Способ количественного определения 2-феноксиэтанола в биологических средах
Владельцы патента RU 2776730:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук (НИОХ СО РАН) (RU)
федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России) (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, фармакологии, и может быть использовано для количественного определения 2-феноксиэтанола в биологических средах. Используют метод газовой хромато-масс-спектрометрии, предусматривающий экстрагирование определяемого вещества ацетонитрилом. Осуществляют хроматографирование при температурном градиенте колонки и регистрацию масс-спектра с последующим обнаружением целевого соединения. Для качественного анализа на присутствие 2-феноксиэтанола выбирают ионы с m/z = 138, 107, 95, 94, 79, 77. Для количественного анализа содержания 2-феноксиэтанола выбирают ион с m/z = 94. Расчет концентрации 2–феноксиэтанола в исследуемых образцах проводят по формуле:
, где Sобразца – площадь хроматографического пика 2-феноксиэтанола в исследуемом образце по выбранному иону с m/z = 94, ед.; mнавески_образца – масса навески образца, из которой производилась экстракция 2-феноксиэтанола, г; Собразца – концентрация 2-феноксиэтанола в исследуемом образце, мкг/г. Способ обеспечивает возможность высокоэффективного количественного определения 2-феноксиэтанола в различных биологических средах, включая кровь и биологические ткани млекопитающих, с высокой чувствительностью, точностью и специфичностью определения, и который мог быть использован при выполнении рутинных анализов за счет предложенного качественного и количественного анализа на наличие 2-феноксиэтанола в исследуемых образцах. 9 ил., 5 табл., 5 пр.
Изобретение относится к области исследования биологических материалов, а именно для определения 2-феноксиэтанола в биологических средах, в том числе в тканях и крови млекопитающих.
Химические композиции, содержащие 2-феноксиэтанол в качестве консерванта и стабилизатора, используются для приготовления готовых лекарственных форм (ГЛФ) для перорального, ингаляционного, парентерального способов введения лекарственных средств, для жидкостной консервации и бактерицидной обработки биологических тканей (применяемых на этапах изготовления имплантатов для человека), а также в современных косметических средствах (для замены парабенов).
Одной из актуальных задач фармакологии при разработке ГЛФ, несущих новые консервирующие композиции, является изучение распределения действующих веществ в составе композиций с целью оценки всасывания, распределения, метаболизма и экскреции у животных и человека.
Для проведения исследований распределения новых консервирующих агентов, требуется разработать биоаналитические методики количественного определения компонентов консервантов в биологических средах. В частности, для компонентов консервирующих средств, вводимых парентерально, или для протезов биологических тканей, обработанных консервирующими композициями, необходимо разработать методику количественного определения в таких биологических средах, как кровь и биологические ткани.
Для количественного определения компонентов консервирующих средств в биологических средах, как правило, используются хроматографические методы, обладающие специфичностью, высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью. Одним из самых распространенных является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС/МС), который обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами, а именно: высокой чувствительностью, которая позволяет определять микроколичества вещества, и высокой скоростью анализа.
В настоящее время известны некоторые способы количественного определения 2-феноксиэтанола. Например, известная общая фармакопейная статья ОФС.1.7.2.0029.15 «Количественное определение 2-феноксиэтанола спектрофотометрическим методом в иммунобиологических лекарственных препаратах» отличается тем, что определение проводится спектрофотометрическим методом. Метод основан на способности 2-феноксиэтанола поглощать свет в ультрафиолетовой области. По результатам измерения оптической плотности растворов при 269 нм (максимум поглощения 2-феноксиэтанола) и 290 нм (максимум поглощения окрашенных примесей) определяется содержание 2-феноксиэтанола по калибровочному графику. Недостатком метода является невозможность определения 2-феноксиэтанола в сложных растворах биологического происхождения, какими являются кровь, сыворотка, плазма, гомогенаты тканей и другие биологические жидкости, а также низкая чувствительность метода (20 мкг/см3 и более).
Известен способ определения 2-феноксиэтанола методом ВЭЖХ с УФ-детекцией (Sharma B., Joseph A., Sood A. A simple and rapid method for quantifying 2-phenoxyethanol (2-PE) in Diphtheria, Tetanus and w-Pertussis (DTwP) vaccine. Biologicals : Journal of the International Association of Biological Standardization, 2007, 36(1):61-63.https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2007.05.005). Метод отличается высокой специфичностью, но низкой чувствительностью (1 мг/см3) и пригоден только для исследования простых по составу биологических объектов, типа вакцин.
Известен способ определения 2-феноксиэтанола методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детекцией (L. Hua, K. Huaxin, Y. Lingmei, Z. Wenjing, X. Zhongping. Determination of Content of 2-phenoxyethanol in Inactivated Hepatitis A Vaccine by RP-HPLC. China Pharmaceuticals, 2006,08, p. 12-13). В этом методе используется колонка C18 с 50% ацетонитрилом в качестве подвижной фазы и скорость потока 1,0 см3/мин. Длина волны обнаружения составляет 270 нм, температура колонки соответствует комнатной температуре. Содержание определяется методом внешнего стандарта. Метод отличается высокой специфичностью, но низкой чувствительностью (0,55 мг/см3 и более) и пригоден только для исследования простых по составу биологических объектов, типа вакцин.
Описан способ определения фармакокинетики 2-феноксиэтанола в крови крыс радионуклидным методом путем оценки распределения 14С-меченого 2-феноксиэтанола (Kwon M, Park JB, Kwon M, Song J, Yeo CS, Bae SH. Pharmacokinetics of 2-phenoxyethanol and its major metabolite, phenoxyacetic acid, after dermal and inhaled routes of exposure: application to development PBPK model in rats. Arch Toxicol. 2021 Jun;95(6):2019-2036. doi: 10.1007/s00204-021-03041-z. Epub 2021 Apr 12.PMID: 33844041). Способ характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако не может быть использован для рутинного определения 2-феноксиэтанола в биологических средах организма человека и животных.
Описан способ определения фармакокинетики 2-феноксиэтанола в крови крыс методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (Kim TH, Kim MG, Kim MG, Shin BS, Kim KB, Lee JB, Paik SH, Yoo SD. Simultaneous determination of phenoxyethanol and its major metabolite, phenoxyacetic acid, in rat biological matrices by LC-MS/MS with polarity switching: Application to ADME studies.Talanta. 2015 Nov 1;144:29-38. doi: 10.1016/j.talanta.2015.05.075). Способ характеризуется высокой чувствительностью (более 10 нг/мл) и специфичностью (не менее 97%). Может быть использован для определения 2-феноксиэтанола и метаболита 2-феноксиэтанол - феноксиуксусной кислоты в плазме крови, моче и гомогенатах тканей головного мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почки, яичек крыс. Следует заметить, что данный способ требует дорогостоящего оборудования и на сегодняшний день слишком затратен для рутинных анализов. Помимо этого, для проведения измерений по данному способу требуется использовать внутренний стандарт, что требует дополнительных действий при пробоподготовке.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового высокоэффективного способа количественного определения 2-феноксиэтанола в различных биологических средах, включая кровь и биологические ткани млекопитающих, который обеспечивал бы высокую чувствительность, точность и специфичность определения и мог быть использован при выполнении рутинных анализов.
Поставленная задача решается предложенным способом количественного определения 2-феноксиэтанола в биологических средах, в том числе в крови и тканях млекопитающих. Определение проводят методом газовой хромато-масс-спектрометрии с регистрацией масс-спектра по выделенным ионам (SIM, Selected Ion Monitoring). Наличие в пробах и количество 2-феноксиэтанола вычисляют из данных хроматограммы, полученной регистрацией интенсивности сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при взаимодействии молекул веществ, вышедших из хроматографической колонки, с потоком ионизирующих электронов в ионном источнике масс-детектора.
Анализ известного уровня техники показал отсутствие какой-либо информации о технических решениях, полностью совпадающих по совокупности существенных признаков с заявленным способом, что позволяет сделать вывод о соответствии предложенного технического решения критерию изобретения «новизна».
Использование заявленного способа решает поставленную задачу и позволяет сделать вывод о соответствии заявленного способа критерию изобретения «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ определения 2-феноксиэтанола может использоваться фармакологии, медицине, токсикологии, т.е. предложение «промышленно применимо».
Перед проведением количественного анализа образца на содержание 2-феноксиэтанола целесообразно убедиться в его наличии в образце на уровне обнаружения. Для этого проводится качественный анализ на наличие этого соединения в исследуемых образцах.
При анализе биологических материалов обнаружено, что область выхода целевого соединения, 2-феноксиэтанола, совпадает с областью выхода широкого пика 1,2,3-пропантриола (глицерина), «закрывая» хроматографический пик определяемого соединения. Чтобы избежать влияния этого фактора, используют хромато-масс-спектрометрический метод анализа, особенность которого заключается в том, что для обнаружения целевых соединений используется режим регистрации выбранных ионов (SelectedIonsMonitoring, SIM), но при этом выбирается не один-три, как обычно, иона для обнаружения соединения, а несколько наиболее интенсивных ионов из масс-спектра соединения. Количество ионов позволяет провести обнаружение целевого соединения с использованием базы данных масс-спектров при помощи программ обработки хромато-масс-спектрограмм, в частности, AMDIS или Agilent ChemStation. При этом выбранные ионы для целевого соединения не совпадают с интенсивными ионами мешающих определению примесей, в случае биологических образцов – примеси глицерина.
Для 2-феноксиэтанола такими ионами являются ионы с m/z=138 (молекулярный), 107, 95, 94 (интенсивность в масс-спектре 100%), 79, 77, 66, 65, 50, 51 (см. фиг. 1). Выбор таких ионов и в таких количествах позволяет проводить качественное определение 2-феноксиэтанола по совпадению масс-спектра с масс-спектром из базы масс-спектральных данных (NIST, WILEY, других), и при этом выбранные ионы не совпадают с ионами в масс-спектре 1,2,3-пропантриола (глицерина) (фиг. 2).
При выборе таких ионов вместо хроматограммы, показанной на фиг. 3 (режим SCAN) одного и того же раствора, полученного при экспериментальной экстракции биологического материала, получается хроматограмма, имеющая выраженный пик определяемого вещества (рис. 4, 5).
Фиг. 1 - Масс-спектр 2-феноксиэтанола из базы данных NIST11.
Фиг. 2- Масс-спектр 1,2,3-пропантриола (глицерина) из баз данных NIST11.
Фиг. 3 - Хроматограмма экстракта биологического образца (200 мг/1 см3 ацетонитрила), полученная в режиме измерения полного ионного тока (SCAN). Прямоугольником выделена область, где должно выходить целевое вещество – 2-феноксиэтанол – его пик полностью закрыт широким пиком 1,2,3-пропантриола (глицерина).
Фиг. 4 - Хроматограмма того же экстракта биологического образца, что и на рис. 3, полученная в режиме регистрации выделенных ионов (SIM). Прямоугольником выделена область, где должно выходить целевое вещество –2-феноксиэтанол.
Фиг. 5- Укрупненный участок хроматограммы с выделенным пиком целевого соединения, с временем выхода 8,68 мин. – 2-феноксиэтанол.
Фиг. 6 - Сравнение пика определяемого вещества с базой данных масс-спектров NIST11. Сравнение масс-спектра пика с временем удержания 8.68 мин, полученного в режиме регистрации выделенных ионов (фиг.6 верху), с масс-спектром 2-феноксиэтанола из базы данных масс-спектров NIST11 (фиг.6 внизу).
Фиг. 7 - Калибровочная зависимость площади хроматографического пика, ед., от концентрации 2-феноксиэтанола, м.д.
Фиг. 8 - Хроматограмма образца, не содержавшего 2-феноксиэтанол в качестве консерванта.
Фиг. 9 - Укрупненный участок хроматограммы в районе выхода целевого соединения, феноксиэтанола.
Таким образом, можно качественно подтвердить присутствие целевого соединения, 2-феноксиэтанола, в образце. Предел качественного обнаружения 2-феноксиэтанола по данной методике составляет 0,00025 мг/г (0,25 м.д.).
Количественный анализ содержания 2-феноксиэтанола выполняется методом абсолютной калибровки при помощи калибровочной зависимости, построенной по результатам измерений градуировочных растворов методом газовой хромато-масс-спектрометрии в режиме регистрации выбранных ионов (SIM) 2-феноксиэтанола по площади хроматографического пика иона с m/z=94.
Способ анализа осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 2-феноксэтанол, в количестве около 200 мг, измельчают, дважды экстрагируют ацетонитрилом (квалификации «сорт 0 О.С.Ч. для хроматографии») порциями по 1 см3, порции объединяют, фильтруют, фильтрат собирают и упаривают до 1 см3 и переносят в хроматографическую виалу на 2 см3 с герметичной навинчивающейся крышкой с септой, позволяющей забор пробы из виалы автосамплером хроматографической системы. В таком виде образцы попадают на газовый хроматографический анализ.
Наиболее оптимальными, но не необходимыми режимами работы газового хромато-масс-спектрометра, являются:
1) объем жидкой пробы – 1,0 мм3, ввод – автоматический, при помощи автосамплера;
2) метод записи – без деления потока при повышенном давлении (Pulsed Splitless), избыточное давление при инжектировании 68 кПа (10 psi) в течение 0,75 мин;
3) хроматографическая колонка – HP-5MS (30м х 0.25 мм х 0.25 мкм, неподвижная фаза: фенилметилполисилоксан, AgilentJ&W);
4) температура инжектора 280 °С, начальная температура колонки – 70 °С, время выдержки при начальной температуре 2 мин., температурный градиент колонки – нагрев со скоростью 10 °С/мин. до 170 °С, далее со скоростью нагрева 30 °С/мин. до 280 °С, конечная температура колонки – 280 °С, время выдержки при конечной температуре 5 мин., общее время анализа 20,66 мин. Рекомендуется после метода выставление температуры колонки 290 °С и ее продув при этой температуре в течение 10 мин. (режим Post Run) для надежного удаления остатков предыдущей пробы. В таких условиях целевое соединение, 2-феноксиэтанол, имеет время выхода 8,7 мин;
5) расход газа-носителя, гелия – 1,0 см3/мин., режим постоянного потока (Constant Flow);
6) температура источника ионов – 230 °С;
7) режим работы масс-детектора – регистрация выбранных ионов (SIM): для качественного анализа на присутствие 2-феноксиэтанола выбраны ионы с m/z=138, 107, 95, 94, 79, 77; для количественного анализа содержания 2-феноксиэтанола выбирается ион с m/z=94;
8) Обработка результатов проводилась по пакету программ Agilent MassHunter или Agilent Chemstation, а также AMDIS32, с использованием базы данных масс-спектров NIST 11 (наличие последней не обязательно, но существенно помогает в быстром обнаружении пиков определяемых соединений в случае, если хроматографические условия необходимо изменить).
Осуществление предлагаемого метода представлено в примерах.
Пример 1.
Построение градуировочного графика.
Для построения градуировочной зависимости приготавливают следующие растворы:
Приготовление опорного раствора
Берут точную навеску 1,000 г 2-феноксиэтанола (чистота 99,5%), переносят в мерную колбу на 100 см3, растворяют в 10 см3 ацетонитрила CH3CN (ацетонитрил квалификации «о.с.ч.» для хроматографии) и затем раствор доведят до метки ацетонитрилом. Получившийся опорный раствор с концентрацией 10 мг/см3 (10 000 миллионных долей, м.д.) 2-феноксиэтанола может храниться в холодильнике при температуре 2…10 °С до 6 месяцев без изменений. Из данного раствора разбавлениями готовят растворы для проведения калибровок и измерений.
Приготовление рабочего раствора с концентрацией 0,10 мг/см3
От опорного раствора отбирают мерной пипеткой 1,0 см3 раствора, переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки ацетонитрилом. Получившийся раствор концентрацией 2-феноксиэтанола 0,10 мг/см3 (100 м.д.) используют для получения градуировочных растворов. Сам раствор может храниться в холодильнике при температуре 2…10 °С в течение трех месяцев без изменений.
Приготовление градуировочных растворов
Предварительные анализы показали, что остаточное содержание 2-феноксиэтанола в смывах с образцов тканей находится на уровне 0,001 мг/см3 (1,0 м.д). Поэтому для количественных измерений с построением калибровочной зависимости готовят растворы с концентрациями 2-феноксиэтанола 0,0005 мг/см3 (0,5 м.д.), 0,00075 мг/см3 (0,75 м.д.), 0,001 мг/см3 (1,0 м.д.), 0,00125 мг/см3 (1,25 м.д.), 0,0015 мг/см3 (1,5 м.д.), 0,0020 мг/см3 (2,0 м.д.), 0,005 мг/см3 (5,0 м.д.), 0,010 мг/см3 (10,0 м.д.).
С помощью мерных пипеток и микрошприцев объемом 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 см3 (например, фирмы «Hamilton», Австралия, возможно применение аналогичных с погрешностью отбора объема не более 5%) отбирают необходимые аликвоты рабочего раствора с концентрацией 0,10 мг/см3 (100 м.д.), переносят в мерные колбы на 10 см3 и доведят до метки ацетонитрилом. Необходимые аликвоты для приготовления каждого раствора приведены в табл. 1.
Таблица 1. Необходимые аликвоты рабочего раствора 2-феноксиэтанола с концентрацией 0,1 мг/см3 (100 м.д.) для приготовления калибровочных растворов 2-феноксиэтанола.
| № п/п | Необходимая концентрация калибровочного раствора, мг/см3 (м.д.) | Объем аликвоты раствора с концентрацией 0,1 мг/см3 (100 м.д.), мм3 |
| 1 | 0,00025 (0,25) | 25 |
| 2 | 0,0005 (0,5) | 50 |
| 3 | 0,00075 (0,75) | 75 |
| 4 | 0,001 (1,0) | 100 |
| 5 | 0,00125 (1,25) | 125 |
| 6 | 0,0015 (1,5) | 150 |
| 7 | 0,002 (2,0) | 200 |
| 8 | 0,005 (5,0) | 500 |
| 9 | 0,010 (10) | 1000 |
Полученные калибровочные растворы могут храниться в холодильнике при температуре 2…10 °С в течение недели. Перед их использованием выдерживают не менее 20 минут при комнатной температуре.
Калибровочные растворы переливают по 1 см3 в виалы для хроматографического анализа, оснащенные навинчивающейся крышкой с прокладкой, позволяющие забор раствора иглой, и анализируют.
Измерения проводят, используя газовый хроматограф, например Agilent 7890B (фирма AgilentTech., США) с масс-селективным одноквадрупольным детектором, например Agilent 5977B (фирма AgilentTech., США).
Хроматографирование проводят на капиллярной хроматографической колонке HP-5MS (30м х 0.25 мм х 0.25 мкм, неподвижная фаза: фенилметилполисилоксан, AgilentJ&W), температура инжектора 280 °С, начальная температура колонки – 70 °С, время выдержки при начальной температуре 2 мин., температурный градиент колонки – нагрев со скоростью 10 °С/мин. до 170 °С, далее со скоростью нагрева 30 °С/мин. до 280 °С, конечная температура колонки – 280 °С, время выдержки при конечной температуре 5 мин. Температура интерфейса между хроматографом и масс-детектором – 280 °С. В качестве газа носителя применяется гелий, расход гелия через колонку – 1 см3/мин (режим постоянного потока, Constant Flow), ввод пробы – без деления потока при повышенном давлении (Pulsed Splitless) 68 кПа (10 psi) в течение 0,75 мин., с задержкой включения масс-детектора 6 минут на пропуск растворителя. Масс-селективный детектор работает в режиме электронной ионизации с энергией ионизирующих электронов 70 эВ. Данное значение энергии ионизирующих электронов является стандартным для большинства приборов и для записей масс-спектров, пригодных для сравнения с общедоступными базами данных масс-спектров. Запись масс-спектров проводится в режиме регистрации выбранных ионов (SIM): m/z=138, 107, 95, 94, 79, 77. Напряжение на электронном умножителе детектора 1064 В. Время выхода целевого соединения, 2-феноксиэтанола, при таком режиме работы, 8,7 мин.
Каждую концентрацию градуировочных растворов, начиная с наименьшей, записывают по три раза для измерения зависимости площади хроматографического пика по иону с m/z=94, результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты измерения площадей хроматографических пиков градуировочных растворов 2-феноксиэтанола, использованных для построения калибровочной зависимости.
| № п/п | Концентрация, мг/см3 (м.д./см3) | Площади хроматографических пиков, измеренных для концентрации, ед. | Средняя площадь по результатам трех измерений, ед. |
| 1 | 0,00025 (0,25) | 14169, 13686, 14791 | 14215 |
| 2 | 0,0005 (0,5) | 29655, 29134, 29578 | 29456 |
| 3 | 0,00075 (0,75) | 49425, 48698, 48885 | 49003 |
| 4 | 0,001 (1,0) | 70156, 69889, 69514 | 69853 |
| 5 | 0,00125 (1,25) | 92445, 94781, 95201 | 94142 |
| 6 | 0,0015 (1,5) | 114510, 113221, 113587 | 113773 |
| 7 | 0,002 (2,0) | 160288, 158133, 159436 | 159286 |
| 8 | 0,005 (5,0) | 411243, 406987, 418589 | 412273 |
| 9 | 0,010 (10) | 864154, 857814, 851692 | 857887 |
Для раствора с минимальной концентрацией, 0,00025 мг/см3, соотношения «сигнал-шум» в имеющейся хроматографической системе по результатам трех измерений составили 18,4:1, 15,5:1; 16,1:1, что находится вблизи нижнего предела количественного обнаружения (НПКО), который характеризуется отношением «сигнал-шум» не менее, чем 10:1.
По результатам измерений зависимости площадей пиков определяемого соединения от их концентрации на хромато-масс-спектрометре строят градуировочный график. График линеен в диапазоне концентраций определяемых веществ 2,5⋅10-7-1⋅10-5 г/см3 (фиг. 7. - Калибровочная зависимость площади хроматографического пика, ед., от концентрации 2-феноксиэтанола, м.д.)
Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение линейной зависимости, которое в данном случае имеет вид:
S = 86882C - 14839
где:
S – площадь хроматографического пика по выбранному иону с m/z=94 для 2-феноксиэтанола, ед.;
С – концентрация 2-феноксиэтанола, мкг/см3 .
Расчет концентрации 2-феноксиэтанола в исследуемых образцах проводят по формуле:
Sобразца – площадь хроматографического пика 2-феноксиэтанола в исследуемом образце по выбранному иону с m/z=94, ед.;
mнавески_образца – масса навески образца, из которой производилась экстракция 2-феноксиэтанола, г;
Собразца – концентрация 2-феноксиэтанола в исследуемом образце, мкг/г.
Значение концентрации в мкг/г численно равно содержанию 2-феноксиэтанола в миллионных долях (м.д.).
Пример 2.
Для определения использовался образец биологического материала, который ранее хранился в растворе, содержащем 2-феноксиэтанол в качестве консерванта, был отмыт от него и предоставлен на анализ.
Навеску биологического материала массой 0,10-0,50 г измельчают, помещают в пробирку Эппендорф объемом 1,5 см3, добавляют 1 см3 ацетонитрила квалификации «сорт 0 о.с.ч. для хроматографии», и перемешивают на специальном устройстве «Vortex». Затем жидкость сливают в другую емкость, а в в пробирку Эппендорф добавляют еще 1 см3 ацетонитрила той же квалификации. Вновь перемешивают на устройстве «Vortex», и центрифугируют на 10000 оборотов в течение 5 минут. Супернатант переливают в емкость с предыдущей партией экстракта. Экстракт упаривают в токе воздуха от растворителя, добавляют 1,0 см3 ацетонитрила квалификации «сорт 0 о.с.ч. для хроматографии», переливают в виалу для хроматографического анализа, затем полученный таким образом раствор поступает на газовый хромато-масс-спектрометрический анализ для определения количественного содержания 2-феноксиэтанола.
Анализ проводят при помощи метода внешнего стандарта, то есть, путем сопоставления площади хроматографического пика целевого вещества, 2-феноксиэтанола, с заранее построенной градуировочной зависимостью (см. Пример 1), полученной путем измерения площадей хроматографических пиков 2-феноксиэтанола в калибровочных растворах заранее известной концентрации, в результате чего имеется уравнение градуировочного графика, связывающее концентрацию исследуемого раствора и площадь хроматографического пика.
Результаты трех последовательных измерений площадей пиков целевого соединения, 2-феноксиэтанола, и расчет его концентрации по уравнению градуировочного графика приведены в табл. 3, статистическую обработку проведят по пакету программ Microsoft Excel. Существенно, что в отличие от градуировочных растворов, состоящих только из растворенного 2-феноксиэтанола в ацетонитриле, измерение концентрации 2-феноксиэтанола в реальном биологическом образце происходит на фоне других соединений, проэкстрагированных из него ацетонирилом, например, на фоне 1,2,3-пропантриола (глицерина).
Таблица 3. Результаты измерений площадей пиков 2-феноксиэтанола на хроматограмме по выделенному иону с m/z=94.
| № п/п | Площадь хроматографического пика в образце, ед. | Среднее значение площади хроматографических пиков, ед., стандартное отклонение, ед. (%) | Концентрация, мг/см3 (м.д./см3) |
| 1 | 59124 | 0,0044±0,0002 (4,4±0,2) | |
| 2 | 63147 | 61687±2227 (3,6%) | |
| 3 | 62789 |
Пример 3.
Берут точную навеску 0,17 г биологического материала, отличающегося от образца, использованного в Примере 2, тем что взята ткань другого органа, но которая также ранее хранилась в растворе, содержащем 2-феноксиэтанол в качестве консерванта, была отмыта от него и предоставлена на анализ.
Дальнейшую пробоподготовку, анализ биологического образца, обработку результатов анализа проводят так же, как приведено в Примере 2.
Результаты трех последовательных измерений площадей хроматографических пиков целевого соединения, 2-феноксиэтанола, и расчет его концентрации по уравнению градуировочного графика приведены в табл. 4, статистическая обработка проведена по пакету программ Microsoft Excel.
Таблица 4. Результаты измерений площадей пиков 2-феноксиэтанола на хроматограмме по выделенному иону с m/z=94.
| № п/п | Площадь хроматографического пика в образце, ед. | Среднее значение площади хроматографических пиков, ед., стандартное отклонение, ед. (%) | Концентрация, мг/см3 (м.д./см3) |
| 1 | 33658 | 0,0032±0,0001 (3,2±0,1) | |
| 2 | 31332 | 32660±1197 (3,7%) | |
| 3 | 32989 |
Пример 4.
Определение остаточного количества 2-феноксиэтанола в биологическом образце, хранившемся в консервирующем растворе, не содержащем 2-феноксиэтанол.
Берут точную навеску 0,21 г биологического образца ткани, аналогичной использованной в Примере 2. Образец, как и образцы в Примерах 2 и 3, подвергают той же процедуре отмывки, что в Примерах 2 и 3, и затем анализируют.
Дальнейшую пробоподготовку, анализ биологического образца, обработку результатов анализа проводят так же, как приведено в Примере 2.
Результаты записи хроматограммы не дают возможности выделить пик целевого соединиения, 2-феноксиэтанола, из фоновой (базовой) линии (фиг. 8. Хроматограмма образца, не содержавшего 2-феноксиэтанол в качестве консерванта; фиг. 9. Укрупненный участок хроматограммы в районе выхода целевого соединения, феноксиэтанола). Соответственно, произвести измерение площади хроматографического пика не представляется возможным.
Таким образом, если образец изначально не содержит 2-феноксиэтанол, то при записи хроматограммы он также не обнаруживается.
Пример 5.
Определение остаточного количества 2-феноксиэтанола в биологическом образце, хранившемся в консервирующем растворе, не содержащем 2-феноксиэтанол. К образцу в процессе пробоподготовки было добавлено определенное (0,001 мг) количество 2-феноксиэтанола.
Берут точную навеску 0,21 г биологического образца ткани, аналогичной использованной в Примере 2. Навеску измельчают, переносят в пробирку Эппендорф объемом 1,5 см3, вносят 10 мкл раствора 2-феноксиэтанола с концентрацией 0,10 мг/см3 (100 м.д./см3). Таким образом, к образцу добавляется 0,001 мг 2-феноксиэтанола. К образцу добавляют ацетонитрил таким образом, чтобы весь образец находился в жидкости. Образец оставляют на несколько часов при комнатной температуре и затем переносят на хранение в холодильник при температуре 4-6 °С на ночь.
Дальнейшую пробоподготовку, анализ биологического образца, обработку результатов анализа проводят так же, как приведено в Примере 2.
Результаты трех последовательных измерений площадей хроматографических пиков целевого соединения, 2-феноксиэтанола, и расчет его концентрации по уравнению градуировочного графика приведены в табл. 5, статистическая обработка проведена по пакету программ Microsoft Excel.
Таблица 5. Результаты измерений площадей пиков 2-феноксиэтанола на хроматограмме по выделенному иону с m/z=94.
| № п/п | Площадь хроматографического пика в образце, ед. | Среднее значение площади хроматографических пиков, ед., стандартное отклонение, ед. (%) | Концентрация, мг/см3 (м.д./см3) |
| 1 | 67134 | 0,0045±0,0001 (4,5±0,1) | |
| 2 | 68838 | 67244±1542 (2,3%) | |
| 3 | 65761 |
Таким образом, в образце биологического материала, с введенной добавкой 0,001 мг 2-феноксиэтанола, с расчетным содержанием 2-феноксиэтанола 0,0048 мг/г, было найдено по методу определения 0,0045 мг/г экспериментально, т.е. 94%.
Предлагаемый способ определения 2-феноксиэтанола в гомогенизатах биологических сред, в том числе в тканях и в крови, опирается на современный физико-химический метод – газовую хромато-масс-спектрометрию, обладает точностью, правильностью, повторяемостью и прецизионностью внутри цикла и обеспечивает высокую чувствительность (от 250 нг/г образца), точность (5%) и специфичность (способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов) в определении целевого вещества, 2-феноксиэтанола. Способ отличается сравнительно простой пробоподготовкой и измерением, не требует дорогостоящих оборудования и расходных материалов, и может использоваться при выполнении рутинных анализов.
Способ количественного определения 2-феноксиэтанола в биологических средах, отличающийся тем, что используют метод газовой хромато-масс-спектрометрии, предусматривающий экстрагирование определяемого вещества ацетонитрилом, включающий хроматографирование при температурном градиенте колонки и регистрацию масс-спектра с последующим обнаружением целевого соединения; где для качественного анализа на присутствие 2-феноксиэтанола выбирают ионы с m/z = 138, 107, 95, 94, 79, 77, для количественного анализа содержания 2-феноксиэтанола выбирают ион с m/z = 94; при этом расчет концентрации 2–феноксиэтанола в исследуемых образцах проводят по формуле:
Sобразца – площадь хроматографического пика 2-феноксиэтанола в исследуемом образце по выбранному иону с m/z = 94, ед.;
mнавески_образца – масса навески образца, из которой производилась экстракция 2-феноксиэтанола, г;
Собразца – концентрация 2-феноксиэтанола в исследуемом образце, мкг/г.
