Способ получения микрорастений подвоя косточковых культур (пк ск 1)
Владельцы патента RU 2779139:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения микрорастений подвоя косточковых культур (ПК СК 1), включающий их размножение в условиях in vitro, где на этапе укоренения используется питательная безгормональная среда, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, кальций хлористый, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, сахарозу, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, никотиновую кислоту, агар-агар и воду, в качестве источника железа используется Fe-EDDHA. Изобретение позволяет повысить общее физиологическое состояние, укореняемость микрорастений, количество и качество корней, способствует повышению эффективности микроразмножения растений in vitro. 1 пр.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве для массового производства подвоев косточковых культур.
Род Слива (Primus sp.) достаточно многообразен и включает в себя около 40 видов растений, таких как абрикос (P. armeniaca), слива домашняя (P. domestica), персик (P. persica), алыча гибридная (или слива русская - P. rossica), а также многие дикие виды. Хотя эти виды имеют близкое родство, в культуре in vitro возникают генотипические особенности, усложняющие и без того сложный процесс в размножении культуры тканей этап укоренения плодовых культур, в особенности сортов и подвоев рода Prunus.
Наиболее часто на этапе укоренения побегов косточковых культур, полученных в культуре in vitro, используют питательную среду, содержащую макро- и микросоли по прописи, разработанной Мурасиге и Скуга (MS). Среда MS первоначально разрабатывалась для каллусной культуры, поэтому возможность выращивания на ней микрорастений необходимо проверять эмпирическим путем и оптимизировать состав под каждую культуру отдельно (Md. J. Alam, R. Barua. In vitro regeneration and antibacterial activity of Prunus domestica L. // J. BioSci. Biotechnol. 2015. V. 4(1). P. 9-15; V. Sarropoulou, K. Dimassi-Theriou, I. Therios. In vitro rooting and biochemical parameters in the cherry rootstocks CAB-6P and Gisela 6 using L-methionine // Turkish Journal of Agriculture and Forestry. 2013. V. 37. P. 688-698; E. Carmona-Martin, C. Petri. Adventitious regeneration from mature seed-derived tissues of Prunus cerasifera and Prunus insititia II Scientia Horticulturae 259 (2020) 108746; N. Ghasheem, F. Stănică, A.G. Peticilă, O. Venat. In vitro effect of genotype, growth season and cytokinines on peach varieties (Prunus persica L.) Batsch) propagation // Scientifc Papers. Series B, Horticulture. Vol. LXII, 2018).
Для эффективного использования среды при укоренении различных культур исследователи оптимизируют ее состав, подбирая соотношение солей, количество фитогормонов, витаминов. В качестве источника железа, влияющего на процесс фотосинтеза и дыхательной функции растения, используют хелат железа Fe-EDTA, получаемый из двух компонентов: FeSO4⋅7H2O и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты NаЭДТА (трилон Б). Для приготовления маточного раствора Fe-EDTA необходимо затратить время для навески компонентов, приготовления отдельных растворов, их смешивания. Затрачивается время на внесение маточных растворов фитогормонов в питательную среду.
Известен способ укоренения подвоя персика GF-677 в культуре in vitro с применением хелатной формы этилендиамин ди-2-гидроксифенилацетата железа (Fe-EDDHA) (6%). Лучший процент укоренения получен, спустя 4 недели, на среде с содержанием 280 мг л-1Fe-EDDHA (Antonopoulou, С., Dimassi, K., Therios, I. et al. The effect of Fe-EDDHA and of ascorbic acid on in vitro rooting of the peach rootstock GF-677 explants. Acta Physiol Plant 29, 559-561 (2007) https://doi.org/10.1007/s11738-007-0067-9). Реакция при выращивании на данной среде подвоев других косточковых культур не известна.
Fe-EDDHA - это особая, высокоэффективная хелатная форма железа, применяемая как источник железа в удобрениях или для лечения и предотвращения хлороза растения, вызванного дефицитом железа. Это легкоусвояемая формы железа, за счет внесения в среду которой нормализуется уровень хлорофилла в растениях, улучшается фотосинтез и дыхание, наращивается вегетативная масса растений (длина побегов растений, количество и размер листьев). Железо в форме EDDHA устойчиво в широком диапазоне рН: от 3.0 до 9.0.
Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда для укоренения межвидового гибрида миндаля и персика GxN15 с применением Fe-EDDHA в качестве источника железа. Введение в среду Fe-EDDHA в количестве 100 и 150 мг/л способствовала 100% укоренению микрорастений и формированию 10-14 корней на растение средней длиной 8-9 см (M. Mehdi Arab, A. Yadollahi, M. Eftekhari, H. Ahmadi, M. Akbari, S. Sarikhani Khorami. Modeling and Optimizing a New Culture Medium for In Vitro Rooting of GxN15 Prunus Rootstock using Artificial Neural Network-Genetic Algorithm // Scientific Reports. 2018. V. 8. Article number: 9977), однако, данная среда испытана только при размножении конкретного гибрида, и при размножении других подвоев косточковых культур не испытана. В научной литературе отсутствуют примеры применения Fe-EDDHA для подвоев сливы домашней, каким является перспективный клоновый подвой ПК СК1, селекции ФГБНУ СКФНЦСВВ.
В приведенных вариантах технологии размножения косточковых культур, помимо использования Fe-EDDHA, на этапе укоренения использовались фитогормоны, способствующие ризогенезу (корнеобразованию): Индолил-3-масляная кислота (ИМК), α-нафтилуксусная кислота и др. Стимуляторы корнеобразования способствуют формированию корней, повышая эффективность укоренения, вместе с тем, наряду с дополнительными финансовыми затратами, гормоны оказывают негативное действие на структуру образующихся корней. При несбалансированном внесении гормонов, формирующиеся корни могут иметь хрупкую хрящеватую структуру, не имеют корневых волосков, при извлечении из среды часто ломаются, что сказывается на эффективности процесса адаптации растений к условиям ex vitro.
Технической задачей изобретения является обеспечение высокой эффективности укоренения, хорошего качества корней микрорастений подвоя косточковых культур при минимальных финансовых затратах и минимизации лабораторных процедур (действий) в процессе приготовления питательной среды, что важно при массовом размножении растений микроклонированием. Внесение фитогормонов, наряду с дополнительными финансовыми затратами (высокая стоимость гормонов), требует выполнения дополнительной процедуры приготовления маточного раствора гормонов.
Задача снижения финансовых затрат и упрощения лабораторных протоколов микроклонального размножения, улучшения качества получаемых микрорастений подвоя косточковых культур решается посредством оптимизации состава питательной среды на этапе укоренения микрорастений in vitro за счет отказа от применения фитогормонов корнеобразования (безгормональная среда) и замены источника железа Fe-EDTA на другую хелатную форму железа - Fe-EDDHA. Fe-EDDHA выпускается в виде порошка (в отличие от 2х компонентного Fe-EDTA, маточный раствор которого готовится в два этапа), поэтому необходимо только отмерить необходимое количество порошка и добавить его непосредственно в питательную среду. Fe-EDDHA -это доступное удобрение, дополнительно применение дорогостоящих или труднодоступных физиологически активных веществ не требуется.
Применение предлагаемого способа позволяет заметно снизить количество микропобегов, отбракованных из-за некроза, улучшить состояние растений, за счет увеличивающейся вегетативной массы (побегов, листьев), ускорить корнеобразование (до 7 суток после пассажа). Хотя процент корнеобразования ниже, чем при использовании фитогормонов, корни образуются более качественные, не хрящеватые, при пересадке менее ломкие, что положительно сказывается на процессе дальнейшей адаптации микрорастений к условиям ex vitro.
Осуществление способа.
Введение эксплантов подвоя косточковых культур проводят в благоприятные для культуры сроки. Через 3-4 недели проводят первый пассаж на среду для микроразмножения. Далее проводят 4-6 пассажей для мультипликации побегов на среде Мурасиге-Скуга. Далее растения высаживают на среду для ризогенеза.
Для приготовления питательной среды для ризогенеза использованы следующие компоненты (концентрации в мг на 1 л среды), макроэлементы:
NH4NO3 - 815-835; KNO3 - 940-960; КН2РО4⋅80-90; MgSO4x7H2O - 180-190, CaCl2x2H2O - 210-230; мезоэлементы: Fe-EDDHA - 100-200; микроэлементы: Н3ВО3 - 6,0-6,5; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,5; ZnSO4⋅7H2O - 8,0-9,0; KJ - 0,80-0,90; Na2MoO4 - 0,2-0,3; CuSO4⋅5H2O - 0,02-0,03; CoCl2⋅6H2O - 0,02-0,03; мезоинозит - 40-60; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,4-0,6; сахароза - 10000-30000; агар-агар - 6000-8000; остальное бидистиллированная вода до 1000; рН - 5,6÷5,8. Питательную среду разливают по сосудам, укупоривают крышками из алюминиевой фольги и автоклавируют. После стабилизации среды осуществляют высадку микропобегов.
Эффективность укоренения оценивалась долей укорененных микрорастений от числа всех высаженных побегов, выраженной в процентах.
Примеры конкретного исполнения.
Пример 1 (Контроль) - сорт подвоя: ПК СК 1 (подвой для крупноплодных косточковых культур).
Состав питательной среды для ризогенеза (мг на 1 л среды):
Аммоний азотнокислый 825
Калий азотнокислый 950
Калий фосфорнокислый однозамещенный 85
Кальций хлористый 220
Магний сернокислый 185
Железо сернокислое - 27,8
Этилендиаминотетраацетат натрия 37,3
Борная кислота 6,2
Марганец сернокислый 22,3
Цинк сернокислый 8,6
Калий йодистый 0,83
Натрий молибденовокислый 0,25
Медь сернокислая 0,0225
Кобальт хлористый 0,025
Мезоинозит 50
Тиамин - 0,5
Пиридоксин 0,5
Никотиновая кислота - 0,5
Сахароза 20000
Агар-агар 7000
Вода остальное до 1,0 л.
Процент укоренения: 4%
Среднее количество корней: 0,08 шт.
Средняя длина корней: 0,14 см.
Средняя высота микрорастений: 1,24 см.
Среднее количество листьев: 7,48 шт.
Пример 2. Сорт подвоя: ПК СК 1.
Состав питательной среды для ризогенеза (мг на 1 л среды):
Аммоний азотнокислый 825
Калий азотнокислый 950
Калий фосфорнокислый однозамещенный 85
Кальций хлористый 220
Магний сернокислый 185
Этилендиамин ди-2-гидроксифенилацетат железа 100
Борная кислота 6,2
Марганец сернокислый 22,3
Цинк сернокислый 8,6
Калий йодистый 0,83
Натрий молибденовокислый 0,25
Медь сернокислая 0,0225
Кобальт хлористый 0,025
Мезоинозит 50
Тиамин - 0,5
Пиридоксин 0,5
Никотиновая кислота - 0,5
Сахароза 20000
Агар-агар 7000
Вода остальное до 1,0 л.
Процент укоренения: 57,1%
Среднее количество корней: 1 шт.
Средняя длина корней: 1,2 см.
Средняя высота микрорастений: 2,6 см.
Среднее количество листьев: 12,9 шт.
Пример 3. Сорт подвоя: ПК СК 1.
Состав питательной среды для ризогенеза (мг на 1 л среды):
Аммоний азотнокислый 825
Калий азотнокислый 950
Калий фосфорнокислый однозамещенный 85
Кальций хлористый 220
Магний сернокислый 185
Этилендиамин ди-2-гидроксифенилацетат железа 200
Борная кислота 6,2
Марганец сернокислый 22,3
Цинк сернокислый 8,6
Калий йодистый 0,8
Натрий молибденовокислый 0,25
Медь сернокислая 0,0225
Кобальт хлористый 0,025
Мезоинозит 50
Тиамин - 0,5
Пиридоксин 0,5
Никотиновая кислота - 0,5
Сахароза 20000
Агар-агар 7000
Вода остальное до 1,0 л.
Процент укоренения: 61,8%
Среднее количество корней: 2,4 шт.
Средняя длина корней: 5,1 см.
Средняя высота микрорастений: 2,1 см.
Среднее количество листьев: 13,6 шт.
Замена хелатной формы железа стандартно используемой формы Fe-EDTA на Fe-EDDHA, на фоне безгормональной среды, заметно повышает процессы развития микрорастений на этапе укоренения побегов.
Способ получения микрорастений подвоя косточковых культур (ПК СК 1), включающий их размножение в условиях in vitro, отличающийся тем, что на этапе укоренения используется питательная безгормональная среда, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, кальций хлористый, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, сахарозу, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, никотиновую кислоту, агар-агар и воду, в качестве источника железа используется Fe-EDDHA, при следующем содержании компонентов, мг/л:
| Аммоний азотнокислый | 815-835 |
| Калий азотнокислый | 940-960 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 80-90 |
| Кальций хлористый | 210-230 |
| Магний сернокислый | 180-190 |
| Этилендиамин ди-2-гидроксифенилацетат | |
| железа (Fe-EDDHA) | 100-200 |
| Борная кислота | 6,0-6,4 |
| Марганец сернокислый | 22,0-22,6 |
| Цинк сернокислый | 8,3-8,9 |
| Калий йодистый | 0,80-0,86 |
| Натрий молибденовокислый | 0,2-0,3 |
| Медь сернокислая | 0,02-0,03 |
| Кобальт хлористый | 0,02-0,03 |
| Мезоинозит | 40-60 |
| Тиамин | 0,4-0,6 |
| Пиридоксин | 0,4-0,6 |
| Никотиновая кислота | 0,4-0,6 |
| Сахароза | 10000-30000 |
| Агар-агар | 6000-8000 |
| Вода | остальное до 1,0 л |
