Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления sars-cov-2 линии омикрон с определением субварианта ba.1


C12N15/00 - Получение мутаций или генная инженерия; ДНК или РНК, связанные с генной инженерией, векторы, например плазмиды или их выделение, получение или очистка; использование их хозяев (мутанты или микроорганизмы, полученные генной инженерией C12N 1/00,C12N 5/00,C12N 7/00; новые виды растений A01H; разведение растений из тканевых культур A01H 4/00; новые виды животных A01K 67/00; использование лекарственных препаратов, содержащих генетический материал, который включен в клетки живого организма, для лечения генетических заболеваний, для генной терапии A61K 48/00 пептиды вообще C07K)

Владельцы патента RU 2779025:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд. Изобретение обеспечивает эффективную детекцию РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон, с определением субварианта BA.1методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). На сегодняшний день выделяют несколько субвариантов SARS-CoV-2 линии Омикрон – BA.1,BA.2,BA.2.12, BA.3,BA.4, BA.5, обладающие различиями в скорости распространения, патогенности и нейтрализации сыворотками переболевших. На сегодняшний день актуальной задачей является разработка тест-систем, пригодных для диагностики SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субвариантов этой линии, что позволит повысить эффективность вирусологического мониторинга.

Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая -ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящей из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPS-CoV-2 считается отрицательным.

Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:

CoV2-f tcacaattc aga agtagg acc tg;

CoV2-r agcctccaaaggcaa tag tgc

CoV2-pr R6G - tcttgccgaataccataatgaatccaa – BHQ1

Также известен набор синтетических олигонуклеотидов (Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2: патент RU2765497, Российская Федерация, заявка RU2021102274, заявл. 02.02.2021, опубл. 31.01.2022), фланкирующих несколько выбранных участков на РНК коронавируса SARS-CoV2 (праймеры), а также синтетических олигонуклеотидов, несущих в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней. Изобретение позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени. 

Также известна тест-система для выявленияSARS-CoV-2, Influenzavirus A и Influenzavirus B (Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenzavirus A, Influenzavirus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU 2761481, Российская Федерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).

На сегодняшний день не известны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.

Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с возможностью дифференцировать субварианты.

Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективной детекции РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Технический результат достигается тем, что тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:

прямойпраймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC

(SEQ ID NO: 1)

обратный праймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA

(SEQ ID NO: 2)

флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –

FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1(SEQ ID NO: 3)

прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT(SEQ ID NO: 4)

обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC(SEQ ID NO: 5)

флоуресцентный зонд N31-33del

HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1(SEQ ID NO: 6)

прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT(SEQ ID NO: 7)

обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA(SEQ ID NO: 8)

флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2(SEQ ID NO: 9)

Предложенная диагностическая система впервые позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон:

Впервые диагностическая система позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон: BA.1, BA.2,BA.2.12,BA.3, BA.4 bBA.5.Мультиплексная тест-система в сочетании (мультиплекс ОТ-ПЦР) с ранее заявленными олигонуклеотидами для детекции SARS-CoV-2 (патент RU2761481) и BA.1 (заявка RU2021140147), позволяет детектировать все известные на данный момент линии и варианты SARS-CoV-2 и определить принадлежность вируса к субвариантам BA.1 и не-BA.1 субвариантам линии Омикрон.

Определение всех вариантов линии Омикрон основано на детекции мутации ERS31del. На основании аннотаций аминокислотных замен и инделов более 5,5 миллионов образцов по 1513 линиям Pango из базы данных GISAID, доступных на 2021-12-03, рассчитаны относительные частоты замен по каждой линии с использованием языка Python v3.9.2, библиотек Pandas v1.3.5 и Numpy v1.3.5. Делеция ERS31del, детектируемая в данном анализе встречается только в линии Омикрон SARS-CoV-2 и является специфичным маркером этой линии.

Таблица 1. Описание разработанных олигонуклеотидов.

Форвард-праймер ERS31delF GTTTGGTGGACCCTCAGATT
Реверс-праймер ERS31del R CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC
Зонд ERS31del P HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1

Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила: 100 nM праймеров, 50 nMзонда. Увеличение количества олигонуклеотидов может привести к снижению специфичности реакции. Программа термоциклирования: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов

Аналитическая чувствительность: предел детекции составляет 1000 генных копий в мл. Эффективность реакции: 105%.

Также заявляемое изобретение поясняется изображениями, где на фиг. 1 приведены результаты мультиплексного анализа, а на фиг. 2 приведен график, иллюстрирующий оптимальную эффективность ОТ-ПЦР для детекции РНК линии Омикрон– он основан на изменении Cqпри серийных десятикратных разведениях.

В случае использования тест-системы для детекции мутации ERS31del без добавления других олигонуклеотидов в реакцию, детекцию увеличения флюоресценции в ходе ПЦР по каналу HEX нужно расценивать как положительный результат – наличие SARS-CoV-2 линии омикрон в образце.

В случае мультиплексной ПЦР в сочетании с ранее разработанными олигонуклеотидами для выявления SARS-CoV-2 (патент №2761481), для выявления субварианта BA.1 линии Омикрон (заявка № 2021140147). Интерпретация результатов представлена в таблице 2.

Таблица 2. Интерпретация результатов мультиплексной ПЦР

ПЦР для детекции 2-SARS-CoV-2 ПЦР для детекции мутации ERS31del ПЦР для детекции мутации Ins214EPE
FAM HEX ROX
+ - - SARS-CoV-2,не принадлежащий к линии Омикрон
+ + - SARS-CoV-2 линии Омикрон, субварианты BA.2/BA.2.12/BA.3/BA.4/BA.5
+ + + SARS-CoV-2 линии Омикрон, субвариант BA.1
- - - В образце отсутствует РНК SARS-CoV-2

Результаты проверки аналитической специфичности теста с использованием заявляемой тест-системы представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты проверки аналитической специфичности теста:

  Наименование вируса в тестируемом образце по классификации PANGO Детекция гена человеческой RP(внутренний контроль),Cq Детекция SARS-CoV-2 по гену ORF Детекция ERS31del, определение линии омикрон SARS-CoV-2, Cq
1 P.1 35,35 15,45  
2 B.1.351 39,91    
3 B.1   15,69  
4 B.1 33,84 26,69  
5 B.1 24,26 26,98  
6 B.1.1.7 25,27 20,64  
7 B.1.1.7 30,54 28,05  
8 B.1.1.7 26,99 31,25  
9 AT.1 30,30 33,07  
10 AT.1 30,02 31,33  
11 AT.1 28,00 33,00  
12 B.1.1.523 29,12 27,09  
13 B.1.1.523 27,39 23,46  
14 B.1.1.523 30,02 27,09  
15 B.1.1.317 25,22 25,31  
16 B.1.1.317 27,58 22,71  
17 B.1.1.317 28,70 23,91  
18 B.1.617.2 26,66 34,03  
19 B.1.617.2 25,72 28,43  
20 B.1.617.2 26,78 25,42  
21 AY.122 23,96 28,95  
22 AY.122 31,16 35,05  
23 AY.122 24,19 34,93  
24 BA.1 27,98 22,20 23,57
25 BA.1 27,08 24,93 27,16
26 BA.1 25,19 27,48 29,83
27 BA.2 26,50 19,64 21,07
28 BA.2 24,70 20,81 22,70

Специфичность ОТ-ПЦР была оценена на образцах (мазки носоглотки от пациентов) SARS-CoV-2 других линий, а также на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева (грипп А и В, РСВ, сезонные коронавирусы, риновирусы) без ложно-положительных результатов.

1. Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:

прямой праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC

обратный праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA

флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –

FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1

прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT

обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC

флоуресцентный зонд N31-33del

HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1

прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT

обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA

флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная концентрация праймеров и зондов составляет 100 nM для праймеров, 50 nM для зондов.

3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная программа термоциклирования соответствует следующим параметрам: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакогенетике. Определяют полиморфизм rs3892097 гена CYP2D6.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации РНК коронавируса человека SARS-CoV-2 методом изотермической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и может быть использовано в биотехнологии и генетической инженерии.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ и композиция для получения характеристики клеток, а также набор для получения конъюгатов аффинная часть-олигонуклеотид.

Изобретение относится к области медицины и биологии. Осуществляют ПЦР-амплификацию QRDR-области гена parC и gyrA M.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, онкологии и терапии внутренних болезней, и может быть использовано для персонифицированного отбора больных с антрациклин-индуцированной кардиомиопатией после полихимиотерапии рака молочной железы для эффективного лечения карведилолом. До начала лечения кардиомиопатии определяют полиморфизм Arg389Gly, rs1801253 гена ADRB1.

Изобретение относится к области офтальмоонкологии и молекулярной биологии. Проводят определение экспрессии микроРНК-27b методом ПЦР в режиме реального времени и сравнивают полученный результат с контрольным значением, полученным у здоровых лиц.

Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакогенетике. Определяют полиморфизм rs1799853 гена CYP2C9.

Группа изобретений относится к биотехнологии и описывает новую бактериальную нуклеазу системы CRISPR-Cas9 из бактерии Capnocytophaga ochracea, а также ее применение для образования строго специфичных двунитевых разрывов в молекуле ДНК. Данная нуклеаза обладает необычными свойствами и может быть использована в качестве инструмента для внесения изменений в строго определенных местах в последовательности геномной ДНК одноклеточных или многоклеточных организмов.

Изобретение относится к материалам для генетического секвенирования. Предложена смоляная композиция для получения проточной ячейки для генетического секвенирования, включающая отверждаемую свободнорадикальную смоляную матрицу, включающую замещенный акрилокси- или метакрилокси-группами полисилоксан или акрил-замещенный полиэдрический олигомерный силсесквиоксан, свободнорадикальный фотоинициатор, матрицу из эпоксидной смолы и генератор фотокислоты.
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и, в частности, к способу получения латексных диагностикумов для реакции агглютинации латекса (РАЛ). Сущность изобретения: разработка латексного диагностикума для РАЛ заключается в том, что полиакролеиновую латексную суспензию центрифугируют, доводят 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рН 9,5 до концентрации 2% по сухому остатку полимера и смешивают в равных объемах с водорастворимым бруцеллезным (туляремийным) антигеном, разведенным 0,1 М ФСБ, рН 9,5 до концентрации 1600 мкг/мл, туляремийным - 800 мкг/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной, способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, способ лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, и применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека.
Наверх