Вакцина, включающая белок orf2 pcv2 генотипа 2b

Изобретение относится к способу защиты свиней против инфекции цирковируса свиней 2 типа. Способ включает введение свинье вакцины, содержащей ORF2-кодируемый белок цирковируса свиней 2 (PCV2) и фармацевтически приемлемый носитель. Вакцина включает 5-20 мкг на дозу ORF2-кодируемого белка. Белок представляет собой белок цирковируса свиней генотипа 2b. Вакцина обеспечивает защиту против PCV2 генотипа 2d на уровне, соответствующем защите, придаваемой, когда свинью вакцинируют ORF2-кодируемым белком PCV2d. Способ обеспечивает улучшение защиты свиней против инфекции PCV2. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к вакцинам для защиты свиней против инфекции цирковирусом свиней 2 типа.

Предпосылки создания изобретения

Свиной цирковирус 2 типа (PCV2) является экономически важным патогеном свиней, и, хотя он является небольшим, он имеет самую высокую скорость эволюции среди ДНК-вирусов. Со времени открытия PCV2 в конце 1990-х годов этот минималистичный вирус с геномом, представленным одноцепочечной ДНК 1,7 т.п.н., и двумя необходимыми генами (ORF1 и ORF2) стал одним из наиболее важных патогенов свиней, и в настоящее время подвергается наиболее сильной профилактической интервенции в виде вакцин в промышленном свиноводстве в глобальном масштабе. ORF2 ген PCV кодирует капсидный белок вируса, который в полную длину представляет собой белок из примерно 233 аминокислот. Ген ORF2 всех изолятов PCV2 имеет 91-100% идентичности нуклеотидной последовательности и 90-100% идентичности предсказанной аминокислотной последовательности. В настоящее время PCV2 можно разделить на пять различных генотипов PCV2a-PCV2e (Karuppannan and Opriessnig in Viruses 2017, 9, 99). Документально подтверждено, что PCV2 продолжает эволюционировать, что отражается в изменениях преобладания генотипов. В течение 2006 года коммерческие вакцины против PCV2 широко применялись для популяции свиней, в основном инфицированных PCV2b. С 2012 года генотип PCV2d по существу заменил ранее преобладающий генотип PCV2b в Северной Америке, и аналогичные тенденции также задокументированы в других географических регионах, таких как Китай и Южная Корея. Это второй основной сдвиг генотипа PCV2 после открытия вируса. Значительное внимание уделялось потенциальному увеличению вирулентности возникающего генотипа PCV2 и эффективности современных вакцин на основе генотипа PCV2a против вирусов генотипа PCV2d.

Вакцины для защиты от инфекции вирусом PCV2 без какого-либо исключения основаны на ORF2 гене PCV2, включающем либо ДНК, либо РНК материал для обеспечения соответствующего белка после введения субъекту-животному, представляющего собой белок, кодируемый геном ORF2 (например, полноразмерный белок, один или несколько усеченных вариантов или их смесь), или представляющего собой полный вирус и, таким образом, по своей природе капсидный белок. В данной области техники несколько вакцин против PCV2 являются коммерчески доступными. Porcilis® PCV (доступная от MSD Animal Health, Boxmeer, Нидерланды) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней 2 типа, предназначенную для свиней от трех недель и старше. При двухразовом введении вакцины (две дозы) продолжительность иммунитета (DOI) составляет 22 недели, что почти полностью охватывает период откорма свиней. Ingelvac CircoFlex® (доступная от Boehringer Ingelheim, Ingelheim) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней 2 типа для введения свиньям от двух недель и старше. Она зарегистрирована только как одноразовая (одна доза) вакцина. Circovac® (доступная от Merial, Lyon, Франция) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней 2 типа для введения свиньям от трех недель и старше. Suvaxyn® PCV (доступная от Zoetis, Capelle a/d IJssel, Нидерланды) представляет собой вакцину для защиты свиней от цирковируса свиней 2 типа, предназначенную для свиней от трех недель и старше. Другие вакцины против PCV2 описаны, например, в WO2007/028823, WO 2007/094893 и WO2008/076915.

В недавно опубликованной обзорной статье, указанной выше (Viruses 2017), обобщены современные знания о биологии PCV2, экспериментальных исследованиях антигенной вариабельности, молекулярно-эпидемиологическом анализе эволюции генотипов PCV2 и вакцинах против PCV2. Что касается последнего, указано, что гомологичная защита может быть лучше, чем гетерологичная защита. Что касается перекрестной защиты, был сделан вывод (стр. 5, строки 29-32), что “контролируемые экспериментальные исследования и полевые испытания показывают, что вакцины на основе PCV2a [такие как Porcilis PCV и CircoFLEX] и вакцина на основе PCV2b обеспечивают адекватную перекрестную защиту против клинического заболевания после контрольного заражения вирусами генотипа PCV2a, PCV2b и PCV2d и улучшение среднесуточного привеса”. Таким образом, общеизвестно, что перекрестная защита является адекватной для каждого генотипа.

Цель изобретения

Целью является обеспечение улучшенной вакцины для защиты против инфекции PCV2.

Сущность изобретения

В соответствии с целью настоящего изобретения, была разработана вакцина, включающая ORF2-кодируемый белок цирковируса свиней 2 (PCV2) и фармацевтически приемлемый носитель, при этом вакцина предназначена для применения в способе защиты свиньи против инфекции цирковирусом свиней 2 типа путем введения вакцины свинье, где вакцина включает меньше чем 20 мкг на дозу ORF2-кодируемого белка (например, полноразмерного белка, одного или нескольких усеченных вариантов или их смеси), причем белок представляет собой белок цирковируса свиней генотипа 2b. Количества могут иметь любое значение 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мкг на дозу.

Удивительно, что вопреки современным знаниям, отраженным в Viruses 2017, было обнаружено, что ниже дозы 20 мкг белка, кодируемого ORF2 (далее также называемого “белок ORF2”), белок, происходящий из PCV2 генотипа 2b, обеспечивает заметно лучшую перекрестную защиту, чем белок ORF2 генотипа 2а, который присутствует в большинстве коммерческих вакцин, включая вакцины, которые преобладают на рынке (т.е. Porcilis PCV от MSD Animal Health и CircoFLEX от Boehringer Ingelheim). Выше 20 мкг разницы в перекрестной защите не наблюдается. Поскольку как Porcilis PCV, так и CircoFLEX содержат уровни значительно выше 20 мкг на дозу, это объясняет, почему обе вакцины успешно защищают от гетерологичного заражения. Однако использование ORF2 белка PCV2b дает возможность снизить количество антигена в вакцине с достижением при этом адекватной перекрестной защиты. Это не только полезно с экономической точки зрения, но и может стать очень важным для избежания интерференции между антигенами в готовых к применению комбинированных вакцинах или для стратегий вакцинации с использованием меньшего объема вакцин, таких как внутрикожная вакцинация.

Минимальное количество ORF2-кодируемого белка на дозу представляет собой количество, при котором защитный иммунитет против инфекции PCV2 все еще может достигаться. Это может быть установлено путем рутинных экспериментов и зависит в том числе от требуемого уровня защиты. Для существующей вакцины, основываясь на существующих данных и предшествующем уровне техники, касающихся минимального защитного количества белка ORF2 в вакцине (см., например, WO2006/072065), считают, что минимальное количество должно составлять 0,2 мкг антигена на дозу, но это может быть любая более высокая доза, такая как 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0 мкг на дозу.

Следует отметить, что изобретение также относится к вакцине как таковой и к способу защиты свиньи от инфекции цирковирусом свиней типа 2 путем введения этой вакцины свинье.

Определения

Вакцина представляет собой фармацевтическую композицию, которая безопасна для введения субъекту-животному и может индуцировать защитный иммунитет у этого животного против патогенного микроорганизма, т.е. индуцировать успешную защиту против инфекции таким микроорганизмом.

Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой биосовместимую среду, т.е. среду, которая после введения не индуцирует существенных побочных реакций у субъекта-животного, способную презентировать антиген иммунной системе животного-хозяина после введения вакцины. Такой фармацевтически приемлемый носитель, например, может представлять собой жидкость, содержащую воду и/или любой другой биосовместимый растворитель, или твердый носитель, такой как обычно используемый для получения лиофилизированных вакцин (на основе сахаров и/или белков), необязательно включающий иммуностимулирующие агенты (адъюванты). Необязательно добавляют другие вещества, такие как стабилизиторы, модификаторы вязкости или другие компоненты, в зависимости от предполагаемого применения или требуемых свойств соответствующей вакцины.

Защита против инфекции микроорганизмом способствует предотвращению, уменьшению интенсивности или лечению инфекции этим микроорганизмом или расстройства, возникающего в результате этой инфекции, например, для предотвращения или уменьшения одного или нескольких клинических симптомов, связанных с инфекцией патогеном.

Вакцина, которая обеспечивает защиту после однократного введения, означает, что защитный иммунитет обеспечивается после только одного введения вакцины, и следовательно, что повторная вакцинация не требуется для достижения указанного защитного иммунитета. В режиме двухкратного введения после первой (первичной) вакцинации обычно вводят бустерную дозу в течение 6 недель после первого введения, обычно в течение 3 или даже 2 недель после первого введения, и только после второго (бустерного) введения, как должно быть понятно, достигается защитный иммунитет, т.е. успешная защита, как определено выше.

Варианты осуществления изобретения

В первом варианте осуществления вакцина включает меньше чем 5 мкг на дозу. Было показано, что даже при 1/16 дозы от полной дозы содержащей 80мкг ORF2 белка вакцины может достигаться адекватная перекрестная защита с ORF2 белком генотипа PCV2b.

Во втором варианте осуществления вакцина предназначена для свиней, имеющих анти-PCV2 антитела. К удивлению, было установлено, что защитный иммунитет против PCV2 можно было получить с дозой ORF2 белка генотипа 2b ниже 20 мкг. Из предшествующего уровня техники, например EP 1926496, известно, что доза выше 20мкг необходима для достижения адекватной защиты у сероположительных поросят с ORF2 белком генотипа 2а. Действительно, коммерческие успешные вакцины против PCV2, такие как Porcilis PCV и CircoFLEX, вводят при дозе значительно выше 20 мкг. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает возможность использовать меньше чем 20 мкг ORF2 белка на дозу, даже когда анти-PCV2 антитела имеют материнское происхождение.

В другом варианте осуществления вакцина предназначена для свиней возраста 4 недели или меньше. Для достижения адекватной защиты в наиболее критический период возраста 5-10 недель вакцинация до достижения возраста 4 недель оказалась эффективной, даже при том, что может быть интерференция материнских антител в этом молодом возрасте.

Еще в одном варианте осуществления вакцина обеспечивает защиту после всего одного введения вакцины. К удивлению было установлено, что даже одноразовая доза вакцины, содержащей ORF2 белок генотипа PCV2b, могла обеспечить адекватную перекрестную защиту при очень низком уровне 5 мкг на дозу, тогда как ORF2 белок генотипа PCV2a был менее способным обеспечивать какую-либо защиту против гетерологичного заражения PCV2 вирусом.

Еще в одном варианте осуществления вакцина обеспечивает защиту против PCV2 гетерологичных генотипов (т.е. PCV2a, PCV2c, PCV2d или PVC2e) на уровне, соответствующем защите, придаваемой когда свинья была бы вакцинирована ORF2-кодируемым белком PCV2, который гомологичен вирусу PCV2 для контрольного заражения.

Также еще в одном варианте осуществления вакцина обеспечивает защиту против PCV2 генотипа 2d на уровне, соответствующем защите, придаваемой когда свинья была бы вакцинирована ORF2-кодируемым белком PCV2d.

Изобретение далее подробно объясняется с использованием следующих неограничивающих примеров.

Пример 1 описывает способы определения количества ORF2 белка в образце.

Пример 2 описывает установление перекрестной защиты с использованием ORF2 белка PCV2a, 2b и 2d.

Фиг. 1 схематически представляет IHC оценку после контрольного заражения PCV2b.

Фиг. 2 схематически представляет IHC оценку после контрольного заражения PCV2d.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Способы определения количества ORF2 белка в образце

Количество ORF2-кодируемого белка можно определить любым известным в данной области способом. EP 1926496 в примере 4 описывает общий способ на основе электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. Этот тип способа определения содержания белка в образце общеизвестен и, например, описан в The Protein Protocols Handbook, 2^nd edition, September 2002, под редакцией JM Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ Chapter 29, pp 237-242. Полноразмерный белок имеет длину около 26-27 кДа. Обычные усеченные варианты типично имеют длину на 2-4 кДа меньше. В случае необходимости (например, когда в образце также присутствуют другие белки сопоставимой длины), соответствующие полосы с ORF2 белками можно идентифицировать с использованием антител против ORF2, которые можно визуализировать с использованием меченых антител.

В альтернативном способе количество ORF2-кодируемого белка (где также можно определить полноразмерный белок, а также его усеченные варианты) устанавливают при помощи масс-спектрометрического метода мониторинга множественных реакций (MRM) с использованием очищенного ORF2 белка в качестве стандарта. Для этого белок сначала расщепляют, например, с использованием трипсина. Затем пептиды разделяют, например с использованием жидкостной хроматографии, и затем пептиды подвергают масс-спектрометрии с использованием сигнального пептида (в данном случае “VEFWPCSPITQGDR”) для нормализации вариаций в сигнале. Наблюдаемый сигнальный пептид уникален для ORF2 PCV2, расщепленного трипсином. Детальное описание способа представлено в декларации Merill Schaeffer, Ph. D, посланной в Европейское патентное ведомство как документ “D60” 23 августа 2016 года компанией Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, представителем которой является Hoffmann Eitle, в качестве возражения против EP 1926496.

Применение этих способов к Porcilis PCV и CircoFLEX показало, что в каждом случае количество ORF2-кодируемого белка намного выше чем 20 мкг на дозу.

Пример 2: установление перекрестной защиты с использованием ORF2 белка PCV2a, 2b и 2d

Как известно из уровня техники, при 100% уровне существующих вакцин, ORF2 белок PCV2a и других генотипов обеспечивает адекватную перекрестную защиту, во всех случаях на сопоставимых уровнях. В следующем эксперименте использовали вакцины, соответствующие Porcilis PCV, при разбавлении либо 4-кратно (“25%” вариант), либо 16-кратно (“6,25%” вариант) по сравнению с вакциной при ее полной (“100%”) дозе. Вакцина была изготовлена в соответствии с указаниями EP1926496 с полной дозой около 80 мкг ORF2-кодируемого белка.

Исследование осуществляли для оценки эффективности ветеринарных вакцин с разными штаммами PCV2 (PCV2a, PCV2b и PCV2d) против контрольного заражения PCV2b и PCV2d для исследования, имеется ли при некоторой низкой дозе предпочтение в отношении ORF2 белка определенного генотипа, в частности, при оценке свойств перекрестной защиты.

Для этого исследования осуществляли 2 отдельных эксперимента, в каждом эксперименте использовали 70 животных. 140 животных происходили от 14 свиноматок, и их распределяли в 14 групп обработки, по 10 животных в каждой. Поросята имели определяемые уровни анти-ORF2 антител от низких до очень высоких, при этом среднее значение для всех животных было по существу одинаковым для обоих экспериментов (около 5,8 во время вакцинации). Поросят вакцинировали внутримышечно дозой 2 мл, когда им было около трех недель. В каждом эксперименте с использованием 70 животных группы 1-6 были вакцинированы вакциной против PCV2 с разными концентрациями ORF2-кодируемого PCV2 и штаммов различных генотипов PCV2, как указано ниже:

Эксперимент 1

Поросят из группы 1 вакцинировали 25% дозой PCV2a штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 2 вакцинировали 6,25% дозой PCV2a штамма (около 5 мкг);

Поросят из группы 3 вакцинировали 25% дозой PCV2b штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 4 вакцинировали 6,25% дозой PCV2b штамма (около 5 мкг);

Поросят из группы 5 вакцинировали 25% дозой PCV2d штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 6 вакцинировали 6,25% дозой PCV2d штамма (около 5 мкг).

Поросят из контрольной группы 7 не вакцинировали.

Эксперимент 2

Поросят из группы 1 вакцинировали 25% дозой PCV2a штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 2 вакцинировали 6,25% дозой PCV2a штамма (около 5 мкг);

Поросят из группы 3 вакцинировали 25% дозой PCV2b штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 4 вакцинировали 6,25% дозой PCV2b штамма (около 5 мкг);

Поросят из группы 5 вакцинировали 25% дозой PCV2d штамма (около 20 мкг);

Поросят из группы 6 вакцинировали 6,25% дозой PCV2d штамма (около 5 мкг).

Поросят из контрольной группы 7 не вакцинировали.

Через две недели после вакцинации всех животных переводили в лабораторию для испытаний Intervet International B.V. Через три недели после вакцинации (в возрасте 6 недель) всех животных подвергали контрольному заражению с использованием 5,0 log10 TCID50/мл штамма вируса для контрольного заражения PCV2b дикого типа (Эксперимент 1) или штамма PCV2d дикого типа (Эксперимент 2), вводимых интраназально по 3мл в ноздрю. Через три недели после контрольного заражения всех животных подвергали вскрытию и мезентериальный лимфатический узел, миндалину и паховый лимфатический узел брали для исследования для определения PCV2 вируса с использованием иммуногистохимического (IHC) анализа, используя оценку от 0 (отсутствие специфического положительного окрашивания) до 3 (больше чем 50% лимфоидных фолликулов содержат клетки с положительным окрашиванием).

Результаты показаны на Фиг. 1 и 2. Как становится ясно из Фиг. 1, гомологичная защита, обеспечиваемая PCV2b вакциной, как ожидалось, лучше, чем гетерологичная защита. PCV2a, по-видимому, обеспечивает несколько лучшую перекрестную защиту против PCV2b, чем PCV2d, хотя при самой низкой дозе никакой разницы нет.

К удивлению, как показано на Фиг. 2, ORF2-кодируемый белок PCV2b обеспечивает гетерологичную защиту при низких дозах, испытанных на уровне, который является таким же, как гомологичная защита, обеспечиваемая ORF2-кодируемым белком PCV2d. В этом состоит отличие от гетерологичной защиты, обеспечиваемой ORF2-кодируемым белком PCV2a, который обеспечивает не такую хорошую защиту при низких дозах, которые были испытаны. Таким образом, в противоположность широко распространенному мнению, что ORF2 белок генотипов PCV2a и PCV2b обеспечивает равный уровень перекрестной защиты, оказалось, что ниже дозы 20мкг, которая известна как необходимая для эффективного прорыва через MDA против PCV2 (см. EP 1926496), ORF2-кодируемый белок PCV2b обеспечивает значительно лучшую перекрестную защиту, чем ORF2-кодируемый белок PCV2a. Также, несмотря на присутствие MDA, адекватная защита могла бы достигаться, по сравнению с контролем, при этих низких уровнях доз, в частности, при использовании ORF2-кодируемого белка PCV2b.

1. Способ защиты свиньи против инфекции цирковирусом свиней 2 типа, включающий введение свинье вакцины, включающей ORF2-кодируемый белок цирковируса свиней 2 (PCV2) и фармацевтически приемлемый носитель, где вакцина включает 5-20 мкг на дозу ORF2-кодируемого белка, где белок представляет собой белок цирковируса свиней генотипа 2b и где вакцина обеспечивает защиту против PCV2 генотипа 2d на уровне, соответствующем защите, придаваемой, когда свинью вакцинируют ORF2-кодируемым белком PCV2d.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вакцина предназначена для защиты свиней, которые имеют антитела против PCV2.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитела против PCV2 имеют материнское происхождение.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что возраст свиньи составляет 4 недели или меньше.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вакцина обеспечивает защиту после всего одного введения вакцины.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что вводят только одну дозу вакцины для достижения указанной защиты.