Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления sars-cov-2 линии омикрон с определением субварианта ba.1
Владельцы патента RU 2779025:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии. Описана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд. Изобретение обеспечивает эффективную детекцию РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон, с определением субварианта BA.1методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). На сегодняшний день выделяют несколько субвариантов SARS-CoV-2 линии Омикрон – BA.1,BA.2,BA.2.12, BA.3,BA.4, BA.5, обладающие различиями в скорости распространения, патогенности и нейтрализации сыворотками переболевших. На сегодняшний день актуальной задачей является разработка тест-систем, пригодных для диагностики SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субвариантов этой линии, что позволит повысить эффективность вирусологического мониторинга.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая -ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящей из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPS-CoV-2 считается отрицательным.
Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:
CoV2-f tcacaattc aga agtagg acc tg;
CoV2-r agcctccaaaggcaa tag tgc
CoV2-pr R6G - tcttgccgaataccataatgaatccaa – BHQ1
Также известен набор синтетических олигонуклеотидов (Набор для выявления коронавируса SARS-CoV-2: патент RU2765497, Российская Федерация, заявка RU2021102274, заявл. 02.02.2021, опубл. 31.01.2022), фланкирующих несколько выбранных участков на РНК коронавируса SARS-CoV2 (праймеры), а также синтетических олигонуклеотидов, несущих в себе флуоресцентную метку и тушитель флуоресценции одновременно (зонды). При узнавании праймерами и зондами соответствующего участка на кДНК, комплементарной РНК коронавируса SARS-CoV2, происходит их связывание с ним, с последующим расщеплением зонда ферментом ДНК-полимеразой. При расщеплении зонда происходит усиление флуоресценции, что говорит о наличии в пробирке молекул-мишеней. Изобретение позволяет выявлять РНК коронавируса SARS-CoV2 в биологических образцах человека и животных, а также в мазках и смывах, взятых из окружающей среды с применением метода ПЦР в реальном времени.
Также известна тест-система для выявленияSARS-CoV-2, Influenzavirus A и Influenzavirus B (Тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenzavirus A, Influenzavirus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU 2761481, Российская Федерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).
На сегодняшний день не известны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.
Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с возможностью дифференцировать субварианты.
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективной детекции РНК SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1 методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
Технический результат достигается тем, что тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон с определением субварианта BA.1включает олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямойпраймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC
(SEQ ID NO: 1)
обратный праймер2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA
(SEQ ID NO: 2)
флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –
FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1(SEQ ID NO: 3)
прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT(SEQ ID NO: 4)
обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC(SEQ ID NO: 5)
флоуресцентный зонд N31-33del
HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1(SEQ ID NO: 6)
прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT(SEQ ID NO: 7)
обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA(SEQ ID NO: 8)
флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2(SEQ ID NO: 9)
Предложенная диагностическая система впервые позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон:
Впервые диагностическая система позволяет детектировать все существующие на данный момент субварианты линии омикрон: BA.1, BA.2,BA.2.12,BA.3, BA.4 bBA.5.Мультиплексная тест-система в сочетании (мультиплекс ОТ-ПЦР) с ранее заявленными олигонуклеотидами для детекции SARS-CoV-2 (патент RU2761481) и BA.1 (заявка RU2021140147), позволяет детектировать все известные на данный момент линии и варианты SARS-CoV-2 и определить принадлежность вируса к субвариантам BA.1 и не-BA.1 субвариантам линии Омикрон.
Определение всех вариантов линии Омикрон основано на детекции мутации ERS31del. На основании аннотаций аминокислотных замен и инделов более 5,5 миллионов образцов по 1513 линиям Pango из базы данных GISAID, доступных на 2021-12-03, рассчитаны относительные частоты замен по каждой линии с использованием языка Python v3.9.2, библиотек Pandas v1.3.5 и Numpy v1.3.5. Делеция ERS31del, детектируемая в данном анализе встречается только в линии Омикрон SARS-CoV-2 и является специфичным маркером этой линии.
Таблица 1. Описание разработанных олигонуклеотидов.
Форвард-праймер | ERS31delF | GTTTGGTGGACCCTCAGATT |
Реверс-праймер | ERS31del R | CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC |
Зонд | ERS31del P | HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1 |
Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила: 100 nM праймеров, 50 nMзонда. Увеличение количества олигонуклеотидов может привести к снижению специфичности реакции. Программа термоциклирования: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов
Аналитическая чувствительность: предел детекции составляет 1000 генных копий в мл. Эффективность реакции: 105%.
Также заявляемое изобретение поясняется изображениями, где на фиг. 1 приведены результаты мультиплексного анализа, а на фиг. 2 приведен график, иллюстрирующий оптимальную эффективность ОТ-ПЦР для детекции РНК линии Омикрон– он основан на изменении Cqпри серийных десятикратных разведениях.
В случае использования тест-системы для детекции мутации ERS31del без добавления других олигонуклеотидов в реакцию, детекцию увеличения флюоресценции в ходе ПЦР по каналу HEX нужно расценивать как положительный результат – наличие SARS-CoV-2 линии омикрон в образце.
В случае мультиплексной ПЦР в сочетании с ранее разработанными олигонуклеотидами для выявления SARS-CoV-2 (патент №2761481), для выявления субварианта BA.1 линии Омикрон (заявка № 2021140147). Интерпретация результатов представлена в таблице 2.
Таблица 2. Интерпретация результатов мультиплексной ПЦР
ПЦР для детекции 2-SARS-CoV-2 | ПЦР для детекции мутации ERS31del | ПЦР для детекции мутации Ins214EPE | |
FAM | HEX | ROX | |
+ | - | - | SARS-CoV-2,не принадлежащий к линии Омикрон |
+ | + | - | SARS-CoV-2 линии Омикрон, субварианты BA.2/BA.2.12/BA.3/BA.4/BA.5 |
+ | + | + | SARS-CoV-2 линии Омикрон, субвариант BA.1 |
- | - | - | В образце отсутствует РНК SARS-CoV-2 |
Результаты проверки аналитической специфичности теста с использованием заявляемой тест-системы представлены в таблице 3.
Таблица 3. Результаты проверки аналитической специфичности теста:
Наименование вируса в тестируемом образце по классификации PANGO | Детекция гена человеческой RP(внутренний контроль),Cq | Детекция SARS-CoV-2 по гену ORF | Детекция ERS31del, определение линии омикрон SARS-CoV-2, Cq | |
1 | P.1 | 35,35 | 15,45 | |
2 | B.1.351 | 39,91 | ||
3 | B.1 | 15,69 | ||
4 | B.1 | 33,84 | 26,69 | |
5 | B.1 | 24,26 | 26,98 | |
6 | B.1.1.7 | 25,27 | 20,64 | |
7 | B.1.1.7 | 30,54 | 28,05 | |
8 | B.1.1.7 | 26,99 | 31,25 | |
9 | AT.1 | 30,30 | 33,07 | |
10 | AT.1 | 30,02 | 31,33 | |
11 | AT.1 | 28,00 | 33,00 | |
12 | B.1.1.523 | 29,12 | 27,09 | |
13 | B.1.1.523 | 27,39 | 23,46 | |
14 | B.1.1.523 | 30,02 | 27,09 | |
15 | B.1.1.317 | 25,22 | 25,31 | |
16 | B.1.1.317 | 27,58 | 22,71 | |
17 | B.1.1.317 | 28,70 | 23,91 | |
18 | B.1.617.2 | 26,66 | 34,03 | |
19 | B.1.617.2 | 25,72 | 28,43 | |
20 | B.1.617.2 | 26,78 | 25,42 | |
21 | AY.122 | 23,96 | 28,95 | |
22 | AY.122 | 31,16 | 35,05 | |
23 | AY.122 | 24,19 | 34,93 | |
24 | BA.1 | 27,98 | 22,20 | 23,57 |
25 | BA.1 | 27,08 | 24,93 | 27,16 |
26 | BA.1 | 25,19 | 27,48 | 29,83 |
27 | BA.2 | 26,50 | 19,64 | 21,07 |
28 | BA.2 | 24,70 | 20,81 | 22,70 |
Специфичность ОТ-ПЦР была оценена на образцах (мазки носоглотки от пациентов) SARS-CoV-2 других линий, а также на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева (грипп А и В, РСВ, сезонные коронавирусы, риновирусы) без ложно-положительных результатов.
1. Тест-система на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для выявления SARS-CoV-2 всех субвариантов линии Омикрон с определением субварианта BA.1, включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – AGAGCTATGAATTGCAGAC
обратный праймер 2-SARS-CoV-2-ORF-1 – GGGAAATACAAAATTTGGACA
флоуресцентный зонд 2-SARS-CoV-2-ORF-1 –
FAM-AATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCA-BHQ1
прямой праймер N31-33del – GTTTGGTGGACCCTCAGATT
обратный праймер N31-33del – CAAGACGCAGTATTATTGGGTAAAC
флоуресцентный зонд N31-33del
HEX-AGTAACCAGAATGGTGGGGCGCG-BHQ1
прямой праймер Ins214EPE – ATATTCTAAGCACACGCCTATT
обратный праймер Ins214EPE – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA
флоуресцентный зонд Ins214EPE – ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ2
2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная концентрация праймеров и зондов составляет 100 nM для праймеров, 50 nM для зондов.
3. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что оптимальная программа термоциклирования соответствует следующим параметрам: обратная транскрипция 45°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термическое циклирование при 95°С - 15 с, 62°С - 30 с - 40 циклов.