению партии.

Хотя представленное выше изобретение описано подробно для определения, содержит ли фильтрат линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме, специалисту в данной области техники легко понять, что аналогичный способ может быть применен для определения других примесей. В частности, композиция и ее фильтрование полезны для получения образца, где могут быть измерены примеси, связанные с линкерным лекарственным средством дуокармицина. Термин «примеси, связанные линкерным лекарственным средством дуокармицина», который используют в настоящем изобретении, относится к примесям, которые могут возникать при разложении линкерного лекарственного средства дуокармицина во время синтеза, очистки и хранения лекарственной субстанции или лекарственного препарата на основе дуокармицин-содержащего ADC. Такие низкомолекулярные примеси, как правило, с молекулярными массами < 2000 Да (молекулярная масса типичного линкерного лекарственного средства) также могут приводить к токсичности, и, следовательно, регулирующие органы могут устанавливать максимальный порог (или заранее заданный уровень) для одной или нескольких из таких примесей. С помощью способа по настоящему изобретению может установить наличие таких примесей и выполнить их количественное определение.

Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации объема настоящего изобретения и не ограничивают его.

Примеры

Материал и способы

Трастузумаб дуокармазин (SYD985) и линкерное лекарственное средство vc-seco-DUBA (SYD980) получают с использованием материалов и методик, описанных в документе WO 2011/133039. Реагенты, растворители и буферы приобретают от коммерческих поставщиков.

Образцы и холостые образцы готовят, как описано ниже.

Приготовление образца или приготовление холостого образца

С использованием пипетки отбирают 100 мкл образца, содержащего дуокармицин-содержащий ADC (10 мг/мл) и возможно некоторое количество линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме, и вводят на фильтр 10K (центрифужное устройство Nanosep^® Omega). На фильтр добавляют 300 мкл разбавляющей среды, содержащей раствор 53% ацетонитрила в воде Milli-Q и 0,13% муравьиной кислоты. Образец и разбавляющую среду гомогенизируют (например, с использованием вихревой мешалки) на фильтре и центрифугируют 15 мин при 14000 g, фильтрат гомогенизируют (например, с использованием вихревой мешалки) и переносят во флакон для ВЭЖХ.

При получении холостого образца следуют той же методике, что описана выше, но используют 100 мкл воды Milli-Q вместо образца, включающего дуокармицин-содержащий ADC и линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме.

Приготовление образцов внешнего стандарта

Образцы внешнего стандарта используют для расчета в образце концентрации линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме. Образцы внешнего стандарта готовят с 0,25 мкг/мл линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме.

ОФ-СВЭЖХ

Для аналитических целей 10 мкл из флакона ВЭХЖ образца или флакона ВЭЖХ холостого образца впрыскивают на колонку обращенно-фазовой сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-СВЭЖХ) с октадецилированным (C18) диоксидом кремния с изо-бутильными боковыми цепочками и с TMS-блокированными концевыми группами (Kinetex 1,7 мкл, XB-C18 100 Å, 100×2,1 мм, Phenomenex) при расходе 0,5 мл/мин и при температуре колонки 45°C. Метод элюирования отображен ниже в таблице 1. Состав подвижной фазы A - 0,1% муравьиной кислоты в воде Milli-Q; состав подвижной вазы B - 0,1% муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил/метанол (50:50 (об./об.). Используют систему обращенно-фазовой сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ), снабженной УФ детектором с 10 мм аналитической ячейкой. Поглощение измеряют при 325 нм. Площади пиков определяют с использованием программного обеспечения Waters Empower. Содержание линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме определяют количественно с использованием формулы (VI):

.

В формуле C_L-D представляет собой концентрацию линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме в образце, A_L-D представляет собой площадь пика линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме в образце, C_стд представляет собой концентрацию линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме во внешнем стандарте, N представляет собой коэффициент разбавления образца, A_стд представляет собой среднюю (среднее значение, по меньшей мере, 3 опытов) площадь пика дуокармицин-содержащего линкерного лекарственного средства в неконъюгированной форме во внешнем стандарте.

Количество связанных с дуокармицином примесей рассчитывают по формуле (VII):

.

В формуле C_п представляет собой концентрацию связанных с дуокармицином примесей в образце, A_п представляет собой площадь пика связанных с дуокармицином примесей в образце, C_стд представляет собой концентрацию линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме во внешнем стандарте, N представляет собой коэффициент разбавления образца, A_стд имеет значение, определенное выше, и RRF_п представляет собой коэффициент относительной чувствительности детектора для связанных с дуокармицином примесей.

Таблица 1. Режим хроматографирования

Время [мин]	Подвижная фаза A [%]	Подвижная фаза B [%]
0	95	5
0,5	95	5
4,0	45	55
6,5	41	59
10,5	5	95
11,5	5	95
12,0	95	5
14,5	95	5

Пример 1 - Образец внешнего стандарта

Линкерное лекарственное средство дуокармицина vc-seco-DUBA в неконъюгированной форме (SYD980) (0,25 мкг/мл) анализируют с помощью метода ОФ-СВЭЖХ, рассмотренного выше. ФИГ. 1 показывает полученную в результате хроматограмму. ФИГ. 1 показывает четкий пик, соответствующий неконъюгированному линкерному лекарственному средству дуокармицина (vc-seco-DUBA) через 6,205 мин.

Пример 2 - Анализ ADC

Образец из партии трастузумаб дуокармазина обрабатывают, следуя описанной выше методике получения образца и анализируют с помощью метода ОФ-СВЭЖХ, рассмотренного выше. Полученная хроматограмма показывает отсутствие неконъюгированного линкерного лекарственного средства vc-seco-DUBA. ФИГ. 2 представляет собой хроматограмму, полученную таким образом, и на ней не обнаружен пик через 6,2 мин или по соседству. Анализ показывает, что количество свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина в образце находится ниже предела обнаружения и, следовательно, ниже заранее заданного уровня (то есть, тест на определение проходит/не проходит). Таким образом, выделение/одобрение партии уместно.

Пример 3 - Сравнение композиций

Вводят 100 мкл образца, содержащего трастузумаб дуокармазина (10 мг/мл) и vc-seco-DUBA (0,25 мкг/мл), на 10K фильтр (центрифужное устройство Nanosep^® Omega). На фильтр добавляют разбавляющую среду (300 мкл), которая состоит из воды, ацетонитрила (ACN) или метанола (MeOH), используемых в разных процентных количествах, и кислоты (муравьиная кислота, трифторуксусная кислота (ТФУК (TFA)) или соляная кислота) в разных процентных количествах. Образец и разбавляющую среду гомогенизируют на фильтре и центрифугируют 15 мин при 14000 g. Фильтрат гомогенизируют и переносят во флакон ВЭЖХ. Количество vc-seco-DUBA (SYD980, то есть неконъюгированного линкерного лекарственного средства дуокармицина) в фильтрате определяют с помощью метода ОФ-СВЭЖХ-УФ с использованием режима хроматографирования, представленного в таблице 1, и определяют количественно по формуле (VI). Результаты обобщены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты выделения vc-seco-DUBA

Опыт	Органический растворитель	Содержание органического растворителя (%)	Кислота	Содержание кислоты (%)	Выделение (%)	RSDa (n=3) (%)
Первая серия опытов
1	ACN	40	Муравьиная кислота	0,1	86	2,4
2	ACN	40	ТФУК	0,1	95	1,8
3	MeOH	40	Муравьиная кислота	0,1	0	-
Вторая серия опытов
4	ACN	25	Муравьиная кислота	0,1	12	8,1
5	ACN	30	Муравьиная кислота	0,1	36	9,7
6	ACN	35	Муравьиная кислота	0,1	68	0,7
7	ACN	40	Муравьиная кислота	0,1	82	2,3
8	ACN	50	Муравьиная кислота	0,1	87	1,2
9	ACN	50	ТФУК	0,1	90	1,5
10	ACN	55	Муравьиная кислота	0,1	87	5,6b
Третья серия опытов
11	ACN	40	HCl	0,1	90	2,6
12	ACN	40	Муравьиная кислота	0,01	84	1,6
13	ACN	40	Муравьиная кислота	0,1	88	1,0
14	ACN	40	Муравьиная кислота	1,0	91	2,2

a: Относительное стандартное отклонение для 3 образцов

b: Только два образца использовано при усреднении и RSD, так как третий имел утечку ADC в такой степени, которая исключает образец.

Первая серия опытов показывает, что ацетонитрил способствует отделению трастузумаб дуокармазина от его неконъюгированного линкерного лекарственного средства дуокармицина vc-seco-DUBA. Оптимальное извлечение vc-seco-DUBA получают при использовании 40% ацетонитрила в комбинации с муравьиной кислотой или трифторуксусной кислотой. При использовании метанола вместо ацетонитрила vc-seco-DUBA извлечен не был.

Вторая серия опытов показывает, что увеличение количества ацетонитрила благоприятно сказывается на извлечении vc-seco-DUBA, которое меняется от 12% (при 25% ацетонитрила) до 90% (при 50% ацетонитрила). Полученное извлечение приемлемо, если ацетонитрил составляет, по меньшей мере, 30%. ФИГ. 3 показывает хроматограмму, полученную в опыте 5 (30% ACN), опыте 1 (40% ACN) и опыте 10 (55% ACN), соответственно, в порядке убывания. Как можно увидеть графически, пик примерно через 6,2 мин, который соответствует количеству извлеченного свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, растет с увеличением процента ACN.

В третьей серии опытов дополнительно исследовано влияние типа или количества кислоты. Результаты показывают, что тип или количество кислоты не имеет решающего значения, и достаточно, чтобы композиция имела pH ниже 7.

1. Композиция для облегчения отделения посредством простого фильтрования дуокармицин-содержащего ADC от свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, содержащая (a) систему растворителей, содержащую воду и ацетонитрил; (b) кислоту; (c) конъюгат антитело-лекарственное средство формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L-D представляет собой линкерное лекарственное средство дуокармицина и m означает среднее DAR от 1 до 12; и необязательно (d) линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме; где указанная композиция содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила.

2. Композиция по п. 1, в которой указанная композиция дополнительно содержит указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме.

3. Композиция по п. 1 или 2, в которой указанный конъюгат антитело-лекарственное средство находится в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 1,0 до 10 мг/мл.

4. Композиция по любому из пп. 1-3, в которой указанная кислота находится в концентрации от 0,01 до 5% (об./об.), предпочтительно от 0,05 до 2%, более предпочтительно от 0,05 до 1,5%, наиболее предпочтительно от 0,1 до 1%.

5. Композиция по любому из пп. 1-4, в которой указанную кислоту выбирают из группы, включающей трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту и соляную кислоту.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, в которой указанное неконъюгированное линкерное лекарственное средство дуокармицина представлено формулой (IV):

,

где n имеет значение 0-3; заместитель R⁵ выбирают из:

;

y имеет значения 1-16; и

заместитель R⁶ выбирают из:

.

7. Композиция по любому из пп. 1-6, в которой указанное неконъюгированное линкерное лекарственное средство дуокармицина представлено формулой:

.

8. Композиция по любому из пп. 1-7, в которой указанное Ab представляет собой антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент.

9. Способ обнаружения и/или количественного определения содержания свободного линкерного лекарственного средства дуокармицина, который включает объединение (i) водного раствора или лиофилизированного продукта конъюгата антитело-лекарственное средство формулы (I):

Ab-(L-D)_m (I),

где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, L-D представляет собой линкерное лекарственное средство дуокармицина, и m означает среднее DAR от 1 до 12, и необязательно дополнительно содержащего линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме, с (ii) разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением композиции, где указанная композиция содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила.

10. Способ по п. 9, который дополнительно включает фильтрование указанной композиции через фильтр, имеющий отсечение по молекулярной массе от 3 до 50 кДа, с получением фильтрата, который по существу свободен от указанного конъюгата антитело-лекарственное средство.

11. Способ по п. 10, в котором указанное фильтрование представляет собой центрифужное фильтрование.

12. Способ по п. 11, в котором указанный фильтр содержит модифицированный полиэфирсульфон, предпочтительно фильтрующую среду Nanosep Omega.

13. Способ по любому из пп. 10-12, который дополнительно включает проведение на указанном фильтрате процесса хроматографического разделения, приемлемого для выделения указанного линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме, и измерение количества, при наличии, указанного линкерного лекарственного средства дуокармицина в неконъюгированной форме, присутствующего в фильтрате.

14. Способ выделения/одобрения партии конъюгата антитело-лекарственное средство, который включает:

1) получение образца из партии конъюгата антитело-лекарственное средство, где указанная партия содержит антитело, конъюгированное с линкерным лекарственным средством дуокармицина, и необязательно линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме;

2) объединение указанного образца с разбавляющей средой, которая содержит воду, ацетонитрил и кислоту, с получением фильтруемой композиции, которая содержит от 30 до 60% (об./об.), предпочтительно от 35 до 55%, указанного ацетонитрила;

3) фильтрование указанной фильтруемой композиции с получением фильтрата, который по существу свободен от указанного конъюгата антитело-лекарственное средство;

4) анализирование указанного фильтрата и определение, содержит ли указанный фильтрат указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме ниже заранее заданного уровня; и

5) выделение/одобрение указанной партии конъюгата антитело-лекарственное средство, если указанное линкерное лекарственное средство дуокармицина в неконъюгированной форме находится ниже заданного уровня.

15. Способ по п. 14, в котором указанный заранее заданный уровень соответствует концентрации линкерного лекарственного средства дуокармицина в образце, которая составляет 0,2 мгк/мг конъюгата антитело-лекарственное средство или меньше.