Штамм микроскопического гриба penicillium sclerotiorum j.f.h. beyma bkm f-4837d, являющийся активным агентом биоповреждений промышленных материалов
Владельцы патента RU 2776487:
Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к защите промышленных материалов от коррозии. Создан штамм микроскопического гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, а также как продуцент ряда биологически активных веществ. Изобретение позволяет повысить коррозионную способность микроскопического гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D no отношению к лакокрасочным материалам, полимерам устойчивостью к ряду фунгицидов. 2 ил., 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к защите промышленных материалов от коррозии и может быть использовано для тестирования грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, а также для получения ряда биологически активных веществ.
Известно, что основным агентом биокоррозии материалов являются микроскопические грибы. В настоящее время для проверки грибостойкости материалов согласно ГОСТ 9.048-89 используются музейные культуры микроскопических грибов, хранящиеся в национальных коллекциях микроорганизмов. Эти культуры выделены много лет назад как обладающие высокой повреждающей способностью к ряду материалов. При длительном хранении грибов в коллекциях многие их свойства ослабевают. Кроме того, за прошедший период появилось множество новых синтетических материалов, устойчивых к данным коллекционным культурам. В то же время микроскопические грибы в природных условиях постоянно приспосабливаются как к появляющимся новым материалам, так и к новым средствам защиты материалов, и среди них постоянно появляются новые высокоагрессивные штаммы грибов. Наиболее быстро процессы адаптации проходят в условиях высоких температур и влажности, поэтому наибольшее количество новых агрессивных форм и наибольший урон приходится на страны с тропическим климатом. Поэтому постоянный поиск и выделение таких штаммов, изучение их свойств и использование новых агрессивных штаммов в тестировании материалов на грибоустойчивость является необходимой частью работы по защите материалов от коррозии. Кроме того, именно такие штаммы зачастую являются активными продуцентами многих метаболитов, таких как органические кислоты и ферменты, которые и обеспечивают высокую коррозионную агрессивность штаммов. Высокопродуктивные штаммы могут быть использованы в биотехнологической промышленности для получения ряда важных метаболитов.
Многие виды пенициллов известны как продуценты ферментов, органических кислот, антибиотиков; реже - как биодеструкторы различных промышленных материалов.
Нами выделен с лакокрасочного покрытия и исследован штамм Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma ЛТТ 13, обладающий высокой коррозионной способностью по отношению к лакокрасочным материалам, полимерам. Данный штамм задепонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ РАН) под номером ВКМ F-4837D 20.03.2019 (свидетельство прилагается).
Известен штамм гриба Penicillium rubrum Stoll ВКМ Р-3409Д, используемый в качестве тест-культуры для определения микологической стойкости консервационных смазочных материалов, применяемых в тропическом климате (RU 2045139, 27.09.1995). Однако данный штамм определяет только микологическую стойкость консервационных смазочных материалов и не используется для других целей.
Известен способ качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов при эксплуатации космических аппаратов посредством суспензии споровых материалов, включающей смесь споровых материалов отдельных культур грибов в равных соотношениях Paecilomyces variotii Bainier ВКМ F-4039D, Ulocladium botrytis Preuss ВКМ F-4032D, Aspergillus sydowii (Bainier et Sartory) Thom et Church BKM F-4037D, Cladosporium sphaerospermum Penz. BKM F-4041D, в том числе и Penicillium chrysogenum Thom BKM F-4034D (RU 2486250, 27.06.2013). Данный штамм используется в смеси споровых материалов только для качественной оценки биокоррозионных поражений тонкостенных герметичных оболочек из алюминиево-магниевых сплавов.
Наиболее близким техническим решением к заявленному штамму является штамм гриба Penicillium ochro-chloron №ВКМ F 2032, используемый для определения стойкости полимерных материалов и покрытий. Данный штамм обладает высокой способностью роста на полимерных и защитных покрытиях в условиях с повышенной агрессивностью, в частности, при низких температурах, при содержании в средах с органическими кислотами (SU 910761, 07.03.1982). Недостатками этого штамма является ограниченное его использование при низких и умеренных температурах. Оптимальная температура роста 18-20°С, при 37°С штамм прекращает рост; что не подходит для тестирования грибостойкости материалов и изделий, экспортируемых в страны с тропическим климатом. Кроме того, штамм Penicillium ochro-chloron NBKM F 2032 зарегистрирован в 1982 году не «знаком» со многими современными синтетическими материалами и при использовании его в качестве тест-культуры результаты грибостойкости материалов могут быть завышены, тогда как в естественных условиях штаммы грибов постоянно приспосабливались к появляющимся новым материалам, вырабатывая соответствующие кислоты и ферменты.
Таким образом, известные коллекционные штаммы микроорганизмов не могут быть использованы для достоверной качественной оценки грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, в том числе в тропических регионах.
Техническим результатом заявленного изобретения является высокая коррозионная способность микроскопического гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D по отношению к лакокрасочным материалам, полимерным материалам.
Технический результат достигается тем, что создан штамм микроскопического гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D, используемый как тест-культура для определения грибостойкости промышленных и строительных материалов и изделий в различных климатических условиях, в том числе в тропических регионах, где повышенные температура и влажность создают оптимальные условия для развития плесневых грибов, вызьшающих биоповреждения различных материалов.
Штамм Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D выделен из биоповреждения лакокрасочного покрытия прибора (Хоа Лак, Ханой, Вьетнам). Получение данного штамма осуществляли путем соскоба с биоповрежденного участка и высева соскоба на агаризованную среду Чапека с добавлением антибиотика стрептомицина 100 мг/л среды для подавления роста бактерий. Затем пересевали отдельные колонии на агаризованную среду Чапека для выделения чистой культуры штамма.
Морфо-физиологические и биохимические свойства штамма изучали на жидкой и агаризованной среде Чапека при 25°С, способность к росту при высоких температурах проверяли до +45°С.
Видовая идентификация штамма проводилась по культурально-морфологическим признакам посредством определителя: Pitt J.I. A laboratory guide to common Penicillium species. 1991. 187 p. Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D. Проведено молекулярное определение путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Полученные нуклеотидные последовательности редактировали с помощью программы Chromas Lite 2.01 (http://www.technelysium.com.au).
Макроскопические признаки (см. фиг. 1а, б): Колонии диаметром 3-3.5 см, войлочно-плотно-пушистые с фасцикулами и коремиями; поверхность неровная, выпуклая, край неровный, по текстуре от пушистого до истонченного; мицелий белый, персиково-желтый до землисто-ярко-оранжевого; спороношение концентрическими зонами, по краю серо-пастельно-зеленое, в центре плотнее и темнее; оборот ярко-оранжевый, наличие желтого пигмента, запах слабый. Особенность штамма: очень пушистый изолят, нет склероций.
Микроскопические признаки (см. фиг. 2 а, б): секц. Aspergilloides (Pitt, 1988);
Конидиеносцы от субстратного и воздушного мицелия, длиной (150)200-400(600) мкм, слабошероховатые. Конидии в плотных колонках средней длины (около 200 мкм), верхушка конидиеносцев вздута до 5 мкм, кисточка одноярусная; фиалиды (по 8-12) кеглевидные с выраженным, но с коротким носиком, плотно прижатые, размерами (7,5)8-9 х 2-2.5 мкм; конидии гиалиновые, гладкие, мелкие, яйцевидные или неровной формы (слабогрушевидные), диаметром 2.5-2.8 х 2-2.5 мкм.
Физиологические свойства штамма:
Растет в аэробных и микроаэрофильных условиях, термотолерантен. Методы исследования. Определение биомассы грибов.
Культивирование Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D для биохимических исследований осуществлялось на жидкой питательной среде следующего состава (г/л): NaNO3 - 2,0; КН2РО4; K2НРO4 - 3; KCL - 0,5; MgSO4⋅7P2O; FeSO4 - 0,01, сахароза - 30,0 при температуре (27±2)°С на перемешивающих устройствах марки ПЭ - 0034 «Электроприбор Россия», которые обеспечивали встряхивание колб со скоростью 180 об/мин.
Накопление биомассы определялось следующим образом:
Споры тест-культуры Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D со скошенной агаризованной питательной среды, путем смыва стерильной дистиллированной водой, переносились в стерильные колбы с жидкой питательной средой. После культивирования в течение 7 суток, мицелий Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D отфильтровывался, и равные по массе образцы мицелия вносились в колбы со свежей питательной средой, содержащей исследуемые соединения в различных концентрациях. Культивирование проводилось аналогичным, описанному выше, способом, в течение 7 суток. По истечении срока культивирования, мицелий Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D был отфильтрован и высушен до постоянной массы.
Определение органических кислот.
Были проведены эксперименты по определению содержания органических кислот в культуральной жидкости (к.ж.) штамма гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D. Пробу подготавливали предварительным разбавлением культуры штамма бидистиллированной водой в 50 раз и центрифугированием в течение 3 мин при скорости 5000 об/мин. Анализ проводили в соответствии с методикой анализа М 04-47-2012. Ввод пробы осуществлялся автоматически при 30 мбар, длина волны детектора 254 нм, напряжение - 20 кВ, температура 20°С.
Определение органических кислот осуществлялось методом капиллярного электрофореза (КЭ), который основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под воздействием электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 3-кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее - от величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной - высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества. Были получены следующие органические кислоты (см. таблица 1). Как видно из таблицы 1, данный штамм продуцирует в больших количествах глюконовую и молочную кислоты.
Определение активности каталазы.
Известно, что основным механизмом действия каталазы является разрушение пероксида водорода до воды и атомарного кислорода. Пероксид водорода является одним из вторичных метаболитов грибов, который выделяется ими во внешнюю среду. Образующийся в результате действия каталазы атомарный кислород чрезвычайно реакционноспособен и способен окислять как синтетические полимеры, так и металлы. Все это приводит к существенным изменениям структуры и состава материалов, т.е. к процессу их биодеградации. Определение активности каталазы проводилось спектрофотометрически (Shimadzu UVmini-1240). В качестве субстрата использовался 30 мМ пероксид водорода (Li, Shellhorn, 2007). Измерения проводились при Х=240 нм. В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из 1 мл буферного раствора рН=7,8; 1 мл культуральной жидкости гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D; 1 мл 30 мМ H2O2. Измерения проводили в течение одной минуты. В контрольной кювете Н2О2 заменяли водой. Активность каталазы рассчитывалась по формуле:
где А - активность фермента каталазы,
D - убыль оптической плотности реакционной смеси гриба,
d - толщина слоя жидкости в кювете, см,
t - время, мин,
С - концентрация белка в к.ж., мг/мл,
α×β×γ - факторы разведения.
Результаты измерений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималась убыль оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг общего белка.
Определение активности полифенолоксидазы.
Полифенолоксидазы (ПФО) грибов играют важную роль в разрушении материалов на основе фенольных, фенолформальдегидных смол, таких как фенопласты, клей и герметики, антикоррозийные материалы, ионообменные смолы, лаковые покрытия и др. Определение активности полифенолоксидазы проводилось спектрофотометрически по модифицированному методу. В качестве субстрата использовали п-фенилендиамин (0,1 М). Измерения проводились при λmax = 535 нм.
В кювету спектрофотометра толщиной 1 см помещалась реакционная смесь, состоящая из: 2 мл буферного раствора рН=7,2; 0,5 мл 0,1 М раствора п-фенилендиамина; 0,5 мл культуральной жидкости гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D. В контрольной кювете n-фенилендиамин заменяли водой. Активность полифенолоксидазы рассчитывалась по формуле:
где А - активность фермента, D - приращение оптической плотности реакционной смеси гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D, С- концентрация белка в к.ж., мг/мл, d - толщина слоя жидкости в кювете, см; t - время, мин; 
- факторы разведения.
Результаты изменений выражались в условных единицах (у.е.). За единицу активности принималось приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D за 1 минуту, в пересчете на 1 мг белка.
В таблице 2 представлены данные по активности каталазы и полифенолоксидазы Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D.
Таким образом, штамм Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D обладает каталазной и полифенолоксидазной активностью, что делает этот вид потенциально опасным для таких полимерных материалов, как ПВХ, полиакрилаты, эпоксидные компаунды, ЛКП и т.п., в деструкции которых участвуют данные энзимы. Штамм представляет опасность как потенциальный деструктор полимерных материалов, содержащих амидную связь. Штамм Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D синтезирует и выделяет в окружающую среду многие органические кислоты: глюконовую, щавелевую, яблочную, янтарную, молочную, уксусную, что свидетельствует о его возможности участвовать в процессе биоповреждений изделий РЭО.
Описание условий, необходимых для культивирования штамма (состав среды, температура, срок выращивания).
Для таксономических и морфо-физиологических исследований, хранения культуру гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma ВКМ F-4837D выращивают на агаризованных средах в чашках Петри или пробирках.
Среда Чапека:
вода питьевая - 1,0 литр
сахароза - 30,0 г
нитрат натрия (NaNO3)- 2,0 г
хлорид калия (КО) - 0,5 г
сульфит магния (MgSO4) - 0,5 г
фосфат калия двузамещенный (К2НРО4) - 1,0 г
агар-агар - 20,0 г
рН 7,4-7,6
Стерилизация при 1 атм. (121°С) - 20 мин.
Мальт-экстракт-агар (солодовый агар):
вода питьевая - 1,0 литр солодовый экстракт 30,0 г пептон из соевой муки 3,0 г агар-агар 15,0 г рН 5,6±0,2 при 25°С.
Стерилизация при 1 атм. (121°С) - 10 мин. Культивирование в термостате 7-10 суток при +25°С.
Для наращивания биомассы и биохимических исследований экзометаболитов Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D культивируют на жидкой среде Чапека (без добавления агар-агара) в колбах на качалке (120-180 оборотов/мин.) при температуре+25-+27°С.
Описание режима хранения штамма (среды, условия, предельный срок).
В пробирке на закошенной питательной среде Чапека под минеральным маслом; в холодильнике при температуре 0-+4°С. Срок хранения без пересева - 2 года.
Лиофилизированные споры гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D в запаянной ампуле для длительного хранения.
Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ФБГУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина (ВКМ ИБФМ РАН) под номером ВКМ F-4837D.
Результаты.
Реализацию использования штамма гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D в качестве тест-культуры для определения биокоррозионной способности (агрессивности) проверяли методом нанесения его споровой суспензии в концентрации 10*5 мл на поверхность лакокрасочных материалов, полимеров, резин и герметиков. Контролем служили образцы тех же материалов, обработанные споровой суспензией грибов Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D согласно ГОСТ 9.048-89. Обработанные суспензией образцы помещали в эксикаторы с 90% влажностью и устанавливали в термостаты с температурой +28°С на 28 суток (ГОСТ 9.048-89). Повторность всех образцов трехкратная.
В опытах использовали следующие материалы:
1. Краска ЭП-525;
2. Краска ЭП-140;
3. Краска акриловая бактерицидная с частицами наносеребра PREMIA (Ярославль);
4. Герметик 1 акриловый (Soudal, Бельгия);
5. Герметик 2 силиконовый бесцветный с кислотным отвердением с добавлением биоцида 2-octyl-2H-isothiazol-3-on (Soudal, Бельгия);
6. Герметик 3 силиконовый белый с кислотным отвердением с добавлением биоцида 4.5-dicmoro-2n-octyl-4-isothiazol-3-one (Soudal, Бельгия);
7. Герметик 4 однокомпонентный герметик ВГО-1 кремнийорганический белый (ТУ 38.303-04-04-90);
Результаты исследования отражены в таблице 3.
По результатам экспериментов, деструктивная активность штамма Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D превышает активность музейных культур, рекомендованных ГОСТ 9.048-89 и штамм может быть рекомендован для дополнительных испытаний на грибостойкость лакокрасочных и полимерных материалов.
Штамм микроскопического гриба Penicillium sclerotiorum J.F.H. Beyma BKM F-4837D как тест-культура для определения грибостойкости промьшленных и строительных материалов и изделий.
