Штамм микроскопического гриба cladosporium halotolerans zalar, de hoog & gunde-cim. bkm f-4829d, являющийся активным агентом биоповреждений промышленных материалов
Владельцы патента RU 2776486:
Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к защите промышленных материалов от коррозии. Создан штамм микроскопического гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях. Изобретение позволяет повысить коррозионную способность микроскопического гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D по отношению к лакокрасочным материалам, полимерам, устойчивостью к ряду фунгицидов. 3 табл., 2 ил.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к защите промышленных материалов от коррозии и может быть использовано для тестирования грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, а также для получения ряда биологически активных веществ.
Известно, что основным агентом биокоррозии материалов являются микроскопические грибы. В настоящее время для проверки грибостойкости материалов согласно ГОСТ 9.048-89 используются музейные культуры микроскопических грибов, хранящиеся в национальных коллекциях микроорганизмов. Эти культуры выделены много лет назад как обладающие высокой повреждающей способностью к ряду материалов. При длительном хранении грибов в коллекциях многие их свойства ослабевают. Кроме того, за прошедший период появилось множество новых синтетических материалов, устойчивых к данным коллекционным культурам. В то же время микроскопические грибы в природных условиях постоянно приспосабливаются как к появляющимся новым материалам, так и к новым средствам защиты материалов, и среди них постоянно появляются новые высокоагрессивные штаммы грибов. Поэтому постоянный поиск и выделение таких штаммов, изучение их свойств и использование новых агрессивных штаммов в тестировании материалов на грибоустойчивость является необходимой частью работы по защите материалов от коррозии. Кроме того, именно такие штаммы зачастую являются активными продуцентами многих метаболитов, таких как органические кислоты и ферменты, которые и обеспечивают высокую коррозионную агрессивность штаммов. Высокопродуктивные штаммы могут быть использованы в биотехнологической промышленности для получения ряда важных метаболитов.
Представители рода Cladosporium хорошо известны как агенты биоповреждения, и как продуценты многих органических кислот и ферментов; различные виды этого рода задепонированы и хранятся во многих коллекциях по всему миру, в основном, как продуценты органических кислот и ферментов. Виды этой группы грибов широко распространены по всему миру, в том числе и в тропических регионах, обладают очень широкими адаптивными способностями и быстро осваивают новые материалы, поэтому постоянно появляются новые агрессивные штаммы. Наиболее быстро процессы адаптации проходят в условиях высоких температур и влажности, поэтому наибольшее количество новых агрессивных форм и наибольший урон приходится на страны с тропическим климатом. Нами выделен и исследован штамм Cladosporium halotolerans. ЛТТ 2 Zalar, de Hoog & Gunde-Cim., обладающий высокой коррозионной способностью по отношению к лакокрасочным материалам, полимерам, устойчивостью к ряду фунгицидов. Данный штамм задепонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ РАН) под номером ВКМ F-4829D 20.03.2019 (свидетельство прилагается).
Известен способ качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов посредством суспензии споровых материалов, включающей смесь споровых материалов отдельных культур грибов в равных соотношениях Paecilomyces variotii Bainier ВКМ F-4039D, Ulocladiurn botrytis Preuss ВКМ F-4032D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thorn et Church BKM F-4037D, Penicillium chrysogenum Thorn BKM F-4034D, в том числе и Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D (RU 2486250, 27.06.2013). Данный штамм используется в смеси споровых материалов только для качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов.
Известен Штамм гриба Cladosporium gossipicola №1902 как тест оценки микробиологической стойкости органических соединений (SU 661012 А1, 19.06.1995). Штамм гриба Cladosporium gossipicola №1902 хранится в коллекции типовых культур института микробиологии РАН. Выделен из образцов фторсодержащих полимеров и элементов металлоконструкций, защищенных лакокрасочными покрытиями. Использование данного штамма позволяет повысить достоверность результатов оценки биостойкости материалов, в том числе защищенных фунгицидами, по сравнению со штаммами, рекомендованными всемирной организацией по стандартизации МЭК.
Недостатками этого штамма является ограниченное его использование при повышенных температурах. При температуре выше 37°С штамм приостанавливает рост. Кроме того, штамм выделен и помещен в коллекцию более 25 лет назад. За это время появилось и активно используется много новых материалов, к которым у природных штаммов-деструкторов метаболизм приспосабливался, тогда как коллекционные не знакомы с новыми материалами. Данный источник рассмотрен в качестве ближайшего аналога.
Техническим результатом заявленного изобретения является высокая коррозионная способность микроскопического гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D по отношению к лакокрасочным материалам, полимерным материалам, устойчивость к ряду фунгицидов.
Технический результат достигается тем, что создан штамм микроскопического гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D, используемый как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, в том числе в тропических регионах, где повышенные температура и влажность создают оптимальные условия для развития плесневых грибов, вызывающих биоповреждения различных материалов.
Штамм Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D, выделен из верхнего слоя почвы на контакте с полимерным материалом (Дам Бай, Нячанг, Вьетнам). Получение данного штамма осуществляли путем посева почвенных разведений на агаризованную среду Чапека с добавлением антибиотика стрептомицина 100 мг/л среды для подавления роста бактерий. Затем пересевали отдельные колонии на агаризованную среду Чапека для выделения чистой культуры штамма Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D.
Морфо-физиологические и биохимические свойства штамма изучали на жидкой и агаризованной среде Чапека при 25°С, способность к росту проверялась от 0 до +45°С.
Видовая идентификация штамма проводилась по культурально-морфологическим признакам посредством определителей:
Crous P.W., Braun U., Schubert K., Groenewald J.Z. (eds.) The genus Cladosporium and similar dematiaceous hyphomycetes. Studies in Mycology, 58. 2007. 253 pp.
Domsch K.H., Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi. IHW-Verlag, 1993. Vol.1. 860 pp.
Также проведено молекулярное определение путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Полученные нуклеотидные последовательности редактировали с помощью программы Chromas Lite 2.01 (http://www.technelysium.com.au). Номер в ГенБанке: MG646343 (99,423%).
Макроскопические признаки (см. фиг. 1а, б): Колонии ограниченно растущие, диаметром 1-1,5 см, плоские, слабовыпуклые, бархатистые, мицелий темноокрашенный, спороношение темно-оливково-зеленого до черного цвета, оборот зеленовато-черный, экссудата и пигмента нет.
Микроскопические признаки:
Конидиеносцы разной длины, от 50 до 150(300) мкм, диаметром 3-5 мкм, хорошо видны в краевой зоне колонии, окрашенные в золотисто-коричневые и оливково-коричневые тона, чаще гладкие, но есть и слабошероховатые; рамоконидии 0-1 септированные, удлиненные, размерами 6-12 x 2-4 мкм, тоже окрашенные, поверхность гладкая до слабошероховатой; конидии округлые до слабоовальных, диаметром (2-)3-5 мкм, окрашенные в сходные тона, шероховатые (см. фиг. 2 а, б).
Физиологические свойства штамма:
Растет в аэробных и микроаэрофильных условиях, термотолерантен (отмечен рост при +45°С).
Методы исследования. Определение биомассы грибов.
Культивирование Cladosporium halotolerans Zalat, de Hoog & Gunde-Cim.BKM F-4829D для биохимических исследований осуществлялось на жидкой питательной среде следующего состав (г/л): NaNO3 - 2,0; KH2PO4; K2HPO4 - 3; KCL - 0,5; MgSO4⋅7P2O; FeSO4 - 0,01, сахароза - 30,0 при температуре (27±2)°С на перемешивающих устройствах марки ПЭ - 0034 «Электроприбор Россия», которые обеспечивали встряхивание колб со скоростью 180 об/мин.
Накопление биомассы определялось следующим образом:
Споры тест-культуры Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D со скошенной агаризованной питательной среды, путем смыва стерильной дистиллированной водой, переносились в стерильные колбы с жидкой питательной средой. После культивирования в течение 7 суток, мицелий Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D отфильтровывался, и равные по массе образцы мицелия вносились в колбы со свежей питательной средой, содержащей исследуемые соединения в различных концентрациях. Культивирование проводилось аналогичным, описанному выше, способом, в течение 7 суток. По истечении срока культивирования, мицелий Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D был отфильтрован и высушен до постоянной массы.
Определение органических кислот.
Были проведены эксперименты по определению количества органических кислот в культуральной жидкости (к.ж.) штамма гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D. Пробу подготавливали предварительным разбавлением культуры штамма Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D бидистиллированной водой в 50 раз и центрифугированием в течение 3 мин при скорости 5000 об/мин. Анализ проводили в соответствии с методикой анализа Μ 04-47-2012. Ввод пробы осуществлялся автоматически при 30 мбар, длина волны детектора 254 нм, напряжение - 20 кВ, температура +20°С.
Определение органических кислот осуществлялось методом капиллярного электрофореза (КЭ), который основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под воздействием электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 3-кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее - от величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной - высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. Были получены следующие органические кислоты (см. таблица 1). Как видно из таблицы 1, данный штамм продуцирует в больших количествах глюконовую и молочные кислоты.
Определение активности каталазы.
Определение активности каталазы проводилось спектрофотометрически (Shimadzu UVmini-1240). В качестве субстрата использовался 30 мМ пероксид водорода (Li, Shellhorn, 2007). Измерения проводились при λ=240 нм.
В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из 1 мл буферного раствора рН=7,8; 1 мл культуральной жидкости гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D; 1 мл 30 мМ Н2О2. Измерения проводили в течение одной минуты. В контрольной кювете Н2О2 заменяли водой.
Активность каталазы рассчитывалась по формуле:
где А - активность фермента каталазы,
D - убыль оптической плотности реакционной смеси гриба Cladosporium halotolerans ВКМ F-4829D
d - толщина слоя жидкости в кювете, см,
t - время, мин,
С - концентрация белка в к.ж., мг/мл
α × β × χ - факторы разведения. Результаты измерений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималась убыль оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг общего белка.
Определение активности полифенолоксидазы.
Определение активности полифенолоксидазы проводилось спектрофотометрически по модифицированному методу. В качестве субстрата использовали n-фенилендиамин (0,1 М). Измерения проводились при λmax = 535 нм.
В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из: 2 мл буферного раствора рН=7,2; 0,5 мл 0,1 Μ раствора n-фенилендиамина; 0,5 мл культуральной жидкости гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D. В контрольной кювете n-фенилендиамин заменяли водой.
Активность полифенолоксидазы рассчитывалась по формуле: А=D • α •·β •·γ / C • t • d,
где А - активность фермента, D - приращение оптической плотности реакционной смеси гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D, С - концентрация белка в к.ж., мг/мл, d - толщина слоя жидкости в кювете, см; t - время, мин; α •·β •·γ - факторы разведения.
Результаты изменений выражались в условных единицах (у.е). За единицу активности принималось приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг белка. Полученные данные приведены в таблице 2.
Таким образом, штамм Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D обладает каталазной и оксидоредуктазной активностью, что делает этот вид потенциально опасным для таких полимерных материалов, как ПВХ, полиакрилаты, эпоксидные компаунды и т.д., в деструкции которых участвуют данные энзимы. Штамм представляет опасность как потенциальный деструктор полимерных материалов, содержащих амидную связь. Штамм Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D синтезирует и выделяет в окружающую среду многие органические кислоты: глюконовую, щавелевую, муравьиную, яблочную, лимонную, янтарную, молочную, уксусную, что свидетельствует о его возможности участвовать в процессе биоповреждений изделий РЭО.
Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания).
Для таксономических и морфо-физиологических исследований, хранения культуру гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D выращивают на агаризованных средах в чашках Петри или пробирках.
Среда Чапека: вода питьевая - 1,0 л сахароза - 30,0 г нитрат натрия (NaNO3)- 2,0 г хлорид калия (KCl) - 0,5 г сульфит магния (MgSO4) - 0,5 г фосфат калия двузамещенный (K2HPO4) - 1,0 г агар-агар - 20,0 г рН 7,4-7,6.
Стерилизация при 1 атм (121°С) - 20 мин.
Мальт-экстракт-агар (солодовый агар):
вода питьевая - 1,0 литр солодовый экстракт 30,0 г пептон из соевой муки 3,0 г агар-агар 15,0 г рН 5,6±0,2 при 25°С. Стерилизация при 1 атм. (121°С) - 10 мин.
Культивирование в термостате 7-10 суток при +25°С.
Для наращивания биомассы и биохимических исследований экзометаболитов Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D культивируют на жидкой среде Чапека (без добавления агар-агара) в колбах на качалке (120-180 об/мин) при температуре +25 - +27°С.
Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок)
1) В пробирке на закошенной питательной среде Чапека под минеральным маслом; в холодильнике при температуре 0 - +4°С. Срок хранения без пересева - 2 года.
2) Лиофилизированные споры гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D в запаянной ампуле для длительного хранения.
Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФБГУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина (ВКМ ИБФМ РАН) под номером ВКМ F-4823D.
Результаты.
Реализацию использования штамма гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D в качестве тест-культуры для определения биокоррозионной способности (агрессивности) проверяли методом нанесения его споровой суспензии в концентрации 10*5 мл на поверхность лакокрасочных материалов, полимеров, резин и герметиков. Контролем служили образцы тех же материалов, обработанные споровой суспензией грибов Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BKM F-4829D согласно ГОСТ 9.048-89. Обработанные суспензией образцы помещали в эксикаторы с 90% влажностью и устанавливали в термостаты с температурой +28°С на 28 суток (ГОСТ 9.048-89). Повторность всех образцов трехкратная. В опытах использовали следующие материалы:
1. Краска ЭП-525;
2. Краска ЭП-140;
3. Краска акриловая бактерицидная с частицами наносеребра PREMIA (Ярославль);
4. Герметик 1 акриловый (Soudal, Бельгия);
5. Герметик 2 силиконовый бесцветный с кислотным отвердением с добавлением биоцида 2-octyl-2H-isothiazol-3-on (Soudal, Бельгия);
6. Герметик 3 силиконовый белый с кислотным отвердением с добавлением биоцида 4.5-dicmoro-2n-octyl-4-isothiazol-3-one (Soudal, Бельгия);
7. Герметик 4 однокомпонентный герметик ВГО-1 кремнийорганический белый (ТУ 38.303-04-04-90).
Результаты исследования отражены в таблице 3.
По результатам экспериментов, деструктивная активность штамма Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. ВКМ F-4829D превышает активность музейных культур, рекомендованных ГОСТ 9.048-89, штамм может быть рекомендован для дополнительных испытаний на грибостойкость лакокрасочных и полимерных материалов.
Штамм микроскопического гриба Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog & Gunde-Cim. BКM F-4829D как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий.
