Cd3-специфические антитела и их применение

Изобретение относится к биотехнологии. Представлено антитело (варианты), которое специфически связывается с CD3, биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD3 и также специфически связывается с опухолевым антигеном. Представлены: фармацевтическая композиция для лечения рака; способ модуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа у пациента; способ ингибирования роста опухолевых клеток у индивида; полинуклеотид для получения антитела или биспецифического антитела; применение антитела или биспецифического антитела или фармацевтической композиции. Заявленные анти-CD3 антитела могут быть полезны для терапевтических целей, включая активацию Т-клеток. 9 н. и 11 з.п. ф-лы, 21 табл., 22 ил., 11 пр.

 

Настоящая заявка подана в электронном виде через EFS-Web и включает списки последовательностей, представленные в электронном виде в формате.txt. Файл.txt, созданный 13 мая 2019 г. и названный «PC72375-PRV2_SequenceListing_ST25_05132019.txt», содержит списки последовательностей и имеет размер 100 КБ. Списки последовательностей, содержащиеся в этом файле.txt, являются частью описания и полностью включены в настоящее описание в виде ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, специфичным к CD3, и способам их применения. Настоящее изобретение также относится к полиспецифическим антителам, которые связываются с CD3 и целевым антигеном, и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кластер дифференцировки 3 (CD3) представляет собой гомодимерный или гетеродимерный антиген, экспрессируемый на Т-клетках в ассоциации с Т-клеточным рецепторным комплексом (TCR), является необходимым для активации Т-клеток. Активация Т-клеток - это сложное явление, которое зависит от участия множества молекул клеточной поверхности, экспрессируемых в популяции реактивных Т-клеток. Функциональный CD3 образуется в результате димерной ассоциации двух из четырех различных цепей: эпсилон, дзета, дельта и гамма. Например, антигенспецифический Т-клеточный рецептор (TCR) состоит из связанного дисульфидной связью гетеродимера, содержащего две клонально распределенные цепи интегральных мембранных гликопротеинов: альфа и бета (α и β) или гамма и дельта (γ и δ), нековалентно связанного с комплексом низкомолекулярных инвариантных белков, обычно обозначаемых как CD3. Димерные структуры CD3 также включают гамма/эпсилон, дельта/эпсилон и дзета/дзета.

Было показано, что анти-CD3 антитела образуют кластеры CD3 на Т-клетках, тем самым вызывая активацию Т-клеток методом, аналогичным связыванию TCR с загруженными пептидами молекулами MHC. Таким образом, анти-CD3 антитела могут быть полезны для терапевтических целей, включая активацию Т-клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам, связывающим CD3, а также композициям, таким как фармацевтические композиции, содержащие одно или более анти-CD3 антител. Антитела согласно этому аспекту изобретения полезны, помимо прочего, для нацеливания на Т-клетки, экспрессирующие CD3, и для стимуляции активации Т-клеток, например в обстоятельствах, когда опосредованное Т-клетками уничтожение является полезным или желательным. Анти-CD3 антитела по изобретению могут быть включены в состав полиспецифического антитела, например биспецифического антитела, которое направляет CD3-опосредованную активацию Т-клеток на определенные типы клеток, такие как опухолевые клетки или инфекционные агенты.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с CD3, причем указанное антитело содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область один VH (VH CDR1), определяющую комплементарность область два VH (VH CDR2) и определяющую комплементарность область три VH (VH CDR3) последовательности VH c SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 или 35; и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область один VL (VL CDR1), определяющую комплементарность область два VL (VL CDR2) и определяющую комплементарность область три VL (VL CDR3) последовательности VL c SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 или 89.

В одном из вариантов этого аспекта анти-CD3 антитело содержит: (а) область VH, содержащую (i) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23 или 24; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 или 25; и/или (b) область VL, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 26, 29, 30, 32, 91 или 92; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27 или 31; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28 или 33.

В некоторых таких вариантах осуществления изобретение относится к антителу, в котором: (а) область VH содержит последовательность SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 или 35; и/или (b) область VL содержит последовательность SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 или 89.

В других вариантах осуществления антитело содержит пару аминокислотных последовательностей VL/VH, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 1 и 2; SEQ ID NO: 3 и 2; SEQ ID NO: 3 и 4; SEQ ID NO: 3 и 5; SEQ ID NO: 6 и 7; SEQ ID NO: 8 и 7; SEQ ID NO: 6 и 4; SEQ ID NO: 8 и 4; SEQ ID NO: 9 и 10; SEQ ID NO: 9 и 7; SEQ ID NO: 11 и 12; SEQ ID NO: 34 и 35; SEQ ID NO: 9 и 4; SEQ ID NO: 87 и 4; и SEQ ID NO: 89 и 4.

В некоторых вариантах осуществления каждого из вышеперечисленных выше аспектов антитело выбирают из группы, состоящей из Fab, Fab фрагмента, F(ab)₂ фрагмента, Fv фрагмента, одноцепочечного Fv фрагмента, стабилизированного дисульфидной связью Fv фрагмента, одноцепочечного антитела, моноклонального антитела, химерного антитела, биспецифического антитела, триспецифического антитела, полиспецифического антитела, биспецифического гетеродимерного диатела, биспецифического гетеродимерного IgG, поликлонального антитела, меченого антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела и их фрагментов.

В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело специфически связывается с опухолевым антигеном.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению дополнительно содержит человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL. В некоторых таких вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей анти-CD3 антитело по изобретению, раскрытое далее в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу модуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение субъекту эффективного количества антитела или фармацевтической композиции, раскрытые в настоящем описании, для модуляции иммунного ответа у субъекта.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу подавления роста опухолевых клеток у субъекта, включающему введение субъекту раскрытого в настоящем описании биспецифического антитела, триспецифического антитела, полиспецифического антитела, биспецифического гетеродимерного диатела или биспецифического гетеродимерного IgG в эффективном количестве для подавления роста опухолевых клеток.

В некоторых таких вариантах осуществления опухолевые клетки представляют собой раковые клетки. В конкретных вариантах осуществления рак выбирают из группы, состоящей из рака груди, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких, мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы.

В одном из вариантов осуществления рак пищеварительной системы выбирают из группы, состоящей из рака пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, ануса, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции, содержащей такое антитело, для применения в терапии.

В другом варианте осуществления изобретение относится к применению антитела по изобретению в производстве лекарственного средства для применения в терапии. В некоторых таких вариантах осуществления терапия включает активацию цитолитического Т-клеточного ответа.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, раскрытое в настоящем описании. В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему такой полинуклеотид.

В еще одном аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей векторы, раскрытые в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления клетка-хозяин рекомбинантно продуцирует антитело, раскрытое в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из линий бактериальных клеток, линий клеток млекопитающих, линий клеток насекомых, линий клеток дрожжей. В конкретном варианте осуществления линия клеток млекопитающих представляет собой линию клеток СНО.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения антитела, раскрытого в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина в условиях, которые приводят к продуцированию антитела, раскрытого в настоящем описании, и очистку антитела из супернатанта культуры.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению анти-CD3 антитела, полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина, которые раскрыты в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для лечения расстройства.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения в способе модуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения в способе подавления роста опухолевых клеток у субъекта.

В другом аспекте изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения при лечении рака, причем необязательно рак выбирают из группы, состоящей из рака груди, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких, мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы.

В еще одном аспекте изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения при лечении рака, при котором модулируется опосредованный Т-клетками иммунный ответ или происходит подавление роста опухолевых клеток.

Другие варианты осуществления станут очевидными из подробного описания. В тех случаях, когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в терминах группы Маркуша или другой группы альтернатив, настоящее раскрытие охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но каждый член группы в отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу, в которой отсутствует один или более членов группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или более членов группы в заявленном изобретении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На фиг.1 представлена схема строения биспецифического антитела, имеющего первый домен, обеспечивающий гетеродимер, и второй домен, обеспечивающий гетеродимер, содержащий цепь Fc фрагмента (Fc цепь), оптимизированную для связывания по типу «выступ-во-впадину».

На фиг. 2 представлены результаты термограмм дифференциальной сканирующей калориметрии, показывающие теплоемкость биспецифических антител GUCY2c-H2B4 и GUCY2c-2B5 как функцию температуры.

На фиг. 3 показано связывание биспецифических антител GUCY2c-H2B4 (GUCY2c-0247) и GUCY2c-2B5 (GUCY2c-0250) с человеческими наивными Т-клетками с помощью анализа проточной цитометрии.

На фиг. 4 показаны результаты цитотоксичности in vitro, опосредованной биспецифическими антителами GUCY2c-H2B4 (GUCY2c-0247) и GUCY2c-2B5 (GUCY2c-0250), с использованием данных о жизнеспособности клеток.

На фиг. 5 изображена поверхность потенциальной энергии (ППЭ) Fv области H2B4, полученная на основе кристаллической структуры, полученной методом рентгеновской дифракции. Она включает 3 вида, которые демонстрируют область VH, интерфейс VH/VL и область VL. CDR с избыточным положительным зарядом указаны на чертеже для справки. Темно-черный означает положительный заряд, а белый - отрицательный.

На фиг. 6 показана поверхность Fv области H2B4 с пространственной склонностью к агрегации (SAP). Отмечены области с концентрированными гидрофобными остатками.

На фиг. 7 представлены электрофореграммы, полученные с помощью капиллярного гель-электрофореза, демонстрирующие гетерогенность биспецифических антител, содержащих связывающие домены анти-CD3 антител H2B4, 2B5 и 2B5v6.

На фиг. 8 представлена термограмма дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), показывающая теплоемкость биспецифического антитела GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) как функцию температуры.

На фиг. 9 показано связывание биспецифического антитела GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) с наивными Т-клетками.

На фиг.10 представлены данные по жизнеспособности клеток, демонстрирующие цитотоксичность in vitro, опосредованную биспецифическим антителом GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6).

На фиг. 11A-11F показаны измерения опосредованного биспецифическим GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) высвобождения цитокинов in vitro. Биспецифическое антитело рекрутирует наивные человеческие Т-клетки к GUCY2c-экспрессирующим клеткам Т84 для индукции высвобождения цитокинов in vitro. Анализ на основе Luminex показал повышенную экспрессию человеческого IFN-гамма (фиг. 11A), IL10 (фиг. 11B), IL2 (фиг. 11C), IL4 (фиг. 11D), IL6 (фиг. 11E) и TNF-альфа (фиг. 11F).

На фиг. 12 показано дозозависимое подавление роста опухоли биспецифическим антителом GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) в ксенотрансплантате PDX-CRX-11201, полученном от пациента с колоректальным раком, в системе адоптивного переноса.

На фиг. 13 показано дозозависимое подавление роста опухоли биспецифическим антителом GUCY2C-1608 (GUCY2C-2B5v6) в клеточной линии ксенотрансплантата колоректального рака LS1034, в системе адоптивного переноса.

На фиг. 14A показаны результаты данных по жизнеспособности клеток, демонстрирующие цитотоксичность in vitro, опосредованную биспецифическими антителами FLT3-2B5v6 при различных соотношениях эффектор:мишень (E:T) с использованием Flt3-экспрессирующих клеток MV4-11. На фиг. 14B показаны результаты данных по жизнеспособности клеток, демонстрирующие цитотоксичность in vitro, опосредованную биспецифическими антителами FLT3-2B5v6 при различных соотношениях эффектор:мишень (E:T) с использованием Flt3-экспрессирующих клеток EOL-1.

На фиг. 15 показано связывание низкоафинных вариантов 2B5v6 с клетками Jurkat, экспрессирующими CD3.

На фиг. 16 представлен график, обобщающий результаты исследования, демонстрирующие зависимую от биспецифических анти-GUCY2C антител Т-клеточно-опосредованную цитотоксичность с анти-CD3 вариантами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Раскрытое в настоящем описании изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с CD3 (например, человеческим CD3), включая полноразмерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим эти антитела, композициям, содержащим эти антитела, и способам получения и применения этих антител. Изобретение также относится к способам лечения расстройства с помощью раскрытых в настоящем описании антител.

Общие методы

При применении настоящего изобретения на практике, если не указано иное, используются обычные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области. Такие методы полностью описаны в литературе, например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). В некоторых случаях термины с общепринятыми значениями определены в настоящем описании для ясности и/или просто в виде ссылки, и включение таких определений в настоящее описание не обязательно следует толковать как то, что такие определения существенно отличаются от их обычного понимания в данной области техники.

Изобретение описано далее более подробно со ссылкой на приведенные ниже определения и примеры. Все патенты и публикации, включая все последовательности, раскрытые в таких патентах и публикациях, упомянутых в настоящем описании, явным образом включены в качестве ссылки.

Определения

Как правило, если не определено иное, все термины в данной области техники, обозначения и другие научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, термин «и/или», используемый в фразе, такой как «A и/или B», включает варианты «A и B», «A или B», «A» (только) и «B» (только). Аналогичным образом, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «A, B и/или C», включает каждый из следующих вариантов: A, B и C; А, В или С; А или С; А или В; B или C; А и С; А и В; B и C; А (только); B (только); и C (только).

Используемые в настоящем описании формы единственного числа включают соответствующие ссылки на множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное.

Используемые в настоящем описании числовые диапазоны включают числа, определяющие этот диапазон.

Термины «примерно», «приблизительно» и т.п., предшествующие списку числовых значений или диапазону, относятся к каждому отдельному значению в списке или диапазоне независимо, как если бы этот термин предшествовал каждому отдельному значению в списке или диапазоне. Эти термины означают, что значения, к которым относятся вышеуказанные указанные, являются точно такими же, близкими или похожими на них. Например, в некоторых вариантах осуществления примерно или приблизительно конкретное значение может указывать на значение 99%, 95% или 90% от указанного значения. Например, выражение «примерно 100» включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5 и т.д.). В качестве другого примера, когда температура составляет 70°C, «примерно» или «приблизительно» 70°C может составлять 69°C, 66°C или 63°C. Следует понимать, что это всего лишь примеры.

В контексте настоящего описания нуклеиновые кислоты представлены слева направо в направлении от 5' к 3'-концу; аминокислотные последовательности представлены слева направо в направлении от аминоконца к карбоксиконцу, соответственно. Определения и термины, используемые в данной области, специалисты могут найти, в частности, в Sambrook et al., 1989 и Ausubel FM et al., 1993. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными методами, протоколами и реагентами, поскольку они могут быть изменены.

Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения аминокислотных цепей любой длины, предпочтительно, относительно коротких (например, из 10-100 аминокислот). Цепь может быть линейной или разветвленной, она может содержать модифицированные аминокислоты и/или может быть прервана не аминокислотами. Термины также охватывают аминокислотную цепь, которая была модифицирована естественным образом или путем вмешательства; например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или путем любых других манипуляций или модификаций, таких как конъюгация с компонентом для мечения. Это определение также включает, например, полипептиды, содержащие один или более аминокислотных аналогов (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Понятно, что полипептиды могут существовать в виде одиночных цепей или связанных цепей. Предпочтительными для использования являются полипептиды млекопитающих (полипептиды, которые были изначально получены из организма млекопитающего), более предпочтительно полипептиды, секретируемые непосредственно в среду.

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., по меньшей мере посредством одного участка распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В контексте настоящего описания этот термин охватывает поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, антитело с двойной специфичностью, бифункциональное антитело, триспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое гетеродимерное диатело, биспецифический гетеродимерный IgG, меченое антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело и их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела (включая, например, антитела акул и верблюдов), слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает участок узнавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или его подкласса), и антитело не обязательно должно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно отнести к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Изобретение также включает «аналог(и) антитела(антител)», каркасы на основе других белков, не являющихся молекулами антител, например, слитые белки и/или иммуноконъюгаты, в которых использованы CDR для обеспечения специфического связывания антигена. Антитела по изобретению могут происходить от любого вида, включая, без ограничения, мышей, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика, курицу, лошадь и крупный рогатый скот.

Термин «антитело» дополнительно включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидных цепи, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначенную в настоящем описании как VR HC или VH) и константную область тяжелой цепи. «Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, СН1, СН2 и СН3. Домены CH1 и CH2 соединены шарнирной областью. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначенную в настоящем описании как VR LC или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления изобретения FR анти-CD3 антитела (или его антигенсвязывающей части) могут быть идентичны последовательностям человеческой зародышевой линии или могут быть модифицированы естественным образом или искусственно. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена методом прямого сравнения двух или более CDR. В каждой цепи CDR удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR и вместе с CDR другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка антител.

Термины «антигенсвязывающий фрагмент», «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающая часть» в контексте настоящего описания относятся к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность избирательно связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи (VL) антитела, или пару VH/VL, полученную из полноразмерных антител или фрагментов антител, таких как домен VH и/или домен VL; (ii) Fab фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (iii) фрагмент Fab', который по существу является Fab с частью шарнирной области (например, Fundamental Immunology, Paul ed., 3.sup.rd ed.1993); (iv) F(ab')₂ фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (v) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (vi) Fv фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (vii) одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), представляющий собой единичную белковую цепь, в которой участки VL и VH спарены с образованием одновалентных молекул (например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); (viii) стабилизированный дисульфидной связью Fv фрагмент (dsFv), т.е. Fv со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью для стабилизации пары VH-VL; (ix) фрагмент антитела с одним вариабельным доменом (sdAb или dAb) (например, Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из вариабельного домена тяжелой цепи и лишен легкой цепи; (х) определяющую комплементарность область (CDR); и любые их производные.

Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или любой аминокислотный состав и обычно содержит по меньшей мере одну CDR, которая находится рядом с одной или более каркасными последовательностями или находится с ними в рамке считывания. В контексте настоящего описания термин «антигенсвязывающий фрагмент антитела» может включать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой конфигурации из конфигураций, состоящих из вариабельной области и константного домена, перечисленных ниже, нековалентно связанных друг с другом и/или с одним или более мономерными областями VH или VL (например, с помощью дисульфидной(ых) связи(ей)). Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут быть обнаружены в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: VH-CH1; VH-CH2; VH-CH3; VH-CH1-CH2; VH-CH1-CH2-CH3; VH-CH2-CH3; VH-VL-CL, VH-VL-CH1, VH-VL-CH2; VH-CL; VL-CH1; VL-CH2; VL-CH3; VL-CH1-CH2; VL-CH1-CH2-CH3; VL-CH2-CH3; и VL-CL. Вариабельные области и константные домены могут быть либо напрямую связаны друг с другом, либо могут быть связаны посредством полноразмерной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, которые приводят к образованию гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными областями и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле.

В контексте настоящего описания термин «связывающий домен» содержит любую область полипептида (например, антитела), которая отвечает за селективное связывание с представляющей интерес молекулой (например, антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Примеры связывающих доменов включают вариабельную область антитела, рецептор-связывающий домен, лиганд-связывающий домен и ферментативный домен.

В контексте настоящего описания термин «человеческая акцепторная каркасная область» представляет собой каркасную область, содержащую аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельной области легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи (VH), полученную из каркасной области человеческого иммуноглобулина или человеческой консенсусной каркасной области, как определено ниже. Человеческий акцепторный каркасный участок, «полученный из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, может содержать такую же аминокислотную последовательность или может содержать модификации аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления количество аминокислотных модификаций составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления последовательность человеческого акцепторного каркасного участка VL идентична последовательности человеческого каркасного участка VL иммуноглобулина или консенсусной последовательности человеческого каркасного участка.

В контексте настоящего описания «антитело с созревшим сродством» относится к антителу с одной или более модификациями в одной или более вариабельных областях (которые включают CDR и FR) относительно родительского антитела, которое не имеет таких модификаций, причем такие модификации приводят к улучшению сродства антитела к антигену.

В контексте настоящего описания термины «Fc область», «Fc домен», «Fc цепь» или аналогичные термины используются для определения С-концевой области тяжелой цепи IgG. Fc область IgG включает два константных домена, CH2 и CH3. Домен CH2 Fc области человеческого IgG обычно простирается от аминокислоты 231 до аминокислоты 340 по системе нумерации индекса ЕU или от аминокислоты 244 до аминокислоты 360 по системе нумерации по Кабат. Домен CH3 Fc области человеческого IgG обычно простирается от аминокислоты 341 до 447 по системе нумерации индекса ЕU или от аминокислоты 361 до аминокислоты 478 по системе нумерации по Кабат. Домен CH2 Fc области человеческого IgG (также называемый доменом «Cγ 2») уникален тем, что он не является тесно спаренным с другим доменом. Напротив, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами CH2 интактного природного IgG. Область Fc может содержать нативные или измененные последовательности Fc. Хотя границы последовательности Fc области тяжелой цепи иммуноглобулина могут меняться, последовательность Fc области тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяют как простирающуюся от аминокислотного остатка примерно в положении Cys226 или примерно в положении Pro230 до карбоксильного конца последовательности Fc области. Если в настоящем описании не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

В некоторых вариантах осуществления Fc цепь начинается в шарнирной области непосредственно перед участком расщепления папаином и заканчивается на С-конце антитела. Соответственно, полная Fc цепь содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь содержит по меньшей мере одно из: шарнирного домена (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка), домена CH2, домена CH3, домена CH4 или их варианта, части или фрагмента. В некоторых вариантах осуществления домен Fc содержит полную Fc цепь (т.е. шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3). В некоторых вариантах осуществления Fc цепь содержит шарнирный домен (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления Fc цепь содержит домен CH2 (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления Fc цепь состоит из домена CH3 или его части. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH3 (или его части). В некоторых вариантах осуществления Fc цепь состоит из домена CH2 (или его части) и домена CH3. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH2 (или его части). В некоторых вариантах осуществления в Fc цепи отсутствует по меньшей мере часть домена CH2 (например, весь домен CH2 или его часть). В контексте настоящего описания Fc цепь обычно относится к полипептиду, содержащему всю или часть Fc цепи тяжелой цепи иммуноглобулина. Она включает, без ограничения, полипептиды, содержащие полностью домен CH1, шарнирный домен, домены CH2 и/или CH3, а также фрагменты таких пептидов, содержащие только, например, шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3. Цепь Fc может происходить из иммуноглобулина любого вида и/или любого подтипа, включая, без ограничения, человеческие антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM. Домен Fc включает нативные молекулы Fc и варианты Fc. Как и в случае вариантов Fc и нативных Fc, термин «Fc цепь» включает молекулы в мономерной или полимерной форме, независимо от того, отщеплены ли они от цельного антитела или получены другими способами. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь содержит карбокси-терминальные части обеих тяжелых цепей, удерживаемые вместе дисульфидными связями. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь состоит из домена CH2 и домена CH3.

Используемые в данной области термины «рецептор Fc» и «FcR» описывают рецептор, который связывается с Fc областью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой человеческий FcR с нативной последовательностью. Более того, предпочтительным FcR является рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся в основном цитоплазматическими доменами. Обзор видов FcR можно найти у Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. «FcR» также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; и Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).

«Fc область с нативной последовательностью» или «Fc область дикого типа» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc области, встречающейся в природе. Под Fc «дикого типа» человеческого IgG подразумевается аминокислотная последовательность, которая встречается в природе в человеческой популяции. Конечно, так же как у разных индивидуумов последовательности Fc могут незначительно отличаться, последовательности дикого типа могут содержать одно или более изменений, но по-прежнему оставаться в пределах объема изобретения. Например, Fc область может содержать дополнительные изменения, не относящиеся к настоящему изобретению, такие как мутация в участке гликозилирования, включение неприродной аминокислоты или мутация «выступ-во-впадину».

«Вариант Fc области» или «вариант Fc цепи» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc области в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, но сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc области с нативной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc цепи имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc цепью с нативной последовательностью или с Fc областью родительского полипептида, например от примерно одной до примерно десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от примерно одной до примерно пяти аминокислотных замен в Fc цепи с нативной последовательностью или в Fc цепи родительского полипептида. В контексте настоящего описания вариант Fc цепи предпочтительно может иметь по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности с Fc цепью с нативной последовательностью и/или с Fc цепью родительского полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99% идентичности последовательности.

В контексте настоящего описания термин «эффекторные функции» относится к тем биологическим активностям, которые присущи Fc цепи (Fc цепям с нативной последовательностью или вариантам Fc цепи аминокислотной последовательности) антитела, и меняются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора B-клеток); и активацию B-клеток. Такие эффекторные функции обычно требуют объединения Fc цепи со связывающим доменом (например, вариабельной областью антитела), и могут быть оценены с помощью различных анализов, известных в данной области техники для оценки таких эффекторных функций антитела. Эффекторная функция может быть измерена, например, через связывание с Fcγ3 и/или C1q.

Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc цепи; эта цепь также является частью, распознаваемой Fc рецепторами (FcR), обнаруженными на определенных типах клеток.

В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc содержит часть или всю шарнирную последовательность дикого типа (обычно на своем N-конце). В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc не содержит функциональную или шарнирную последовательность дикого типа.

Термин «шарнирная область», «последовательность шарнирной области» и их варианты, используемые в настоящем описании, включают значение, известное в данной области, которое проиллюстрировано, например, Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, Elsevier Science Ltd., NY (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science, 6:407-415, 1997; and Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209:193-202, 1997.

Термин «иммуноглобулин-подобная шарнирная область», «последовательность иммуноглобулин-подобной шарнирной области» или их варианты, используемые в настоящем описании, относятся к шарнирной области и последовательности шарнирной области иммуноглобулин-подобной или антитело-подобной молекулы (например, иммуноадгезинов). В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин-подобная шарнирная область может происходить или может быть получена из любого подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или из IgA, IgE, IgD или IgM, включая их химерные формы, например, шарнирной области химерного IgG1/2.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может происходить из подтипа человеческого IgG1, простираясь от аминокислоты 216 до аминокислоты 230 согласно системе нумерации индекса ЕU или от аминокислоты 226 до аминокислоты 243 согласно системе нумерации по Кабат. В некоторых вариантах осуществления последовательность может представлять собой EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 63). Специалисты в данной области могут по-разному определять точные границы аминокислот, соответствующие различным доменам молекулы IgG. Таким образом, N-конец или C-конец доменов, описанных выше, может удлиняться или укорачиваться на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или даже 10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может быть мутирована по одной или более аминокислотам. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может быть укороченной и содержать только часть полной шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может содержать только последние 5 аминокислот шарнирной области, называемой в настоящем описании «нижней шарнирной» областью. В некоторых вариантах осуществления нижняя шарнирная область может состоять из аминокислот CPPCP (SEQ ID NO: 64) или от аминокислоты 226 до аминокислоты 230 согласно системе нумерации индекса ЕU или от аминокислоты 239 до аминокислоты 243 согласно системе нумерации по Кабат.

В контексте настоящего описания термин «модификация» относится к аминокислотной замене, вставке и/или делеции в полипептидной последовательности, изменению фрагмента, химически связанного с белком, или модификации функции белка, например, антитела. Например, модификация может представлять собой измененную функцию антитела или измененную углеводную структуру, присоединенную к белку. В контексте настоящего описания термин «модификация аминокислоты» относится к мутации (замене), вставке (добавлению) или делеции одного или более аминокислотных остатков в антителе. Термин «аминокислотная мутация» означает замену по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка другим отличным аминокислотным остатком (например, заменяющим аминокислотным остатком). Термин «делеция аминокислоты» означает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заранее определенном положении в аминокислотной последовательности. Например, мутация L234A означает, что аминокислотный остаток лизина в положении 234 в Fc области антитела заменен аминокислотным остатком аланина (замена лизина на аланин) (нумерация согласно системе нумерации индекса ЕU). «Встречающийся в природе аминокислотный остаток» означает аминокислотный остаток из группы, состоящей из аланина (трехбуквенный код: Ala, однобуквенный код: A), аргинина (Arg, R), аспарагина (Asn, N), аспарагиновой кислоты (Asp, D), цистеина (Cys, C), глутамина (Gin, Q), глутаминовой кислоты (Glu, E), глицина (Gly, G), гистидина (His, H), изолейцина (He, I), лейцина (Leu, L), лизина (Lys, K), метионина (Met, M), фенилаланина (Phe, F), пролина (Pro, P), серина (Ser, S), треонина (Thr, T), триптофана (Trp, W), тирозина (Tyr, Y) и валина (Val, V).

Термин «агент» используется в настоящем описании для обозначения биологической макромолекулы, экстракта, полученного из биологических материалов, смеси биологических макромолекул, химического соединения, смеси химических соединений и/или смеси химических соединений и биологических макромолекул. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, обладающему биологической активностью.

В контексте настоящего описания «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного участка. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного детерминанта на антигене. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, получаемого из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует толковать как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены методом гибридомы, впервые описанным Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975 или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК, например, описанными в патенте США № 4,816,567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, созданных с помощью способов, описанных, например, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990.

Антитела по настоящему изобретению могут быть «гуманизированными антителами». В контексте настоящего описания термин «гуманизированное» антитело относится к формам нечеловеческих (например, мышиных, крысиных, кроличьих, нечеловеческих приматов или других млекопитающих) форм антител, которые представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулина или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не относящегося к человеку. Эти не относящиеся к человеческим аминокислотные остатки часто называют «импортируемыми» остатками, которые обычно получают из «импортируемого» вариабельного домена. Импортируемый остаток, последовательность или антитело имеет требуемое сродство и/или специфичность или другую требуемую биологическую активность антитела, как обсуждается в настоящем описании.

Предпочтительно гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентные антитела), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками из CDR нечеловеческого вида (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, имеющей требуемую специфичность, сродство и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которых нет ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасной области, но которые включены для дальнейшего улучшения и оптимизации характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все, по меньшей мере один и, как правило, две вариабельные области, в которых все или по существу все области CDR соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или по существу все области FR, которые являются областями консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Оптимально, если гуманизированное антитело может включать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Предпочтительными являются антитела, имеющие Fc цепи, модифицированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 или CDR H3), которые изменены по отношению к исходному антителу, которые также называются одной или более CDR, «полученными от» одной или более CDR исходного антитела. Подразумевается, что термин «гуманизированный» включает деиммунизированные антитела.

В контексте настоящего описания «человеческое антитело» означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком и/или полученного с помощью любого способа получения человеческих антител, известного специалистам в данной области или раскрытого в настоящем описании. Соответственно, термин «человеческое антитело», используемый в настоящем описании, предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии (например, случайные мутации или мутации, полученные в результате сайт-специфического мутагенеза in vitro, или соматические мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Это определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи. Человеческие антитела можно получить различными способами, известными в данной области. В одном из вариантов осуществления человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, где фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Человеческие антитела можно также получить путем иммунизации животных, которым вместо эндогенных локусов трансгенно введены локусы человеческого иммуноглобулина, например мышей, у которых гены эндогенных иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США №№ 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5633425; и 5,661,016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело, направленное против целевого антигена (такие В-лимфоциты могут быть получены от индивидуума или получены путем клонирования кДНК из одной клетки, или путем иммунизации in vitro). См., например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991; и патент США № 5,750,373.

Человеческие антитела по настоящему изобретению могут существовать по меньшей мере в двух формах, которые связаны с гетерогенностью шарнирной области. Например, молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию, составляющую приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе межцепочечной дисульфидной связью тяжелых цепей. В альтернативном случае димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями, и образуется молекула размером примерно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело).

Используемый в настоящем описании термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных средств, таких как антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяин (дополнительно описанную ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител (описанных далее ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческих иммуноглобулинов (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res 20:6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулинов человеческой зародышевой линии. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела подвергаются мутагенезу in vitro (или, когда используется животное, трансгенное по последовательностям человеческого Ig, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и связаны с ними, могут не существовать в природе в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo.

Антитела по изобретению могут быть «химерными» антителами, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от определенного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, а остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США 4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984). Представляющие интерес химерные антитела включают приматизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельной области, полученные от приматов, не являющихся человеком (например, обезьян Старого Света, обезьян и т.д.), и последовательности человеческих константных областей.

«Моновалентное антитело» содержит один антигенсвязывающий участок на молекулу (например, IgG или Fab). В некоторых случаях моновалентное антитело может иметь более одного антигенсвязывающего участка, но эти связывающие участки происходят от разных антигенов.

«Моноспецифическое антитело» относится к антителу или препарату антитела, которое содержит два идентичных антигенсвязывающих участка на молекулу (например, IgG), например два антигенсвязывающих участка, идентичных эпитопу на антигене. Таким образом, они конкурируют друг с другом за связывание с одной молекулой антигена. Этот термин включает «моноклональное антитело» или «композицию моноклонального антитела». Большинство природных антител моноспецифичны. В некоторых случаях моноспецифическое антитело также может быть моновалентным антителом (например, Fab).

Термины «нагрузка мутации», «мутационная нагрузка», «бремя мутации» или «мутационное бремя» используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Мутационная нагрузка опухоли представляет собой меру количества мутаций в геноме опухоли, определяемую как общее количество мутаций на кодирующую область генома опухоли. Бремя мутаций среди типов опухолей сильно варьирует, от нескольких мутаций до 1000 (Alexandrov LB et al., Nature 2013; 500(7463):415-421; Lawrence MS et al., Nature 2013;499:214-218; Vogelstein B et al., Science, 2013;339:1546-1558).

«Исходный аминокислотный остаток» является остатком, который заменяют «импортированным аминокислотным остатком» с боковой цепью меньшего или большего размера, чем у исходного остатка. Импортированный аминокислотный остаток может представлять собой встречающийся в природе или не встречающийся в природе аминокислотный остаток, но предпочтительно является первым. «Встречающиеся в природе» аминокислотные остатки - это остатки, кодируемые генетическим кодом. Под «не встречающимся в природе» аминокислотным остатком подразумевается остаток, который не кодируется генетическим кодом, но который способен ковалентно связываться с соседним аминокислотным остатком(ами) в полипептидной цепи. Примерами не встречающихся в природе аминокислотных остатков являются норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как описанные, например, в Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению включает замену по меньшей мере одного исходного аминокислотного остатка, но могут быть заменены более одного исходного остатка. Количество исходных аминокислотных остатков, которые могут быть заменены обычно не превышает общего количества остатков на поверхности контакта первого или второго полипептида.

Термин «конкурировать», используемый в настоящем описании по отношению к антителу, означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (или часть) связывается с эпитопом способом, практически аналогичным связыванию второго антитела или его антигенсвязывающей части, в результате чего связывание первого антитела с его родственным эпитопом заметно снижается в присутствии второго антитела относительно уровня связывания первого антитела в отсутствие второго антитела. Альтернативно, связывание второго антитела с его эпитопом также может заметно снижаться в присутствии первого антитела, но это не обязательно. Другими словами, первое антитело может подавлять связывание второго антитела с эпитопом, при этом это второе антитело не подавляет связывание первого антитела с соответствующим ему эпитопом. Однако, если каждое антитело детектируемо подавляет связывание другого антитела с родственным ему эпитопом или лигандом, в такой же, большей или меньшей степени, говорят, что антитела «перекрестно конкурируют» друг с другом за связывание с соответствующим(и) эпитопом(ами). Настоящее изобретение охватывает как конкурирующие, так и перекрестно-конкурирующие антитела. Независимо от механизма, с помощью которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, стерическое препятствие, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его частью), квалифицированному специалисту будет понятно, исходя из представленных в настоящем описании аспектов, что такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела входят в объем изобретения и могут быть полезны для способов, раскрытых в настоящем описании.

В контексте настоящего описания термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc (FcR) (например, естественные киллерные (NK) клетки, нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена с помощью анализа ADCC in vitro, например описанного в патенте США № 5,500,362 или 5,821,337. Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно ADCC активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, на модели животных, такой как описанная в Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656, 1998.

Используемый в настоящем описании термин «комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизированию мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом) в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ CDC, например, описанный в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163, 1996.

В контексте настоящего описания термины «иммуноспецифически связывается», «иммуноспецифически распознает», «специфически связывается», «специфически распознает», и аналогичные термины относятся к молекулам, например, связывающим доменам, которые специфически связываются с антигеном (например, эпитопом или иммунным комплексом) и не связываются специфически с другой молекулой. Молекула, которая специфически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низким сродством, что определяется с помощью анализов, известных в данной области, например, иммуноанализов, BIACORE™ или других анализов. Предпочтительно, молекулы, которые специфически связываются с антигеном, не вступают в перекрестную реакцию с другими белками.

Подходящие «умеренно жесткие условия» включают предварительную промывку в растворе 5× SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при 50°C-65°C, 5× SSC в течение ночи; с последующей двукратной промывкой при 65°C в течение 20 минут каждым из 2×, 0,5× и 0,2× SSC, содержащим 0,1% SDS.

В контексте настоящего описания «очень жесткие условия» или «условия высокой жесткости» означают условия, при которых: (1) для промывки используются низкая ионная сила и высокая температура, например смесь 0,015М хлорида натрия/0,0015М цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°С; (2) во время гибридизации используются денатурирующий агент, такой как формамид, например 50% (об./об.) формамид, со смесью 0,1% бычий сывороточный альбумин/0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натрий-фосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) используется 50% формамид, 5× SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5× раствор Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с промывками при 42°C в 0,2× SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C, с последующей промывкой в условиях высокой жесткости, состоящих из 0,1×SSC, содержащего EDTA, при 55°C. Квалифицированному специалисту известно, как регулировать температуру, ионную силу и т.д., при необходимости, с учетом таких факторов, как длина зонда и т.п.

Связывающие белки, связывающие домены, CDR или антитела (в широком смысле этого слова) могут быть идентифицированы в соответствии с определениями по Кабат, Чотиа, определениями накопления как по Кабат, так и по Чотиа, определениями по AbM, определением контакта, определением по North и/или конформационному определению или с помощью любого метода определения CDR, хорошо известного в данной области. См., например, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (гипервариабельные области); Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989 (структурные петлевые структуры). Идентичность аминокислотных остатков в конкретном антителе, составляющих CDR, может быть определена с помощью методов, хорошо известных в данной области. Определение CDR с помощью AbM является компромиссом между определениями по Кабат и Чотиа, в котором используется программное обеспечение для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (Accelrys®). Определение «контакта» для CDR основано на наблюдаемых контактах с антигенами, описанными в MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. Определение «конформационный» в отношении CDR основано на остатках, которые вносят вклад в энтальпию при связывании антигена (см., например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008). North идентифицировал канонические конформации CDR, используя другой предпочтительный набор определений CDR (North et al., J. Mol. Biol. 406:228-256, 2011). В другом подходе, называемом в настоящем описании «конформационным определением» CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые вносят вклад в энтальпию при связывании антигена (Makabe et al., J Biol. Chem. 283:1156-1166, 2008). Тем не менее, другие определения границ CDR могут нестрого соответствовать одному из вышеперечисленных подходов, но, тем не менее, будут перекрываться по меньшей мере с частью CDR по Кабат, хотя они могут оказаться более короткими или более длинными в свете прогнозов или результатов эксперимента, согласно которым конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR не оказывают значительного влияния на связывание антигена. Используемый в настоящем описании термин CDR может относиться к CDR, определенным с помощью любого подхода, известного в данной области, включая комбинацию подходов. В применяемых в настоящем описании методах могут использоваться CDR, определенные в соответствии с любым из этих подходов. Для любого данного варианта осуществления, содержащего более одной CDR, CDR (или другой остаток антитела) могут быть определены в соответствии с любой из систем Кабат, Чотиа, расширенной (комбинации Кабат и Чотиа) системы, North, расширенной системы определений, определений AbM, контакта и/или конформационного определения.

Остатки в вариабельном домене нумеруют в соответствии с системой Кабат, которая представляет собой систему нумерации, используемую для вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи при составлении антител. См. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Используя эту систему нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может включать меньее количество или дополнительные аминокислотные остатки, соответствующие укорочению или вставке в FR или CDR вариабельной области. Например, вариабельная область тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52a по Кабат) после остатка H2 в положении 52 и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c по Кабат) после остатка в положении 82 в FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабат может быть определена для заданного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела относительно «стандартной» последовательности, пронумерованной по Кабат. Доступны различные алгоритмы присвоения нумерации по Кабат. В настоящем описании использован алгоритм, реализованный в версии 2.3.3 Abysis (www.abysis.org), для нумерации вариабельных областей VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 по Кабат. Положения конкретных аминокислотных остатков в антителе также могут быть пронумерованы по Кабат.

Используемый в настоящем описании термин «библиотека фагового дисплея» относится к популяции бактериофагов, каждая из которых содержит чужеродную кДНК, рекомбинантно слитую в рамке считывания с поверхностным белком. Фаг отображает на своей поверхности чужеродный белок, кодируемый кДНК. После репликации в бактериальном хозяине, обычно в E. coli, фаг, содержащий представляющую интерес чужеродную кДНК, отбирают путем экспрессии чужеродного белка на поверхности фага.

Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая может быть распознаваемой, вступать в контакт и/или связываться с антителом в одной или более антигенсвязывающих областях антитела, известных как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными участками антигена и иметь разные биологические эффекты. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и имеют определенные трехмерные структурные характеристики, а также характеристики удельного заряда. В контексте настоящего описания эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образуется пространственно расположенными аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп является эпитопом, образуемым соседними аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп на антигене.

Термин «антигенный эпитоп» в контексте настоящего описания определен как часть полипептида, с которой антитело может специфически связываться, определенная любым методом, хорошо известным в данной области техники, например, с помощью обычных иммуноанализов. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержит несмежные полипептиды (или аминокислоты) в антигенном белке, с которым связывается антитело, специфичное к эпитопу. После определения желаемого эпитопа на антигене можно генерировать антитела к этому эпитопу, например, с помощью методов, раскрытых в настоящем описании.

Термины «специфическое связывание» или «специфически связывающийся», когда используются в отношении взаимодействия антитела с белком или пептидом, относятся к взаимодействию, которое зависит от наличия конкретной структуры (т.е. антигенной детерминанты или эпитопа) на белке; другими словами, антитело распознает и связывается с конкретной структурой белка, а не с белком в целом. Например, если антитело является специфическим к эпитопу «А», присутствие белка, содержащего эпитоп А (или свободный немеченый А), в реакции, содержащей меченный «А» и антитело, уменьшает количество меченного А, связанного с антителом.

В некоторых вариантах осуществления «специфически связывается» означает, например, что антитело связывается с белком с KD, равным примерно 0,1 нМ или менее, но чаще менее примерно 1 мкМ. В некоторых вариантах осуществления «специфически связывается» означает, что антитело связывается с мишенью в одних случаях с KD по меньшей мере примерно 0,1 мкМ или менее, в других случаях по меньшей мере примерно 0,01 мкм или менее, и в других случаях по меньшей мере примерно 1 нМ или менее. Из-за идентичности последовательностей между гомологичными белками у разных видов специфическое связывание может включать антитело, которое распознает белок более чем одного вида (например, белок человека или белок мыши). Аналогичным образом, из-за гомологии в определенных областях полипептидных последовательностей различных белков, специфическое связывание может включать антитело, которое распознает более одного белка. Понятно, что в некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий фрагмент, который специфически связывается с первой мишенью, может специфически связываться или не связываться со второй мишенью. По существу, «специфическое связывание» не обязательно требует (хотя может включать) исключительное связывание, т.е. связывание с единственной мишенью. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело может специфически связываться с более чем одной мишенью. В некоторых вариантах осуществления с одним и тем же антигенсвязывающим участком на антителе могут связываться несколько мишеней. Например, в некоторых случаях антитело может содержать два идентичных антигенсвязывающих участка, каждый из которых специфически связывается с одним и тем же эпитопом на двух или более белках. В некоторых альтернативных вариантах осуществления антитело может быть полиспецифическим и содержать по меньшей мере два антигенсвязывающих участка с разными специфичностями. В качестве неограничивающего примера биспецифическое антитело может содержать один антигенсвязывающий участок, который распознает эпитоп на одном белке (например, CD3 человека), и дополнительно может содержать второй, другой антигенсвязывающий участок, который распознает другой эпитоп на втором белке. Обычно, но не обязательно, ссылка на связывание означает специфическое связывание.

Антитело, которое специфически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низким сродством, которое определяется с помощью анализов, известных в данной области, например, иммуноанализов, BIACORE™ или других анализов. Предпочтительно, антитело, которое специфически связывается с антигеном, не вступает в перекрестную реакцию с другими белками.

Термины «неспецифическое связывание» или «фоновое связывание», когда используются в отношении взаимодействия антитела и белка или пептида, относятся к взаимодействию, которое не зависит от наличия конкретной структуры (т.е. антитело связывается с белками в целом, а не с определенной структурой, такой как эпитоп).

Термин «k_on» или «k_a» в контексте настоящего описания относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном. В частности, константы скоростей (k_on/k_a и ko_ff/k_d) и константы равновесной диссоциации измеряют, используя цельные антитела (т.е. двухвалентные) и мономерные белки CD3.

Используемый в настоящем описании термин «k_off» или «k_d» относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

В контексте настоящего описания термин «K_D» относится к константе равновесной диссоциации взаимодействия антитело-антиген.

В контексте настоящего описания термин «сродство связывания» обычно относится к силе общих суммарных нековалентных взаимодействий между одним связывающим участком молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в контексте настоящего описания «сродство связывания» относится к истинному сродству связывания, которое отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Сродство молекулы X к ее партнеру Y как правило может быть представлено константой диссоциации (K_D). Сродство молекулы X к ее партнеру Y как правило может быть представлено константой диссоциации (K_D). Например, Kd может составлять примерно 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или более. Сродство можно измерить обычными методами, известными в данной области, включая раскрытые в настоящем описании. Антитела с низким сродством обычно связываются с антигеном медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как антитела с высоким сродством обычно связываются с антигеном быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известны различные методы измерения сродства связывания, любой из которых может быть использован для целей настоящего изобретения. В частности, термин «сродство связывания» означает скорость диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. K_D представляет собой отношение скорости диссоциации, также обозначаемой «(k_off)», к скорости ассоциации или «(k_on)». Таким образом, K_D равна k_off/k_on и выражается в виде молярной концентрации (M). Отсюда следует, что чем меньше значение K_D, тем сильнее сродство связывания. Следовательно, K_D, равная 1 мкМ, указывает на слабое сродство связывания по сравнению с K_D, равной 1 нМ. Значения K_D для антител могут быть определены с помощью методов, хорошо известных в данной области. Один из методов определения K_D антитела заключается в применении поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как правило выполняемого в биосенсорной системе, такой как система BIACORE^™. Кинетический анализ BIACORE™ включает анализ связывания и диссоциации антигена из чипов с иммобилизованными на их поверхности молекулами (например, молекулами, содержащими эпитопа-связывающие домены). Другой метод определения K_D антитела заключается в биослойной интерферометрии, обычно выполняемой с помощью системы OCTET® (система Octet QKe, ForteBio).

«Биологически активный», «биологическая активность» и «биологические характеристики» в отношении антитела по настоящему изобретению, например, антитела, его фрагмента или производного, означают наличие способности связываться с биологической молекулой, если не указано иное.

В контексте настоящего описания термины «нуклеиновые кислоты» и «нуклеотидные последовательности» включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), комбинации молекул ДНК и РНК или гибридные молекулы ДНК/РНК и аналоги молекул ДНК или РНК. Такие аналоги могут быть получены с использованием, например, нуклеотидных аналогов, которые включают, без ограничения, инозин или тритилированные основания. Такие аналоги также могут включать молекулы ДНК или РНК, содержащие модифицированные остовы, которые придают молекулам полезные свойства, такие как, например, устойчивость к нуклеазам или повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, могут содержать как одноцепочечные, так и двухцепочечные части и могут содержать трехцепочечные части, но предпочтительно представляют собой двухцепочечную ДНК.

Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, которые кодируют антитела по изобретению, включая полипептиды и связывающие области антител. Полинуклеотиды, кодирующие молекулы по настоящему изобретению, могут быть получены, и нуклеотидная последовательность полинуклеотидов может быть определена любым способом, известным в данной области.

Полинуклеотиды, которые кодируют антитела по настоящему изобретению, могут включать следующее: только кодирующую последовательность для варианта, кодирующую последовательность для варианта и дополнительные кодирующие последовательности, такие как функциональный полипептид или сигнальная или секреторная последовательность, или последовательность пропротеина; кодирующую последовательность для антитела и некодирующую последовательность, такую как интроны или некодирующая последовательность 5’ и/или 3’ кодирующей последовательности для антитела. Термин «полинуклеотид, кодирующий антитело» охватывает полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую последовательность для варианта, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. В данной области известно, что полинуклеотидная последовательность, оптимизированная для конкретной клетки-хозяина/системы экспрессии, может быть легко получена из аминокислотной последовательности желаемого белка (см. GENEART® AG, Regensburg, Germany).

Антитела по настоящему изобретению могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены или замены не относящихся к незаменимым аминокислот, которые не оказывают существенного влияния на функции полипептида. Будет ли переноситься конкретная замена, т.е. не будет ли она отрицательно влиять на желаемые биологические свойства, такие как активность связывания, можно определить, как описано Bowie, JU et al. Science 247:1306-1310, 1990 или Padlan et al. FASEB J. 9:133-139, 1995.

В контексте настоящего описания термин «консервативная аминокислотная замена» означает замену аминокислотного остатка на аминокислотный остаток, имеющий аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

В контексте настоящего описания «не относящийся к незаменимым» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен относительно последовательности связывающего агента дикого типа, например, антитела, не приводя при этом к отмене или существенному изменению биологической активности, тогда как «незаменимый» аминокислотный остаток приводит к такому изменению. В антителе незаменимый аминокислотный остаток может быть определяющим специфичность остатком (SDR).

Используемый в настоящем описании термин «выделенный» относится к материалу, который удален из своей исходной среды (например, из естественной среды, если он встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, который отделен от некоторых или всех материалов, сосуществующих с ним в естественной системе, является выделенным. Такой полинуклеотид может быть частью вектора и/или такой полинуклеотид или полипептид может быть частью композиции, например смеси, раствора или суспензии, или содержащей выделенную клетку или культивируемую клетку, которая содержит этот полинуклеотид или полипептид, и при этом он остается выделенным в том смысле, что вектор или композиция не являются частью его естественной среды. Например, полипептид, который синтезирован химическим путем или синтезируется в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в естественных условиях, будет «отделенным» от естественным образом связанных с ним компонентов. Белок также можно сделать практически свободным от компонентов, связанных с ними в естественных условиях, с помощью методов очистки белка, хорошо известных в данной области.

«Выделенное» или «очищенное» антитело практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клетки или ткани или среды, послуживших источником, из которых получен белок, или практически не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Выражение «по существу не содержит клеточного материала» включает препараты антитела, в которых полипептид/белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантно. Таким образом, антитело, которое практически не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее примерно 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% (по сухой массе) загрязняющего белка. Если антитело получено рекомбинантно, оно также предпочтительно практически не содержит культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее примерно 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% от объема белкового препарата. Если антитело получено с помощью химического синтеза, оно предпочтительно практически не содержит химических предшественников или других химикатов и реагентов, т.е. представляющее интерес антитело отделяют от химических предшественников или других химических веществ, которые участвуют в синтезе белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее примерно 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (по сухому весу) химических предшественников или соединений, отличных от представляющего интерес антитела. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела выделяют или очищают. Антитело, которое отделено или удалено по меньшей мере от одного компонента организма или ткани, или клетки, в которых это антитело существует или вырабатывается естественным путем, является «выделенным антителом» для целей настоящего изобретения.

Используемый в настоящем описании термин «извлечение» относится к процессу, который делает химическое вещество, такое как полипептид, по существу свободным от компонентов, связанных с ним в естественных условиях, путем выделения, например, методами очистки белка, хорошо известными в данной области.

В контексте настоящего описания термин «репликон» относится к любому генетическому элементу, такому как плазмида, хромосома или вирус, который ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотида внутри клетки.

Используемый в настоящем описании термин «функционально связанный» относится к ситуации, когда описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предполагаемым образом. Например, контрольную последовательность, «функционально связанную» с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, чтобы экспрессия кодирующей последовательности обеспечивалась в условиях, подходящих или совместимых с контрольной последовательностью. Обычно «функционально связанный» означает, что связываемые последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторного лидера они являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования удобных участков рестрикции. Если такие участки не существуют, используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Используемый в настоящем описании термин «вектор» означает конструкцию, которая способна доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более представляющих интерес генов или последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, без ограничения, вирусные векторы, векторы экспрессии голой ДНК или РНК, плазмидные векторы, космидные или фаговые векторы, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Используемый в настоящем описании термин «последовательность контроля экспрессии» или «контрольная последовательность» относится к полинуклеотидной последовательности, которая необходима для воздействия на экспрессию кодирующей последовательности, с которой она лигирована. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и терминаторы и, в некоторых случаях, энхансеры. Таким образом, термин «контрольная последовательность» предназначен для включения как минимум всех компонентов, присутствие которых необходимо для экспрессии, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является преимущественным, например лидерные последовательности.

«Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или была реципиентом вектора(ов), предназначенных для включения в них полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство необязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке из-за естественной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) по настоящему изобретению.

Используемый в настоящем описании термин «клетки млекопитающих» включает ссылку на клетки, полученные от млекопитающих, включая людей, крыс, мышей, морских свинок, шимпанзе или макак. Клетки можно культивировать in vivo или in vitro.

Используемый в настоящем описании термин «очищенный продукт» относится к препарату продукта, который был выделен из клеточных компонентов, с которыми продукт обычно ассоциирован, и/или из других типов клеток, которые могут присутствовать в представляющем интерес образце.

В контексте настоящего описания термин «по существу чистый» относится к материалу, который имеет чистоту по меньшей мере 50% (т.е. не содержит примесей), более предпочтительно чистоту по меньшей мере 90%, более предпочтительно чистоту по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно чистоту по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно чистоту по меньшей мере 99%.

Используемый в настоящем описании термин «лечить», «лечащий» или «лечение» представляет собой подход к получению полезных или желаемых клинических результатов. Для целей настоящего изобретения лечение определено как введение молекулы анти-CD3 антитела (например, моноклонального антитела, биспецифического антитела) субъекту, например пациенту, или введение, например, путем нанесения на выделенную ткань или клетку, полученную от субъекта, которую затем возвращают этому субъекту. Молекулу анти-CD3 антитела можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более агентами. Лечение может включать выздоровление, исцеление, облегчение, изменение, восстановление, ослабление, облегчение, смягчение, купирование или воздействие на расстройство, симптомы расстройства или предрасположенность к расстройству, например, раку.

Используемый в настоящем описании термин «субъект» включает любое животное (например, млекопитающее), включая, помимо прочего, людей, нечеловеческих приматов, грызунов и т.п., которое должно быть реципиентом конкретного лечения. Например, субъектом может быть пациент (например, пациент-человек или пациент, относящийся к ветеринарии), страдающий раком. Обычно термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются в настоящем описании взаимозаменяемо по отношению к человеку.

Согласно настоящему изобретению, термин «животные, не относящиеся к человеку» включает всех позвоночных, кроме человека, например, млекопитающих, не являющихся человеком, и немлекопитающих, таких как нечеловеческие приматы, овцы, собаки, коровы, куры, амфибии, рептилии, мыши, крыса, кролик или коза и т.д., если не указано иное.

Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый» относится к продукту или соединению, одобренному (или заслуживающему одобрения) регулирующим органом федерального правительства или правительства штата, или представленному в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее в списке для использования животными, включая людей.

В контексте настоящего описания термины «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или адъювант» или «фармацевтически приемлемый носитель» относятся к вспомогательному веществу, носителю или адъюванту, которые можно вводить субъекту вместе по меньшей мере с одним антителом по настоящему изобретению и который не нарушает активность антитела. Вспомогательное вещество, носитель или адъювант должны быть нетоксичными при введении с антителом в дозах, достаточных для оказания терапевтического эффекта.

Используемый в настоящем описании термин «ослабление» означает уменьшение или купирование одного или более симптомов по сравнению с тем, когда молекулы антитела по изобретению не вводятся. «Ослабление» также включает сокращение или уменьшение продолжительности проявления симптома.

В контексте настоящего описания термины «предотвращать», «предотвращающий» и «профилактика» относятся к профилактике рецидива или появления одного или более симптомов расстройства у субъекта благодаря введению профилактического или терапевтического агента.

В контексте настоящего описания «эффективное количество», «терапевтически эффективное количество», «терапевтически достаточное количество» или «эффективная доза» относятся к такому количеству терапевтического агента (например, анти-CD3 антитела, отдельно или как часть полиспецифического антитела (например, биспецифического)), которое является эффективным или достаточным при однократном или многократном введении дозы субъекту для профилактики, выздоровления, облегчения, ослабления или купирования заболевания, расстройства или побочного эффекта или для снижения скорости развития заболевание или расстройства, или в продлении состояния выздоровления, облегчения, смягчения или купирования раскрытого в настоящем описании расстройства у субъекта, сверх ожидаемого в отсутствие такого лечения. Этот термин также включает количество, эффективное для улучшения нормальной физиологической функции. Эффективное количество можно рассматривать в контексте введения одного или более терапевтических агентов, и можно считать, что один агент вводится в эффективном количестве, если при введении в комбинации с одним или более другими агентами может достигаться или достигается требуемый результат.

Используемый в настоящем описании эффективный агент способен нацеливаться на эффекторные Т-клетки, чтобы индуцировать опосредованную Т-клетками цитотоксичность клеток, связанных с заболеванием, таким как рак, аутоиммунное заболевание или инфекционное заболевание. Терапевтический агент по настоящему изобретению вызывает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками, путем модуляции антигена CD3 на поверхности Т-клеток, в частности CD3, более конкретно CD3-эпсилон.

Что касается рака, терапевтически эффективное количество относится к количеству терапевтического агента, которое подавляет рост опухоли или рака путем замедления, прерывания, купирования или остановки роста злокачественной опухоли и/или метастазов.

Эффективность является мерой активности терапевтического агента, выраженной в количестве, необходимом для получения эффекта заданной интенсивности. Сильнодействующий агент вызывает более сильный ответ при низких концентрациях по сравнению с агентом с более низкой эффективностью, который вызывает менее сильный ответ при низких концентрациях. Эффективность является функцией сродства и эффективности. Под эффективностью понимают способность терапевтического агента вызывать биологический ответ при связывании с целевым лигандом и количественная величина этого ответа. Используемый в настоящем описании термин «половина максимальной эффективной концентрации (ЕС₅₀)» относится к концентрации терапевтического агента, которая вызывает ответ, равный половине между исходным уровнем и максимумом, достигаемым после определенного времени воздействия. Терапевтический агент может вызывать ингибирование или стимуляцию. Величина EC₅₀ обычно используется, а также используется в настоящем описании, как мера эффективности.

Используемый в настоящем описании термин «комбинированная терапия» или введение «в комбинации с» относится к применению более чем одного профилактического и/или терапевтического агента. Использование термина «комбинированная терапия» или «в комбинации» не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят субъекту с расстройством. Другими словами, комбинированную терапию можно осуществлять в виде отдельного, последовательного или одновременного лечения терапевтическими агентами. В случае «последовательного введения» первый введенный агент может оказывать некоторое физиологическое действие на субъекта или стать более активным в организме субъекта при введении второго агента.

Термин «одновременное введение», используемый в контексте настоящего описания по отношению к введению профилактического и/или терапевтического агента, относится к введению агентов таким образом, чтобы каждый из агентов присутствовал в организме субъекта в одно и то же время. Одновременное введение может осуществляться с помощью молекул, находящихся в одной композиции или в отдельных композициях, вводимых в одно и то же или аналогичное время. Последовательное введение может осуществляться в любом порядке по мере необходимости.

Термин «кластер дифференцировки 3» или «CD3» относится к мультимерному белковому комплексу, исторически известному как комплекс Т3 и состоящему из четырех различных полипептидных цепей; эпсилон (ε), гамма (γ), дельта (δ) и дзета (ζ), которые собираются и функционируют в виде трех пар димеров (εγ, εδ, ζζ). Комплекс CD3 служит в качестве корецептора Т-клеток, который нековалентно связывается с рецептором Т-клеток (TCR) (Smith-Garvin et al. 2009) и генерирует сигнал активации в Т-лимфоцитах. Белковый комплекс CD3 является определяющим признаком Т-клеточной линии, поэтому анти-CD3 антитела могут эффективно использоваться в качестве маркеров Т-клеток (Chetty and Gatter 1994). Хорошо известно, что анти-CD3 антитела вызывают образование цитотоксических Т-клеток через активацию выработки эндогенных лимфокинов и способны избирательно уничтожать опухолевые мишени (Yun et al., Cancer Research, 49:4770-4774 (1989)).

Т-клетки играют центральную роль в клеточном иммунитете человека и животных. Распознавание и связывание конкретного антигена опосредовано TCR, экспрессируемыми на поверхности Т-клеток. TCR Т-клетки способен взаимодействовать с иммуногенными пептидами (эпитопами), связанными с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) и представленными на поверхности клеток-мишеней. Специфическое связывание TCR запускает сигнальный каскад внутри Т-клетки, ведущий к пролиферации и дифференцировке в созревшую эффекторную Т-клетку. Более конкретно, Т-клетки экспрессируют комплексы TCR, которые способны вызывать антиген-специфические иммунные ответы (Smith Garvin et al, 2009). Антигены представляют собой пептиды, экспрессируемые опухолевыми клетками и инфицированными вирусами клетками, способными стимулировать иммунные ответы. Внутриклеточно экспрессируемые антигены связываются с молекулами основного класса гистосовместимости I (MHC класса I) и транспортируются на поверхность, где они подвергаются воздействию Т-клеток. Если сродство связывания TCR с MHC класса I в комплексе с антигеном является достаточным, будет инициировано образование иммунного синапса. Передача сигналов через иммунный синапс осуществляется через корецепторы CD3, которые образуют димеры эпсилон/дельта, дельта/гамма и дзета/дзета. Эти димеры связываются с TCR и генерируют сигнал активации в Т-лимфоцитах. Этот сигнальный каскад направляет опосредованное Т-клетками уничтожение клеток, экспрессирующих антиген. Цитотоксичность опосредуется высвобождением и переносом гранзима В и перфорина из Т-клетки в клетку-мишень.

В контексте настоящего описания термин «активирующий Т-клеточный антиген» относится к антигенной детерминанте, экспрессируемой на поверхности Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, который способен индуцировать активацию Т-клеток при взаимодействии с антигенсвязывающей молекулой. В частности, взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с активирующим Т-клеточным антигеном может индуцировать активацию Т-клеток путем запуска сигнального каскада рецепторного комплекса Т-клеток. В конкретном варианте осуществления активирующий Т-клеточный антиген представляет собой CD3, в частности эпсилон-субъединицу CD3 (см. UniProt № P07766 (версия 130), NCBI RefSeq № NP_000724.1, SEQ ID NO: 66 для человеческой последовательности). Как правило, природный аллельный вариант имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95%, 97% или 99% идентичную белку, описанному в GenBank с номером доступа: BAB71849.1.

«Активация Т-клеток» в контексте настоящего описания относится к одному или более клеточным ответам Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, выбранным из: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксической эффекторной молекулы, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Активирующие Т-клетки биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению способны индуцировать активацию Т-клеток. Подходящие анализы для измерения активации Т-клеток известны в раскрытой в настоящем описании области.

В контексте настоящего описания «антитело, которое связывает CD3», «антитело, которое распознает CD3», «анти-CD3 антитело» или «CD3 антитело» включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически распознают одну субъединицу CD3 (например, эпсилон, дельта, гамма или дзета), а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически распознают димерный комплекс, состоящий из двух субъединиц CD3 (например, димеры гамма/эпсилон, дельта/эпсилон и дзета/дзета CD3). CD3-эпсилон человека указан в GenBank под номером доступа NM_000733. Антитела по настоящему изобретению могут связывать растворимый CD3 и/или экспрессируемый на клеточной поверхности CD3. Растворимый CD3 включает природные белки CD3, а также варианты рекомбинантных белков CD3, такие как, например, мономерные и димерные конструкции CD3, в которых отсутствует трансмембранный домен или которые иным образом не связаны с клеточной мембраной.

Антитела, направленные против CD3, способны генерировать сигнал активации в Т-лимфоцитах. Также могут быть использованы другие лиганды активации Т-клеток, включая, без ограничения, CD28, CD134, CD137 и CD27.

Настоящее изобретение включает одноплечевые антитела, связывающие CD3. Используемый в настоящем описании термин «одноплечевое антитело» означает антигенсвязывающую молекулу, содержащую одну тяжелую цепь антитела и одну легкую цепь антитела. Одноплечевые антитела по настоящему изобретению могут содержать любую из аминокислотных последовательностей VL/VH или CDR, указанные в настоящем описании в таблицах 1, 2 и 3.

Раскрытые в настоящем описании CD3-антитела могут содержать одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных и/или CDR областях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены антитела. Такие мутации можно легко установить путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые происходят из любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, где одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или участках CDR мутированы на соответствующий остаток(и) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или на соответствующий остаток(и) другой последовательности человеческой зародышевой линии, или подвергнуты консервативной аминокислотной замене соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности упоминаются в настоящем документе под общим названием «мутации зародышевой линии»). Специалист в данной области может легко получить из последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем описании, многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления все остатки каркасной области и/или CDR в доменах VH и/или VL мутированы обратно на остатки, обнаруживаемые в исходной последовательности зародышевой линии, из которой произошло антитело. В некоторых вариантах осуществления только определенные остатки мутированы обратно до исходной последовательности зародышевой линии, например, только мутированные остатки, присутствующие в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутированные остатки, присутствующие в CDR1, CDR2 или CDR3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления один или более остатков каркасной области и/или CDR мутированы на соответствующий остаток(и) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой изначально было получено антитело).

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасной области и/или областей CDR, например, в которых определенные отдельные остатки мутированы на соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, в то время как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии сохранены или мутированы на соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антител, которые содержат одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко протестированы на наличие одного или более желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенное сродство связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от обстоятельств), пониженная иммуногенность и т.д. Антитела, полученные таким обычным образом, входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также включает анти-CD3 антитела, содержащие варианты любой из описанных здесь аминокислотных последовательностей VH, VL и/или CDR, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает анти-CD3 антитела, имеющие аминокислотные последовательности VH, VL и/или CDR, например, с 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любых аминокислотных последовательностей VH, VL и/или CDR, представленных настоящем описании в таблице 1.

В контексте настоящего описания термин «комплекс» или «в комплексе» относится к ассоциации двух или более молекул, которые взаимодействуют друг с другом посредством связей и/или сил (например, ван-дер-ваальсовых, гидрофобных, гидрофильных сил), которые не являются пептидными связями. В одном из вариантов осуществления комплекс является гетеромультимерным. Следует понимать, что термин «белковый комплекс» или «полипептидный комплекс», используемый в настоящем описании, включает комплексы, которые имеют небелковую составляющую, конъюгированную с белком в белковом комплексе (например, включая, без ограничения, химические молекулы, такие как токсин или агент обнаружения).

В контексте настоящего описания термин «CD3 антитело» включает моновалентные антитела с одной специфичностью, а также «биспецифическое антитело», «антитело с двойной специфичностью», «триспецифическое антитело», «бифункциональное антитело», «гетеромультимер», «гетеромультимерный комплекс», «биспецифическое гетеродимерное диатело», «гетеромультимерный полипептид» или биспецифические гетеродимерные IgG. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD3 антитела по изобретению являются человеческими или гуманизированными антителами.

В контексте настоящего описания термин «биспецифическое антитело» представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, причем аминокислотная последовательность второго полипептида отличается от аминокислотной последовательности первого полипептида по меньшей мере одним аминокислотным остатком. В некоторых случаях биспецифическое антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные области тяжелой цепи и легкой цепи. Предпочтительно биспецифическое антитело имеет специфичность связывания по меньшей мере с двумя разными лигандами, антигенами или связывающими участками. Соответственно, биспецифические антитела могут одновременно связывать два разных антигена. Два антигенсвязывающих участка биспецифического антитела связываются с двумя разными эпитопами, которые могут находиться на одной и той же или разных белковых мишенях, например, опухолевой мишени.

В контексте настоящего описания первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь «биспецифического антитела» включают по меньшей мере одну VL область антитела и одну VH область антитела или их фрагмент, причем оба связывающих домена антитела содержатся в одной полипептидной цепи, и причем VL и VH области в каждой полипептидной цепи происходят из разных антител.

Биспецифические антитела могут происходить из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифических антител F(ab')₂). Диатела описаны более полно, например, в EP 404097; WO93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Биспецифические антитела представляют собой гетеродимеры двух «кроссоверных» фрагментов sFv, в которых области VH и VL двух антител присутствуют на разных полипептидных цепях.

В контексте настоящего описания термины «связанный», «слитый», «слияние», «ковалентно связанный» и «генетически слитый» используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к объединению вместе еще двух элементов или компонентов любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные методы. Используемый в настоящем описании термин «ковалентно связанный» означает, что указанные фрагменты либо непосредственно ковалентно связаны друг с другом, либо опосредованного ковалентно связаны друг с другом через промежуточный фрагмент или фрагменты, такие как связывающий пептид или фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления фрагменты являются ковалентно слитыми. Один из типов ковалентной связи представляет собой пептидную связь. Способы химической конъюгации (например, с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов) известны в данной области. Слитые фрагменты также могут быть генетически слитым. В контексте настоящего описания термин «генетически связанный» или «генетически слитый» относится к ковалентному связыванию или присоединению в одну линию двух или более белков, полипептидов или фрагментов через их индивидуальные пептидные скелеты, посредством генетической экспрессии одной полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки, полипептиды или фрагменты. Такое генетическое слияние приводит к экспрессии одной непрерывной генетической последовательности. Предпочтительные генетические слияния находятся в рамке считывания, т.е. две или более открытых рамки считывания (ORF) сливаются с образованием непрерывной более длинной рамки считывания с сохранением правильной рамки считывания исходных ORF. Таким образом, полученный рекомбинантный слитый белок представляет собой один полипептид, содержащий два или более белковых сегмента, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ORF (эти сегменты обычно не соединены таким образом в природе). В этом случае отдельный полипептид расщепляется во время процессинга с образованием димерных молекул, содержащих две полипептидные цепи.

В контексте настоящего описания термин «связанный» или «связи» относится либо к соединению, состоящему из непосредственной пептидной связи между первой и второй аминокислотной последовательностью, либо к соединению, которое включает третью аминокислотную последовательность, связанную пептидной связью с первой и второй аминокислотными последовательностями и расположенную между ними. Например, линкерный пептид, связанный с С-терминальным концом одной аминокислотной последовательности и с N-терминальным концом другой аминокислотной последовательности.

Используемый в настоящем описании термин «линкер» относится к аминокислотной последовательности длиной от двух или более аминокислот. Линкер может состоять из нейтральных полярных или неполярных аминокислот. Линкер может иметь в длину, например, от 2 до 100 аминокислот, например от 2 до 50 аминокислот, например, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, или 50 аминокислот в длину. Линкер может быть «расщепляемым», например, путем авторасщепления или ферментативного или химического расщепления. Участки расщепления в аминокислотных последовательностях и ферменты и химические вещества, которые расщепляют такие участки, хорошо известны в данной области и также раскрыты в настоящем описании.

В контексте настоящего описания термин «дисульфидная связь» или «цистеин-цистеиновая дисульфидная связь» относится к ковалентному взаимодействию между двумя цистеинами, при котором атомы серы цистеинов окисляются с образованием дисульфидной связи. Средняя энергия связи в дисульфидной связи составляет примерно 60 ккал/моль по сравнению с 1-2 ккал/моль в случае водородной связи. В контексте настоящего изобретения цистеины, которые образуют дисульфидную связь, находятся в каркасных областях одноцепочечного антитела и служат для стабилизации конформации антитела. Остатки цистеина могут быть введены, например, путем сайт-направленного мутагенеза, так что внутри молекулы могут быть образованы стабилизирующие дисульфидные связи.

Обозначение «выступ-во-впадину» аналогично обозначению «выпуклость и полость» и могут использоваться синонимично.

«Выпуклость» или «выступ» относится по меньшей мере к одной аминокислотной боковой цепи, которая выступает на поверхности контакта (границе раздела) первого полипептида и, следовательно, может располагаться в компенсаторной полости на соседней поверхности контакта (т.е. на поверхности контакта второго полипептида), обеспечивая стабилизацию гетеродимера и, таким образом, способствуя образованию гетеродимера, а не гомодимера, например. Выпуклость может находиться на исходной поверхности контакта или может быть введена синтетически (например, путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей поверхность контакта). Обычно нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность контакта первого полипептида, модифицируют таким образом, чтобы она кодировала выпуклость. Для достижения этого нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один «исходный» аминокислотный остаток на поверхности контакта первого полипептида, заменяют нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один «импортированный» аминокислотный остаток, имеющий более объемную боковую цепи по сравнению с исходным аминокислотным остатком. Верхний предел количества заменяемых исходных остатков равен общему количеству остатков на поверхности контакта первого полипептида. Некоторые импортируемые остатки для образования выпуклости обычно представляют собой встречающиеся в природе аминокислотные остатки, и их предпочтительно выбирают из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).

Выпуклость или выступ является «помещаемым» во впадину или полость, что означает, что пространственное расположение выпуклости и полости на поверхности контакта первого полипептида и второго полипептида соответственно, а также размеры выпуклости и полости таковы, что выпуклость может быть расположена внутри полости, не нарушая нормальную ассоциацию первого и второго полипептидов на поверхности контакта. Поскольку выпуклости, такие как фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W), обычно не расположены перпендикулярно оси поверхности контакта, выравнивание выпуклости с соответствующей полостью основано на моделировании пары выпуклость/полость, исходя из трехмерной структуры, например, полученной с помощью рентгеновской кристаллографии или ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Это может быть достигнуто с помощью методов, общедоступных в данной области техники.

«Полость» или «впадина» относится по меньшей мере к одной аминокислотной боковой цепи, которая углублена относительно поверхности контакта второго полипептида и, следовательно, вмещает соответствующий выступ на соседней поверхности контакта первого полипептида. Полость может находиться на исходной поверхности контакта или может быть введена синтетически (например, путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей поверхность контакта). Обычно нуклеиновую кислоту, кодирующую поверхность контакта второго полипептида, изменяют, чтобы она кодировала полость. Для достижения этого нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один «исходный» аминокислотный остаток на поверхности контакта второго полипептида, заменяют ДНК, кодирующей по меньшей мере один «импортированный» аминокислотный остаток с менее объемной боковой цепью по сравнению с исходным аминокислотным остатком. Верхний предел количества заменяемых исходных остатков равен общему количеству остатков на поверхности контакта второго полипептида. Некоторые импортируемые остатки для образования полости обычно представляют собой встречающиеся в природе аминокислотные остатки, и их предпочтительно выбирают из аланина (A), серина (S), треонина (T) и валина (V).

«Целевой антиген (антиген-мишень)», «целевой клеточный антиген», «опухолевый антиген» или «опухолеспецифический антиген» в контексте настоящего описания относятся к антигенной детерминанте, представленной на поверхности целевой клетки, например клетки в опухоли, такой как раковая клетка или клетка стромы опухоли.

В контексте настоящего описания термин «раковый» или «злокачественный» относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток, новообразованием или опухолью, возникающей в результате аномального неконтролируемого роста клеток. В некоторых аспектах рак относится к злокачественной первичной опухоли без метастазов, которая остается локализованной. В других аспектах рак относится к злокачественной опухоли, которая вторглась и разрушила соседние структуры тела и распространилась на отдаленные участки. В некоторых аспектах рак связан со специфическим раковым антигеном. Примеры рака включают, без ограничения, рак полости рта и глотки, пищеварительной системы (например, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, печени, желчного пузыря, желчных протоков и поджелудочной железы), дыхательной системы (например, гортани, легких и бронхов, включая немелкоклеточный рак легких), костей и суставов (например, метастазы в костях), мягких тканей, кожи (например, меланома), груди, половых органов (например, шейки матки, тела матки, вульвы яичников, влагалища, простаты и яичка), мочевыделительной системы (например, мочевого пузыря, почек, почечной лоханки и мочеточника), глаза и глазной орбиты, мозга и нервной системы (например, глиома), головы и шеи или эндокринной системы (например, щитовидной железы). Рак также может представлять собой лимфому (например, болезнь Ходжкина и неходжкинскую лимфому), множественную миелому или лейкоз (например, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфолейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз и т.п.). В некоторых вариантах осуществления рак пищеварительной системы представляет собой рак пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, печени, желчного пузыря, желчных протоков и поджелудочной железы.

Что касается рака, лечение полезно в любом одном или более из следующих случаев: (а) лечение, профилактика или облегчение одного или более симптомов состояния, ассоциированного со злокачественными клетками у субъекта (например, рака желудочно-кишечного тракта, такого как колоректальный рак (CRC)); (b) подавление роста или прогрессирование опухоли у субъекта, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую опухолевый антиген; (c) ингибирование метастазирования раковых (злокачественных) клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, у субъекта, содержащего одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих опухолевый антиген; (d) индукцию регрессии (например, долговременной регрессии) опухоли, экспрессирующей опухолевый антиген; (e) проявление цитотоксической активности в злокачественных клетках, экспрессирующих опухолевый антиген; (f) увеличение выживаемости субъекта, страдающего ассоциированным с опухолевым антигеном расстройством, без прогрессирования заболевания; (g) увеличение общей выживаемости субъекта, страдающего расстройством, ассоциированным с опухолевым антигеном; (h) сокращение использования дополнительных химиотерапевтических или цитотоксических агентов субъектом, страдающим расстройством, ассоциированным с опухолевым антигеном; (i) снижение опухолевой нагрузки у субъекта, страдающего расстройством, ассоциированным с опухолевым антигеном; или (j) блокирование взаимодействия опухолевого антигена с другими еще не идентифицированными факторами. Не ограничиваясь какой-либо теорией, считается, что лечение приводит к подавлению роста, деструкции или уничтожению клетки in vitro или in vivo или снижению иным образом способности клетки, включая аберрантную клетку, опосредовать расстройство, например, раскрытое в настоящем описании расстройство, такое как рак.

Используемый в настоящем описании термин «злокачественная клетка» или «злокачественное новообразование» относится к опухолям или опухолевым клеткам, которые являются инвазивными и/или способны метастазировать, т.е. к раковой клетке.

Хотя на практике или при тестировании, или тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые материалы и методы, подобные или эквивалентные раскрытым в настоящем описании, ниже приведено описание предпочтительных материалов и методов.

Материалы и методы

Описаны различные методы получения антител, которые включают традиционный метод гибридом для получения моноклональных антител, рекомбинантные методы для получения антител (включая химерные антитела, например, гуманизированные антитела), продуцирование антител в организме трансгенных животных и недавно описанную технологию фагового дисплея для получения «полностью человеческих» антител. Эти методы кратко описаны ниже.

Поликлональные антитела к представляющему интерес антигену обычно можно получить у животных путем нескольких подкожных (sc) или внутрибрюшинных (ip) инъекций антигена и адъюванта. Антиген (или фрагмент, содержащий целевую аминокислотную последовательность) может быть конъюгирован с белком, который является иммуногенным для видов, подлежащих иммунизации, например, с сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина) или N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина). Животных иммунизируют против иммуногенных конъюгатов или производных, и через несколько недель животных повторно иммунизируют введением подкожной инъекции в несколько участков. Спустя 7-14 дней у животных берут кровь, и анализируют сыворотку на титр антител. Животным вводят бустерную инъекцию до достижения плато титра. Предпочтительно животным вводят бустерную инъекцию конъюгата одного и того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или с помощью другого сшивающего реагента. Конъюгаты также могут быть получены в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Для усиления иммунного ответа также используются способствующие агрегации агенты, такие как квасцы.

Моноклональные антитела могут быть получены из популяции по существу гомогенных антител с помощью метода гибридом, впервые описанного Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975, или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (Cabilly et al., патент США № 4816567). В методе гибридом мышь или другое подходящее животное-хозяин иммунизируют, как описано выше, для получения лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, специфически связывающиеся с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с помощью подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, с образованием гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Полученные таким образом гибридомные клетки засевают и выращивают в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских миеломных клеток. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo как асцитные опухоли у животных. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим образом отделяют от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, белок А-сефароза, гидроксиапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

Экспрессия антитела, антигенсвязывающих фрагментов антитела или любой конструкции антитела может осуществляться в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки CHO, клетки NSO, клетки SP2/0, клетки HEK293, клетки COS, клетки PER.C6, дрожжевые клетки или клетки E.coli, и секретируемое антитело выделяют и собирают из клеток (супернатанта клеточной культуры, кондиционированного супернатанта клеточной культуры, клеточного лизата или осветленной массы). Общие методы получения антител хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в обзорных статьях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1986; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16:151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880, 1998. В конкретном варианте осуществления культура клеток представляет собой культуру клеток млекопитающих, такую как культура клеток яичника китайского хомячка (СНО).

В одном из вариантов осуществления антитело можно выделить или изолировать из источника, в котором оно продуцируется в природе. В некоторых таких вариантах осуществления изолированные или выделенные антитела можно подвергнуть дополнительным стадиям очистки с помощью обычных методов хроматографии, известных в данной области. В частности, предполагается, что методы очистки включают, без ограничения, аффинную хроматографию (например, аффинную хроматографию с белком A), ионообменную хроматографию (например, анионообменную хроматографию или катионообменную хроматографию), хроматографию гидрофобного взаимодействия, гидроксиапатитную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию и/или диализ. Среди них предпочтительным методом очистки является хроматография с белком А. Матрица, к которой присоединен аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, но доступны и другие матрицы.

В данной области также известны другие методы очистки антител, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, хроматография под высоким давлением на колонках с обращенной фазой, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарин-сефарозе™, хроматография на анионной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE-электрофорез и осаждение сульфатом аммония. Вышеприведенный список методов очистки носит лишь иллюстративный характер и не предназначен в качестве исчерпывающего перечисления.

Альтернативно, можно получить трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный репертуар человеческих антител, не продуцируя при этом эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена области соединения тяжелой цепи антитела (J.sub.H) у химерных и мышей, несущих мутантную зародышевую линию, приводит к полному подавлению продуцирования эндогенных антител. Перенос массива генов иммуноглобулина человеческой зародышевой линии таким мышам с мутантной зародышевой линией приведет к продуцированию человеческих антител после заражения антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Акад. Sci. USA 90:2551-255; 1993 и Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут быть гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других благоприятных биологических свойств. Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны в данной области. Гуманизацию по существу можно выполнять, следуя методу Винтера и др. (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) путем замены CDR или последовательностей CDR грызунов соответствующими последовательностями человеческого антитела. Соответственно, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (Cabilly, см. выше), в которых по существу существенно меньшая часть относительно интактного человеческого вариабельного домена заменена соответствующей последовательностью, полученной из вида, не относящегося к человеку. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов. Важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела получают путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с помощью трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательности-кандидата иммуноглобулина, т.е. проанализировать остатки, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны из консенсусной и импортируемой последовательностей и объединены таким образом, чтобы была получена требуемая характеристика антитела, такая как повышенное сродство к целевому антигену(ам). Для получения дополнительных сведений см. WO92/22653, опубликованную 23 декабря 1992 г.

Антитела по настоящему изобретению также можно получить с помощью различных способов фагового дисплея, известных в данной области. В методах фагового дисплея функциональные домены антител отображаются на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В конкретном аспекте такой фаг можно использовать для отображения антигенсвязывающих доменов, таких как Fab и Fv, или Fv, стабилизированного дисульфидными связями, экспрессируемых из репертуара или библиотеки комбинаторных антител (например, человеческих или мышиных). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывается с представляющим интерес антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например, с помощью меченого антигена или антигена, связанного или захваченного на твердой поверхности или грануле. Фаг, используемый в этих методах, обычно представляет собой нитчатый фаг, включая fd и M13. Антигенсвязывающие домены экспрессируются в виде рекомбинантно слитого белка либо с белком гена III, либо гена VIII фага. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения иммуноглобулинов или их фрагментов по настоящему изобретению, включают методы, раскрытые у Brinkmann et al. «Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments,» J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995.

Функциональные характеристики нескольких изотипов IgG и их доменов хорошо известны в данной области. Аминокислотные последовательности IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 известны в данной области. Выбор и/или комбинирование двух или более доменов из конкретных изотипов IgG для использования в способах по изобретению можно выполнять на основе любого известного параметра родительских изотипов, включая сродство к FcγR. Например, применение областей или доменов из изотипов IgG, которые демонстрируют ограниченное связывание или отсутствие такого связывания с FcγRIIB, например IgG2 или IgG4, может найти конкретное применение в тех случаях, когда требуется максимальное связывание сконструированного биспецифического антитела с активирующим рецептором и минимальное связывание с ингибирующим рецептором. Аналогичным образом, использование цепей Fc или доменов из изотипов IgG, которые, как известно, предпочтительно связываются с C1q или FcγRIIIA, например IgG3, можно комбинировать с модификациями аминокислот Fc, известными в данной области, для усиления антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) для создания биспецифического антитела, демонстрирующего максимальную активность эффекторной функции, например активацию комплемента или ADCC. Аналогично, могут быть выполнены мутации в цепях Fc или доменах изотипов IgG, которые минимизируют или устраняют эффекторную функцию цепи Fc.

В процессе открытия создание и определение характеристик антител может пролить свет на информацию о желаемых эпитопах. Затем на основе этой информации можно провести конкурентный скрининг антител на связывание с тем же эпитопом. Одним из подходов для достижения этой цели заключается в проведении конкурентного и перекрестно-конкурентного анализа для поиска антител, которые конкурируют или перекрестно конкурируют друг с другом, например, антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Один из методов заключается в идентификации эпитопа, с которым связываются антитела, или «картирование эпитопа». Существует несколько методов, известных в данной области для картирования и описания положения эпитопов на белках, включая определение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии генных фрагментов и анализы на основе синтетических пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. В качестве дополнительного примера, можно использовать картирование эпитопа для определения последовательности, с которой связывается антитело. Картирование эпитопов коммерчески доступно из различных источников, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). В качестве еще одного примера, для идентификации остатков, требуемых, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа можно использовать метод мутагенеза антигенсвязывающего домена, эксперименты по обмену доменами и мутагенез по методу аланинового сканирования. Сродство связывания и скорость взаимодействия антигенсвязывающего домена можно определить с помощью анализов конкурентного связывания. Одним из примеров анализа конкурентного связывания является радиоиммуноанализ, включающий инкубацию меченого антигена и обнаружение молекулы, связанной с меченым антигеном. Сродство молекулы по настоящему изобретению к антигену и скорости диссоциации для связывания можно определить по данным насыщения с помощью анализа Скэтчарда.

Сродство и связывающие свойства антител по настоящему изобретению с антигеном могут быть первоначально определены с помощью известных в данной области техники анализов in vitro (биохимических или иммунологических анализов) для антигенсвязывающего домена, включая, без ограничения, иммуноферментный (ELISA) анализ, анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR), биослойную интерферометрию или тесты иммунопреципитации. Молекулы по настоящему изобретению могут иметь связывающие свойства в in vivo моделях (например, описанных и раскрытых в данном документе), сходные таковыми, полученными на основе in vitro анализов. Однако настоящее изобретение не исключает молекулы по изобретению, которые не проявляют требуемый фенотип в in vitro анализах, но демонстрируют требуемый фенотип in vivo.

После получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулы по изобретению (т.е. связывающих доменов), вектор для продуцирования молекул может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с помощью методов, хорошо известных в данной области.

Полинуклеотиды, кодирующие связывающие домены антитела по настоящему изобретению, могут включать полинуклеотидную последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующими последовательностями антитела, включая естественно ассоциированные или гетерологичные промоторные области, известные в данной области. Последовательности контроля экспрессии могут быть эукариотическими промоторными системами в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева, но также можно использовать последовательности контроля прокариотических хозяев. После включения вектора в соответствующую линию клеток-хозяев клетку-хозяина размножают в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей и, при необходимости, для сбора и очистки антител. Линии эукариотических клеток включают клеточные линии CHO, различные клеточные линии COS, клетки HeLa, клеточные линии миеломы, трансформированные B-клетки или клеточные линии эмбриональной почки человека.

В одном из вариантов осуществления ДНК, кодирующая антитела по изобретению, выделяют и секвенируют, используя обычные процедуры (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Клетки гибридомы по изобретению служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки CHO или клетки миеломы, которые иным образом не продуцируют белок иммуноглобулина, для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей, Morrison et al., Proc. Nat. Акад. Sci. 81:6851, 1984. Таким образом получают химерные антитела, которые демонстрируют специфичность связывания антигена, характерную для раскрытых в настоящем описании моноклональных антител.

CD3 антитела

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к агентам, которые специфически связываются с CD3 (например, полноразмерной субъединицей CD3-эпсилон человека (например, с номером доступа NP_000724 или SEQ ID NO: 66)).

В некоторых вариантах осуществления анти-CD3 антитело специфически связывается с человеческим CD3.

Типичные CD3 антитела по настоящему изобретению перечислены в описании в таблицах 1, 2 и 3. В таблице 1 представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей VH областей и VL областей. В некоторых вариантах осуществления предложено антитело, имеющее любую из неполных последовательностей легкой цепи, перечисленных в Таблице 1, и/или любую из неполных последовательностей тяжелой цепи, перечисленных в Таблице 1.

Таблица 1

Вариант	Легкая цепь	Тяжелая цепь
2B5-0001 (2B5 антитело)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 1)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2)
2B5-0002	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2)
2B5-0006 (2B5v6)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)
2B5-0009	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRAQGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 5)
2B5-0517	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 6)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHQPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7)
2B5-0522	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 8)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHQPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7)
2B5-0533	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 6)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)
2B5-0538	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 8)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)
2B5-0598	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 9)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQDRGYTSDHQPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10)
2B5-0623	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 9)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHQPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 7)
2B5-0707	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYYLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 11)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRHSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 12)
2B5-0003	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 34)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 35)
H2B4	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 85)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2)
2B5-1038	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 9)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)
2B5-1039	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 87)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)
2B5-1040	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 89)	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)

В таблице 1 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR по Кабат, а жирным шрифтом - по Чотиа.

В изобретении предложены участки CDR анти-CD3 антител (включая CDR по Чотиа, Кабат и контактные области CDR). Способы и методы идентификации CDR в аминокислотных последовательностях VH и VL хорошо известны в данной области и могут использоваться для идентификации CDR в конкретных аминокислотных последовательностях VH и/или VL, раскрытых в настоящем описании. Примерные условные обозначения, которые можно использовать для идентификации границ CDR, включают, например, определение по Кабат, определение по Чотиа и определение AbM. В общих чертах, определение по Кабат основано на вариабельности последовательности, определение по Чотиа основано на расположении регионов структурной петли, а определение AbM представляет собой компромисс между подходами по Кабат и Чотиа. См., например, Kabat, «Sequences of Proteins of Immunological Interest,» National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et ai, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et ai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Для идентификации последовательностей CDR в антителе также имеются общедоступные базы данных. Понятно, что в некоторых вариантах осуществления CDR могут представлять собой комбинацию CDR по Кабат и Чотиа (также называемые «комбинированными CDR» или «расширенными CDR»). В некоторых вариантах осуществления CDR представляют собой CDR по Кабат. В некоторых дополнительных вариантах осуществления CDR представляют собой CDR по Чотиа. Другими словами, в вариантах осуществления с более чем одним CDR, эти CDR могут быть любыми из CDR по Кабат, Чотиа, комбинированных CDR или их комбинаций. В таблицах 2 и 3 представлены примеры последовательностей CDR по изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим аминокислотную последовательность, которая приведена в Таблице 1, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательностей.

В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VL область, содержащую аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей VL областей, перечисленных в таблице 1, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В некоторых других таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VH область, содержащую аминокислотную последовательность любой из аминокислотных последовательностей VH областей, перечисленных в таблице 1, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, идентичность по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В одном из вариантов осуществления предоставляется антитело, которое специфически связывается с CD3, причем указанное антитело содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область один VH (VH CDR1), определяющую комплементарность область два VH (VH CDR2) и определяющую комплементарность область три VH (VH CDR3) последовательности VH c SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 или 35; и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область один VL (VL CDR1), определяющую комплементарность область два VL (VL CDR2) и определяющую комплементарность область три VL (VL CDR3) последовательности VL c SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 или 89.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, содержащему набор из шести CDR (т.е. VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей VL/VH, как определено для любого из типичных анти-CD3 антител, перечисленных в таблице 1.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим набор аминокислотных последовательностей VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3, VH CDR1, VH CDR2 или VH CDR3, содержащихся в паре аминокислотных последовательностей VL/VH, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 2 (например, 2B5-0001 (2B5)); SEQ ID NO: 3 и 2 (2B5-0002); SEQ ID NO: 3 и 4 (например, 2B5-0006 (2B5v6)); SEQ ID NO: 3 и 5 (например, 2B5-0009); SEQ ID NO: 6 и 7 (например, 2B5-0517); SEQ ID NO: 8 и 7 (например, 2B5-0522); SEQ ID NO: 6 и 4 (например, 2B5-0533); SEQ ID NO: 8 и 4 (например, 2B5-0538); SEQ ID NO: 9 и 10 (например, 2B5-0598); SEQ ID NO: 9 и 7 (например, 2B5-0623); SEQ ID NO: 11 и 12 (например, 2B5-0707); SEQ ID NO: 34 и 35 (например, 2B5-0003); SEQ ID NO: 85 и 2 (например, H2B4); SEQ ID NO: 9 и 4 (например, 2B5-1038); SEQ ID NO: 87 и 4 (например, 2B5-1039); и SEQ ID NO: 89 и 4 (например, 2B5-1040). В таблице 2 представлены области VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 типичных анти-CD3 антител.

Таблица 2

Вариабельная область тяжелой цепи
mAb	VH CDR1	VH CDR2	VH CDR3
2B5-0001 (2B5)	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNRARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 16) (Кабат) RNRARGYT (SEQ ID NO: 17) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0002	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15)	FIRNRARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 16) (Кабат) RNRARGYT (SEQ ID NO: 17) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0006 (2B5v6)	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа);	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0009	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNRAQGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 21) (Кабат) RNRAQGYT (SEQ ID NO: 22) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0517	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFS DY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHQPSVKG (SEQ ID NO: 23) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0522	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHQPSVKG (SEQ ID NO:23) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0533	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0538	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFS DY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0598	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQDRGYTSDHQPSVKG (SEQ ID NO: 24) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0623	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFS DY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHQPSVKG (SEQ ID NO: 23) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-0707	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRHSYYVLDY (SEQ ID NO: 25)
2B5-0003	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
H2B4	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNRARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 16) (Кабат) RNRARGYT (SEQ ID NO: 17) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-1038	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-1039	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)
2B5-1040	DYYMT (SEQ ID NO: 13) (Кабат) GFTFSDY (SEQ ID NO: 14) (Чотиа) GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 15) (расширенное)	FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 19) (Кабат) RNQARGYT (SEQ ID NO: 20) (Чотиа)	DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 18)

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VH CDR1, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VH CDR1, перечисленных в Таблице 2, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VH CDR2, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VH CDR2, перечисленных в Таблице 2, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VH CDR3, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VH CDR3, перечисленных в Таблице 2, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В таблице 3 представлены VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 типичных анти-CD3 антител.

Таблица 3

Вариабельная область легкой цепи
mAb	CDR 1	CDR 2	CDR 3
2B5-0001 (2B5)	TSSQSLFNVRSRKNYLA (SEQ ID NO: 26)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0002	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0006 (2B5v6)	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0009	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0517	TSSQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 30)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0522	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0533	TSSQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 30)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0538	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0598	TSDQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 32)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0623	TSDQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 32)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-0707	TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 29)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYYLFT (SEQ ID NO: 33)
2B5-0003	TSSQSLFNVRSRKNYLA (SEQ ID NO: 26)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
H2B4	TSSQSLFNVRSRKNYLA (SEQ ID NO: 26)	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-1038	TSDQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 32)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-1039	TSSESLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 91)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)
2B5-1040	TSSQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 92)	WASDRES (SEQ ID NO: 31)	KQSYDLFT (SEQ ID NO: 28)

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VL CDR1, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VL CDR1, перечисленных в таблице 3, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителам, содержащим VL CDR2, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VL CDR2, перечисленных в таблице 3, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, содержащему VL CDR3, содержащую любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VL CDR3, перечисленных в Таблице 3, или по существу аналогичную ей последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с CD3, причем указанное антитело содержит: (а) вариабельную область (VH) тяжелой цепи (HC), содержащую определяющую комплементарность область один VH (CDR1), определяющую комплементарность область два VH (VH CDR2) и определяющую комплементарность область три VH (VH CDR3) последовательности VH, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 10, 12 и 35; и/или (b) вариабельную (VL) область легкой цепи (LC), содержащую определяющую комплементарную область один VL (VL CDR1), определяющую комплементарную область два VL (VL CDR2) и определяющую комплементарную область три VL (VL CDR3) последовательности VL, имеющей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 9, 11, 34, 87 и 89.

В конкретных вариантах осуществления антитело содержит: (а) область VH, содержащую (i) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15; (ii) VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23 или 24; и (iii) VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 или 25; и/или (b) область VL, содержащую (i) VL CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 26, 29, 30, 32, 91 или 92; (ii) VL CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27 или 31; и (iii) VL CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28 или 33.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с CD3 и конкурирует с антителом, раскрытом в настоящем описании, включая 2B5-0001 (2B5), 2B5-0002, 2B5-0006 (2B5v6), 2B5-0009, 2B5-0517, 2B5-0522, 2B5-0533, 2B5-0538, 2B5-0598, 2B5-0623, 2B5-0707, 2B5-0003, 2B5-1038, 2B5-1039 и 2B5-1040.

В некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к участкам CDR анти-CD3 антител на основе контактных областей CDR. Контактные области CDR представляют собой области антитела, которые придают антителу специфичность к антигену. Как правило, контактные области CDR включают положения остатков в CDR и зонах Вернье, которые ограничены с целью сохранения правильной структуры петли антитела, связывающегося с конкретным антигеном. См., например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007. Определение контактных областей CDR хорошо известно специалистам в данной области.

Некоторые из представленных в настоящем описании анти-CD3 антител могут иметь более чем одно название. Например, 2B5-0001 может называться 2B5 или h2B5; а 2B5-0006 может называться 2B5v6 или h2B5v6. В таблице 4 показан формат антитела и область анти-CD3 антитела, присутствующая в антителах по настоящему изобретению.

Таблица 4

Последовательность	Описание	Формат	Область анти-CD3 нтитела
2B5-0001 (2B5)	CD3 антитело	IgG	2B5-0001
2B5-0002	CD3 антитело	IgG	2B5-0002
2B5-0003	CD3 антитело	IgG	2B5-0003
2B5-0006 (2B5v6)	CD3 антитело	IgG	2B5-0006
2B5-0009	CD3 антитело	IgG	2B5-0009
2B5-0517	CD3 антитело	IgG	2B5-0517
2B5-0522	CD3 антитело	IgG	2B5-0522
2B5-0533	CD3 антитело	IgG	2B5-0533
2B5-0538	CD3 антитело	IgG	2B5-0538
2B5-0598	CD3 антитело	IgG	2B5-0598
2B5-0623	CD3 антитело	IgG	2B5-0623
2B5-0707	CD3 антитело	IgG	2B5-0707
2B5-1038	CD3 антитело	IgG	2B5-1038
2B5-1039	CD3 антитело	IgG	2B5-1039
2B5-1040	CD3 антитело	IgG	2B5-1040
H2B4	CD3 антитело	IgG	H2B4
GUCY2C-H2B4	CD3-GUCY2c биспецифическое антитело	CD3 биспецифическое	H2B4
GUCY2C-2B5	CD3-GUCY2c биспецифическое антитело	CD3 биспецифическое	2B5-0001
GUCY2C-2B5v6	CD3-GUCY2c биспецифическое антитело	CD3 биспецифическое	2B5-0006
xFLT3-2B5v6	CD3-FLT3 биспецифическое антитело	CD3 биспецифическое	2B5-0006

Сродство связывания (K_D) раскрытых в настоящем описании анти-CD3 антител (например, CD3-эпсилон человека (например, SEQ ID NO: 40)) может составлять от примерно 0,001 нМ до примерно 6500 нМ. В некоторых вариантах осуществления сродство связывания может иметь любую из следующих величин, равных примерно 6500 нМ, 6000 нМ, 5500 нМ, 4500 нМ, 4000 нМ, 3500 нМ, 3000 нМ, 2500 нМ, 2000 нМ, 1500 нМ, 1000 нМ, 750 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5,5 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,3 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 0,002 нМ или 0,001 нМ. В некоторых вариантах осуществления сродство связывания может быть меньше любой из следующих величин, равных примерно 6500 нМ, 6000 нМ, 5500 нМ, 5000 нМ, 4000 нМ, 3000 нМ, 2000 нМ, 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4,5 нМ, 4 нМ, 3,5 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,01 нМ или менее нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет K_D от примерно 80 до примерно 200 пМ. В конкретном варианте осуществления антитело имеет K_D от примерно 10 до 2000 нм.

В одном из аспектов изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения в способе модуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. В конкретных вариантах осуществления изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения в способе подавления роста опухолевых клеток у субъекта.

В другом аспекте изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения для лечения рака, причем необязательно рак выбирают из группы, состоящей из рака груди, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких, мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы.

В еще одном аспекте изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции для применения для лечения рака, при этом модулируется опосредованный Т-клетками иммунный ответ или происходит подавление роста опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим анти-CD3 антитела или их части. Например, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей VH или VL, перечисленных в Таблице 1, или практически аналогичную им последовательность, содержащую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей VH CDR1, VH CDR2 или VH CDR3, перечисленным в таблице 2, или практически аналогичную им последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любую из аминокислотных последовательностей VL CDR1, VL CDR2 или VL CDR3, перечисленных в таблице 3, или практически аналогичную им последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере на 99% идентичности последовательности.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим VR HC, где VH содержит набор из трех CDR (т.е. VH CDR1, VH CDR2 или VH CDR3), причем набор аминокислотных последовательностей VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 является таким, как определено для любого типичного анти-CD3 антитела, указанного в таблице 2.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим VR LC, где VL содержит набор из трех CDR (т.е. VL CDR1, VL CDR2 или VL CDR3), причем набор аминокислотных последовательностей VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 является таким, как определено для любым типичного анти-CD3 антитела, указанного в таблице 3.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим как VH, так и VL, причем VH содержит любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VH, перечисленных в таблице 1, и причем VL содержит любую аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей VL, приведенных в таблице 1.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, способным экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепей анти-CD3 антитела. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие любую из молекул нуклеиновых кислот, упомянутых выше, т.е. молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из VH и VL, указанных в таблице 1, и/или последовательности CDR, указанные в таблицах 2 или 3. В объем настоящего изобретения также включены клетки-хозяева, в которые были введены такие векторы, а также способы получения антител или их частей путем культивирования клеток-хозяев в условиях, позволяющих продуцировать антитела или фрагменты антител, и извлечения антител и фрагментов антител, полученных таким образом.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела 2B5-0001 (2B5), 2B5-0002, 2B5-0006 (2B5v6), 2B5-0009, 2B5-0517, 2B5-0522, 2B5-0533, 2B5-0538, 2B5-0598, 2B5-0623, 2B5-0707, 2B5-0003, 2B5-1038, 2B5-1039 или 2B5-1040, указанные в таблице 4.

Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело, может быть сохранена в векторе в клетке-хозяине, а затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для будущего использования. В настоящем описании дополнительно раскрыты векторы (включая векторы экспрессии) и клетки-хозяева.

Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также включены в объем настоящего изобретения. В одном из аспектов изобретение относится к способу получения любого из полинуклеотидов, раскрытых в настоящем описании. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут быть молекулами ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы HnRNA, которые содержат интроны и взаимно однозначно соответствуют молекуле ДНК, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связан с другими молекулами и/или материалами носителя.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, такие, что иммунореактивность кодируемого полипептида не снижается по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида обычно можно оценить методами, раскрытыми в настоящем описании. Варианты предпочтительно демонстрируют идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 80%, еще более предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 90% и наиболее предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 95% с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативное антитело или его часть.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получить с помощью химического синтеза, рекомбинантных методов или метода ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и не нуждаются в подробном описании. Специалист в данной области может использовать представленные в настоящем описании последовательности и коммерческий синтезатор ДНК для получения требуемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с помощью рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий требуемую последовательность, может быть вставлен в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяин для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается в настоящем описании. Полинуклеотиды можно вставлять в клетки-хозяева любыми способами, известными в данной области. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида путем прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может быть сохранен в клетке в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрирован в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид можно выделить из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, Sambrook et al., 1989.

В качестве альтернативы ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области и описана в патентах США №№ 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 и 4,683,202, а также в PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК можно получить, используя выделенную ДНК в соответствующем векторе и вставив ее в подходящую клетку-хозяина. После репликации клетки и транскрипции ДНК в РНК, эта РНК затем может быть выделена с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, например, описанных в Sambrook et al., 1989, см. выше.

Подходящие векторы для клонирования могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методами или могут быть выбраны из большого количества векторов клонирования, доступных в данной области. Хотя выбранный вектор клонирования может меняться в зависимости от клетки-хозяина, которую предполагается использовать, полезные векторы для клонирования, как правило, обладают способностью к саморепликации, могут иметь единственную мишень для конкретной эндонуклеазы рестрикции и/или могут нести маркерные гены, которые можно использовать при выборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие векторы клонирования можно приобрести у коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

Векторы экспрессии обычно представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид по настоящему изобретению. Подразумевается, что вектор экспрессии должен реплицироваться в клетках-хозяевах либо в виде эписомы, либо как неотъемлемая часть хромосомной ДНК. Подходящие векторы экспрессии включают, без ограничения, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и вектор(ы) экспрессии, раскрытые в публикации РСТ № WO 87/04462. Компоненты вектора обычно могут включать, без ограничения, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; источник репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы, контролирующие транскрипцию (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) обычно также требуются один или более элементов, контролирующих трансляцию, таких как сайты связывания рибосомы, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из нескольких подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, когда вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины). Выбор векторов для введения или полинуклеотидов часто зависит от характеристик клетки-хозяина.

Изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим любой из полинуклеотидов, раскрытых в настоящем описании. Любые клетки-хозяева, способные сверхэкспрессировать гетерологичные ДНК, можно использовать с целью выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, без ограничения, клетки COS, HeLa и CHO. См. также публикацию РСТ № WO 87/04462. Подходящие клетки-хозяева, не относящиеся к млекопитающим, включают клетки прокариот (таких как E. coli или B. subtillis) и дрожжей (таких как S. cerevisae, S. pombe; или K. lactis). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне, превышающем примерно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз, даже более предпочтительно в 20 раз уровень соответствующего эндогенного антитела или белка CD3, или домена CD3 (например, доменов 1-4), определенный иммуноанализом или FACS. Можно идентифицировать клетку, сверхэкспрессирующую представляющее интерес антитело или белок.

Изобретение также включает scFv антител по настоящему изобретению. Фрагменты одноцепочечной вариабельной области получают путем связывания вариабельной области легкой и/или тяжелой цепи с помощью короткого связывающего пептида (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Пример связывающего пептида включает последовательность SEQ ID NO: 65. В одном из вариантов осуществления связывающий пептид представляет собой мост, размером примерно 3,5 нМ между карбокси-концом одной вариабельной области и аминоконцом другой вариабельной области. Разработаны и используются линкеры, имеющие другие последовательности (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Линкеры должны быть короткими гибкими полипептидами и предпочтительно состоять из менее чем примерно 20 аминокислотных остатков. Линкеры, в свою очередь, можно модифицировать с тем, чтобы они выполняли дополнительные функции, такие как прикрепление лекарственных веществ или прикрепление к твердой подложке. Одноцепочечные варианты могут быть получены либо рекомбинантно, либо синтетически. Для синтетического получения scFv можно использовать автоматический синтезатор. Для рекомбинантного продуцирования scFv подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, кодирующий scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, либо эукариотическую, такую как дрожжевая клетка, растительная клетка, клетка насекомых или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как клетка E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие представляющий интерес scFv, можно получить обычными манипуляциями, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv можно выделить стандартными методами очистки белков, известными в данной области.

В одном из аспектов предоставлена полинуклеотидная последовательность, кодирующая любую одну из частичной последовательности легкой цепи и/или любую одну из частичной последовательности тяжелой цепи, раскрытых в настоящем описании. Типичные полинуклеотиды CD3, кодирующие области VH и области VL антител по настоящему изобретению, приведены в таблице 5.

Таблица 5

Вариант	Легкая цепь	Тяжелая цепь
2B5-0001 (2B5)	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCGGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 68)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATAGGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 69)
2B5-0002	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 70)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATAGGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 69)
2B5-0006 (2B5v6)	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 70)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
2B5-0009	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 70)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATAGGGCACAGGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 72)
2B5-0517	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGAAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 83)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACCAGCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 73)
2B5-0522	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGATCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 74)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACCAGCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 73)
2B5-0533	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGAAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 83)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
2B5-0538	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGATCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 74)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
2B5-0598	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCGACCAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCaag (SEQ ID NO: 75)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGACCGCGGGTACACTTCAGACCACCAGCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCtct (SEQ ID NO: 76)
2B5-0623	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCGACCAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCaag (SEQ ID NO: 75)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACCAGCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 73)
2B5-0707	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCAGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACTACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 77)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACACTCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 84)
2B5-0003	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCCGGAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTACACGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 68)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
H2B4	GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGAGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGTTCAACGTGAGAAGCCGGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCAGCTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCAAGCAGAGCTACGACCTGTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 86)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATAGGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 69)
2B5-1038	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCGACCAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCaag (SEQ ID NO: 75)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
2B5-1039	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCAGAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 88)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)
2B5-1040	GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 90)	GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT (SEQ ID NO: 71)

В одном из аспектов изобретение относится к композициям (таким как фармацевтическая композиция), содержащим любой из полинуклеотидов по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция может содержать любой из полинуклеотидов, приведенных в таблице 5. В конкретных вариантах осуществления композиция содержит вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий любое из антител, раскрытых в настоящем описании, например, любой из полинуклеотидов, приведенных в таблице 5.

Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также включены в настоящее изобретение. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут быть молекулами ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают зрелые и незрелые мРНК, такие как мРНК-предшественники (пре-мРНК) или гетерогенные ядерные мРНК (гяРНК) и зрелые мРНК. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связан с другими молекулами и/или материалами носителя.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, которые не снижают иммунореактивность кодируемого полипептида по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида обычно можно оценить методами, раскрытыми в настоящем описании. Варианты предпочтительно демонстрируют идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 80%, еще более предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 90%, и наиболее предпочтительно идентичность, составляющую по меньшей мере примерно 95% с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативное антитело или его часть.

Две полинуклеотидные или полипептидные последовательности называются «идентичными», если две нуклеотидные или аминокислотные последовательности одинаковы при выравнивании для поиска максимального соответствия, как описано ниже. Сравнение двух последовательностей обычно выполняют путем сравнения последовательностей в пределах окна сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. «Окно сравнения», используемое в настоящем описании, относится к сегменту, состоящему из по меньшей мере примерно 20 смежных положений, обычно от 30 до примерно 75 или от 40 до примерно 50, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью с таким же количеством смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено с помощью программы Megalign из набора биоинформатического программного обеспечения Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Предпочтительно, «процент идентичности последовательности» определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, состоящем по меньшей мере из 20 положений, причем для оптимального выравнивания двух последовательностей часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или удаления (т.е. зазоры (гэпы)), составляющие 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов относительно эталонных последовательностей (которые не содержат добавлений или делеций). Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях встречаются идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки, чтобы получить количество совпадающих положений, путем деления количества совпадающих положений на общее количество положений в эталонной последовательности (т.е. размер окна) и умножения результатов на 100 с получением процента идентичности последовательности.

Варианты также или альтернативно могут быть по существу гомологичны нативному гену или его части или комплементарной последовательности. Такие варианты полинуклеотидов способны гибридизоваться в умеренно жестких условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).

Специалистам в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, раскрытый в настоящем описании. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию с нуклеотидной последовательностью любого природного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые различаются по причине различий в использовании кодонов, в настоящем изобретении отмечены особо. Кроме того, аллели генов, содержащих представленные в настоящем описании полинуклеотидные последовательности, входят в объем настоящего изобретения. Аллели являются эндогенными генами, которые изменяются в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели можно идентифицировать стандартными методами (такими как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей в базе данных).

В одном из аспектов изобретение относится к способу получения любого из полинуклеотидов, раскрытых в настоящем описании. Например, полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получить с помощью химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и не нуждаются в подробном описании. Специалист в данной области может использовать представленные в настоящем описании последовательности и коммерческий синтезатор ДНК для получения требуемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с помощью рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий требуемую последовательность, может быть вставлен в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается в настоящем описании. Полинуклеотиды можно вставлять в клетки-хозяева любыми способами, известными в данной области. Клетки трансформируют путем введения экзогенного полинуклеотида посредством прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может быть сохранен в клетке в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрирован в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид можно выделить из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области (например, Sambrook et al., 1989).

В качестве альтернативы ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в данной области и описана в патентах США №№ 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 и 4,683,202, а также PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК можно получить, используя выделенную ДНК в соответствующем векторе и вставив ее в подходящую клетку-хозяина. После репликации клетки и транскрипции ДНК в РНК, эта РНК затем может быть выделена с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, как, например, изложено в Sambrook et al., 1989, см. выше.

Подходящие векторы для клонирования могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методами или могут быть выбраны из большого количества векторов клонирования, доступных в данной области. Хотя выбранный вектор клонирования может меняться в зависимости от клетки-хозяина, которую предполагается использовать, полезные векторы для клонирования, как правило, обладают способностью к саморепликации, могут иметь единственную мишень для конкретной эндонуклеазы рестрикции и/или могут нести маркерные гены, которые можно использовать при выборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие векторы клонирования можно приобрести у коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

Векторы экспрессии обычно представляют собой реплицируемые полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид по настоящему изобретению. Подразумевается, что вектор экспрессии должен реплицироваться в клетках-хозяевах либо в виде эписомы, либо как неотъемлемая часть хромосомной ДНК. Подходящие векторы экспрессии включают, без ограничения, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и вектор(ы) экспрессии, раскрытые в публикации РСТ № WO87/04462. Компоненты вектора обычно могут включать, без ограничения, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; источник репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы, контролирующие транскрипцию (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) обычно также требуются один или более элементов, контролирующих трансляцию, таких как сайты связывания рибосомы, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из нескольких подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, когда вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины). Выбор векторов для введения или полинуклеотидов часто зависит от характеристик клетки-хозяина.

Для выделения генов, кодирующих представляющее интерес антитело, полипептид или белок, можно использовать любые клетки-хозяева, способные сверхэкспрессировать гетерологичные ДНК. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, без ограничения, клетки COS, HeLa и CHO. См. также публикацию РСТ № WO87/04462. Подходящие клетки-хозяева, не относящиеся к млекопитающим, включают клетки прокариот (такие как E. coli или B. subtillis) и клетки дрожжей (такие как S. cerevisae, S. pombe; или K. lactis). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне, превышающем примерно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз, даже более предпочтительно в 20 раз уровень соответствующего эндогенного антитела или белка CD3, или домена CD3 (например, доменов 1-4), определенный иммуноанализом или FACS. Можно идентифицировать клетку, сверхэкспрессирующую представляющее интерес антитело или белок.

В одном из аспектов молекула антитела CD3 может иметь сродство к CD3, например, измеренное с помощью анализов прямого связывания или конкурентного связывания в пикомолярном-микромолярном диапазоне сродства связывания, предпочтительно в пикомолярном-низком наномолярном диапазоне.

Биспецифические антитела можно получить с помощью раскрытых в настоящем описании последовательностей. Способы получения биспецифических антител известны в данной области (см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986). Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, причем две тяжелые цепи имели разные специфичности (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).

В другом варианте осуществления антитело, раскрытое в настоящем описании, включает полноразмерное человеческое антитело, в котором вариабельная область антитела гетеродимерного белка способна рекрутировать активность эффекторной иммунной клетки человека путем специфического связывания с эффекторным антигеном (например, антигеном CD3), расположенным на иммунной эффекторной клетке человека, и при этом вторая вариабельная область антитела гетеродимерного белка способна специфически связываться с целевым антигеном. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления гетеродимерный белок содержит иммунологически инертную цепь Fc.

Эффекторная иммунная клетка человека может быть любой из множества эффекторных иммунных клеток, известных в данной области. Например, эффекторная иммунная клетка может быть членом лимфоидной клеточной линии человека, включая, помимо прочего, Т-клетку (например, цитотоксическую Т-клетку), В-клетку и естественную киллерную (NK) клетку. Иммунная эффекторная клетка также может быть, например, без ограничения, членом миелоидной линии человека, включая, без ограничения, моноцит, нейтрофильный гранулоцит и дендритную клетку. Такие иммунные эффекторные клетки могут оказывать либо цитотоксический, либо апоптотический эффект на целевую клетку или другой желаемый эффект при активации через связывание эффекторного антигена.

Эффекторный антиген представляет собой антиген (например, белок или полипептид), который экспрессируется на эффекторной иммунной клетке человека. Примеры эффекторных антигенов, которые могут связываться с гетеродимерным белком (например, гетеродимерным антителом или биспецифическим антителом), включают, без ограничения, человеческие CD3, CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 и CD89.

Целевая клетка может быть нативной или чужеродной для человека. В случае нативной целевой клетки эта клетка могла трансформироваться в злокачественную клетку или могла быть патологически модифицирована (например, нативная целевая клетка, инфицированная вирусом, плазмодием или бактерией). В случае целевой чужеродной клетки клетка является вторгающимся патогеном, таким как бактерия, плазмодий или вирус.

В некоторых вариантах осуществления антитело, используемое в настоящем изобретении, представляет собой Fab, Fab фрагмент, F(ab)₂ фрагмент, Fv фрагмент, одноцепочечный Fv фрагмент, стабилизированный дисульфидными связями Fv фрагмент, одноцепочечное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое гетеродимерное диатело, биспецифический гетеродимерный IgG, поликлональное антитело, меченое антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело или их фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления анти-CD3 антитело, раскрытое в настоящем описании, представляет собой моноклональное антитело. Например, анти-CD3 антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или химерное моноклональное антитело.

Настоящее изобретение включает антитело, содержащее цепь или Fc домен, или их части. В некоторых вариантах осуществления Fc цепь или ее часть(и) содержит один или более константных доменов Fc цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, домен CH2 или CH3). В другом варианте осуществления изобретение охватывает молекулы, содержащие Fc цепь или ее часть, где Fc цепь или ее часть содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты (например, замену) относительно сравниваемой Fc цепи дикого типа или ее части. Варианты Fc областей хорошо известны в данной области и в первую очередь используются для изменения фенотипа антитела, содержащего вариантную Fc область, оцениваемого с помощью любого анализа связывающей активности или эффекторной функции, хорошо известного в данной области, например, с помощью ELISA, SPR-анализ или ADCC. Такие измененные Fc цепи или их части могут увеличивать период полужизни в плазме и стабильность, демонстрируемые биспецифическим антителом по изобретению, содержащим Fc цепь или ее часть. В другом варианте осуществления изобретение включает использование любого варианта Fc, известного в данной области.

В одном из вариантов осуществления выполняют одну или более модификаций аминокислот Fc цепи для снижения сродства и авидности Fc цепи и, таким образом, биспецифического антитела по изобретению по отношению к одному или более рецепторам FcγR. В конкретном варианте осуществления изобретение включает биспецифические антитела, содержащие вариант Fc цепи или ее часть, причем вариант Fc цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты относительно Fc цепи дикого типа, и причем измененная Fc область связывается только с одним FcγR, где FcγR представляет собой FcγRIIIA. В другом конкретном варианте осуществления изобретение включает биспецифические антитела, содержащие вариант Fc цепи или ее часть, причем вариант Fc цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты относительно Fc цепи дикого типа (WT), и причем измененная область Fc связывается только с одним FcγR, где FcγR представляет собой FcγRIIA. В другом конкретном варианте осуществления изобретение включает биспецифические антитела, содержащие вариант Fc цепи или его часть, причем вариант Fc цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты относительно Fc цепи дикого типа, и причем этот вариант Fc цепи связывается только с одним FcγR, где FcγR представляет собой FcγRIIB. В другом варианте осуществления изобретение охватывает молекулы, содержащие вариант Fc цепи, где вариант обеспечивает или опосредует сниженную активность ADCC (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание с FcγRIIB (CD32B) по сравнению с молекулой, не содержащей Fc цепь или содержащей Fc цепь дикого типа, измеренные способами, известными специалистам в данной области и раскрытыми в настоящем описании.

Изобретение также включает использование Fc области, содержащей домены или области из двух или более изотипов IgG. Как известно в данной области, аминокислотная модификация Fc области может оказывать серьезное влияние на опосредованную Fc эффекторную функцию и/или связывающую активность. Однако эти изменения функциональных характеристик можно дополнительно модифицировать и/или регулировать, если они реализованы в контексте выбранных изотипов IgG. Аналогичным образом, природные характеристики изотипа Fc можно изменять с помощью одной или более модификаций аминокислот. Многочисленные изотипы IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) демонстрируют разные физические и функциональные свойства, включая период полужизни в сыворотке, фиксацию комплемента, сродство связывания FcγR и активность эффекторных функций (например, ADCC, CDC), что связано с различиями в их аминокислотных последовательностях шарнирных и/или Fc областей.

В одном из вариантов осуществления аминокислотную модификацию и Fc область IgG выбирают независимо, исходя из их соответствующих активностей связывания и/или эффекторной функции, оцениваемых по отдельности, чтобы сконструировать биспецифическое антитело с желаемыми характеристиками. В конкретном варианте осуществления аминокислотные модификации и шарнирные/Fc области IgG анализируют отдельно на активность связывания и/или эффекторную функцию, как раскрыто в настоящем описании или известно в данной области в контексте IgG1. В одном из вариантов осуществления аминокислотная модификация и шарнирная/Fc область IgG обладают аналогичной функциональностью, например, сниженной активностью ADCC (или другой эффекторной функцией) и/или повышенным связыванием с FcγRIIB в контексте биспецифического антитела или другой Fc содержащей молекулы (например, и иммуноглобулина). В другом варианте осуществления изобретение охватывает вариантные Fc области, содержащие комбинации модификаций аминокислот, известных в данной области, и выбранные области IgG, проявляющие новые свойства, которые не были обнаружены при независимом анализе модификаций и/или областей, раскрытых в настоящем описании.

Одним из способов определения сродства связывания антитела с CD3 является измерение сродства связывания монофункциональных Fab фрагментов антитела. Для получения монофункциональных Fab фрагментов антитело (например, IgG) можно расщепить папаином или экспрессировать рекомбинантно. Сродство Fab фрагмента антитела к CD3 может быть определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (системы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore™ 3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ) с использованием сенсорных чипов с предварительно иммобилизованным стрептавидином (SA) или антимышиным Fc или античеловеческим Fc, используя рабочий буфер HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% об./об. поверхностно-активное вещество P20). Биотинилированный или слитый с Fc человеческий CD3 можно развести в буфере HBS-EP до концентрации менее 0,5 мкг/мл и ввести через отдельные каналы чипа, используя изменяемое время контакта, для достижения двух диапазонов плотности антигена: либо 50-200 единиц ответа (RU) для детального изучения кинетических характеристик, либо 800-1000 RU для скрининговых анализов. Исследования по регенерации показали, что 25 мМ NaOH в 25% об./об. этанола эффективно удаляет связанный Fab, сохраняя при этом активность CD3 на чипе для более, чем 200 инъекций. Как правило, серийные разведения (охватывающие концентрации 0,1-10x оцениваемой K_D) очищенных образцов Fab вводят в течение 1 мин при 100 мкл/мин, и оставляют для осуществления диссоциации на 2 часа. Концентрации Fab белков определяют методом ELISA и/или SDS-PAGE-электрофореза с использованием Fab в известной концентрации (определенной аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Кинетические скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) получают одновременно путем подгонки данных в целом к модели связывания 1:1 Ленгмюра (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) с помощью программы BIAevaluation. Значения константы равновесной диссоциации (K_D) вычисляют по формуле: k_off/k_on. Этот протокол подходит для определения сродства связывания антитела с любым CD3, включая человеческий CD3, CD3 другого млекопитающего (например, CD3 мыши, CD3 крысы или CD3 приматов), а также различные формы CD3 (например, гликозилированные CD3). Сродство связывания антитела обычно измеряют при 25°C, но оно также может быть измерено при 37°C.

Раскрытые в настоящем описании антитела могут быть получены любым способом, известным в данной области. Для получения линий гибридомных клеток путь и схема иммунизации животного-хозяина обычно соответствуют установленным и общепринятым методам стимуляции и продуцирования антител, как дополнительно раскрыто в настоящем описании. Общие методы получения человеческих и мышиных антител известны в данной области и/или раскрыты в настоящем описании.

Предполагается, что любой субъект-млекопитающее, включая человека или клетку, продуцирующую антитела, можно использовать таким образом, чтобы они послужили в качестве основы для получения клеточных линий гибридомы млекопитающих, включая человека. Обычно животному-хозяину прививают внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутрикожно определенное количество иммуногена, включая способы, раскрытые в настоящем описании.

Гибридомы могут быть получены из лимфоцитов и иммортализованных миеломных клеток с помощью общего метода гибридизации соматических клеток, предложенного Kohler, B. и Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975 или модифицированного Buck, DW, et al., In Vitro, 18: 377-381, 1982. Для гибридизации могут быть использованы доступные линии миеломы, включая, помимо прочего, X63-Ag8.653 и линии из Института Солка, Центр распределения клеток, Сан-Диего, Калифорния, США. Обычно метод включает слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием фузогена, такого как полиэтиленгликоль, или с помощью электрических средств, хорошо известных специалистам в данной области. После слияния клетки отделяют от среды слияния и выращивают в среде для селективного роста, такой как среда гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT), для удаления негибридизированных родительских клеток. Любая из раскрытых в настоящем описании сред, дополненных сывороткой или без нее, может использоваться для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела. В качестве другой альтернативы в методе слияния клеток можно использовать иммортализованные В-клетки EBV для получения моноклональных антител по настоящему изобретению. При желании гибридомы размножают и субклонируют, а супернатанты анализируют на антииммуногенную активность с помощью обычных процедур иммуноанализа (например, радиоиммуноанализа, иммуноферментного анализа или флуоресцентного иммуноанализа).

Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, включают все производные, клетки-потомки родительских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные для CD3, или их части.

Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, можно выращивать in vitro или in vivo с помощью известных процедур. Моноклональные антитела могут быть выделены из культуральной среды или жидкостей организма с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация, если при необходимости. Нежелательную активность, если она присутствует, можно устранить, например, пропуская препарат через адсорбенты, состоящие из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюируя или высвобождая желаемые антитела из иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим CD3 или фрагментом, содержащим целевую аминокислотную последовательность, конъюгированную с белком, который является иммуногенным для видов, подлежащих иммунизации, например гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального агента или дериватизирующего агента, например сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют собой разные алкильные группы, может дать популяцию антител (например, моноклональные антитела).

При желании, представляющее интерес антитело может быть секвенировано, а затем полинуклеотидная последовательность может быть клонирована в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело, может быть сохранена в векторе в клетке-хозяине, а затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для использования в будущем. Получение рекомбинантных моноклональных антител в культуре клеток можно осуществлять путем клонирования генов антител из В-клеток способами, известными в данной области. См., например, Tiller et al., J. Immunol. Methods, 329, 112, 2008; патент США № 7,314,622.

В качестве альтернативы полинуклеотидная последовательность может использоваться для генетических манипуляций с целью гуманизации антитела или улучшения сродства или других характеристик антитела. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы она больше напоминала человеческие константные области, чтобы избежать инициации иммунного ответа при использовании антитела в клинических испытаниях и для лечения людей. Может потребоваться генетическое изменение последовательности антитела для получения более высокого сродства к CD3 и более высокой терапевтической эффективности.

В некоторых вариантах осуществления антитело имеет модифицированную константную область, которая удаляет или снижает связывание с гамма-рецептором Fc. Например, Fc может быть человеческим IgG2, содержащим мутацию D265, причем аминокислотные остатки пронумерованы со ссылкой на последовательность IgG2 дикого типа. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления константная область имеет модифицированную константную область, имеющую последовательность, показанную в SEQ ID NO: 80. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет модифицированную константную область, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81.

Существует четыре основных этапа гуманизации моноклональных антител. К ним относятся: (1) определение нуклеотидной и прогнозируемой аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей исходного антитела (2) разработка гуманизированного антитела, т.е. решение, какую каркасную область антитела использовать в процессе гуманизации (3) реализуемые на практике техники/методы гуманизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№ 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; и 6,180,370.

Описано несколько молекул гуманизированных антител, содержащих антигенсвязывающий участок, полученный из нечеловеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие V-области грызунов или модифицированные V-области грызунов и ассоциированные с ними CDR, слитые с человеческими константными областями. См., например, Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987, and Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987. В других источниках описаны CDR грызунов, трансплантированные в поддерживающую каркасную область (FR) человека перед слиянием с подходящей константной областью человеческого антитела. См., например, Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988, и Jones et al. Nature 321:522-525, 1986. В другом источнике описаны CDR грызунов, поддерживаемые рекомбинантно сконструированными каркасными областями грызунов. См., например, европейскую публикацию № EP0519596. Эти «гуманизированные» антитела предназначены для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы античеловеческих антител грызунов, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтического применения этих фрагментов у людей-реципиентов. Например, константная область антитела может быть сконструирована таким образом, чтобы она была иммунологически инертной (например, не запускала лизис комплемента). См., например, заявку РСТ № PCT/GB99/01441; заявку на патент Великобритании № 9809951.8. Другие методы гуманизации антител, которые также можно использовать, раскрыты у Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476, 1991, и в патентах США №№ 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; и 6,350,861; и в публикации РСТ № WO01/27160.

Общие принципы, относящиеся к гуманизированным антителам, обсужденные выше, также применимы к адаптации антител для использования, например, у других млекопитающих (например, человека, приматов, не относящихся к человеку, мыши, осла, овцы, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или курицы). Кроме того, один или более аспектов гуманизации антитела, раскрытого в настоящем описании, могут быть объединены, например, прививка CDR, мутация каркаса и мутация CDR.

В одном из вариантов полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием коммерчески доступных мышей, которые были созданы для экспрессии специфичных для человека иммуноглобулиновых белков. Трансгенных животных, которые созданы для выработки более предпочтительного (например, полностью человеческих антител) или более устойчивого иммунного ответа, также можно использовать для создания гуманизированных или человеческих антител. Примерами такого метода являются Xenomouse™ от Abgenix, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-Mouse® и TC Mouse™ от Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

В качестве альтернативы антитела можно получить рекомбинантно и экспрессировать с помощью любого метода, известного в данной области. В другом альтернативном варианте антитела могут быть получены рекомбинантно с помощью метода фагового дисплея. См., например, патенты США №№ 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; и 6,265,150; и Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994. Альтернативно, технология фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) может быть использована для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из репертуаров генов вариабельного (V) домена иммуноглобулина от неиммунизированных доноров. Согласно этому методу, гены V-домена антитела клонируют в рамке считывания в основной или минорный ген белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как M13 или fd, и отображают в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитевидная частица содержит копию одноцепочечной ДНК генома фага, выбор, основанный на функциональных свойствах антитела, также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговый дисплей может быть выполнен в различных форматах; для обзора см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993. Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-гена. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991, выделили набор различных антиоксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенки иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар V-генов, полученных от неиммунизированных доноров-людей, и можно выделить антитела к разнообразному набору антигенов (включая аутоантигены), по существу, следуя методам, описанным Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993. При естественном иммунном ответе гены антител накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из внесенных изменений будут обеспечивать более высокое сродство, и В-клетки, демонстрирующие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, предпочтительно реплицируются и дифференцируются во время последующего заражения антигеном. Этот естественный процесс можно имитировать, используя метод, известный как «перетасовка цепей» (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). В этом методе сродство «первичных» человеческих антител, полученных с помощью фагового дисплея, может быть улучшено путем последовательной замены генов V-областей тяжелой и легкой цепей репертуарами встречающихся в природе вариантов (репертуаров) генов V-домена, полученных от неиммунизированных доноров. Этот метод позволяет получать антитела и фрагменты антител со сродством в диапазоне пМ-нМ. Стратегия создания очень больших репертуаров фаговых антител (также известных как «материнские библиотеки») описана Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. Перетасовка генов также может быть использована для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет сходное сродство и специфичность с исходным антителом грызунов. В соответствии с этим методом, который также называется «импринтинг эпитопа», ген V-домена тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученный методом фагового дисплея, заменяют репертуаром генов V-домена человека, создавая химеры грызунов и человека. Селекция по антигену приводит к выделению вариабельных областей человека, способных восстанавливать функциональный антигенсвязывающий участок, т.е. эпитоп управляет (импринтирует) выбор партнера. Когда процесс повторяется для замены оставшегося V-домена грызунов, получают человеческое антитело (см. публикацию РСТ № WO93/06213). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов путем пересадки CDR, этот метод обеспечивает получение полностью человеческих антител, которые не имеют остатков каркасных областей или CDR грызунов.

Антитела можно получить рекомбинантно, сначала выделив антитела и клетки, продуцирующие антитела, от животных-хозяев, получив последовательность гена и используя эту последовательность гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другой способ, который можно использовать, представляет собой экспрессию последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Раскрыты методы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке. См., например, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; и Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999. Способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т.д., известны в данной области.

Иммуноанализы и методы сортировки с помощью проточной цитометрии, такие как сортировка активируемых флуоресценцией клеток (FACS), также могут быть использованы для выделения антител, специфичных для CD3 или представляющих интерес антигенов.

Раскрытые в настоящем описании антитела могут быть связаны со многими различными твердофазными подложками или носителями. Такие носители могут быть активными и/или инертными. Хорошо известные подложки включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Подложка по своей природе может быть растворимой или нерастворимой для целей изобретения. Специалисты в данной области знают о других подходящих подложках для связывания антител или способны определить их с помощью рутинных экспериментов. В некоторых вариантах осуществления подложка содержит фрагмент, нацеленный на миокард.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать с помощью обычных процедур (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии (такие как векторы экспрессии, раскрытые в публикации РСТ № WO87/04462), которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки CHO или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина, для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию РСТ № WO87/04462. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности константных областей тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичных мышиных последовательностей, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984, или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом получают «химерные» или «гибридные» антитела, которые обладают специфичностью связывания моноклонального антитела, раскрытого в настоящем описании.

Антитела к CD3 или другим антигенам, раскрытые в настоящем описании, могут быть идентифицированы или охарактеризованы с помощью способов, известных в данной области, посредством которых выявляют и/или измеряют уровни экспрессии антигена. В некоторых вариантах осуществления анти-CD3 антитело идентифицируют путем инкубации агента-кандидата с CD3 и мониторинга связывания и/или сопутствующего снижения уровней экспрессии CD3. Анализ связывания можно проводить с очищенным полипептидом(ами) CD3 или с клетками, экспрессирующими естественным образом или трансфицированными для экспрессии полипептида(ов) CD3. В одном из вариантов осуществления анализ связывания представляет собой анализ конкурентного связывания, в котором оценивается способность антитела-кандидата конкурировать с известным анти-CD3 антителом за связывание с CD3. Анализ можно проводить в различных форматах, включая формат ELISA.

После первоначальной идентификации активность кандидата CD3 или другого антигенного антитела может быть дополнительно подтверждена и уточнена с помощью биоанализов, известных для тестирования целевых биологических активностей. В качестве альтернативы для непосредственного отбора кандидатов можно использовать биоанализы. Некоторые методы идентификации и характеристики антител подробно описаны в примерах.

CD3 или другие антигенные антитела можно охарактеризовать с помощью методов, хорошо известных в данной области. Например, одним из методов является идентификация эпитопа, с которым он связывается, или картирование эпитопа. Существует несколько методов, известных в данной области для картирования и характеристики расположения эпитопов на белках, включая определение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии генных фрагментов и анализы на основе синтетических пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999. В дополнительном примере можно использовать картирование эпитопа для определения последовательности, с которой связывается антитело. Картирование эпитопов коммерчески доступно из различных источников, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Эпитоп может быть линейным эпитопом, т.е. содержащимся в одном отрезке аминокислот, или конформационным эпитопом, образованным трехмерным взаимодействием аминокислот, которое необязательно может содержаться в одном отрезке. Пептиды различной длины (например, длиной не менее 4-6 аминокислот) могут быть выделены или синтезированы (например, рекомбинантно) и использованы для анализов связывания с антителом к CD3 или другому антигену. В другом примере эпитоп, с которым связывается антитело к CD3 или другому антигену, может быть определен в ходе систематического скрининга с использованием перекрывающихся пептидов, полученных из последовательности CD3 или другого антигена, и определения связывания с антителом к CD3 или другому антигену. В соответствии с анализами экспрессии фрагментов гена открытую рамку считывания, кодирующую CD3 или другой антиген, фрагментируют либо случайным образом, либо используя специфические генетические конструкции, и определяют реактивность экспрессируемых фрагментов CD3 или другого антигена с тестируемым антителом. Фрагменты гена можно, например, получить с помощью ПЦР, а затем транскрибировать и транслировать в белок in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот. Связывание антитела с радиоактивно меченным CD3 или другими фрагментами антигена затем определяют методами иммунопреципитации и гель-электрофореза. Определенные эпитопы также можно идентифицировать с помощью больших библиотек случайных пептидных последовательностей, отображаемых на поверхности фаговых частиц (фаговых библиотек). Альтернативно, определенная библиотека перекрывающихся пептидных фрагментов может быть протестирована на связывание с тестируемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере могут быть выполнены мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты по замене домена и мутагенез по методу аланинового сканирования для идентификации остатков, требуемых, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа. Например, эксперименты по замене домена могут быть выполнены с использованием мутантного CD3 или другого антигена, причем различные фрагменты CD3 или другого антигенного белка заменяют (заменяют местами) последовательностями антигена другого вида (например, мыши) или близкого к нему родственного, но отличного по антигену белка (например, Trop-1). Оценивая связывание антитела с мутантным CD3 или другим антигеном, можно оценить важность конкретного CD3 или другого фрагмента антигена для связывания антитела.

Еще один метод, который можно использовать для характеристики антитела к CD3 или другому антигену, заключается в использовании конкурентных анализов с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же антигеном, т.е. с различными фрагментами на CD3 или другом антигене, чтобы определить, связывается ли анти-CD3 антитело или антитело к другому антигену, с тем же самым эпитопом, что и другие антитела, соответственно. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области.

Вектор экспрессии можно использовать для управления экспрессией анти-CD3 антитела или другого антигена. Специалист в данной области знаком с введением векторов экспрессии для получения экспрессии экзогенного белка in vivo. См., например, патенты США №№ 6,436,908; 6,413,942; и 6,376,471. Введение векторов экспрессии включает местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, введение с помощью пушки или катетеризацию, а также топическое введение. В другом варианте осуществления вектор экспрессии вводят непосредственно в симпатический ствол или ганглий или в коронарную артерию, предсердие, желудочек или перикард.

Также можно использовать адресную доставку терапевтических композиций, содержащих вектор экспрессии или субгеномные полинуклеотиды. Методы опосредованной рецептором доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol., 11:202, 1993; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; and Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от примерно 100 нг до примерно 200 мг ДНК для местного введения согласно протоколу генной терапии. Согласно протоколу генной терапии также могут использоваться диапазоны концентраций от примерно 500 нг до примерно 50 мг, от примерно 1 мкг до примерно 2 мг, от примерно 5 мкг до примерно 500 мкг и от примерно 20 мкг до примерно 100 мкг ДНК. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды можно доставлять с помощью носителей для доставки генов. Носитель для доставки генов может иметь вирусное или невирусное происхождение (см. обзор, Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1:185, 1995; and Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может быть конститутивной или регулируемой.

Векторы на основе вирусов для доставки требуемого полинуклеотида и экспрессии в требуемой клетке хорошо известны в данной области. Примеры носителей на основе вирусов включают, без ограничения, рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации РСТ № WO90/07936; WO94/03622; WO93/25698; WO93/25234; WO93/11230; WO93/10218; WO91/02805; патенты США № 5,219,740 и 4,777,127; патент Великобритании № 2200651 и патент EP № EP0345242), векторы на основе альфа-вирусов (например, векторы вируса Синдбис, вируса леса Семлики (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), вируса Росс-Ривер (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) и вируса венесуэльского энцефалита лошадей (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) и аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов (см., например, публикации РСТ № WO94/12649, WO93/03769; WO93/19191; WO94/28938; WO95/11984 и WO95/00655). Также можно вводить ДНК, связанную с убитым аденовирусом, как описано в Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992.

Также можно использовать невирусные носители и способы доставки, включая, без ограничения, поликатионную конденсированную ДНК, связанную или несвязанную только с убитым аденовирусом (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992); лиганд-связанную ДНК (см., например, Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989); клетки-носители для доставки в эукариотические клетки (см., например, патент США № 5,814,482; публикации РСТ № WO95/07994; WO96/17072; WO95/30763; и WO97/42338) и нейтрализацию заряда нуклеиновых кислот или слияние с клеточными мембранами. Также можно использовать «голую» ДНК. Типичные способы введения «голой» ДНК описаны в публикации РСТ № WO90/11092 и патенте США № 5,580,859. Липосомы, которые могут действовать как средства доставки генов, описаны в патенте США № 5,422,120; публикациях РСТ № WO95/13796; WO94/23697; WO91/14445; и европейской публикации EP 0524968. Дополнительные подходы описаны в Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994 и Woffendin, Proc. Natl. Акад. Sci., 91:1581, 1994.

В некоторых вариантах осуществления изобретение включает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению, раскрытые в настоящем описании, или полученные способами и имеющие характеристики, раскрытые в настоящем описании. В контексте настоящего описания фармацевтические композиции могут содержать одно или более антител, которые связываются с опухолевым антигеном, одно или более биспецифических антител, которые связываются с CD3 и опухолевым антигеном, и/или один или более полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или более этих антител. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие наполнители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, включая буферы, которые хорошо известны в данной области.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, которая представляет собой комбинацию анти-CD3 антитела и второго терапевтического агента. В одном из вариантов осуществления второй терапевтический агент представляет собой любой агент, который преимущественно комбинируют с анти-CD3 антителом. Примеры агентов, которые можно выгодно комбинировать с анти-CD3 антителом, включают, без ограничения, другие агенты, которые связывают и/или активируют передачу сигнала CD3 (включая другие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и т.д.), и/или агенты, которые не связываются непосредственно с CD3, но, тем не менее, активируют или стимулируют активацию иммунных клеток. Настоящее изобретение, кроме того, включает дополнительные комбинированные виды терапии и совместные фармацевтические препараты, включающие анти-CD3 антитела по настоящему изобретению. Изобретение также относится к способам получения любого из этих антител. Антитела по настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области, включая синтез белка de novo и рекомбинантную экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие белки. Требуемые последовательности нуклеиновых кислот можно получить рекомбинантными методами (например, мутагенезом с помощью ПЦР ранее полученного варианта требуемого полинуклеотида) или твердофазным синтезом ДНК. Обычно используются рекомбинантные методы экспрессии. В одном из аспектов изобретение относится к полинуклеотиду, который содержит последовательность, кодирующую VH и/или VL CD3. Из-за вырожденности генетического кода несколько последовательностей нуклеиновых кислот кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность иммуноглобулина, и настоящее изобретение включает все нуклеиновые кислоты, кодирующие раскрытые в настоящем описании связывающие белки.

Химерные или гибридные антитела также могут быть получены in vitro с помощью известных методов химического синтеза белков, включая методы, включающие сшивающие агенты. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы в ходе реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

В рекомбинантных гуманизированных антителах часть Fcγ может быть модифицирована, чтобы избежать взаимодействия с рецептором Fcγ, системой комплемента и иммунной системой. Способы получения таких антител описаны в публикации РСТ WO99/58572. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы она была больше похожа на человеческие константные области, чтобы избежать инициации иммунного ответа при использовании антитела в клинических испытаниях и для лечения людей. См., например, патент США №№ 5,997,867 и 5,866,692.

Раскрытые в настоящем описании CD3-антитела могут содержать одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасных и/или CDR-областях вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены эти антитела. Такие мутации можно легко установить путем сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из баз данных последовательностей антител, находящихся в общем доступе. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые происходят из любой аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящем описании, причем одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или участках CDR мутированы на соответствующий остаток(и) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или на соответствующий остаток(и) другой последовательности человеческой зародышевой линии, или путем консервативной аминокислотной замены соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие замены последовательности упоминаются в настоящем описании под общим названием «мутации зародышевой линии»). Специалист в данной области, может легко получить многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации, из последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления все остатки каркасной области и/или CDR в доменах VH и/или VL мутированы обратно на остатки, встречающиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. В некоторых вариантах осуществления только определенные остатки мутированы обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, содержащиеся среди первых 8 аминокислот FR1 или последних 8 аминокислот FR4, или только мутированные остатки, содержащиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления один или более остатков каркасной области и/или CDR мутированы на соответствующий остаток(и) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой изначально было получено антитело).

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию из двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасной области и/или областей CDR, например, в которых определенные отдельные остатки мутированы на соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, в то время как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохранены или мутированы на соответствующей остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко протестированы на наличие одного или более требуемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенное сродство связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от обстоятельств), пониженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные таким общим способом, охвачены настоящим изобретением.

Настоящее изобретение также включает анти-CD3 антитела, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей HC VR, LC VR и/или CDR, раскрытых в настоящем описании, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает анти-CD3 антитела, имеющие аминокислотные последовательности HC VR, LC VR и/или CDR, содержащие, например, 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативных аминокислотных замен относительно любой из раскрытых в настоящем описании аминокислотных последовательностей HC VR, LC VR и/или CDR.

Соответственно, изобретение охватывает модификации антител и полипептидов вариантов изобретения, раскрытых в настоящем описании, включая функционально эквивалентные антитела, которые не оказывают существенного влияния на их свойства, и варианты, которые обладают повышенной или пониженной активностью и/или сродством. Например, аминокислотная последовательность может быть мутирована для получения антитела с желаемым сродством связывания с опухолевым антигеном и/или CD3. Модификация полипептидов является обычной практикой в данной области и не требует подробного описания. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одну или более делеций или добавлений аминокислот, которые не приводят к существенному изменению функциональной активности или которые обеспечивают созревание (увеличение) сродства полипептида к своему лиганду, или использование химических аналогов.

Вставки аминокислотной последовательности включают слияния аминоконца и/или карбоксильного конца длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с меткой эпитопа. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом или полипептидом, которые позволяют увеличить период полужизни антитела в кровотоке.

Варианты с заменой имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле антитела и вставленный на его место другой остаток. Участки, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения в FR. Консервативные замены показаны в таблице 6 в столбце, озаглавленном «консервативные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда могут быть внесены более существенные изменения, названные в Таблице 6 «иллюстративными заменами» или дополнительно описанные ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты могут быть подвергнуты скринингу.

Таблица 6

Исходный остаток (встречающаяся в природе аминокислота)	Консервативные замены	Иллюстративные замены
Ala (A)	Val	Val; Leu; Ile
Arg (R)	Lys	Lys; Gln; Asn
Asn (N)	Gln	Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D)	Glu	Glu; Asn
Cys (C)	Ser	Ser; Ala
Gln (Q)	Asn	Asn; Glu
Glu (E)	Asp	Asp; Gln
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I)	Leu	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine
Leu (L)	Ile	Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K)	Arg	Arg; Gln; Asn
Met (M)	Leu	Leu; Phe; Ile
Phe (F)	Tyr	Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr; Phe
Tyr (Y)	Phe	Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V)	Leu	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин

Существенные модификации биологических свойств антитела достигаются путем выбора замен, которые сильно различаются по своему воздействию на сохранение (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде конформации в форме листа или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом участке, или (c) величину боковой цепи. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки делятся на группы на основе общих свойств боковой цепи:

(1) неполярные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) полярные без заряда: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислые (отрицательно заряженные): Asp, Glu;

(4) основные (положительно заряженные): Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и

(6) ароматические: Trp, Tyr, Pheб His.

Неконсервативные замены осуществляют путем замены члена одного из этих классов членом из другого класса.

Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также может быть заменен, обычно серином, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантной перекрестной сшивки. И наоборот, цистеиновая связь(и) может быть добавлена к антителу для улучшения его стабильности, особенно когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv фрагмент.

Количество аминокислотных модификаций может находиться в пределах от изменения или модификации одной или более аминокислот до полной перестройки области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменять сродство связывания и/или специфичность. В некоторых вариантах осуществления в домене CDR выполняют не более одной-пяти консервативных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления в домене CDR выполняют не более одной-трех консервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления домен CDR представляет собой VH CDR3 и/или VL CDR3.

Модификации также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела гликозилируют в консервативных положениях в константных областях (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997). Боковые олигосахаридные цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, которые могут влиять на конформацию и представлены трехмерной поверхностью гликопротеина (Jefferis and Lund, выше; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996). Олигосахариды также могут служить для нацеливания данного гликопротеина на определенные молекулы на основе определенных структур распознавания. Также имеются сообщения о том, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, имеются сообщения о том, что клетки CHO с регулируемой тетрациклином экспрессией (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисектирующего GlcNAc, обладают улучшенной активностью ADCC (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180, 1999).

Гликозилирование антител обычно является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное относится к присоединению углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин, аспарагин-X-треонин и аспарагин-X-цистеин, где X представляет собой любую аминокислоту, кроме пролина, представляют собой последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров: N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя также может использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление участков гликозилирования к антителу обычно осуществляется путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более из описанных выше трипептидных последовательностей (для участков N-связанного гликозилирования). Изменение также может быть выполнено путем добавления или замены одним или несколькими остатками серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов O-связанного гликозилирования).

Паттерн гликозилирования антител также может быть изменен без изменения основной нуклеотидной последовательности. Гликозилирование во многом зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клеток, используемый для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например антител, в качестве потенциальных терапевтических средств редко является нативной клеткой, можно ожидать изменения в характере гликозилирования антитела (см., например, Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997). Помимо выбора клеток-хозяев, факторы, которые влияют на гликозилирование во время рекомбинантного продуцирования антител, включают режим роста, состав среды, плотность культуры, оксигенацию, pH, схемы очистки и т.п. Предложены различные способы изменения паттерна гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, включая введение или сверхэкспрессию определенных ферментов, участвующих в продуцировании олигосахаридов (патенты США №№ 5,047,335; 5,510,261 и 5,278,299). Гликозилирование или определенные типы гликозилирования можно удалить из гликопротеина ферментативно, например, с помощью эндогликозидазы H (Endo H), N-гликозидазы F, эндогликозидазы F1, эндогликозидазы F2, эндогликозидазы F3. Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин может быть генетически сконструирована таким образом, чтобы она не была способной обрабатывать определенные типы полисахаридов. Эти и аналогичные методы хорошо известны в данной области.

Другие методы модификации включают использование методов связывания, известных в данной области, включая, без ограничения, ферментативные средства, окислительное замещение и хелатирование. Модификации можно использовать, например, для прикрепления меток для иммуноанализа. Модифицированные полипептиды получают с помощью установленных в данной области процедур и могут быть подвергнуты скринингу с помощью стандартных анализов, известных в данной области, некоторые из которых описаны ниже и в примерах.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит модифицированную константную область, такую как константная область, которая имеет повышенное сродство к человеческому гамма-рецептору Fc, является иммунологически инертной или частично инертной, например, не запускает лизис, опосредованный комплементом, не стимулирует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или не активирует макрофаги; или имеет пониженную активность (по сравнению с немодифицированным антителом) в одном или нескольких случаях из следующих: запуск опосредованного комплементом лизиса, стимуляция антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или активация микроглии. Для достижения оптимального уровня и/или комбинации эффекторных функций могут использоваться различные модификации константной области. См., например, Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143:2595-2601, 1989; и Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999; в заявке PCT № PCT/GB99/01441; и/или заявке на патент Великобритании № 9809951.8. В других вариантах осуществления константную область агликозилируют для N-связанного гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления константную область агликозилируют для N-связанного гликозилирования путем мутации гликозилированного аминокислотного остатка или фланкирующих остатков, которые являются частью последовательности распознавания N-гликозилирования в константной области. Например, сайт N-гликозилирования N297 может быть мутирован на A, Q, K или H. См., Tao et al., J. Immunology 143:2595-2601, 1989; и Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. В некоторых вариантах осуществления константную область агликозилируют для N-связанного гликозилирования. Константная область может быть агликозилирована для N-связанного гликозилирования ферментативно (например, путем удаления углеводов ферментом PNGase) или путем экспрессии в клетке-хозяине, дефицитной по гликозилированию.

Другие модификации антител включают антитела, которые модифицированы, как описано в публикации РСТ № WO99/58572. Эти антитела содержат, помимо связывающего домена, направленного на целевую молекулу, эффекторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу гомологичную всей или части константной области тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Эти антитела способны связывать целевую молекулу без запуска значительного комплементзависимого лизиса или клеточно-опосредованного разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связываться с FcRn и/или FcγRIIb. Обычно они основаны на химерных доменах, происходящих из двух или более доменов CH2 тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. Модифицированные таким образом антитела особенно подходят для длительной терапии антителами, позволяя избежать воспалительных и других побочных реакций, возникающих на традиционную терапию антителами.

Изобретение включает варианты осуществления с созревшим сродством. Например, антитела с созревшим сродством можно получить с помощью процедур, известных в данной области (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154 (7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992; и публикация РСТ № WO2004/058184).

Описанные ниже методы можно использовать для регулирования сродства антитела и для характеристики CDR. Один из способов характеристики CDR антитела и/или изменения (например, улучшения) сродства связывания полипептида, такого как антитело, называется «мутагенезом путем сканирования библиотек». Обычно библиотека-сканирующий мутагенез работает следующим образом. Одно или более положений аминокислот в CDR заменяют двумя или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотами с помощью признанных в данной области методов. Таким образом формируют небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления по одной для каждого анализируемого положения аминокислоты), каждая со сложностью из двух или более членов (если в каждом положении меняют две или более аминокислоты). Обычно библиотека также включает клон, содержащий нативную (незамещенную) аминокислоту. Небольшое количество клонов, например примерно 20-80 клонов (в зависимости от сложности библиотеки), из каждой библиотеки скринируют на сродство связывания с целевым полипептидом (или другой мишенью связывания), и определяют кандидатов с увеличенной, такой же, сниженной связывающей способностью, или не имеющих связывающей способности. Способы определения сродства связывания хорошо известны в данной области. Сродство связывания можно определить с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™, который позволяет обнаружить 2-кратные или более различия в сродстве связывания примерно. BIACORE™ особенно полезен, когда исходное антитело уже связывается с относительно высоким сродством, например K_D, составляющим примерно 10 нМ или менее. Скрининг с помощью поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™ раскрыт в настоящем описании в примерах.

Сродство связывания может быть определено с помощью биосенсора Kinexa, сцинтилляционного анализа близости, ELISA, иммуноанализа ORIGEN (IGEN), тушения флуоресценции, переноса флуоресценции и/или дрожжевого дисплея. Скрининг сродства связывания также возможен с помощью подходящего биоанализа.

В некоторых вариантах осуществления каждое положение аминокислоты в CDR заменяют (в некоторых вариантах осуществления по одной за один раз) на все 20 природных аминокислот с использованием признанных в данной области методов мутагенеза (некоторые из которых раскрыты в настоящем описании). Это генерирует небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления анализируют по одной для каждого положения аминокислоты), каждый со сложностью 20 членов (если в каждом положении заменены все 20 аминокислот).

В некоторых вариантах осуществления библиотека, подлежащая скринингу, содержит замены в двух или более положениях, которые могут находиться в одной и той же CDR или в двух или более CDR. Таким образом, библиотека может содержать замены в двух или более положениях в одной CDR. Библиотека может содержать замену в двух или более положениях в двух или более CDR. Библиотека может содержать замены в 3, 4, 5 или более положениях, указанные положения находятся в двух, трех, четырех, пяти или шести CDR. Замена может быть получена с использованием кодонов с низкой избыточностью. См., например, Таблицу 2 у Balint et al., Gene 137 (1):109-18, 1993.

Кандидатов с улучшенным связыванием можно секвенировать, тем самым идентифицируя мутант с заменой CDR, которая обеспечивает улучшенное сродство (также называемой «улучшенной» заменой). Кандидаты, которые связываются, также можно секвенировать, тем самым идентифицируя замену CDR, которая сохраняет связывание.

Возможно проведение нескольких раундов скрининга. Например, кандидаты (каждый из которых содержит аминокислотную замену в одном или более положениях одной или более CDR) с улучшенным связыванием также полезны для создания второй библиотеки, содержащей по меньшей мере исходную и замещенную аминокислоту в каждом улучшенном положении CDR (т.е. положение аминокислоты в CDR, в котором мутант с заменой показал улучшенное связывание). Приготовление, скрининг или выбор этой библиотеки обсуждается ниже.

Мутагенез путем сканирования библиотек также предоставляет средства для характеристики CDR, поскольку частота клонов с улучшенным связыванием, таким же связыванием, пониженным связыванием или отсутствием связывания также предоставляет информацию, касающуюся важности положения каждой аминокислоты для стабильности комплекса антитело-антиген. Например, если положение CDR сохраняет связывание в случае изменения всех 20 аминокислот, это положение идентифицируют как положение, которое вряд ли потребуется для связывания антигена. И наоборот, если положение CDR сохраняет связывание только в небольшом проценте замен, это положение идентифицируют как положение, которое важно для функции CDR. Таким образом, методы мутагенеза путем сканирования библиотек предоставляют информацию о положениях в CDR, которые могут быть заменены ногосисленными различными аминокислотами (включая все 20 аминокислот), и о положениях в CDR, которые не могут быть заменены или которые могут быть заменены только несколькими аминокислотами.

Кандидаты с улучшенным сродством могут быть объединены во вторую библиотеку, которая включает улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту в этом положении и может дополнительно включать дополнительные замены в этом положении, в зависимости от сложности библиотеки, которая предпочтительна или допустима для использования требуемого метода скрининга или отбора. Кроме того, при необходимости, положение соседней аминокислоты может быть рандомизировано по меньшей мере для двух или более аминокислот. Рандомизация соседних аминокислот может обеспечить дополнительную конформационную гибкость мутантной CDR, что, в свою очередь, может разрешить или облегчить введение большего количества улучшающих мутаций. Библиотека также может содержать замену в положениях, которые не показали улучшенного сродства в первом раунде скрининга.

Вторая библиотека подвергается скринингу или отбору в отношении членов библиотеки с улучшенным и/или измененным сродством связывания с помощью любого метода, известного в данной области, включая скрининг с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™ и отбор с помощью любого метода, известного в данной области для отбора, включая фаговый дисплей, дисплей дрожжей и дисплей рибосом.

Затем следуют методы выделения антител и получения антител. Однако следует учитывать, что антитела могут быть образованы из других полипептидов или в них могут быть включены другие полипептиды с помощью методов, известных в данной области. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая представляющий интерес полипептид (например, лиганд, рецептор или фермент), может быть выделен из библиотеки кДНК, полученной из ткани, которая, как предполагается, содержит мРНК полипептида и экспрессирует ее на детектируемом уровне. Библиотеки проверяют с помощью зондов (таких как антитела или олигонуклеотиды, состоящие из примерно 20-80 оснований), предназначенных для идентификации представляющего интерес гена или кодируемого им белка. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с выбранным зондом можно осуществлять с помощью стандартных процедур, описанных в главах 10-12 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Анти-CD3 антитела для лечения аутоиммунного расстройства

В одном из аспектов предложен способ лечения аутоиммунного расстройства у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей антитела по настоящему изобретению.

В контексте настоящего описания аутоиммунные расстройства включают, помимо прочего, воспалительное заболевание кишечника, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, диабет (типа I), рассеянный склероз, болезнь Аддисона, целиакию, дерматомиозит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, энцефалопатию Хашимото, миастению, реактивный артрит, синдром Шегрена, атопическую аллергию, атопический дерматит, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную периферическую нейропатию, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндемический синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунную крапивницу, аутоиммунный увеит, болезнь Беше, болезнь Кастлемана, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дерматомиозит, эозинофильный фасциит, желудочно-кишечный пемфигоид, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, гнойный гидраденит, нарколепсию, вульгарную пузырьчатку, полимиозит, рецидивирующий полихондрит, ревматическую лихорадку, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированное заболевание соединительной ткани, васкулит и гранулематоз Вегенера.

Полиспецифические антитела и их применение

Анти-CD3 антитела по настоящему изобретению могут быть специфичными к разным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфичные к более чем одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Анти-CD3 антитела по настоящему изобретению могут быть связаны или совместно экспрессироваться с другой функциональной молекулой, например, с другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, с получением полиспецифических антител со второй специфичностью связывания.

В одном из аспектов антитело по настоящему изобретению представляет собой полиспецифическое антитело. В конкретном варианте осуществления анти-CD3 антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое специфически связывается с человеческим CD3. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело дополнительно специфически связывается с опухолевым антигеном. В другом таком варианте осуществления биспецифические антитела по настоящему изобретению нацелены одновременно на Т-клетки (CD3) и опухолевые клетки и успешно направляют Т-клеточную цитотоксичность и активируют ее против опухолевых клеток, экспрессирующих опухолевый антиген.

В дополнительных вариантах осуществления каждого из выше указанных аспектов биспецифическое антитело, которое связывается с CD3, отличается одной или более из следующих характеристик: (a) лечение, предотвращение, облегчение одного или более симптомов состояния, ассоциированного со злокачественными клетками, экспрессирующими специфический опухолевый антиген у субъекта (например, рак, связанный с В-клетками, такой как множественная миелома); (b) подавление роста или прогрессирования опухоли у субъекта (имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую специфический опухолевый антиген); (c) ингибирование метастазирования раковых (злокачественных) клеток, экспрессирующих специфический опухолевый антиген, у субъекта (имеющего одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих опухолевый антиген); (d) индуцирование регрессии (например, долговременной регрессии) опухоли, экспрессирующей опухолевый антиген; (e) проявление цитотоксической активности в злокачественных клетках, экспрессирующих опухолевый антиген; (f) увеличение выживаемости субъекта с ассоциированным с опухолью расстройством без прогрессирования заболевания; (g) увеличение общей выживаемости субъекта с расстройством, ассоциированным с опухолью; (h) сокращение использования дополнительных химиотерапевтических или цитотоксических агентов у субъекта с расстройством, ассоциированным с опухолью; (i) снижение опухолевой нагрузки у субъекта с расстройством, ассоциированным с опухолью; или (j) блокирование взаимодействия опухолевого антигена с другими еще не идентифицированными факторами.

В контексте настоящего описания биспецифическое антитело по настоящему изобретению относится к комплексу, состоящему из двух или более полипептидных цепей, каждая из которых содержит по меньшей мере одну область VL антитела и одну область VH антитела или их фрагмент, причем области VL и VH в каждой полипептидной цепи получают от разных антител. В конкретных аспектах биспецифическое антитело включает димеры или тетрамеры полипептидных цепей, содержащих как область VL, так и область VH. Отдельные полипептидные цепи, содержащие мультимерные белки, могут быть ковалентно связаны по меньшей мере с одним другим пептидом мультимера посредством межцепочечных дисульфидных связей.

В некоторых таких вариантах осуществления биспецифические антитела по настоящему изобретению содержат первый домен, обеспечивающий гетеродимер, на первой полипептидной цепи и второй домен, обеспечивающий гетеродимер, на второй полипептидной цепи (фиг.1). Вместе, первый и второй домены, обеспечивающие гетеродимер, управляют гетеродимеризацией и/или стабилизируют биспецифическое антитело (например, через взаимодействие по типу выступ-во-впадину на доменах, обеспечивающих гетеродимер, комплементарной цепи) и/или служат для стабилизации биспецифического антитела. В некоторых вариантах осуществления как первый домен, обеспечивающий гетеродимер, так и второй домен, обеспечивающий гетеродимер, содержат домен CH2 и домен CH3, причем аминокислотная последовательность каждого из доменов CH2 и/или каждого из доменов CH3 модифицирована с целью управления гетеродимеризацией и/или стабилизацией биспецифического антитела.

В некоторых вариантах осуществления первый домен, обеспечивающий гетеродимер, может содержать Fc цепь, имеющую домен CH2 и/или CH3, модифицированный таким образом, чтобы он содержал либо выступ (выпуклость), либо впадину (полость). В некоторых таких вариантах осуществления аминокислотная последовательность домена CH2 и/или домена CH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, при которой: (а) домен CH3 первого домена, обеспечивающего гетеродимер, образует выступ; и (b) домен CH3 второго домена, обеспечивающего гетеродимер, образует впадину. В другом таком варианте осуществления домен CH3 первого домена, обеспечивающего гетеродимер, содержит мутации Y349C и/или T366W; и домен CH3 второго домена, обеспечивающего гетеродимер, содержит мутации S354C, T366S, L368A и/или Y407V (нумерация согласно индексу ЕU).

В одном из вариантов осуществления первый домен, обеспечивающий гетеродимер, может содержать домен CH2 и/или CH3, модифицированный таким образом, чтобы он содержал выступ (выпуклость), содержащий последовательность SEQ ID NO: 78, если второй домен, обеспечивающий гетеродимер, содержит домен CH2 и/или CH3, модифицированный таким образом, чтобы он содержал впадину (полость). В другом варианте осуществления первый домен, обеспечивающий гетеродимер, может содержать впадину (полость), содержащую последовательность SEQ ID NO: 79, если второй домен, обеспечивающий гетеродимер, содержит домен CH2 и/или CH3, модифицированный таким образом, чтобы он содержал выступ (выпуклость).

Каждая полипептидная цепь биспецифического антитела включает область VL и область VH, которые могут быть ковалентно связаны глицин-сериновым линкером, содержащим остатки глицина и серина (линкер 1 или линкер 2), который предотвращает самосборку доменов антитела. Кроме того, каждая полипептидная цепь включает домен гетеродимеризации, который способствует гетеродимеризации и/или стабилизации нескольких полипептидных цепей и снижает вероятность гомодимеризации разных полипептидных цепей. Домен гетеродимеризации может располагаться на N-конце полипептидной цепи или на C-конце. Домен гетеродимеризации может содержать цистеиновый линкер (линкер 3), который имеет длину 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более аминокислотных остатков. Взаимодействие двух полипептидных цепей может приводить к спариванию VL/VH с образованием двух эпитоп-связывающих доменов, т.е. двухвалентной молекулы. Ни область VH, ни область VL не ограничены каким-либо положением в полипептидной цепи, т.е. не ограничены аминоконцом или карбоксиконцом, а также ни одна из этих областей не ограничена своим положением относительно других областей, т.е. область VL может быть N-терминальной относительно области VH и наоборот. Единственное ограничение заключается в доступности комплементарной полипептидной цепи для образования функционального биспецифического антитела. Если области VL и VH получены из антител, специфичных для разных антигенов, для образования функционального биспецифического антитела необходимо взаимодействия двух разных полипептидных цепей, т.е. образования гетеродимера. Напротив, если две разные полипептидные цепи могут свободно взаимодействовать, например, в рекомбинантной системе экспрессии, в которой одна цепь содержит VLA и VHB (A - первый эпитоп, а B - второй эпитоп), и другая цепь содержит VLB и VHB, то два разных связывающих участка могут образовать: VLA-VHA и VLB-VHB. Любая из пар полипептидных цепей биспецифических антител может иметь нарушенную ориентацию или неправильное связывание двух цепей, например, взаимодействие областей VL-VL или VH-VH. Однако легко можно подобрать очистку функциональных биспецифических антител, основанную на иммуноспецифичности правильно димеризованного связывающего участка, используя любой метод на основе сродства, известный в данной области или приведенный в настоящем описании качестве примера, например, метод аффинной хроматографии.

В одном из вариантов полипептидные цепи биспецифического антитела могут содержать различные линкеры и пептиды. Линкеры и пептиды могут состоять из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления домен 1 ковалентно связан с первым доменом, обеспечивающим гетеродимер, через цистеиновый линкер, и домен 2 ковалентно связан со вторым доменом, обеспечивающим гетеродимер, через цистеиновый линкер. Каждый цистеиновый линкер включает по меньшей мере один цистеиновый остаток, обеспечивая образование внутримолекулярных дисульфидных связей. В дополнительных вариантах осуществления каждого из вышеперечисленного аспекта цистеиновый линкер (линкер 3) содержит по меньшей мере пять аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь ковалентно связана со второй полипептидной цепью по меньшей мере одной дисульфидной связью. В некоторых таких вариантах осуществления между линкером 3 первой полипептидной цепи и линкером 3 второй полипептидной цепи образуется по меньшей мере одна дисульфидная связь. В другом таком варианте осуществления между первым доменом, обеспечивающим гетеродимер, и вторым доменом, обеспечивающим гетеродимер, образуется по меньшей мере одна дисульфидная связь. В конкретных вариантах осуществления каждая дисульфидная связь образована двумя остатками цистеина. В одном из аспектов настоящего изобретения биспецифическое антитело, как показано на фиг. 1, содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь. В некоторых таких вариантах осуществления линкер 3 может содержать укороченную нижнюю шарнирную область человеческого IgG1, имеющую последовательность SEQ ID NO: 64, с по меньшей мере одним остатком глицина, предшествующим нижней шарнирной области.

Биспецифические антитела по изобретению могут одновременно связываться с двумя отдельными и разными эпитопами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один связывающий участок эпитопа специфичен для детерминанты CD3, экспрессируемой на иммунной эффекторной клетке, например, экспрессируемой на Т-лимфоцитах. В одном из вариантов осуществления молекула биспецифического антитела связывается с детерминантой эффекторной клетки, а также активирует эффекторную клетку.

В одном из аспектов изобретения представлена первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь. В одном из вариантов осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36. В другом варианте осуществления вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в одной или более из SEQ ID NO: 37 или 38 (таблица 7). В предпочтительном варианте осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36; и вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 37 или 38. В одном из вариантов осуществления вторая полипептидная цепь представляет собой любой полипептид, способный к ассоциации с первой полипептидной цепью через поверхность контакта. В таблице 7 показаны последовательности первой полипептидной цепи и второй полипептидной цепи для биспецифических антител GUCY2c-H2B4 и GUCY2c-2B5.

Таблица 7

Биспецифическое антитело	Первая полипептидная цепь	Вторая полипептидная цепь
GUCY2c-H2B4	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ IN NO: 36)	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ IN NO: 37)
GUCY2c-2B5	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 36)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 38)

В конкретных вариантах осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению (а) связывается с внеклеточным доменом опухолевого антигена человека; (b) демонстрирует увеличенный период полужизни в сыворотке и опухоли от 30 минут до 100 дней; и/или (c) демонстрирует более низкое значение EC₅₀, составляющее от 0,0001 до 100 нМ, в присутствии повышенных уровней экспрессии опухоли или повышенных уровней плотности рецепторов.

В одном из вариантов осуществления эпитоп-связывающий домен способен связываться с опухоль-ассоциированным антигеном, ассоциированным с раком молочной железы, яичника, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких (включая, без ограничения, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого), мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомой и раком пищеварительной системы. Рак пищеварительной системы включает, без ограничения, рак пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, ануса, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления терапия активирует цитолитический Т-клеточный ответ.

Мутации, обеспечивающие нулевую эффекторную функцию, в CH2-CH3 человеческого IgG1

Fc цепь человеческого IgG1 модифицируют путем введения мутаций L234A, L235A и G237A (SEQ ID NO: 82, нумерация в соответствии с индексом ЕU) с помощью стандартного сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР с использованием праймеров, несущих мутацию, для уменьшения эффекторной функции за счет связывания с FcγRIII, обеспечивая фенотип с нулевой эффекторной функцией (Canfield et al., J. Exp. Med (1991) 173:1483-1491; Shields et al., J. Biol. Chem. (2001) 276: 6591-604).

Мутации по типу «Выступ-во-впадину» в CH2-CH3 человеческого IgG1

«Выступ-во-впадину» является эффективной стратегией конструирования, известной в данной области техники, для конструирования гомодимеров тяжелых цепей антител с целью гетеродимеризации. В этом подходе вариант «выступа» получали путем замены небольшой аминокислоты на более крупную в одной из Fc цепей IgG1, например, Y349C и T366W (нумерация согласно индексу ЕU). «Выступ» подбирали для вставки во «впадину» в домене CH3 комплементарной Fc цепи, созданной заменой большого остатка на меньший, например, S354C, T366S, L368A и Y407V (нумерация огласно индексу ЕU).

В некоторых вариантах осуществления вводили комплементарные мутации для гетеродимеризации полученных цепей Fc так, чтобы каждая Fc цепь несла один набор мутаций, Y349C и T366W для выступа (или выпуклости) в Fc цепи (SEQ ID NO: 78), или S354C, T366S, L368A и Y407V для Fc цепи со впадиной (или полостью) (SEQ ID NO: 79), как показано в таблице 8. При котрансфекции в подходящего млекопитающего-хозяина ДНК, кодирующая аминокислотные последовательности, например SEQ ID NO: 78 и 79, продуцирует домен Fc, который является преимущественно биспецифическим антителом, имеющим одну Fc цепь с выступом (или выпуклостью), связанную с Fc цепью с одной впадиной (или полостью).

Таблица 8

Fc цепь с мутацией «выступ» (SEQ ID NO: 78)	APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
Fc цепь с мутацией «впадина» (SEQ ID NO: 79)	APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Биспецифические антитела к CD3-опухолевому антигену по настоящему изобретению являются стабильными в отношении агрегации по результатам исследования термостабильности и эффективными слитыми белками биспецифического антитела-Fc, нацеленными как на CD3 человека, так и на опухолевый антиген. Fc домен с мутацией «выступ-во-впадину» обеспечивает улучшенную экспрессию в клетках СНО и улучшенную очистку, что обеспечивает высокую чистоту желаемого гетеродимера. Мутации, спроектированные в домене Fc, отменяют связывание с FcR, таким образом позволяя избежать опосредованного ADCC истощения Т-клеток. Кроме того, включение Fc домена в биспецифическое антитело повышает стабильность молекулы, как показано с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Биспецифическое антитело может быть сконструировано таким образом, чтобы оно содержало, по меньшей мере, один остаток цистеина, который может взаимодействовать с аналогичным остатком цистеина на другой полипептидной цепи по изобретению с образованием межцепочечной дисульфидной связи. Межцепочечные дисульфидные связи могут служить для стабилизации биспецифического антитела, улучшения экспрессии и восстановления в рекомбинантных системах, что обеспечивает стабильный и постоянный состав, а также улучшает стабильность выделенного и/или очищенного продукта in vivo. Остаток или остатки цистеина могут быть введены в виде отдельной аминокислоты или в виде части более крупной аминокислотной последовательности, например шарнирной области, в любую часть полипептидной цепи. В конкретном аспекте введен по меньшей мере один остаток цистеина, который находится на С-конце полипептидной цепи.

Изобретение включает способы и композиции для лечения, профилактики или лечения рака у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, сконструированного в соответствии с изобретением, молекула которого дополнительно связывается с раковым антигеном. Антитела по настоящему изобретению могут быть особенно полезны для предотвращения, ингибирования, уменьшения роста и/или регрессии первичных опухолей и метастазирования раковых клеток. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом действия, антитела по изобретению могут опосредовать эффекторную функцию, которая может приводить к исчезновению опухоли, уменьшению опухоли или их комбинации.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам терапевтического лечения, направленным на стимуляции активацию Т-клеток с помощью анти-CD3 антитела по изобретению, при этом терапевтические методы включают введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению. Расстройство, подверженное лечению, представляет собой любое заболевание или состояние, которое купируется, облегчается, подавляется или предотвращается стимуляцией активности или передачи сигналов CD3. В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антигенсвязывающим молекулам, например биспецифическим антителам, которые связываются CD3 и целевым антигеном.

В одном из аспектов изобретение относится к способам подавления роста опухоли, включающим контактирование опухоли с эффективным количеством антитела, которое связывается с CD3, включая каждое из антител, раскрытых в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу подавления роста опухоли у субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с CD3, включая любое антитело, раскрытое в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу модуляции ангиогенеза у субъекта, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое связывает CD3, включая любое антитело, раскрытое в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к способу уменьшения степени онкогенности опухоли у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое связывает CD3, включая любое антитело, раскрытое в настоящем описании.

В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения состояния, связанного с экспрессией опухолевого антигена у субъекта путем конструирования биспецифического антитела, которое иммуноспецифически распознает опухолевый антиген и антиген CD3 на Т-клетках. Биспецифические антитела, которые сконструированы в соответствии с изобретением, полезны для профилактики или лечения рака, поскольку они обладают цитотоксической активностью в отношении индуцированных анти-CD3 антителом активированных Т-киллеров.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения рака. В конкретных вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких (включая, помимо прочего, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого), рак мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластому или рак пищеварительной системы. В некоторых вариантах осуществления рак пищеварительной системы выбирают из группы, состоящей из пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, ануса, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, биспецифическому антителу или фармацевтической композиции, как раскрыто в настоящем описании, для применения в терапии. В конкретном варианте осуществления изобретение также относится к анти-CD3 биспецифическому антителу для применения в способе лечения рака, определенном в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления терапия обеспечивает активацию цитолитического Т-клеточного ответа.

Настоящее изобретение также относится к антителу или биспецифическому антителу, как раскрыто в настоящем описании, для применения в производстве лекарственного средства для использования в терапии. В некоторых вариантах осуществления терапия представляет собой лечение рака. В некоторых вариантах осуществления рак выбирают из группы, состоящей из рака молочной железы, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких (включая, без ограничения, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкго), мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы. В некоторых вариантах осуществления рак пищеварительной системы выбирают из группы, состоящей из пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, ануса, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, который кодирует антитело или биспецифическое антитело, раскрытое в настоящем описании. В другом варианте осуществления изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотиды, раскрытые в настоящем описании. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей векторы, раскрытые в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления клетка-хозяин рекомбинантно продуцирует антитело или биспецифическое антитело, раскрытое в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из линий бактериальных клеток, линий клеток млекопитающих, линий клеток насекомых, линий дрожжевых клеток и систем бесклеточного синтеза белка in vitro. В конкретном варианте осуществления линия клеток млекопитающих представляет собой линию клеток СНО.

В одном из аспектов предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий: а) введение биспецифического антитела по настоящему изобретению, и b) введение указанного биспецифического антитела указанному субъекту.

В некоторых вариантах осуществления предоставлен способ подавления роста или прогрессирования опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие опухолевый антиген, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления предложен способ ингибирования у субъекта метастазирующих клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления предложен способ индукции регрессии опухоли в злокачественных клетках у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей антитела по настоящему изобретению.

В конкретном аспекте антитела по изобретению подавляют или уменьшают рост раковых клеток на по меньшей мере 99%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 10% относительно роста раковых клеток в отсутствие антитела или биспецифического антитела по изобретению.

В конкретном аспекте антитела уничтожают клетки или подавляют или уменьшают рост раковых клеток на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% более эффективно, чем в отсутствие антитела или биспецифических антител по изобретению.

В одном из аспектов изобретение обеспечивает эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей биспецифическое антитело по настоящему изобретению для лечения состояния (например, рака), ассоциированного с экспрессией опухолевого антигена, у нуждающегося в этому субъекта.

В другом аспекте изобретение относится антителам, представленным в настоящем описании, для применения при лечении состояния (например, рака), ассоциированного с экспрессией опухолевого антигена, у нуждающегося в этом субъекта. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела, представленные в настоящем описании, для подавления роста или прогрессирования опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела, представленные в настоящем описании, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих опухолевый антиген, у нуждающегося в этом субъекта. В некоторых вариантах осуществляется предложены антитела, представленные в настоящем описании, для индукции регрессии опухоли у субъекта, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие опухолевый антиген.

В другом аспекте изобретение относится к применению антител, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для лечения состояния (например, рака), ассоциированного с экспрессией опухолевого антигена. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение антител, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для подавления роста или прогрессирования опухоли. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение антител, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение антител, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для индукции регрессии опухоли.

В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем описании, дополнительно включают этап лечения субъекта дополнительной формой терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная форма терапии представляет собой дополнительную противораковую терапию, включая, помимо прочего, химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое вмешательство, гормональную терапию и/или дополнительную иммунотерапию.

Изобретение также включает введение молекул по изобретению в комбинации с другими методами лечения или профилактики рака, известными специалистам в данной области, включая, без ограничения, современные стандартные и экспериментальные методы химиотерапии, биологические методы лечения, иммунотерапию, лучевую терапию или операцию. В некоторых аспектах молекулы по изобретению можно вводить в комбинации с терапевтически или профилактически эффективным количеством одного или более агентов, терапевтических антител или других агентов, известных специалистам в данной области для лечения и/или профилактики рака.

Соответственно, способы лечения рака включают введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества полиспецифического антитела (например, биспецифического антитела) по настоящему изобретению в комбинации с химиотерапевтическим агентом. Такое комбинированное лечение можно вводить отдельно, последовательно или одновременно.

Раскрытые в настоящем описании количества доз и частота введения охвачены терминами терапевтически эффективный и профилактически эффективный. Дозировка и частота дополнительно могут меняться в зависимости от факторов, специфичных для каждого субъекта, в зависимости от конкретных вводимых терапевтических или профилактических средств, тяжести и типа рака, пути введения, а также возраста, массы тела, реакции субъекта и истории болезни. Специалист в данной области может подобрать подходящий режим лечения с учетом таких факторов и следуя, например, дозировкам, указанным в литературе и рекомендованным в Physician's Desk Reference (56-е изд., 2002 г.).

Соответственно, помимо перенаправления Т-клеток на опухолеспецифические антигены, биспецифические молекулы, взаимодействующие с Т-клетками, также можно использовать для переноса других диагностических или терапевтических соединений к клеткам, экспрессирующим опухоль на своей поверхности. Таким образом, биспецифическая молекула, взаимодействующая с Т-клетками, может быть присоединена прямо или опосредованно, например через линкер, к лекарственному веществу для его доставки непосредственно в несущие опухоль клетки. Терапевтические агенты включают такие соединения, как нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, аминокислоты или производные, гликопротеины, радиоизотопы, липиды, углеводы или рекомбинантные вирусы. Терапевтические и диагностические фрагменты нуклеиновых кислот включают антисмысловые нуклеиновые кислоты, дериватизированные олигонуклеотиды для сшивки посредством ковалентных связей с одно или двухцепочечной ДНК и триплексообразующие олигонуклеотиды.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество раскрытого в настоящем описании антитела и фармацевтически приемлемый носитель.

Антитела по настоящему изобретению могут быть представлены в виде предназначенной для введения фармацевтической композиции, приготовленной в соответствии с выбранным способом введения с фармацевтически приемлемым разбавителем или вспомогательными веществами, такими как буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, регулирующие изотоничность агенты, стабилизирующие агенты, носители и т.п. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, 18-е изд., 1995, предоставляет собой сборник методов, используемых для приготовления лекарственных составов, которые как правило известны специалистам-практикам.

Эти фармацевтические композиции можно вводить любыми способами, известными в данной области, которые обеспечивают достижение цели, которая обычно заключается в лечении рака. Путь введения может быть парентеральным, который в контексте описания относится к способам введения, включающим, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Способ введения и дозирование молекул по изобретению (например, антител, фармацевтической композиции) зависят от типа заболевания, предназначенного для лечения, либо от стадии заболевания, антигена, который необходимо контролировать, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты приема лечения, характера желаемого эффекта, а также массы тела, возраста, состояния здоровья, диеты и пола пациента. Таким образом, фактически применяемый режим дозирования может меняться в широких пределах и, следовательно, может отклоняться от режимов дозирования, раскрытых в настоящем описании.

Для введения могут использоваться различные составы антител, содержащие антитела по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитела можно вводить в чистом виде. В некоторых вариантах осуществления антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель могут находиться в различных составах. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества известны в данной области и представляют собой относительно инертные вещества, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, вспомогательное вещество может придавать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие вспомогательные вещества включают, без ограничения, стабилизирующие агенты, смачивающие и эмульгирующие агенты, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проникновения через кожу. Наполнители, а также составы для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственных веществ раскрыты в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

В некоторых вариантах осуществления эти агенты приготовлены в виде состава, предназначенного для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Соответственно, эти агенты можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретный режим дозирования, т.е. доза, время и повторное введение, будет зависеть от конкретного человека и его истории болезни.

Раскрытые в настоящем описании антитела можно вводить с помощью любого подходящего метода, включая инъекцию (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Антитело, например моноклональное антитело или биспецифическое антитело, также можно вводить путем ингаляции, как раскрыто в настоящем описании. Как правило, доза вводимого антитела по настоящему изобретению зависит от хозяина, которого лечат, и конкретного способа введения. В одном из вариантов осуществления диапазон доз антитела по настоящему изобретению может составлять от примерно 0,001 мкг/кг веса тела до примерно 20000 мкг/кг веса тела. Термин «масса тела» применяется к пациенту, получающему лечение. Когда обрабатываются выделенные клетки, «масса тела» в контексте настоящего описания относится к «общей клеточной массе тела». Термин «общая масса тела» может использоваться как для лечения обработки клеток, так и для лечения пациента. Все концентрации и уровни лечения в настоящем описании, выраженные как «масса тела» или просто «кг», также следует рассматривать как включающие аналогичные концентрации «общей клеточной массы тела» и «общей массы тела». Однако специалистам в данной области понятна практическая ценность многообразия диапазона доз, например, от 0,01 мкг/кг массы тела до 20000 мкг/кг массы тела, от 0,02 мкг/кг массы тела до 15000 мкг/кг массы тела, от 0,03 мкг/кг массы тела до 10000 мкг/кг массы тела, от 0,04 мкг/кг массы тела до 5000 мкг/кг массы тела, от 0,05 мкг/кг массы тела до 2500 мкг/кг массы тела, от 0,06 мкг/кг массы тела до 1000 мкг/кг массы тела, от 0,07 мкг/кг массы тела до 500 мкг/кг массы тела, от 0,08 мкг/кг массы тела до 400 мкг/кг массы тела, от 0,09 мкг/кг массы тела до 200 мкг/кг массы тела или от 0,1 мкг/кг массы тела до 100 мкг/кг массы тела. Кроме того, специалисты поймут, что можно использовать различные уровни дозирования, например, 0,0001 мкг/кг, 0,0002 мкг/кг, 0,0003 мкг/кг, 0,0004 мкг/кг, 0,005 мкг/кг, 0,0007 мкг/кг, 0,001 мкг/кг, 0,1 мкг/кг, 1,0 мкг/кг, 1,5 мкг/кг, 2,0 мкг/кг, 5,0 мкг/кг, 10,0 мкг/кг, 15,0 мкг/кг, 30,0 мкг/кг, 50 мкг/кг, 75 мкг/кг, 80 мкг/кг, 90 мкг/кг, 100 мкг/кг, 120 мкг/кг, 140 мкг/кг, 150 мкг/кг, 160 мкг/кг, 180 мкг/кг, 200 мкг/кг, 225 мкг/кг, 250 мкг/кг, 275 мкг/кг, 300 мкг/кг, 325 мкг/кг, 350 мкг/кг, 375 мкг/кг, 400 мкг/кг, 450 мкг/кг, 500 мкг/кг, 550 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 750 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг, 1 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 12 мкг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг и/или 30 мг/кг. Все эти дозировки являются примерными, и ожидается, что, согласно изобретению, может быть применена любая доза между этими точками. Для антитела по настоящему изобретению можно использовать любой из вышеуказанных диапазонов доз или уровней доз. При повторных введениях в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до требуемого уровня подавления симптомов или до достижения достаточных терапевтических уровней, например, до подавления или задержки роста/прогрессирования опухоли или метастазирования раковых клеток.

Также могут быть полезны другие режимы дозирования, в зависимости от формы фармакокинетического распада, которого желает достичь практикующий врач. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению вводят в начальной дозе с последующей более высокой дозой и/или в непрерывной, по существу постоянной дозе. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено введение дозы от одного до четырех раз в неделю. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено введение дозы один раз в месяц, один раз в два месяца или каждые три месяца. Прогресс этой терапии легко контролировать с помощью обычных методов и тестов. Режим дозирования может со временем меняться.

Для целей настоящего изобретения подходящая доза антитела будет зависеть от применяемого антитела или его композиций, типа и тяжести симптомов, подлежащих лечению, от того, вводится ли агент в терапевтических целях, от предшествующей терапии, от истории болезни пациента и ответа на агент, скорости клиренса введенного агента из организма пациента и усмотрения лечащего врача. Обычно врач назначает введение антитела до тех пор, пока не будет достигнут желаемый результат. Доза и/или частота дозирования могут меняться в зависимости от курса лечения. Величину дозы обычно определяют, исходя из эмпирических соображений, таких как период полураспада. Например, для продления периода полужизни антитела и предотвращения атаки антитела со стороны иммунной системы хозяина можно использовать антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела. Частота введения может быть определена и скорректирована в ходе терапии и обычно, но не обязательно, основана на лечении и/или подавлении, и/или облегчении, и/или задержке симптомов, например, ингибировании или задержке роста опухоли и т.д. Альтернативно, подходящими могут оказаться составы антител с замедленным непрерывным высвобождением. В данной области известны различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения.

В одном из вариантов осуществления дозы антитела могут быть определены эмпирически у индивидуумов, получающих одно или более введений антитела. Людям вводят возрастающие дозы антитела. Для оценки эффективности можно следить за показателем заболевания.

В некоторых вариантах осуществления введение антитела приводит по меньшей мере к одному эффекту, выбранному из группы, состоящей из: подавления роста опухоли, регрессии опухоли, уменьшения размера опухоли, уменьшения количества опухолевых клеток, задержки роста опухоли, абскопального эффекта, ингибирования метастазирования опухоли, уменьшения количества метастатических поражений с течением времени, сокращения использования химиотерапевтических или цитотоксических агентов, снижения опухолевой нагрузки, увеличения выживаемости без прогрессирования, увеличения общей выживаемости, полного ответа, частичного ответа и стабильного заболевания.

Введение антитела в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть непрерывным или периодическим, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, от того, является ли цель введения терапевтической или профилактической, а также от других факторов, известных квалифицированным врачам-практикам. Введение антитела по существу может быть непрерывным в течение заранее выбранного периода времени или может осуществляться в виде нескольких разнесенных по времени доз.

В некоторых вариантах осуществления может присутствовать более одного антитела. Может присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более различных антител. Как правило, эти антитела могут иметь дополнительные активности, которые не оказывают друг на друга отрицательного влияния. Например, можно использовать одно или более из следующих антител: первое анти-CD3 антитело, направленное на один эпитоп на CD3, и второе анти-CD3 антитело, направленное на другой эпитоп на CD3.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению особенно полезны для парентерального введения, такого как внутривенное введение или введение в полость тела или просвет органа.

Терапевтические составы антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела с требуемой степенью чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005) в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензил аммония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области, такими как описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; и патенте США. №№ 4,485,045 и 4,544,545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты в патентах США № 5,013,556. Особенно полезные липосомы могут быть получены методом обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и производное фосфатидилэтаноламина с PEG (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор с получением липосом требуемого диаметра.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, липосомах, микросферах альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы раскрыты в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем эти матрицы имеют форму оформленных изделий, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7 этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), изобутират ацетата сахарозы и поли-D-(-)-3-оксимасляную кислоту.

Составы, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается, например, фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны. Композиции терапевтического антитела (например, анти-CD3 антитела) обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций.

Композиции по настоящему изобретению могут быть в виде стандартных дозированных форм, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозиториев для перорального, парентерального или ректального введения или введения путем ингаляции или инсуффляции.

Для приготовления твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например, с традиционными ингредиентами для таблетирования, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или камеди, и другими фармацевтическими разбавителями, например водой, для образования твердой предварительной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению или его нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. При указании на то, что такие предварительные составы композиций являются гомогенными, имеется в виду, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всему объему композиции так, что композиция может быть легко разделена на одинаково эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Эту твердую предварительную композицию затем делят на стандартные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до примерно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты оболочкой или смешаны иным образом для получения лекарственной формы, обеспечивающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать компонент внутренней дозы и компонент внешней дозы, причем последний находится в виде оболочки, покрывающей первый компонент. Два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который предотвращает распад внутреннего компонента в желудке и позволяет ему проникать в двенадцатиперстную кишку в неповрежденном виде или задерживает его высвобождение. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий можно использовать различные материалы, включая ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящие поверхностно-активные агенты включают, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Tween™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Span™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным агентом обычно содержат от 0,05 до 5% поверхностно-активного агента, например, от 0,1 до 2,5%. Следует понимать, что при необходимости могут быть добавлены другие ингредиенты, например маннит или другие фармацевтически приемлемые носители.

Композиции по изобретению включают все композиции, в которых антитело присутствует в количестве, эффективном для достижения требуемого медицинского эффекта при лечении рака. Хотя индивидуальные потребности могут меняться от одного пациента к другому, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств всех компонентов находится в компетенции обычного врача.

Примеры таких композиций, а также способы их приготовления также были описаны выше и дополнительно описаны ниже. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно или более антител. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область, которая способна вызывать требуемый иммунный ответ, такой как опосредованный антителами лизис или ADCC. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область, которая не вызывает нежелательного иммунного ответа, такого как опосредованный антителами лизис или ADCC.

Понятно, что композиции могут содержать более одного антитела, например смесь анти-CD3 антител, которые распознают разные эпитопы CD3 или CD3 и опухолевый антиген. Другие иллюстративные композиции содержат более одного антитела, которые распознает один и тот же эпитоп(ы), или разные виды антител, или которые связываются с разными эпитопами CD3 и опухолевым антигеном (например, CD3 человека).

В некоторых вариантах осуществления антитело можно вводить в комбинации с введением одного или более дополнительных терапевтических агентов. Это включет, без ограничения, введение биотерапевтического агента и/или химиотерапевтического агента, такого как, без ограничения, вакцина, терапию на основе CAR-T-клеток, лучевую терапию, цитокиновую терапию, биспецифическое анти-CD3 антитело, ингибитор других иммуносупрессивных путей, ингибитор ангиогенеза, активатор Т-клеток, ингибитор метаболического пути, ингибитор mTOR, ингибитор аденозинового пути, ингибитор тирозинкиназы, включая, помимо прочего, Инлита, ингибиторы ALK и сунитиниб, ингибитор BRAF, эпигенетический модификатор, ингибитор IDO1, ингибитор JAK, ингибитор STAT, ингибитор циклин-зависимой киназы, биотерапевтический агент (включая, помимо прочего, антитела к VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, рецепторы других факторов роста, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, TIGIT и ICOS), иммуногенный агент (например, аттенуированные раковые клетки, опухолевые антигены, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, стимулированные антигеном опухолевого происхождения или нуклеиновыми кислотами, иммуностимулирующие цитокины (например, IL-2, IFNα2, GM-CSF) и клетки, трансфицированные генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины, такие как GM-CSF, без ограничения).

Примеры биотерапевтических агентов включают терапевтические антитела, иммуномодулирующие агенты и терапевтические иммунные клетки.

Терапевтические антитела могут обладать специфичностью в отношении множества различных антигенов. Например, терапевтические антитела могут быть направлены на ассоциированный с опухолью антиген так, что связывание антитела с антигеном приводит к гибели клетки, экспрессирующей антиген. В другом примере терапевтические антитела могут быть направлены на антиген (например, PD-1) на иммунной клетке так, что связывание антитела предотвращает подавление активности клетки, экспрессирующей антиген (и, таким образом, активирует клетку, экспрессирующую антиген). В некоторых ситуациях терапевтическое антитело может функционировать на основе нескольких разных механизмов (например, оно может как i) способствовать гибели клетки, экспрессирующей антиген, так и ii) предотвращать опосредованное антигеном снижение активности иммунных клеток, контактирующих с клеткой, экспрессирующей антиген).

Терапевтические антитела могут быть направлены, например, на перечисленные ниже антигены. Для некоторых антигенов ниже (в скобках/круглых скобках после антигена) также указаны типичные антитела, направленные на этот антиген. Приведенные ниже антигены также могут называться в настоящем описании «целевыми антигенами» или т.п. В настоящем описании целевые антигены для терапевтических антител включают, например: 4-1BB (например, утомилумаб); 5Т4; A33; рецептор 1 альфа-фолиевой кислоты (например, мирветуксимаб соравтансин); Alk-1; BCMA [например, PF-06863135 (см. US9969809)]; BTN1A1 (например, см. WO2018222689); CA-125 (например, абаговомаб); карбоангидраза IX; CCR2; CCR4 (например, могамулизумаб); CCR5 (например, леронлимаб); CCR8; CD3 [например, блинатумомаб (биспецифическое CD3/CD19), PF-06671008 (биспецифическое CD3/P-кадгерин), PF-06863135 (биспецифическое CD3/BCMA), PF-07062119 (биспецифическое CD3/GUCY2c)] CD19 (например, блинатумомаб, MOR208); CD20 (например, ибритумомаб тиуксетан, обинутузумаб, офатумумаб, ритуксимаб, ублитуксимаб); CD22 (инотузумаб озогамицин, моксетумомаб пасудотокс); CD25; CD28; CD30 (например, брентуксимаб ведотин); CD33 (например, гемтузумаб озогамицин); CD38 (например, даратумумаб, изатуксимаб), CD40; CD-40L; CD44v6; CD47; CD52 (например, алемтузумаб); CD63; CD79 (например, полатузумаб ведотин); CD80; CD123; CD276/B7-H3 (например, омбуртамаб); CDH17; CEA; ClhCG; CTLA-4 (например, ипилимумаб, тремелимумаб), CXCR4; десмоглеин 4; DLL3 (например, ровалпитузумаб тезирин); DLL4; E-кадгерин; EDA; ЕАБР; EFNA4; EGFR (например, цетуксимаб, депатуксизумаб, мафодотин, нецитумумаб, панитумумаб); EGFRvIII; Эндосиалин; EpCAM (например, опортузумаб монатокс); FAP; рецептор ацетилхолина плода; FLT3 (например, см. WO2018/220584); GD2 (например, динутуксимаб, 3F8); GD3; GITR; GloboH; GM1; GM2; GUCY2C (например, PF-07062119); HER2/neu [например, маргетуксимаб, пертузумаб, трастузумаб; адо-трастузумаб эмтанзин, трастузумаб дуокармазин, PF-06804103 (см. US8828401)]; HER3; HER4; ICOS; IL-10; ITG-AvB6; LAG-3 (например, релатлимаб); Lewis-Y; LG; Ly-6; M-CSF [например, PD-0360324 (см. US7326414)]; MCSP; мезотелин; MUC1; MUC2; MUC3; MUC4; MUC5AC; MUC5B; MUC7; MUC16; Notch1; Notch3; Нектин-4 (например, энфортумаб ведотин); OX40 [например, PF-04518600 (см. US7960515)]; P-кадгерин [например, PF-06671008 (см. WO2016/001810)]; PCDHB2; PD-1 [например, BCD-100, камрелизумаб, цемиплимаб, генолимзумаб (CBT-501), MEDI0680, ниволумаб, пембролизумаб, RN888 (см. WO2016/092419), синтилимаб, спартализумаб, STI-A1110, тислелизумаб, TSR-0]; PD-L1 (например, атезолизумаб, дурвалумаб, BMS-936559 (MDX-1105) или LY3300054); PDGFRA (например, оларатумаб); антиген плазматических клеток; PolySA; PSCA; PSMA; PTK7 [например, PF-06647020 (см. US9409995)]; Ror1; SAS; SCRx6; SLAMF7 (например, элотузумаб); SHH; SIRPa (например, ED9, Effi-DEM); STEAP; TGF-бета; TIGIT; TIM-3; TMPRSS3; предшественник TNF-альфа; TROP-2 (например, сацитузумаб говитекан); TSPAN8; VEGF (например, бевацизумаб, бролуцизумаб); VEGFR1 (например, ранибизумаб); VEGFR2 (например, рамуцирумаб, ранибизумаб); Wue-1.

Терапевтические антитела могут иметь любой подходящий формат. Например, терапевтические антитела могут иметь любой формат, раскрытый в настоящем описании в другом месте. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело может быть голым антителом. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело может быть связано с лекарственным веществом/агентом (также известным как «конъюгат антитело-лекарственное средство» (ADC)). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело к конкретному антигену может быть включено в полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

В некоторых вариантах осуществления антитело, направленное на антиген, может быть конъюгировано с лекарственным веществом/агентом. Молекулы лекарственного вещества, связанные с антителом, также называются «конъюгатами антитело-лекарственное вещество» (ADC). Лекарственные вещества/агенты могут быть связаны с антителом непосредственно или опосредованно через линкер. Чаще всего токсичные лекарственные вещества связаны с антителом так, чтобы связывание ADC с соответствующим антигеном приводило к уничтожению клеток, экспрессирующих антиген. Например, ADC, которые связаны с токсичными лекарственными веществами, особенно полезны для нацеливания на антигены, ассоциированные с опухолью, что способствует уничтожению опухолевых клеток, которые экспрессируют ассоциированные с опухолью антигены. В других вариантах осуществления агенты, которые могут быть связаны с антителом, могут представлять собой, например, иммуномодулирующий агент (например, для модуляции активности иммунных клеток в непосредственной близости от ADC), агентом визуализации (например, для облегчения визуализации ADC у субъекта или в биологического образце, полученном от субъекта), или агентом для увеличения периода полужизни антитела в сыворотке или увеличения биоактивности.

Способы конъюгации цитотоксического агента или других терапевтических агентов с антителами описаны в различных публикациях. Например, антитела могут быть химически модифицированы либо через амины лизина боковых цепей, либо через сульфгидрильные группы цистеина, активируемые восстановлением межцепочечных дисульфидных связей для протекания реакции конъюгации. См., например, Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096, 2005, и Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004. Также были описаны реактивные остатки цистеина, введенные в конкретные участки антител для конъюгации специфического лекарственного вещества с определенной стехиометрией. См., например, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008. Конъюгация с использованием метки, содержащей глутамин (ацильный донор), или эндогенного глутамина, приведенного в реактивное состояние (т.е. способности образовывать ковалентную связь в качестве ацильного донора) путем создания полипептида в присутствии трансглутаминазы и амина (например, цитотоксического агента, содержащего реакционноспособный амин или присоединенного к нему), также описана в международных заявках WO2012/059882 и WO2015015448. В некоторых вариантах осуществления ADC может обладать любыми функциями или характеристиками ADC, представленными в WO2016166629, которая включена в настоящее описание в виде ссылки для всех целей.

Лекарственные вещества/агенты, которые могут быть связаны с антителом в формате ADC, могут включать, например, цитотоксические агенты, иммуномодуляторы, агенты визуализации, терапевтические белки, биополимеры или олигонуклеотиды.

Типичные цитотоксические агенты, которые могут быть включены в ADC, включают антрациклин, ауристатин, доластатин, комбретастатин, дуокармицин, димер пирролобензодиазепина, димер индолинобензодиазепина, энедиин, гелданамицин, майтанзин, пиромицин, таксан, алкалоид барвинка, камптотецин, тубулизин, гемиастерлин, сплайсостатин, пладиенолид и их стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные.

Типичные иммуномодулирующие агенты, которые могут быть включены в ADC, включают ганцикловир, этанерцепт, такролимус, сиролимус, воклоспорин, циклоспорин, рапамицин, циклофосфамид, азатиоприн, микофенолгат мофетил, метотрекстрат, глюкокортикоид и его аналоги, цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, фактор некроза опухоли (TNF), гемопоэтические факторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 и IL-21), колониестимулирующие факторы (например, фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF) и фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF)), интерфероны (например, интерфероны-альфа, -бета и -гамма), фактор роста стволовых клеток, обозначенный как «фактор S 1», эритропоэтин и тромбопоэтин или их комбинацию.

Примеры агентов визуализации, которые могут быть включены в ADC, включают флуоресцеин, родамин, лантанидные фосфоры и их производные или радиоизотоп, связанный с хелатором. Примеры флуорофоров включают, без ограничения, флуоресцеина изотиоцианат (FITC) (например, 5-FITC), флуоресцеина амидит (FAM) (например, 5-FAM), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor.RTM. (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5-TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101). Примеры хелаторов включают, без ограничения, 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N, N',N”,N”’-тетрауксусную кислоту (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA), 1,4,7-триазациклононан, 1-глутаровую кислоту-4,7-уксусную кислоту (дефероксамин), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N, N,N, N'-тетрауксусную кислоту) (BAPTA).

Примеры терапевтических белков, которые могут быть включены в ADC, включают токсин, гормон, фермент и фактор роста.

Примеры биосовместимых полимеров, которые могут быть включены в ADC, включают водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG) или его производные, и биосовместимые полимеры, содержащие цвиттерион (например, полимер, содержащий фосфорилхолин).

Примеры биосовместимых полимеров, которые могут быть включены в ADC, включают антисмысловые олигонуклеотиды.

В некоторых вариантах осуществления антитело, направленное на антиген, раскрытое в настоящем описании, может быть включено в молекулу биспецифического антитела. Биспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя разными антигенами.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело включает первый вариабельный домен антитела и второй вариабельный домен антитела, причем первый вариабельный домен антитела способен рекрутировать активность эффекторной клетки иммунной системы человека путем специфического связывания с CD3, как предусмотрено в настоящем описании, и причем второй вариабельный домен антитела способен специфически связываться с целевым антигеном. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществление антитело содержит иммунологически инертную Fc область. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело или гуманизированное антитело.

Целевой антиген обычно экспрессируется на целевой клетке в болезненном состоянии (например, раковой клетке). Примеры целевых антигенов, представляющих особый интерес в случае биспецифических антител, включают, помимо прочего, BCMA, EpCAM (молекула адгезии эпителиальных клеток), CCR5 (рецептор хемокина типа 5), CD19, HER (рецептор фактора эпидермального роста человека)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозид GD3, 9-O-ацетил-GD3, GM2, Globo H, фукозил GM1, Poly SA, GD2, карбоангидразу IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, антиген плазматических клеток, (мембраносвязанный) IgE, MCSP (протеогликан хондроитинсульфата меланомы), CCR8, предшественник TNF-альфа, STEAP, мезотелин, антиген A33, PSCA (антиген стволовых клеток простаты), Ly-6; десмоглеин 4, неоэпитоп E-кадгерина, ацетилхолиновый рецептор плода, CD25, маркер CA19-9, маркер CA-125 и рецептор MIS (ингибирующее вещество Мюллера) типа II, sTn (сиалированный антиген Tn; TAG-72), FAP (антиген активации фибробластов), эндосиалин, EGFRvIII, LG, SAS, PD-L1, CD47, SIRPa и CD63.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело содержит полноразмерное человеческое антитело, в котором первый вариабельный домен биспецифического антитела способен рекрутировать активность эффекторной клетки иммунной системы человека путем специфического связывания с CD3, и в котором второй вариабельный домен антитела гетеродимерного белка способен специфически связываться с целевым антигеном (например, CD20, EpCAM или P-кадгерином).

Способы получения биспецифических антител известны в данной области (см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986). Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител было основано на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, причем две тяжелые цепи имели разные специфичности (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).

Согласно одному из подходов к получению биспецифических антител вариабельные домены антитела с требуемой специфичностью связывания (участки, объединяющие антитело-антиген) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно выполняют с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей по меньшей мере часть шарнирной области, области СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере у одного из партнеров слияния присутствовала первая константная область тяжелой цепи (CH1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие предназначенные для слияния тяжелые цепи иммуноглобулина и, при необходимости, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это позволяет регулировать долю каждого из полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда оптимальные выходы обеспечивают неравные соотношения трех полипептидных цепей, используемых в конструкции. Однако можно вставить последовательности, кодирующие две или все три полипептидные цепи, в один вектор экспрессии, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях обеспечивает высокий выход или когда соотношения не имеют особого значения.

В одном из подходов биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и пары тяжелая/легкая цепи гибридного иммуноглобулина (обеспечивающей вторую специфичность связывания) на другом плече. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулина. Этот подход описан в публикации РСТ № WO 94/04690.

В другом подходе биспецифические антитела состоят из модификации аминокислоты в первой шарнирной области на одном плече, при этом замещенная/замененная аминокислота в первой шарнирной области имеет заряд, противоположный заряду соответствующей аминокислоты во второй шарнирной области на другом плече. Этот подход описан в международной патентной заявке № PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

В другом подходе образование требуемого гетеромультимерного или гетеродимерного белка (например, биспецифического антитела) увеличивают путем изменения или создания области контакта между первой и второй иммуноглобулин-подобными Fc областями (например, шарнирной областью и/или областью CH3). В этом подходе биспецифические антитела могут состоять из области CH3, причем область CH3 включает первый полипептид CH3 и второй полипептид CH3, которые взаимодействуют вместе с образованием области контакта CH3, где одна или более аминокислот в этой области контакта CH3 дестабилизируют образование гомодимера и не являются электростатически неблагоприятными для образования гомодимеров. Этот подход описан в международной патентной заявке № PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

В другом подходе биспецифические антитела могут быть созданы с использованием глутамин-содержащего пептидного тега, сконструированного для антитела, направленного на эпитоп (например, BCMA) на одном плече, и другого пептидного тега (например, Lys-содержащего пептидного тега или реактивного эндогенного Lys), сконструированного на втором антителе, направленном на второй эпитоп, на другом плече в присутствии трансглутаминазы. Этот подход описан в международной патентной заявке № PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882).

В некоторых вариантах осуществления первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела содержат модификации аминокислот в положениях, в которых первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела содержат модификации аминокислот в положениях 223, 225 и 228 (например, (C223E или C223R), (E225R) и (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации ЕUС)) в области CH3 человеческого IgG2.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела содержат модификации аминокислот в положениях 221 и 228 (например, (D221R или D221E) и (P228R или P228E)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации EU)) в области CH3 человеческого IgG1.

В некоторых вариантах осуществления первый и второй вариабельные домены биспецифического антитела содержат модификации аминокислот в положениях 228 (например, (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, R409 или L368E (схема нумерация EU)) в области CH3 человеческого IgG4.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело может иметь любые признаки или характеристики любого из биспецифических антител, представленных в заявке на патент WO2016166629, включенной в качестве ссылки для всех целей.

Иммуномодулирующие агенты включают множество различных типов молекул, которые могут стимулировать иммунный ответ у субъекта, таких как агонисты рецепторов распознавания паттернов (PRR), иммуностимулирующие цитокины и противораковые вакцины.

Рецепторы распознавания паттернов (PRR) представляют собой рецепторы, которые экспрессируются клетками иммунной системы и распознают множество молекул, связанных с патогенами и/или повреждением или гибелью клеток. PRR участвуют как во врожденном иммунном ответе, так и в адаптивном иммунном ответе. Агонисты PRR можно использовать для стимуляции иммунного ответа у субъекта. Существует несколько классов молекул PRR, включая толл-подобные рецепторы (TLR), RIG-I-подобные рецепторы (RLR), нуклеотид-связывающие домены олигомеризации (NOD)-подобные рецепторы (NLR), лектиновые рецепторы C-типа (CLR) и белок стимулятор генов интерферона (STING).

Термины «TLR» и «toll-подобный рецептор» относятся к любому toll-подобному рецептору. Toll-подобные рецепторы представляют собой рецепторы, участвующие в активации иммунных ответов. TLR распознают, например, молекулярные паттерны, связанные с патогенами (PAMP), экспрессируемые в микробах, а также молекулярные паттерны, ассоциированные с эндогенными повреждениями (DAMP), которые высвобождаются из мертвых или умирающих клеток.

Молекулы, которые активируют TLR (и тем самым активируют иммунные ответы), называются в настоящем описании «агонистами TLR». Агонисты TLR могут включать, например, малые молекулы (например, органическую молекулу с молекулярной массой менее примерно 1000 Дальтон), а также большие молекулы (например, олигонуклеотиды и белки). Некоторые агонисты TLR специфичны для одного типа TLR (например, TLR3 или TLR9), в то время как некоторые агонисты TLR активируют два или более типа TLR (например, как TLR7, так и TLR8).

Примеры агонистов TLR, представленных в настоящем описании, включают агонисты TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 и TLR9.

Примеры низкомолекулярных агонистов TLR включают агонисты, раскрытые, например, в патентах США №№ 4,689,338; 4,929,624; 5,266,575; 5,268,376; 5,346,905; 5,352,784; 5,389,640; 5,446,153; 5,482,936; 5,756,747; 6,110,929; 6,194,425; 6,331,539; 6,376,669; 6,451,810; 6,525,064; 6,541,485; 6,545,016; 6,545,017; 6,573,273; 6,656,938; 6,660,735; 6,660,747; 6,664,260; 6,664,264; 6,664,265; 6,667,312; 6,670,372; 6,677,347; 6,677,348; 6,677,349; 6,683,088; 6,756,382; 6,797,718; 6,818,650; и 7,7091,214; публикацих патентов США №№ 2004/0091491, 2004/0176367 и 2006/0100229; и международных публикациях №№ WO 2005/18551, WO 2005/18556, WO 2005/20999, WO 2005/032484, WO 2005/048933, WO 2005/048945, WO 2005/051317, WO 2005/051324, WO 2005/066169, WO 2005/066170, WO 2005/066172, WO 2005/076783, WO 2005/079195, WO 2005/094531, WO 2005/123079, WO 2005/123080, WO 2006/009826, WO 2006/009832, WO 2006/026760, WO 2006/028451, WO 2006/028545, WO 2006/028962, WO 2006/029115, WO 2006/038923, WO 2006/065280, WO 2006/074003, WO 2006/083440, WO 2006/086449, WO 2006/091394, WO 2006/086633, WO 2006/086634, WO 2006/091567, WO 2006/091568, WO 2006/091647, WO 2006/093514 и WO 2006/098852.

Дополнительные примеры низкомолекулярных агонистов TLR включают некоторые производные пурина (например, описанные в патентах США №№ 6,376,501 и 6,028,076), некоторые амидные производные имидазохинолина (например, описанные в патенте США № 6,069,149), некоторые производные имидазопиридина (например, описанные в патенте США № 6,518,265), некоторые производные бензимидазола (например, описанные в патенте США № 6,387,938), некоторые производные 4-аминопиримидина, конденсированного с пятичленным азотсодержащим гетероциклическим кольцом (например, производные аденина, описанные в патентах США №№ 6,376,501; 6,028,076 и 6,329,381; и в WO 02/08905), и некоторые производные 3-β-D-рибофуранозилтиазоло[4,5-d]пиримидина (например, описанные в публикации США № 2003/0199461), и некоторые низкомолекулярные иммуностимулирующие соединения, такие как описанные, например, в публикации патента США № 2005/0136065.

Типичные макромолекулярные агонисты TLR включают олигонуклеотидные последовательности. Некоторые олигонуклеотидные последовательности агонистов TLR содержат цитозин-гуаниндинуклеотиды (CpG) и описаны, например, в патентах США №№ 6,194,388; 6,207,646; 6,239,116; 6,339,068; и 6,406,705. Некоторые CpG-содержащие олигонуклеотиды могут включать синтетические иммуномодулирующие структурные мотивы, такие как описанные, например, в патентах США №№ 6,426,334 и 6,476,000. В других нуклеотидных последовательностях агонистов TLR отсутствуют последовательности CpG, и они описаны, например, в международной патентной публикации № WO 00/75304. Еще одни нуклеотидные последовательности агонистов TLR включают богатую гуанозином и уридином одноцепочечную РНК (оцРНК), такую как описано, например, в Heil et al., Science, vol. 303, pp. 1526-1529, Mar. 5, 2004.

Другие агонисты TLR включают биологические молекулы, такие как аминоалкилглюкозаминидфосфаты (AGP), и описаны, например, в патентах США №№ 6,113,918; 6 303 347; 6,525,028; и 6,649,172.

Агонисты TLR также включают инактивированные патогены или их фракции, которые могут активировать несколько различных типов рецепторов TLR. Типичные агонисты TLR, полученные из патогенов, включают BCG, экстракт микобактерий M. obuense, талимоген лахерпарепвек(T-Vec) (полученный из HSV-1) и Pexa-Vec (полученный из вируса вакцины).

В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может представлять собой антитело-агонист, которое специфически связывается с TLR.

Ниже приведено краткое описание различных TLR, а также агонистов TLR. Приведенный ниже список агонистов TLR не следует толковать в отношении конкретного TLR как указание на то, что данный агонист TLR обязательно активирует только этот TLR (например, некоторые молекулы могут активировать несколько типов TLR или даже несколько классов PRR). Например, некоторые молекулы, представленные ниже в качестве примера агониста TLR4, также могут быть агонистом TLR5.

Термины «TLR1» и «toll-подобный рецептор 1» относятся к любой форме рецептора TLR1, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR1. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR1, TLR1 включает нативные последовательности TLR1 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR1 представлен в UniProt под номером доступа Q15399.

«Агонист TLR1» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR1 (1) стимулирует или активирует TLR1, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR1, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR1. Агонисты TLR1, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, которые связывают TLR1.

Примеры агонистов TLR1, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, такие как SPM-105 (полученный из автоклавированных микобактерий), OM-174 (производное липида A), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OspA (из Borrelia burgdorferi), MALP-2 (липопептид-2kD, активирующий микоплазменные макрофаги), STF (растворимый фактор туберкулеза), CU-T12-9, дипровоцим и липопептиды, полученные из компонентов клеточной стенки, таких как PAM2CSK4, PAM3CSK4 и PAM3Cys.

TLR1 может образовывать гетеродимер с TLR2, и, соответственно, многие агонисты TLR1 также являются агонистами TLR2.

Термины «TLR2» и «toll-подобный рецептор 2» относятся к любой форме рецептора TLR2, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR2. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR2, TLR2 включает нативные последовательности TLR2 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR2 представлен в UniProt под номером доступа Q60603.

«Агонист TLR2» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR2 (1) стимулирует или активирует TLR2, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR2, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR2. Агонисты TLR2, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, которые связывают TLR2.

Примеры агонистов TLR2, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины (например, диацилированные липопротеины) и их производные, такие как SPM-105 (полученный из автоклавированных микобактерий), OM-174 (производное липида A), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OspA (из Borrelia burgdorferi), MALP-2 (липопептид-2kD, активирующий микоплазменные макрофаги), STF (растворимый фактор туберкулеза), CU-T12-9, дипровоцим, ампливант и липопептиды, полученные из компонентов клеточной стенки, таких как PAM2CSK4, PAM3CSK4 и PAM3Cys.

TLR2 может образовывать гетеродимер с TLR1 или TLR6, и, соответственно, многие агонисты TLR2 также являются агонистами TLR1 или TLR6.

Термины «TLR3» и «toll-подобный рецептор 3» относятся к любой форме рецептора TLR3, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR3. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR3, TLR3 включает нативные последовательности TLR3 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR3 представлен в UniProt под номером доступа Q15455.

«Агонист TLR3» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR3 (1) стимулирует или активирует TLR3, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR3, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR3. Агонисты TLR3, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновых кислот, которые связывают TLR3.

Примеры агонистов TLR3, которые можно использовать в способах лечения, лекарствах и применениях по настоящему изобретению, включают лиганды TLR3, такие как синтетическая дцРНК, полиинозиновая полицитидиловая кислота [«поли(I:C)»] (доступны, например, от InvivoGen в высокомолекулярных (HMW) и низкомолекулярных (LMW) препаратах), полиадениловая-полиуридиловая кислота [«поли (A:U)»] (доступная, например, от InvivoGen), полиICLC (см. Levy et al., Journal of Infectious Diseases, vol. 132, No. 4, pp. 434-439, 1975), амплиген (см. Jasani et al., Vaccine, vol. 27, no. 25-26, pp. 3401-3404, 2009), хинтонол, ринтатолимод и RGC100 (см. Naumann et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, article ID 283649).

Термины «TLR4» и «toll-подобный рецептор 4» относятся к любой форме рецептора TLR4, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR4. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR4, TLR4 включает нативные последовательности TLR4 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR4 представлен в UniProt под номером доступа Q00206.

«Агонист TLR4» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR4 (1) стимулирует или активирует TLR4, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR4, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR4. Агонисты TLR4, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липополисахариды (LPS) и их производные, которые связывают TLR4.

Примеры агонистов TLR4, которые можно использовать в способах лечения, лекарствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липополисахариды (LPS) и их производные, такие как B:0111 (Sigma), монофосфориллипид A (MPLA), 3DMPL (3-O-деацилированный MPL), GLA-AQ, G100, AS15, ASO2, GSK1572932A (GlaxoSmithKline, UK).

Термины «TLR5» и «toll-подобный рецептор 5» относятся к любой форме рецептора TLR5, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR5. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR5, TLR5 включает нативные последовательности TLR5 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR5 представлен в UniProt под номером доступа Q60602.

«Агонист TLR5» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR5 (1) стимулирует или активирует TLR5, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR5, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR5. Агонисты TLR5, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные флагеллины и их производные, которые связывают TLR5.

Примеры агонистов TLR5, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, бактериальный флагеллин, очищенный из B. subtilis, флагеллин, очищенный из P. aeruginosa, флагеллин, очищенный из S. typhimurium, и рекомбинантный флагеллин (все доступны от InvivoGen), энтолимод (CBLB502; фармакологически оптимизированное производное флагеллина).

Термины «TLR6» и «toll-подобный рецептор 6» относятся к любой форме рецептора TLR6, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR6. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR6, TLR6 включает нативные последовательности TLR6 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR6 представлен в UniProt под номером доступа Q9Y2C9.

«Агонист TLR6» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR6 (1) стимулирует или активирует TLR6, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR6, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR6. Агонисты TLR6, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопептиды и их производные, которые связывают TLR6.

Примеры агонистов TLR6, которые можно использовать в способах лечения, лекарствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, многие из агонистов TLR2, представленных выше, поскольку TLR2 и TLR6 могут образовывать гетеродимер. TLR6 может также образовывать гетеродимер с TLR4, и агонисты TLR6 могут включать различные агонисты TLR4, указанные выше.

Термины «TLR7» и «toll-подобный рецептор 7» относятся к любой форме рецептора TLR7, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR7. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR7, TLR7 включает нативные последовательности TLR7 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR7 представлен в UniProt под номером доступа Q9NYK1.

«Агонист TLR7» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR7 (1) стимулирует или активирует TLR7, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR7, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR7. Агонисты TLR7, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновых кислот, которые связывают TLR7.

Примеры агонистов TLR7, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях настоящего изобретения, включают рекомбинантную одноцепочечную («ss») РНК, соединения имидазохинолина, такие как имиквимод (R837), гардиквимод и резиквимод (R848); локсорибин (7-аллил-7,8-дигидро-8-оксогуанозин) и родственные соединения; 7-тиа-8-оксогуанозин, 7-деазагуанозин и родственные аналоги гуанозина; ANA975 (Anadys Pharmaceuticals) и родственные соединения; SM-360320 (Sumimoto); 3M-01, 3M-03, 3M-852 и 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; молекула 8-оксоаденина), AZD8848 (AstraZeneca; молекула 8-оксоаденина), MEDI9197 (Medimmune; ранее 3M-052), ssRNA40 и аналоги аденозина, такие как UC-1V150 (Jin et al. Chem Lett (2006) 16:4559-4563, соединение 4). Многие агонисты TLR7 также являются агонистами TLR8.

Термины «TLR8» и «toll-подобный рецептор 8» относятся к любой форме рецептора TLR8, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR8. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR8, TLR8 включает нативные последовательности TLR8 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR8 представлен в UniProt под номером доступа Q9NR97.

«Агонист TLR8» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR8 (1) стимулирует или активирует TLR8, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR8, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR8. Агонисты TLR8, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновых кислот, которые связывают TLR8.

Примеры агонистов TLR8, которые можно использовать в способах лечения, лекарствах и применениях по настоящему изобретению, включают рекомбинантную одноцепочечную оцРНК, имиквимод (R837), гардиквимод, резиквимод (R848), 3M-01, 3M-03, 3M-852 и 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; молекула 8-оксоаденина), AZD8848 (AstraZeneca; молекула 8-оксоаденина), MEDI9197 (Medimmune; ранее 3M-052), поли-G10, мотолимод и различные агонисты TLR7, представленные выше (как отмечалось ранее, многие агонисты TLR7 также являются агонистами TLR8).

Термины «TLR9» и «toll-подобный рецептор 9» относятся к любой форме рецептора TLR9, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности TLR9. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на человеческий TLR9, TLR9 включает нативные последовательности TLR9 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR9 представлен в UniProt под номером доступа Q9NR96.

«Агонист TLR9» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR9 (1) стимулирует или активирует TLR9, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие TLR9, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию TLR9. Агонисты TLR9, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновых кислот, которые связывают TLR9.

Примеры агонистов TLR9, которые можно использовать в способах лечения, лекарствах и применениях настоящего изобретения, включают неметилированную CpG-содержащую ДНК, иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды (ODN), такие как CpG-содержащие ODN, такие как CpG24555, CpG10103, CpG7909 (PF-3512676/агатолимод), CpG1018, AZD1419, ODN2216, MGN1703, SD-101, 1018ISS и CMP-001. Агонисты TLR9 также включают нуклеотидные последовательности, содержащие синтетический цитозин-фосфат-2'-дезокси-7-дезазагуанозиндинуклеотид (CpR) (Hybridon, Inc.), dSLIM-30L1 и комплексы иммуноглобулин-ДНК. Типичные агонисты TLR9 раскрыты в WO2003/015711, WO2004/016805, WO2009/022215, PCT/US95/01570, PCT/US97/19791 и патентах США №№ 8,552,165, 6,194,388 и 6,239,116, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.

RLR включают различные цитозольные PRR, которые позволяют детектировать, например, дцРНК. Примеры RLR включают, например, ген I, индуцируемый ретиноевой кислотой (RIG-I), ген 5, связанный с дифференцировкой меланомы (MDA-5), и лабораторию генетики и физиологии 2 (LGP2).

«Агонист RLR» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с RLR (1) стимулирует или активирует RLR, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие RLR, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию RLR. Агонисты RLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применений по настоящему изобретению, включают, например, нуклеиновые кислоты и их производные, которые связывают RLR, и агонистические моноклональные антитела (mAb), которые специфически связываются с RLR.

Примеры агонистов RLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, короткую двухцепочечную РНК с некэпированным 5’-трифосфатом (агонист RIG-I); поли I:C (агонист MDA-5) и BO-112 (агонист MDA-A).

NLR включают различные PRR, которые позволяют детектировать, например, молекулы, ассоциированные с повреждениями (DAMP). NLR включают подсемейства NLRA-A, NLRB-B, NLRC-C и NLRP-P. Примеры NLR включают, например, NOD1, NOD2, NAIP, NLRC4 и NLRP3.

«Агонист NLR» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с NLR (1) стимулирует или активирует NLR, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие NLR, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию NLR. Агонисты NLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных препаратов и применений по настоящему изобретению, включают, например, DAMP и их производные, которые связывают NLR, и агонистические моноклональные антитела (mAb), которые специфически связываются с NLR.

Примеры агонистов NLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, липосомальный мурамилтрипептид/мифамуртид (агонист NOD2).

CLR включают различные PRR, которые позволяют детектировать, например углеводы и гликопротеины. CLR включают как трансмембранные, так и секретированные CLR. Примеры CLR включают, например, DEC-205/CD205, макрофагальный маннозный рецептор (MMR), дектин-1, дектин-2, минкле, DC-SIGN, DNGR-1 и лектин, связывающий маннозу (MBL).

«Агонист CLR» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с CLR (1) стимулирует или активирует CLR, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие CLR, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию CLR. Агонисты CLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применений по настоящему изобретению, включают, например, углеводы и их производные, которые связывают CLR, и агонистические моноклональные антитела (mAb), которые специфически связываются с CLR.

Примеры агонистов CLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, MD-фракцию (очищенный экстракт растворимого бета-глюкана из Grifola frondosa) и Imprime PGG (бета 1,3/1,6-глюкан PAMP, полученный из дрожжей).

Белок STING действует как сенсор цитозольной ДНК и как адаптерный белок в передаче сигналов интерферона 1 типа. Термины «STING» и «стимулятор генов интерферона» относятся к любой форме белка STING, а также к вариантам, изоформам и гомологам видов, которые сохраняют по меньшей мере часть активности STING. Если не указано иное, например, путем конкретной ссылки на STING человека, STING включает нативные последовательности STING всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров человеческого TLR9 представлен в UniProt под номером доступа Q86WV6. STING также известен как TMEM173.

«Агонист STING» в контексте настоящего описания означает любую молекулу, которая после связывания с TLR9 (1) стимулирует или активирует STING, (2) усиливает, увеличивает, стимулирует, индуцирует или продлевает активность, функцию или присутствие STING, или (3) усиливает, увеличивает, способствует или индуцирует экспрессию STING. Агонисты STING, которые можно использовать в любом способе лечения, лекарствах и применениях по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновых кислот, которые связывают STING.

Примеры агонистов STING, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применениях по настоящему изобретению, включают различные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, такие как синтетическая двухцепочечная ДНК, циклический ди-GMP, циклический GMP-AMP (cGAMP), синтетические циклические динуклеотиды (CDN), такие как MK-1454 и ADU-S100 (MIW815), и малые молекулы, такие как P0-424.

Другие PRR включают, например, ДНК-зависимый активатор IFN-регуляторных факторов (DAI) и Absent в меланоме 2 (AIM2).

Иммуностимулирующие цитокины включают различные сигнальные белки, которые стимулируют иммунный ответ, такие как интерфероны, интерлейкины и гематопоэтические факторы роста.

Примеры иммуностимулирующих цитокинов включают GM-CSF, G-CSF, IFN-альфа, IFN-гамма; IL-2 (например, денилейкин дифитокс), IL-6, IL-7, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 и TNF-альфа.

Иммуностимулирующие цитокины могут иметь любой подходящий формат. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может быть рекомбинантной версией циоткина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может быть мутеином, который имеет одно или более аминокислотных изменений по сравнению с соответствующим цитокином дикого типа. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может быть включен в химерный белок, содержащий цитокин и по меньшей мере один другой функциональный белок (например, антитело). В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может быть ковалентно связан с лекарственным средством/агентом (например, любым лекарственным средством/агентом, как раскрыто в другом месте в настоящем описании, в качестве возможного компонента ADC).

Противораковые вакцины включают различные композиции, которые содержат антигены, ассоциированные с опухолью (или которые могут быть использованы для генерации антигена, ассоциированного с опухолью, у субъекта) и, таким образом, могут использоваться для провоцирования иммунного ответа у субъекта, который будет направлен на опухолевые клетки, содержащие опухоль-ассоциированный антиген.

Примеры материалов, которые могут быть включены в противораковую вакцину, включают аттенуированные раковые клетки, опухолевые антигены, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, стимулированные антигеном, полученным из опухоли, или нуклеиновые кислоты, кодирующие антигены, ассоциированные с опухолью. В некоторых вариантах осуществления противораковая вакцина может быть приготовлена из собственных раковых клеток пациента. В некоторых вариантах осуществления противораковая вакцина может быть приготовлена из биологического материала, который не происходит из собственных раковых клеток пациента.

Противораковые вакцины включают, например, сипулеуцел-Т и талимоген лахерпарепвек (T-VEC).

Иммуноклеточная терапия включает лечение пациента иммунными клетками, которые способны воздействовать на раковые клетки. Иммуноклеточная терапия включает, например, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) и Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR-T-клетки).

Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин phiI1, см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин А, бисфосфонаты; такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарзиностатина и хромофоры родственных хромопротеинов ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, деторубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), пегилированный липосомальный доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, макрелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; а нтитела к ткани коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2″-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел и доксетаксел; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного. Также включены антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов в опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Фарестон); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующий выработку эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат, экземестан, форместан, фадрозол, ворозол, летрозол и анастрозол; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; ингибиторы KRAS; ингибиторы MCT4; ингибиторы MAT2a; ингибиторы тирозинкиназы, такие как сунитиниб, акситиниб; ингибиторы alk/c-Met/ROS, такие как кризотиниб, лорлатиниб; ингибиторы mTOR, такие как темсиролимус, гедатолисиб; ингибиторы src/abl, такие как босутиниб; ингибиторы циклин-зависимой киназы (CDK), такие как палбоциклиб, PF-06873600; ингибиторы erb, такие как дакомитиниб; ингибиторы PARP, такие как талазопариб; ингибиторы SMO, такие как гласдегиб, PF-5274857; ингибиторы EGFR T790M, такие как PF-06747775; ингибиторы EZH2, такие как PF-06821497; ингибиторы PRMT5, такие как PF-06939999; ингибиторы TGFRβr1, такие как PF-06952229; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленного. В конкретных вариантах осуществления таким дополнительным терапевтическим агентом является бевацизумаб, цетуксимаб, сиролимус, панитумумаб, 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, тивозаниб, иринотекан, оксалиплатин, цисплатин, трифлуридин, типирацил, лейковорин, гемцитабин, регорафиниб или эрлотиниба гидрохлорид.

В некоторых вариантах осуществления антитело используется в сочетании с одним или более другими терапевтическими агентами, нацеленными на модулятор иммунных контрольных точек, или костимулирующим агентом, таким как, например, без ограничения, агент, нацеленный на CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1 (CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-аденозиновый путь (A2AR), BTK, TIK, CXCR2, CXCR4, CCR4, CCR8, CCR5, CSF-1 или модулятор врожденного иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления антитело используется в сочетании, например, с антагонистическим анти-CTLA-4 антителом, таким как, например, ипилимумаб; антагонистическое анти-LAG-3 антитело, такое как BMS-986016 и IMP701; антагонистическое анти-TIM-3 антитело; антагонистическое анти-B7-H3 антитело, такое как, например MGA271; антагонистическое анти-VISTA антитело; антагонистическое анти-TIGIT антитело; антитело; анти-CD80 антитело; анти-CD86 антитело; антагонистическое анти-B7-H4 антитело; агонистическое анти-ICOS антитело; агонистическое анти-CD28 антитело; модулятор врожденного иммунного ответа (например, TLR, KIR, NKG2A) и ингибитор IDO.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело используется в сочетании с агонистом OX40, таким как, например, агонистическое анти-OX-40 антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело используется в сочетании с агонистом GITR, таким как, например, агонистическое анти-GITR антитело, такое как, например, без ограничения, TRX518. В некоторых вариантах осуществления антитело используется в сочетании с ингибитором IDO. В некоторых вариантах осуществления антитело используется в сочетании с цитокиновой терапией, такой как, например, без ограничения, IL-15, CSF-1, MCSF-1 и т.д.

В некоторых вариантах осуществления антитело используется в сочетании с одним или более другими терапевтическими антителами, такими как, например, без ограничения, антитело, нацеленное на CD19, CD22, CD40, CD52 или CCR4.

В некоторых вариантах осуществления композиция антитела содержит по меньшей мере один дополнительный агент, такой как бевацизумаб, цетуксимб, сиролимус, панитумумаб, 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, тивозаниб, иринотекан, оксалиплатин, цисплатин, трифлуридин, типирацил, лейковорин, гемцитабин и эрлотиниба гидрохлорид.

В некоторых вариантах осуществления изобретения терапию антителами можно проводить совместно или последовательно до или после лечения другим агентом с интервалами от нескольких минут до нескольких недель. В вариантах осуществления, в которых другие агенты и/или белки или полинуклеотиды вводят отдельно, как правило необходимо, чтобы период времени между каждой доставкой не превышал период времени, в течение которого агент и композиция по настоящему изобретению все еще способны оказывать благоприятное комбинированное воздействие на субъект. В таких случаях предполагается, что оба введения следует осуществлять с интервалом примерно 12-24 часов и, более предпочтительно, с интервалом примерно 6-12 часов. Однако в некоторых ситуациях, в которых время между соответствующими введениями составляет от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) может оказаться желательным значительно увеличить время введения.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению комбинируют с режимом лечения, дополнительно включающим традиционную терапию, выбранную из группы, состоящей из: хирургии, лучевой терапии, химиотерапии, таргетной терапии, иммунотерапии, гормональной терапии, ингибирования ангиогенеза и паллиативной помощи.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. KE Hoover) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в определенных дозах и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). Фармацевтически приемлемые наполнители приведены ниже в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу продуцирования антитела по настоящему изобретению, включающему культивирование клетки-хозяина в условиях, которые приводят к продуцированию антитела по настоящему изобретению, и очистку антитела или биспецифического антитела из культуры.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела, фармацевтической композиции, полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина, как раскрыто в настоящем описании, при производстве лекарственного средства для обнаружения, диагностики и/или лечения расстройства, ассоциированного с опухолевым антигеном.

Применение в диагностике

В одном из аспектов анти-CD3 антитела по настоящему изобретению можно использовать для обнаружения и/или измерения в образце CD3 или клеток, экспрессирующих CD3, например, для диагностических целей. Например, анти-CD3 антитело можно использовать для диагностики состояния или заболевания, характеризующегося аберрантной экспрессией (например, чрезмерной экспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) CD3. Иллюстративные диагностические анализы CD3 могут включать, например, контактирование образца, полученного от субъекта, с анти-CD3 антителом по изобретению, где антитело CD3 помечено детектируемой меткой или репортерной молекулой. В качестве альтернативы в диагностических целях можно использовать немеченое анти-CD3 антитело в комбинации со вторичным антителом, которое само по себе является детектируемой меткой. Детектируемая метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как ¹⁴C, ³H, ¹²⁵I, ³²P или ³⁵S; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеинизотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные типичные анализы, которые можно использовать для обнаружения или измерения CD3 в образце, включают, без ограничения, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS) и т.п. Образцы, которые можно использовать в диагностических анализах CD3 согласно настоящему изобретению, включают любой образец ткани или жидкости, полученный от пациента, который содержит детектируемые количества белка CD3 или его фрагментов в нормальных или патологических условиях. Обычно уровни CD3 в конкретном образце, полученном от здорового пациента (например, пациента, не страдающего заболеванием или состоянием, связанным с аномальными уровнями или активностью CD3) измеряют для определения исходного или стандартного уровня CD3. Затем этот исходный уровень CD3 можно сравнить с уровнями CD3, измеренными в образцах, полученных от лиц, подозреваемых на наличие заболевания или состояния, связанного с CD3.

В другом аспекте предложен способ обнаружения, диагностики и/или мониторинга состояния, связанного с экспрессией опухолевого антигена. Например, раскрытые в настоящем описании полиспецифические антитела могут быть помечены детектируемым фрагментом, таким как визуализирующее средство и фермент-субстратная метка. Антитела по настоящему изобретению также можно использовать для диагностических анализов in vivo, таких как визуализация in vivo (например, PET или SPECT), или с окрашивающим реагентом.

Наборы

В дополнительном аспекте изобретения представлен набор, содержащий описанное выше антитело и инструкции по применению в соответствии с любым из способов по изобретению, раскрытых в настоящем описании. Обычно эти инструкции содержат инструкции по введению антитела при проведении описанных выше терапевтических процедур. Этот набор включает любую раскрытую в настоящем описании фармацевтическую композицию. Фармацевтические композиции и другие реагенты могут присутствовать в наборах в любой удобной форме, например, в виде раствора или порошка.

В другом аспекте набор дополнительно содержит одно или более других профилактических или терапевтических средств, полезных для лечения рака, в одном или более контейнерах. В одном из вариантов осуществления другое профилактическое или терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. В других аспектах профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.

Некоторые аспекты фармацевтических композиций, профилактических или терапевтических средств по изобретению перед применением на людях предпочтительно тестируют in vitro на наличие требуемой терапевтической активности в системе культивирования клеток и в организме животного-модели, такой как модельная система на основе грызунов.

Токсичность и эффективность профилактических и/или терапевтических протоколов по настоящему изобретению можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (терапевтически эффективной дозы у 50% населения). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен в виде отношения LD₅₀/ED₅₀. Профилактические и/или терапевтические средства, демонстрирующие высокие терапевтические показатели, являются предпочтительными.

Кроме того, для оценки профилактического и/или терапевтического применения раскрытых в настоящем описании способов лечения или комбинированных способов лечения для лечения или профилактики рака могут быть использованы любые анализы, известные специалистам в данной области.

Инструкции, касающиеся применения раскрытого в настоящем описании биспецифического антитела, обычно включают информацию о дозе, схеме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут быть единичными лекарственными формами, объемными упаковками (например, многодозовыми упаковками) или делимыми единичными дозами. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыш в упаковке (например, лист бумаги, включенный в комплект), но также приемлемы машиночитаемые инструкции (например, инструкции, хранящиеся на магнитном или оптическом устройстве хранения данных).

Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, помимо прочего, флаконы, ампулы, пробирки, бутыли, банки, гибкую упаковку (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п. для каждой фармацевтической композиции и других включенных реагентов, таких как буферы, сбалансированные солевые растворы и т.д., применяемых при введении фармацевтических композиций субъектам. Также предусмотрены упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или устройство для инфузии, такое как мининасос. Набор может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер также может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере, один активный агент в композиции представляет собой антитело. Контейнер может дополнительно содержать второй фармацевтически активный агент.

Обычно набор содержит контейнер и этикетку или вкладыш(и) на контейнере или связанный с ним.

Депонирование биологического материала

Представленные материалы по настоящему изобретению были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA, 13 февраля 2018 г. Цепь A вектора GUCY2C-1608, (VH-Hole SEQ ID NO: 94), имеющая регистрационный номер ATCC PTA-124943, содержит вставку ДНК, кодирующую VH-цепь, содержащую впадину, биспецифического антитела GUCY2C-1608, которая включает полинуклеотид (SEQ ID NO: 70), кодирующий вариабельную область легкой цепи анти-CD3 антитела (SEQ ID NO: 3); и цепь B вектора GUCY2C-1608 (VL-Knob, SEQ ID NO: 93), имеющая регистрационный номер ATCC PTA-124944, содержит вставку ДНК, кодирующую VL-цепь, содержащую выступ, биспецифического антитела GUCY2C-1608, которая содержит полинуклеотид (SEQ ID NO: 71), кодирующий вариабельную область тяжелой цепи анти-CD3 антитела (SEQ ID NO: 4).

Эти депозиты были получены в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и установления правил на основании этого договора (Будапештского договора). Это гарантирует поддержание культуры депозита жизнеспособной в течение 30 лет от даты депонирования. Депозиты доступны в ATCC в соответствии с условиями Будапештского договора и с учетом договора между Pfizer Inc. и ATCC, который гарантирует постоянный и неограниченный доступ пользователей к потомству культуры депозита после опубликования соответствующего патента США или после предоставления в открытый доступ какой-либо патентной заявки США или иностранной патентной заявки, вне зависимости от того, какая будет первой, а также который гарантирует доступ к потомству стороне, определенной комиссаром США по патентам и товарным знакам как имеющий на это право в соответствии с 35 USC 122 и относящимися к этому правилами для комиссара (в том числе 37 CFR § 1.14 с особой ссылкой на 886 OG 638).

Обладатель настоящей заявки согласен с тем, что в случае гибели, утраты или разрушения культуры материалов на депозите при культивировании в приемлемых условиях материалы незамедлительно, с уведомлением, заменят другими такими же материалами. Доступность депонированного материала не следует понимать как разрешение осуществлять изобретение на практике в нарушение прав, гарантированных какими-либо органами власти в соответствии с местным патентным законодательством.

Приведенные ниже примеры конкретных аспектов осуществления настоящего изобретения предлагаются исключительно с целью иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1

Создание растворимого CD3ed

Белок, названный CD3ed, представляющий внеклеточные домены эпсилон и дельта-субъединиц CD3, слитых в виде тандема через короткий линкер (SEQ ID NO: 39), получали стандартными методами молекулярной биологии, экспрессии белка и очистки. Ген, несущий плазмиду, кодирующий аминокислоту, приведенную в таблице 9 (SEQ ID NO: 40), временно трансфицировали в клетки HEK293 в 20-литровом культуральном объеме с использованием PEI в качестве агента трансфекции. После инкубации в течение 7 дней при 37°С 20 л урожая связывали по частям с 50 мл смолы His60 (уравновешенной PBS) в течение ночи. Затем связанную смолу промывали сначала PBS, затем 10 мМ имидазолом, содержащим буферы PBS (10-15 CV). После промывки белок элюировали 200 мМ имидазола, содержащим фосфатный буфер. После этого фракции элюата анализировали с помощью SDS-геля. Фракции, содержащие чистый белок, объединяли и сконцентрировали с помощью ультра центриконов Amicon 3 кДа. Во время процесса концентрации глицерин в образце поддерживали на уровне 5% для сохранения стабильности белка. Пул His60 дополнительно загружали в колонку Superdex200 для эксклюзионной хроматографии. Фракции, содержащие эпсилон/дельта гетеродимер CD3, анализировали с помощью SDS-PAGE, соответствующие фракции объединяли и фильтровали через 0,22 мкм фильтр. В таблице 9 показана последовательность эпсилон/дельта субъединиц CD3, слитых в виде тандема и используемых в качестве антигена для всех работ по оптимизации.

Таблица 9

SEQ ID NO:	Белок	Последовательность
40	CD3 эпсилон/дельта слитый белок	MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARGGGGSGGGGSGGGGSPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDHHHHHH

Пример 2

Оптимизация структуры анти-CD3 антитела H2B4

Ведущее анти-CD3e (CD3-эпсилон) антитело H2B4 показало более низкую термостабильность при использовании в формате биспецифического диатела-Fc. Для повышения стабильности в каркасе легкой цепи выполняли замену VK4 на VK1 (DPK9), а каркас тяжелой цепи сохраняли в формате VH3 (DP54). VL CDR1 (SEQ ID NO: 26), VL CDR2 (SEQ ID NO: 27) и VL CDR3 (SEQ ID NO: 28) переносили на каркас DPK9 и экспрессировали в комбинации с CDR, несущими тяжелую цепь, VH CDR1 (SEQ ID NO: 13), VH CDR2 (SEQ ID NO: 16) и VH CDR3 (SEQ ID NO: 18). В дополнение к CDR, привитым на рабочий каркас, также тестировали некоторые обратные мутации. Обратные мутации, введенные в каркас как тяжелой, так и легкой цепей, показаны в таблице 10 с указанием номера остатка, в котором была выполнена обратная мутация.

Синтезировали кДНК, содержащие человеческий акцепторный каркас, VH3 тяжелой цепи и VK1 легкой цепи с соответствующими донорными последовательностями CDR. Синтезированные продукты кДНК субклонировали и сливали в пределах рамки считывания с константной областью тяжелой цепи человеческого IgG1 и человеческой легкой каппа-цепи в векторах экспрессии млекопитающих. Для возможности отличить от антитела H2B4, эти варианты назвали 2B5, и все оптимизированные молекулы упоминаются далее в настоящем описании как 2B5 и его варианты. Все мутанты 2B5 анализировали на конкурентное связывание с клетками Jurkat с эндогенной экспрессией CD3e.

Для проверки, сохранило ли гуманизированное 2B5 свой связывающий эпитоп на поверхности клетки, выполняли конкурентный FACS. Перед выполнением конкурентного FACS химерный cH2B4 биотинилировали. Значение ЕС₅₀ для связывания биотинилированного cH2B4 с клетками Jurkat определяли путем прямого связывания с помощью FACS анализа, которое составило 0,8 нМ. Для конкурентного FACS, 3-кратно серийно разведенные варианты антител смешивали с постоянным количеством биотин-cH2B4, представляющим собой концентрацию EC₅₀, и 1,0+E05 клеток Jurkat на лунку. Смеси инкубировали в течение 1 часа на льду с последующей трехкратной промывкой FACS буфером. К клеткам добавляли вторичное антитело, стрептавидин, конъюгированный с PE (фикоэритрин) (PE-SA), и инкубировали в течение 30 минут на льду. Затем анализировали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с помощью FACS на анализаторе FACS CANTO™ (BD Biosciences). Расчет по оси Y: % связывания до Макс. = [MFI (лунки с серийно разведенными Ab) - MFI (2-й PE-SA)]/[макс. MFI (клетки Jurkat только с биотин-cH2B4) - MFI (2-й PE-SA)]. В таблице 10 показаны значения IC₅₀, полученные в результате конкурентного связывания, причем для оптимизации каркасов в CD3-антитело H2B4 были введены мутации. На основании этих результатов H2B4 1.0/1.0T показало характеристики связывания, аналогичные H2B4, и обозначено как домен связывания анти-CD3 антитела 2B5.

Таблица 10

Антитеор	Тяжелая цепь	Легкая цепь	IC50 конкурентного связывания
h2B4 1.0/1.0T (2B5)	Привитые CDR	Привитые CDR, R24T	1,27
h2B4 1.0/1.1	vH1.0	Q13V, R24T, Y49S, L78V	1,68
h2B4 1.0/1.2	vH1.0	Q13V, R24T, Y49S	Не тестировали
h2B4 1.0/1.3	vH1.0	R24T, Y49S	1,309
c2B4 (химерное 2B4)	мышиная vH	мышиная vK	0,752

Пример 3

Создание и определение характеристик биспецифической молекулы диатело-Fc с использованием последовательностей H2B4 и 2B5

Биспецифические молекулы диантитело-Fc получали, используя последовательности анти-CD3-антител 2B5 или H2B4 (таблицы 2 и 3) и антитела GUCY2c в одной из конфигураций, показанных на фиг.1 (схематично), стандартными методами экспрессии и очистки, известными в данной области. Полученные биспецифические антитела (таблица 7; SEQ.ID.NO.36-38) тестировали на стабильность с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

Пример 4

Оценка стабильности биспецифических антител с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии

Белки разбавляли фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до 0,6 мг/мл в объеме 400 мкл. PBS использовали в качестве холостого буфера в контрольной лунке. PBS содержал 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄ и 1,47 мМ KH₂PO₄, pH 7,2. Образцы помещали в лоток для образцов MicroCal VP-Capillary DSC с автосамплером (Malvern Instruments Ltd, Малверн, Великобритания). Образцы уравновешивали в течение 5 минут при 10°C, а затем сканировали до 110°C со скоростью 100°C в час. Период фильтрации выбирали, равным 16 секунд. Исходные данные корректировали до исходного уровня, и концентрацию белка нормализовали. Для подгонки данных к модели MN2-State с соответствующим количеством переходов использовали программное обеспечение Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Как показано на фиг. 2, биспецифическое GUCY2c-2B5 показало улучшенный фазовый переход первого рода на 5°C по сравнению с биспецифическим GUCY2c-H2B4. Это указывает на то, что биспецифические антитела, содержащие 2B5, являются более стабильными.

Два биспецифических антитела проверяли на связывание с Т-клетками с помощью FACS анализа, используя стандартные процедуры, известные в данной области, и, как показано на фиг. 3, оба биспецифических антитела показали примерно одинаковое связывание с Т-клетками, что указывает на сохранение связывания при преобразовании H2B4 в 2B5.

Для оценки активности перенаправления Т-клеток также оценивали цитотоксичность обоих биспецифических антител H2B4 и 2B5. Как показано на фиг. 4, оба биспецифических антитела показали сходную цитотоксичность, что указывает на то, что активность 2B5 осталась такой же, как у H2B4.

Пример 5

Структурно-рациональный мутагенез 2B5

Связывающий домен Н2В4 анти-CD3 антитела показал полиреактивность, определенную по связыванию с ДНК и инсулином, склонность к самосборке, о чем свидетельствуют высокие показатели AC-SINS, и склонность к усечению (clipping) в положении R53 в CDR-H2 при экспрессии в клетках-хозяевах СНО. Чтобы снизить полиреактивность, склонность к самосборке и усечению в CDRH2, в CDR 2B5 вводили мутации, позволяющие сохранить сродство связывания и стабильность. Для этого все прогнозы делали на основе на основе полученной методом рентгеновской дифракции кристаллической структуры антитела CD3 H2B4 в комплексе с пептидом, представляющим связывающий эпитоп и полученный из N-конца эпсилон-субъединицы CD3. В данной области хорошо известно, что избыточный положительный заряд и/или гидрофобность могут играть важную роль в полиреактивности. Для определения электростатической поверхности Fv области H2B4 на основе кристаллической структуры использовали калькулятор Пуассона-Больцмана DelPhi в Discovery Studio 4.01. На фиг. 5 можно видеть пятна избыточного положительного заряда, которые не разрушаются отрицательными зарядами. Это предполагает корреляцию с высокой полиреактивностью. Кроме того, для определения чрезмерных гидрофобных пятен использовали инструмент для определения склонности к пространственной агрегации (Spatial Aggregation Propensity, SAP) в Discovery Studio1 (фиг. 6). Как показано на фиг. 6, гидрофобное пятно кажется небольшим и несущественным. Основываясь на этом наблюдении, основное внимание было уделено уменьшению положительных зарядов путем удаления положительных зарядов или добавления отрицательных зарядов для разрушения пятен.

Для определения подходящих положений для мутагенеза, на компьютере, используя методы Discovery Studio и FoldX вычисляли мутации, позволяющие изменить как сродство, так и стабильность. К толерантным мутациям были отнесены мутации, которые по прогнозам обих методов Discovery Studio и FoldX, не давали значение ΔΔG >1 ккал/моль. Исходя из этих прогнозов, был идентифицирован набор остатков, которые, как предполагалось, будут иметь наименьшее влияние на связывание и стабильность, при этом все еще разрушая заряженные пятна. Кроме того, предпочтение было отдано гидрофильным мутациям, где это возможно, чтобы не увеличивать гидрофобную поверхность. Список возможных мутаций CDR, введенных в анти-CD3-антитело 2B5 для оптимизации биофизических свойств, показан в таблице 11. Он включает мутации, которые, как предполагается, являются толерантными в каждом положении и снижают полиреактивность и риск усечения.

Таблица 11

Остаток # относительно 2B5-0001 (по Кабат)	WT аминокислота	Аминокислоты, мутированные на
Тяжелая цепь
H52	R	Q
H52B	R	Q
H53	R	Q	L	E
H65	K	Q
H96	R	Q
Легкая цепь
L27F	R	T	S
L29	R	Q	N
L30	K	Q

Кроме того, был разработан набор нескольких мутаций (в комбинации) для тяжелой цепи и легкой цепи. К ним относятся R52Q/R52bQ/R53Q, R52Q/R52bQ/R53Q/R96Q, R52bQ/R53Q/R96Q и R52Q/R52bQ/R96Q для тяжелой цепи и R29Q/K30Q/R54L/V27eE, R29Q_R54L_V27eE30, R29Q_R54Q_R54Q_R54Q_V27eE30.

Пример 6

Характеристика мутантов

Все мутанты создавали в виде молекул IgG с помощью стандартных методов экспрессии и очистки, хорошо известных в данной области, и тестировали на связывание с CD3ed, полиреактивность (связывание с ДНК и инсулином) и AC-SINS.

Анализы связывания для оценки вариантов

Разработали и выполнили анализ Octet для изучения скоростей ассоциации и диссоциации 10 мкг/мл растворимого человеческого антигена CD3ed (SEQ ID NO: 40). Наконечники с античеловеческими IgG использовали для захвата анти-CD3 антител в концентрации 10 мкг/мл в течение 120 секунд, с последующим определением исходного уровня в PBS в течение 30 секунд, после чего наконечники погружали в концентрацию 10 мкг/мл растворимого человеческого CD3-антигена на 120 секунд, и, наконец, выполняли диссоциацию в течение 300 секунд. Изучали сенсограммы для определения, связан ли антиген с антителом, и для вычисления kd (1/с) и ошибки kd использовали программное обеспечение Octet. Двадцать шесть рациональных мутаций обеспечивали сохранение связывания с антигеном hCD3ed. Затем изучали кинетику связывания с растворимым CD3 двадцати шести вариантов антитела CD3, которые все еще демонстрировали связывание с антигеном, методом SPR с помощью анализа Biacore. Анти-CD3 антитела захватывали античеловеческим Fc, и растворимый антиген CD3 в концентрациях 0, 3,7, 11,1, 33,3 и 100 нМ вводили поверх захваченных антител для определения кинетики связывания. Двадцать три анти-CD3 антитела связывались с растворимым антигеном CD3 с такой же сродством, что и исходное антитело с привитыми CDR.

ДНК и инсулин ELISA для измерения полиреактивности

384-луночные планшеты для ELISA (Nunc Maxisorp) покрывали ДНК (10 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, D1626) и инсулином (5 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, I9278-5 мл) в PBS, pH 7,5 в течение ночи при 4°C. ELISA, адаптированный на основе анализов, описанных в Tiller et al (17), выполняли на автоматизированной рабочей станции PerkinElmer Janus для работы с жидкостями. Лунки промывали водой, блокировали 50 мкл полиреактивного буфера для ELISA (PEB; PBS, содержащий 0,05% Твин-20, 1 мМ EDTA) в течение 1 часа при комнатной температуре и трижды промывали водой. Серийно разведенные mAb в 25 мкл добавляли в четырех повторностях в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали водой, и в каждую лунку добавляли 25 мкл 10 нг/мл козьего антитела к человеческому IgG (фрагмент, специфичный к Face), конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, 109-035-008). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, трижды промывали 80 мкл воды, и в каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата TMB (Sigma-Aldrich, T-0440). Реакции останавливали приблизительно через 7 минут добавлением в каждую лунку 25 мкл 0,18 М ортофосфорной кислоты, и считывали оптическую плотность при 450 нм. Величину связывания ДНК и инсулина рассчитывали, как отношение сигнала ELISA антитела при 10 мкг/мл к сигналу содержащей буфер лунки, а не первичное антитело. Величины ниже 8 считались идеальными и свидетельствовали о низкой полиреактивности.

Анализ AC-SINS для измерения склонности к самосборке

Анализ AC-SINS (спектроскопию самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом) стандартизировали под 384-луночный формат для автоматизированной системы для работы с жидкостями Perkin-Elmer Janus. Наночастицы золота размером 20 нм (Ted Pella, Inc., # 15705) покрывали смесью 80% козьих антител к человеческому Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 109-005-098) и 20% неспецифических козьих поликлональных антител (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 005-000-003), которые представляли собой буфер, замененный 20 мМ ацетатом натрия, pH 4,3, и разбавляли до 0,4 мг/мл. После одного часа инкубации при комнатной температуре участки, незанятые наночастицами золота, блокировали тиолированным полиэтиленгликолем (2 кДа). Наночастицы с покрытием затем 10-кратно концентрировали с помощью шприцевого фильтра и добавляли 10 мкл к 100 мкл mAb в концентрации 0,05 мг/мл в PBS pH 7,2. Наночастицы с покрытием инкубировали с представляющим интерес антителом в течение 2 часов в 96-луночном полипропиленовом планшете, а затем переносили в 384-луночный полистироловый планшет и считывали на спектрофотометре Tecan M1000. Оптическую плотность считывали в диапазоне 450-650 с шагом 2 нм, и для определения максимальной оптической плотности, сглаживания данных и подгонки данных с помощью полинома второго порядка использовали макрос Microsoft Excel. Сглаженная величина максимального поглощения средней контрольной пробы (только буфер PBS) вычитали из сглаженного максимального поглощения образца антитела для определения показателя AC-SINS антитела. Результат менее 8 считался идеальным и свидетельствовал о низкой степени самосборки.

Оценка ведущих вариантов анти-CD3 антитела 2B5 в биспецифическом формате диатело-Fc

Всесторонний анализ данных по оценке связывания, AC-SINS и полиреактивности помог сузить количество демонстрирующих связывание вариантов до пяти, которые были переформатированы в молекулы биспецифических диатело-Fc с использованием противоопухолевых последовательностей и стандартных стратегий клонирования, хорошо известных в данной области. Эти биспецифические антитела временно экспрессировали и очищали стандартными методами, хорошо известными в данной области. Полученные биспецифические антитела тестировали на связывание с клетками jurkat, цитотоксичность in vitro с помощью анализа перенацеливания Т-клеток, полиреактивности, термостабильности методами DSC и AC-SINS. Из всех пяти биспецифических антител только один биспецифический вариант 2B5v6, несущий анти-CD3 антитело 2B5, показал сильное связывание и, как результат, показал сильную цитотоксичность. Этот вариант также показал пониженную полиреактивность, оцененную по связыванию ДНК и инсулина и шкале AC-SINS. Величины биспецифических антител 2B5v6 были ниже 8 в отличие от величин, наблюдаемых у биспецифических антител H2B4, которые выше 8. На основании этих результатов, в качестве оптимизированного варианта 2B5 для дальнейшего анализа был выбран вариант 2B5v6.

Пример 7

Оценка усечения в CDR-H2

Усечение (clipping) в VH CDR2 (SEQ ID NO: 16) в положении R53 наблюдали в анти-CD3 антителе (H2B4 и 2B5), когда экспрессия биспецифического антитела происходила в клетках СНО, а не в клетках HEK293. Чтобы снизить этот риск и обеспечить лучшую однородность продукта в промышленном масштабе, внимание было уделено выбору мутаций в области усечения наряду с другими мутациями, чтобы снизить другие риски, как описано в предыдущих примерах. Вкратце, для оценки усечения создавали биспецифические антитела диатело-Fc с использованием последовательности вариабельного домена антитела, служившей отрицательным контролем, и анти-CD3 антитела 2B5 или анти-CD3 антитела H2B4, или анти-CD3 антитела 2B5v6. Все молекулы биспецифического диатела-Fc получали по аналогичной схеме, спользуя способы экспрессии и очистки, хорошо известные в данной области. Клеточные линии CHO SSI создавали с помощью стандартных процедур. Две цепи, кодирующие биспецифическое антитело, клонировали в вектор экспрессии млекопитающих pRY19-GA-Q, содержащий двойной промотор и сайт рекомбинации для интеграции одного участка (SSI) (Zhang, L. et al. Biotechnology Progress.2015; 31:1645-1656) в геном клетки CHO. Полученную плазмиду трансфицировали в клетки CHO-K1 SV 10e9 посредством электропорации с помощью вектора pRY19, содержащего представляющий интерес ген, с последующим положительным и отрицательным давлением отбора, используя гигромицин-B и ганцикловир. Эти пулы CHO прошли трехнедельную фазу восстановления. Когда наблюдаемая жизнеспособность превысила 90%, для будущей работы создавали банки клеток. Созданные пулы CHO затем подвергали 12-дневной экспрессии в режиме периодического культивирования с подпиткой в среде CD-CHO (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) в объеме 1 л. Культуры собирали на 12-й день, пропускали через колонку с белком А и элюировали при низком pH. Пул proA сразу нейтрализовали до pH 8,1. Полученные чистые белки оценивали с помощью капиллярного гель-электрофореза (cGE), следуя стандартным протоколам, хорошо известным в данной области. Как показано в Таблице 12 и на фиг. 7, биспецифическое антитело 2B5 имело значительно меньший процент усечений по сравнению с H2B4, и отсутствие усечений наблюдали у 2B5v6, тогда как H2B4 показало увеличенный процент усечений или увеличенную фрагментацию. В таблице 12 представлены результаты электрофореза в капиллярном геле, показывающие фрагментацию биспецифических антител CD3-GUCY2c. %POI указывает представляющий интерес пик.

Таблица 12

Восстановленный cGE образец	%POI	% фрагментации
Отрицательный контроль-H2B4	88,8	11,2
Отрицательный контроль-2B5	98,9	1,1
Отрицательный контроль-2B5v6	99,6	0,4

Пример 8

Биспецифические антитела GUCY2c-2B5v6: экспрессия и очистка химерных биспецифических антител CD3-GUCY2c с помощью антитела CD3 2B5v6

Комплементарные пары конструкций (12,5 мкг каждой цепи) котрансфицировали в 25 мл культур в лог-фазе, содержащих 1 миллион клеток/мл клеток HEK 293, с помощью набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Life Technologies). Через двадцать четыре часа после трансфекции добавляли усилитель трансфекции ExpiFectamine, и выращивали клетки еще в течение 4-5 дней перед сбором. Затем истощенные культуры собирали, центрифугировали для удаления клеточного дебриса и пропускали через 20 мкм фильтр.

После этого очищенную кондиционированную среду, содержащую биспецифические антитела к Т-клеткам GUCY2c, очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А. Образцы загружали на микроколонки объемом 0,45 мл (Repligen), предварительно упакованные смолой MabSelect SuRe и белком A (GE Healthcare), с помощью манипулятора для жидкости (Tecan). Связанный белок промывали PBS, pH 7,2, затем элюировали 20 мМ лимонной кислотой, 150 мМ хлоридом натрия, pH 3,5 и нейтрализовали 2М трис, pH 8,0. Затем образцы обессоливали в PBS pH 7,2, используя заполненные G25 Sephadex колонки (GE Healthcare), в соответствии с методами производителя. Очищенные белки анализировали на чистоту с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии на колонке Mab HTP (TOSOH) в системе Aglient 1200 HPLC в соответствии с протоколами производителя. Концентрации определяли путем измерения при OD280 нм с помощью микроспектрофотометра (Trinean).

Оценка стабильности биспецифических антител с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии

Белки разбавляли фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до 0,6 мг/мл в объеме 400 мкл. PBS использовали в качестве холостого буфера в контрольной лунке. PBS содержал 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄ и 1,47 мМ KH₂PO₄, pH 7,2. Образцы помещали в лоток для образцов калориметра MicroCal VP-Capillary DSC с автосамплером (Malvern Instruments Ltd, Малверн, Великобритания). Образцы уравновешивали в течение 5 минут при 10°C, а затем сканировали до 110°C со скоростью 100°C в час. Период фильтрации выбирали, равным 16 секунд. Исходные данные корректировали по исходному уровню, и концентрацию белка нормализовали. Для подгонуи данных к модели MN2-State с соответствующим количеством переходов использовали программное обеспечение Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Как показано на фиг. 8, биспецифическое антитело GUCY2c-2B5v6 показало превосходную термостабильность с T_m1=70°C.

Связывание с наивными Т-клетками

Очищенные биспецифические анти-CD3 антитела титровали для определения связывания с клеточной поверхностью с человеческим CD3 на наивных человеческих Т-клетках, очищенных из свежих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека, с помощью стандартных методов проточной цитометрии, известных в данной области, на анализаторе BD LSRII Fortessa. Как показано на фиг. 9, биспецифическое GUCY2c-2B5v6 очень хорошо связывается с Т-клетками с ЕС₅₀ связывания 35,44 нМ.

Оценка активности биспецифических Т-клеток

Человеческие PBMC выделяли из крови здоровых доноров с помощью Histopaque-177 (Sigma). Наивные Т-клетки выделяли из PBMC с помощью набора для обогащения Т-клеток компании Stem Cell Technologies (отрицательный отбор Т-клеток). GUCY2c, экспрессирующие T84 опухолевые клетки человека, трансфицированные конструкцией для экспрессии люциферазы, обрабатывали серийными разведениями биспецифических антител GUCY2c или CD3-биспецифических антител, служивших в качестве отрицательного контроля, вместе с T-клетками. Отношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) составляло 10:1 или 5:1. Т-клетки и опухолевые клетки инкубировали при 37°C в течение 48 часов с последующим измерением сигнала люциферазы с использованием реагента Neolite (Perkin Elmer). Значения EC₅₀ рассчитывали с помощью программы Graphpad PRISM, используя четырехпараметрический нелинейный регрессионный анализ. Негативные клетки-мишени HCT116 или HT29 не проявляли биспецифической цитотоксичности, опосредованной GUCY2c. Как показано на фиг. 10, биспецифическое GUCY2c-2B5v6 показало сильную цитотоксичность в анализе перенацеливания Т-клеток.

Клетки Т84 обрабатывали Т-клетками (соотношение Е:Т=5:1) и GUCY2c-1608 (GUCY2c-2B5v6) в разных дозах. Супернатанты собирали в разные моменты времени (24 часа, 48 часов, 96 часов) и анализировали с помощью мультиплексного анализа Lumninex в соответствии с инструкциями производителя и считывали на Luminex 200 с помощью программного обеспечения xPONENT. Измеряемыми цитокинами были человеческий IFN-гамма, IL10, IL2, IL4, IL6, TNF-альфа. На фиг. 11 показана повышенная экспрессия цитокинов (11A) IFN-гамма, (11B) IL10, (11C) IL2, (11D) IL4, (11E) IL6, (11F) TNF-альфа после активации Т-клеток GUCY2c-1608.

Оценка in vivo активности, опосредованная биспецифическим GUCY2c-2B5v6

Изучение эффективности in vivo выполняли на модели адоптивного переноса. Линии опухолевых клеток/фрагментов ксенотрансплантата, полученные от пациента, имплантировали мышам NSG и доводили до объема примерно 200 мм³. Мышам внутривенно вводили биспецифические антитела (если не указано иное). Два миллиона активированных и размноженных Т-клеток (с использованием наборов для размножения и активации Т-клеток от Miltenyi Biotec) вводили внутривенно через 24 часа после введения биспецифических соединений. Биспецифические антитела вводили еженедельно. Как показано на фиг. 12 и фиг. 13, биспецифическое антитело GUCY2c-2B5v6 (GUCY2c-1608) показало превосходную стойкую регрессию опухоли как в моделях PDX CRX-11201, так и в клеточной линии LS1034 in vivo, представляющих колоректальный рак.

Пример 9

FLT3-CD3 биспецифические антитела и создание FLT3-2B5v6 биспецифических IgG с использованием оптимизированных анти-CD3 антител (2B5v6) и цитотоксичность

Человеческое анти-FLT3 антитело (xFLT3) и человеческое анти-CD3 антитело (2B5v6) экспрессировали по отдельности как человеческое IgG2dA_D265A, сконструированное с EEEE на одном плече и RRRR на другом плече для биспецифического обмена в положениях 223, 225 и 228 (например, (C223E или C223R), (E225E или E225R) и (P228E или P228R)) в шарнирной области и в положении 409 или 368 (например, K409R или L368E (схема нумерации ЕU)) в области CH3 человеческого IgG2. Антитела также имели мутацию D на A в положении 265 (схема нумерации EU).

Каждое плечо антитела очищали отдельно, используя смолу с белком А. Затем один мг/мл очищенного антитела xFLT3 заменяли 1 мг/мл очищенного антитела 2B5v6 в присутствии 2 мМ восстановленного глутатиона. Реакцию обмена проводили при 37°C в течение 16 часов. Затем к белкам добавляли 2 мМ окисленного глутатиона и смесь инкубировали при 37°C в течение 30 минут. После этого смесь разбавляли 1:5 20 мМ буфером MES pH 5,4 без NaCl. Разбавленный образец загружали в ионообменную колонку MonoS и промывали 20 мМ MES, pH 5,4, 25 мМ буфером NaCl. Затем биспецифическое антитело xFLT3-2B5v6 элюировали градиентом 0-500 мМ NaCl в 20 мМ буфере MES, pH 5,4. Наконец, биспецифическое антитело подвергали диализу в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) для клеточного анализа. Для анализа цитотоксичности нестимулированные человеческие Т-клетки и клетки-мишени, экспрессирующие люциферазу (Eol-1 или MV411), инкубировали совместно в определенных соотношениях в 96 луночных планшетах с U-образным дном в 200 мкл RPMI+10% FBS. Биспецифические антитела xFLT3-2B5v6 серийно разводили в PBS и добавляли в лунки. Через 24 часа 100 мкл клеточной суспензии смешивали со 100 мкл реагента One-GLO в 96-луночных планшетах с белыми стенками и измеряли люминесценцию на люминометре Envision. Значения цитотоксичности определяли по следующей формуле:

% цитотоксичности = [1- (RLUобразец)/RLUцелевая клетка)] × 100RLU: относительные световые единицы

Как показано на фиг. 14A и 14B, биспецифическое антитело xFLT3-2B5v6, содержащее оптимизированное анти-CD3 антитело (2B5v6), оказалось очень эффективным в альтернативном биспецифическом формате IgG при тестировании в обоих типах клеток, экспрессирующих более высокое количество копий FLT3 (EOL-1) и более низкое количество копий (МВ4-11).

В таблице 13 показаны последовательности легкой и тяжелой цепей FLT3 (EOL-1) и легкой и тяжелой цепей биспецифических антител 2B5v6.

Таблица 13

mAb	Легкая цепь	Тяжелая цепь
xFLT3	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 41)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)
2B5v6	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 4)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 3)

Пример 10

Уменьшение риска, связанного с наличием Т-клеточных эпитопов биспецифического антитела 2B5v6

Оптимизированный клон 2B5v6 анализировали на предмет потенциальных Т-клеточных эпитопов с желанием снизить риск иммуногенности. Для этого анализа использовали инструмент Epivax Tool для in silico предсказания потенциальных Т-клеточных эпитопов. Этот инструмент предсказывает количество 9-мерных каркасных пептидов, связывающихся с любым из 8 различных аллелей HLA. Попадание определяли как попадания, Z-баллы которых вошли в 5% лучших, а сильные попадания - в 1% лучших. Попадания в 4 или более аллелей или 1-но сильное попадание рассматривали как предсказанные Т-клеточные эпитопы. На основании этих критериев идентифицировали 3 предсказанных Т-клеточных эпитопа незародышевой линии в CDRH2, 2 - в CDRL1 и 1 предсказанный эпитоп зародышевой линии в L2 (таблица 15). В дополнение к баллам для отдельных пептидов определяли общий риск для последовательности по общему количеству попаданий или скорректированной оценке Epivax T-регитопа, которую оптимизировали для корреляции с частотой встречаемости клинической ADA. В данном случае для этих прогнозируемых значений более низкий балл означал более низкий ожидаемый риск развития ADA. В данном случае домен VH имел 70 попаданий, и его балл был равен -42,82, а домен VL имел 60 совпадений с баллом, равным -23,79.

Для снижения риска иммуногенности идентифицировали мутации, которые позволили бы снизить общий балл этого клона и удалить при этом попадания и, в идеале, идентифицировать предсказанные Т-клеточные эпитопы. Для идентификации единичных мутаций, которые снижают количество попаданий, уменьшают общий балл EpiMatrix с поправкой на T-регитоп и удаляют Т-клеточные эпитопы, рассмотрели все возможные единичные мутантные изменения в CDR-L1, CDR-L2 и CDR-H2. Поскольку эти потенциальные мутации также могут оказать влияние на связывание и стабильность, были учтены описанные выше данные по предсказанным стабильности и сродстве, а также идентифицированы толерантные мутации. В таблицах 14A, 14B и 14C показаны мутации, определенные как снижающие риск иммуногенности 2B5v6. Кроме того, предполагается, что мутации, показанные в SEQ ID NO: 44-47, 51-57, 60 и 62, уменьшают количество Т-клеточных эпитопов.

Таблица 14А

# остатка VH CDR2 в 2B5v6	WT остаток	Мутирован на
Чотиа	Кабат
H50	H50	F	H
H52A	H52A	N	D
H52B	H52B	Q	D
H52C	H52C	A	D
H55	H55	Y	E
H56	H56	T	P
H57	H57	S	D
H60	H60	N	Q

Таблица 14В

# остатка VL CDR1 в 2B5v6	WT остаток	Мутирован на
Чотиа	Кабат	WT	Mut
L26	L26	S	D
L27	L27	Q	E
L28	L27A	S	D
L30B	L27E	V	E
L30D	L28	S	T
L30E	L29	Q	G
L30F	L30	K	Q
L31	L31	N	E
L34	L34	A	N

Таблица 14С

# остаток VL CDR2 в 2B5v6	WT остаток	Мутирован на
Чотиа	Кабат	WT	Mut
L51	L51	A	T
L53	L53	T	D
L54	L54	R	D
L54	L54	R	Q
L56	L56	S	D
Зародышевая линия	Зародышевая линия	WASTRES (SEQ ID NO: 27)	AASSLQS (SEQ ID NO: 43)

В таблице 15 показаны области вариабельного домена анти-CD3 антитела (2B5v6) с Т-клеточными эпитопами, представляющими потенциальный риск развития иммуногенности.

Таблица 15

VH/VL	Пептид	Попадания	Сильные попадания
VH	VQPGGSLRL (SEQ ID NO: 44)	2	0
VH	LRLSCAASG (SEQ ID NO: 45)	7	4
VH	WVRQAPGKG (SEQ ID NO: 46)	4	3
VH	VRQAPGKGL (SEQ ID NO: 47)	3	0
VH	WVAFIRNQA (SEQ ID NO: 48)	2	1
VH	FIRNQARGY (SEQ ID NO: 49)	5	2
VH	YTSDHNPSV (SEQ ID NO: 50)	4	2
VH	VKGRFTISR (SEQ ID NO: 51)	2	0
VH	FTISRDNAK (SEQ ID NO: 52)	5	0
VH	LYLQMNSLR (SEQ ID NO: 53)	6	2
VH	YLQMNSLRA (SEQ ID NO: 54)	8	5
VH	LQMNSLRAE (SEQ ID NO: 55)	2	0
VL	IQMTQSPSS (SEQ ID NO: 56)	6	1
VL	MTQSPSSLS (SEQ ID NO: 57)	7	0
VL	ITCTSSQSL (SEQ ID NO: 58)	3	1
VL	VRSQKNYLA (SEQ ID NO: 59)	8	5
VL	WYQQKPGKA (SEQ ID NO: 60)	5	0
VL	LLIYWASTR (SEQ ID NO: 61)	2	1
VL	FTLTISSLQ (SEQ ID NO: 62)	7	5

Все мутанты были получены в виде моновалентных антител IgG с помощью стандартной временной экспрессии HEK293 с последующей очисткой на колонке с белком А. Полученные клоны тестировали на связывание с клетками Jurkat, экспрессирующими CD3, с помощью FACS анализа и оценивали потенциал самосборки методом AC-SINS, как описано выше в примере 7. Как показано в таблице 16, для дальнейшего тестирования отбирали пять молекул с улучшенным баллом Epivax и уменьшенным количеством Т-клеточных эпитопов и сохраненным сродством к CD3, которые тестировали в формате диатело-Fc. Варианты 2B5v6 с улучшенными баллами Epivax сравнивали с родительским 2B5v6. Результаты показывают сопоставимое связывание с клетками Jurkat, экспрессирующими CD3 и AC-SINS.

Таблица 16

Вариант	EC50 (нМ) клетки Jurkat	AC-SINS	Балл Epivax
2B5v6-0453	11,1	0	-47,18
2B5v6-0517	9,9	1	-42,92
2B5v6-0522	8,6	0	-46,6
2B5v6-0533	6,1	1	-38,8
2B5v6-0538	9,2	0	-42,47
2B5v6-0453	11,1	0	-47,18

Среди протестированных мутантов несколько мутантов показали более низкое связывание с клетками Jurkat по сравнению с 2B5v6. Из этих мутантов для создания биспецифических молекул диатело-Fc с антителом GUCY2c в качестве другого связывающего домена использовали мутанты со всеми удаленными Т-клеточными эпитопами и улучшенными баллами Epivax. В таблице 17 показаны баллы Epivax, а на фиг. 15 показано снижение связывания этих мутантов с клетками jurkat. Варианты низкоаффинного CD3-антитела 2B5v6 имеют улучшенные баллы Epivax.

Таблица 17

Варианты анти-CD3 антитела	Балл Epivax (tReg-адаптированный)
2B5v6-0598	-65,15
2B5v6-0623	-56,74

Пример 11

Три варианта анти-CD3 показывают улучшенное сродство и цитотоксичность в формате биспецифических антителах GUCY2C-CD3

Три варианта анти-CD3: 2B5-1038 (SEQ ID NO: 4 и 9), 2B5-1039 (SEQ ID NO: 4 и 87) и 2B5-1040 (SEQ ID NO: 4 и 89), которые получили из 2B5v6, переформатировали в молекулы биспецифического диатела-Fc, спаренные с последовательностью противоопухолевого антитела GUCY2c в одной из конфигураций, показанных на фиг. 1, с помощью стандартных методов клонирования, экспрессии и очистки, описанных выше. Полученные биспецифические антитела, показанные в таблице 18, тестировали на цитотоксичность in vitro с помощью анализа перенацеливания Т-клеток и на сродство связывания с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и неспецифичность по AC-SIN. Риск иммуногенности оценивали с помощью Epivax Tool для in silico предсказания потенциальных Т-клеточных эпитопов. Необработанные данные масс-спектроскопии показывают, что все биспецифические антитела имеют правильное спаривание и являются 100% гетеродимерами. В таблице 18 показано, что все три биспецифических антитела (1) примерно в 2 раза более эффективны, согласно результатам анализа цитотоксичности in vitro, по сравнению с контрольным биспецифическим GUCY2C-1608, которое спарено с анти-CD3 2B5v6 (фиг. 16); (2) обладают сродством связывания с рекомбинантным человеческим CD3 согласно результатам SPR, что согласуется с цитотоксической активностью; (3) имеют более высокие показатели иммуногенности по сравнению с контролем; и (4) показатели AC-SIN остались такими же, как у контрольных биспецифических GUCY2C-1608. Эти результаты демонстрируют, что анти-GUCY2c биспецифические антитела с различными вариантами CD3 рекрутируют наивные человеческие Т-клетки для индукции уничтожения клеток в опухолевых клетках Т84 (фиг. 16). Три варианта анти-CD3, полученные из 2B5v6, продемонстрировали примерно в 2 раза более сильную активность по сравнению с контрольным биспецифическим GUCY2C-1608.

Таблица 18

Биспецифическое антитело	Вариант CD3	Балл Epivax (tReg-адаптированный)	MassSpec (интактные)	Балл AC-SIN	In vitro цитото-ксичность (нМ)	KD (нМ, SPR)
GUCY2C-1608	2B5-0542	-33,7	100% гетеродимер	3	0,772	127,88±1,63
GUCY2C-1678	2B5-1038	-52,61	100% гетеродимер	2	0,247	63,55±0,49
GUCY2C-1679	2B5-1040	-47,58	100% гетеродимер	3	0,194	72,02±0,36
GUCY2C-1680	2B5-1039	-53,51	100% гетеродимер	3	0,385	78,57±0,9

Последовательности биспецифических антител представлены в таблице 19.

Биспецифическое антитело	Первая полипептидная цепь	Вторая полипептидная цепь
GUCY2C-1608	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 93)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 94)
GUCY2C-1678	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 95)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 96)
GUCY2C-1679	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 97)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 98)
GUCY2C-1680	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 99)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 100)

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Пфайзер ИНК.

Апгар, Джеймс

Цзинь, Фан

Катрагадда, Мадан

Матур, Дивия

Чистякова, Людмила Геннадьевна

<120> CD3-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PC72375

<160> 100

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Gln Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Gln Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Asp Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Asp Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Gln Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg His Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 13

Asp Tyr Tyr Met Thr

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 14

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 15

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr

1 5 10

<210> 16

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 16

Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 17

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 17

Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 18

Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 19

Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 20

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 20

Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 21

Phe Ile Arg Asn Arg Ala Gln Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 22

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 22

Arg Asn Arg Ala Gln Gly Tyr Thr

1 5

<210> 23

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 23

Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Gln Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 24

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 24

Phe Ile Arg Asn Gln Asp Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Gln Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 25

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 25

Asp Arg His Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 26

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 26

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 27

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 27

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 28

Lys Gln Ser Tyr Asp Leu Phe Thr

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 29

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 30

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 30

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 31

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 31

Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 32

Thr Ser Asp Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 33

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 33

Lys Gln Ser Tyr Tyr Leu Phe Thr

1 5

<210> 34

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 36

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 37

<211> 464

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 37

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly

165 170 175

Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val

180 185 190

Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu

210 215 220

Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

370 375 380

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 38

<211> 464

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly

165 170 175

Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val

180 185 190

Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu

210 215 220

Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

370 375 380

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 39

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 39

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 40

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 40

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn

130 135 140

Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu

145 150 155 160

Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg

165 170 175

Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser

180 185 190

Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp

195 200 205

His His His His His His

210

<210> 41

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 41

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 124

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 42

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 43

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 44

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 45

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 46

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 47

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 48

Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala

1 5

<210> 49

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 49

Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 50

Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 51

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 52

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 53

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 54

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 55

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 56

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 57

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 58

Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 59

Val Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 60

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 61

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

1 5

<210> 62

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 62

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

1 5

<210> 63

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 63

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 64

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 64

Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 65

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 65

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 66

<211> 186

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 66

Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys

1 5 10 15

Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro

20 25 30

Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp

35 40 45

Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg

65 70 75 80

Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg

85 90 95

Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile

100 105 110

Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr

115 120 125

Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro

145 150 155 160

Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp

165 170 175

Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

180 185

<210> 67

<211> 1534

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 67

tattgtcaga gtcctcttgt ttggccttct aggaaggctg tgggacccag ctttcttcaa 60

ccagtccagg tggaggcctc tgccttgaac gtttccaagt gaggtaaaac ccgcaggccc 120

agaggcctct ctacttcctg tgtggggttc agaaaccctc ctcccctccc agcctcaggt 180

gcctgcttca gaaaatgaag tagtaagtct gctggcctcc gccatcttag taaagtaaca 240

gtcccatgaa acaaagatgc agtcgggcac tcactggaga gttctgggcc tctgcctctt 300

atcagttggc gtttgggggc aagatggtaa tgaagaaatg ggtggtatta cacagacacc 360

atataaagtc tccatctctg gaaccacagt aatattgaca tgccctcagt atcctggatc 420

tgaaatacta tggcaacaca atgataaaaa cataggcggt gatgaggatg ataaaaacat 480

aggcagtgat gaggatcacc tgtcactgaa ggaattttca gaattggagc aaagtggtta 540

ttatgtctgc taccccagag gaagcaaacc agaagatgcg aacttttatc tctacctgag 600

ggcaagagtg tgtgagaact gcatggagat ggatgtgatg tcggtggcca caattgtcat 660

agtggacatc tgcatcactg ggggcttgct gctgctggtt tactactgga gcaagaatag 720

aaaggccaag gccaagcctg tgacacgagg agcgggtgct ggcggcaggc aaaggggaca 780

aaacaaggag aggccaccac ctgttcccaa cccagactat gagcccatcc ggaaaggcca 840

gcgggacctg tattctggcc tgaatcagag acgcatctga ccctctggag aacactgcct 900

cccgctggcc caggtctcct ctccagtccc cctgcgactc cctgtttcct gggctagtct 960

tggaccccac gagagagaat cgttcctcag cctcatggtg aactcgcgcc ctccagcctg 1020

atcccccgct ccctcctccc tgccttctct gctggtaccc agtcctaaaa tattgctgct 1080

tcctcttcct ttgaagcatc atcagtagtc acaccctcac agctggcctg ccctcttgcc 1140

aggatattta tttgtgctat tcactccctt ccctttggat gtaacttctc cgttcagttc 1200

cctccttttc ttgcatgtaa gttgtccccc atcccaaagt attccatcta cttttctatc 1260

gccgtcccct tttgcagccc tctctgggga tggactgggt aaatgttgac agaggccctg 1320

ccccgttcac agatcctggc cctgagccag ccctgtgctc ctccctcccc caacactccc 1380

taccaacccc ctaatcccct actccctcca ccccccctcc actgtaggcc actggatggt 1440

catttgcatc tccgtaaatg tgctctgctc ctcagctgag agagaaaaaa ataaactgta 1500

tttggctgca agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1534

<210> 68

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 68

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gccggaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtacacga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 69

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 69

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaata gggcacgcgg gtacacttca 180

gaccacaatc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 70

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 70

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gccagaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtacacga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 71

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 71

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaatc aggcacgcgg gtacacttca 180

gaccacaatc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 72

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 72

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaata gggcacaggg gtacacttca 180

gaccacaatc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 73

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 73

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaatc aggcacgcgg gtacacttca 180

gaccaccagc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 74

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 74

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gccagaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtgatcga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 75

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 75

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagcgacca gtcactgttt aatgtccgca gcggcaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtgaccga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 76

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 76

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaatc aggaccgcgg gtacacttca 180

gaccaccagc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagaccat cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 77

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 77

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gccagaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtacacga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttactacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 78

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 78

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 79

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 79

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 80

<211> 326

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 80

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Arg Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 81

<211> 326

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 81

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 82

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 82

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 83

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 83

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gcggaaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtacacga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 84

<211> 363

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 84

gaagtgcagc ttgttgaatc tggcggcggt ttggttcagc ccggtggatc actgcgactc 60

agttgcgcag ctagcggctt caccttttct gattactaca tgacatgggt acgacaggcg 120

ccaggcaagg gtttggaatg ggtagcattc atacgcaatc aggcacgcgg gtacacttca 180

gaccacaatc cctcagtaaa aggaagattt accatctcaa gagacaatgc caaaaattca 240

ctctacctgc aaatgaactc acttcgcgcc gaggataccg ccgtgtatta ctgtgccaga 300

gacagacact cttattacgt gctggactat tggggacagg gcactacagt caccgtcagc 360

tct 363

<210> 85

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 85

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 86

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 86

gacatcgtga tgacccagag ccccgatagc ctggccgtgt ctctgggaga gagagccacc 60

atcaactgca agagcagcca gagcctgttc aacgtgagaa gccggaagaa ctacctggcc 120

tggtatcagc agaaacccgg ccagcccccc aagctgctga tcagctgggc cagcaccaga 180

gaaagcggcg tgcccgatag attcagcggc agcggaagcg gcaccgactt caccctgaca 240

atcagctccc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gcaagcagag ctacgacctg 300

ttcaccttcg gcagcggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 87

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 87

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Glu Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 88

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 88

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaga gtcactgttt aatgtccgca gcggcaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtgaccga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 89

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 89

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 90

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического нуклеотида

<400> 90

gacatccaga tgacccagtc cccctcttct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60

atcacctgca caagctcaca gtcactgttt aatgtccgca gcggcaaaaa ctatcttgcg 120

tggtatcagc agaagcctgg caaggctccc aagctgctga tctactgggc cagtgaccga 180

gaatccggcg tgccttccag attctccggc tctggctctg gcaccgattt caccctgacc 240

atctcctccc tccagcctga ggatttcgcc acctactact gcaaacagtc ttacgacctt 300

ttcacttttg gcggcggaac aaaggtggag atcaag 336

<210> 91

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 91

Thr Ser Ser Glu Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 92

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 92

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 93

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 93

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 94

<211> 465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 94

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 95

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 95

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 96

<211> 465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Asp Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 97

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 97

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 98

<211> 465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 98

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 99

<211> 461

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 99

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 100

<211> 465

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность синтетического пептида

<400> 100

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Glu Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<---

1. Антитело, которое специфически связывается с CD3, где антитело содержит:

a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область один VH (VH CDR1), определяющую комплементарность область два VH (VH CDR2) и определяющую комплементарность область три VH (VH CDR3) последовательности VH c SEQ ID NO: 4; и

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область один VL (VL CDR1), определяющую комплементарность область два VL (VL CDR2) и определяющую комплементарность область три VL (VL CDR3) последовательности VL c SEQ ID NO: 3; или

b) VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, где VH и VL имеют последовательности

(i) SEQ ID NO: 2 и 1, соответственно;

(ii) SEQ ID NO: 2 и 3, соответственно;

(iii) SEQ ID NO: 5 и 3, соответственно;

(iv) SEQ ID NO: 7 и 6, соответственно;

(v) SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно;

(vi) SEQ ID NO: 4 и 6, соответственно;

(vii) SEQ ID NO: 4 и 8, соответственно;

(viii) SEQ ID NO: 10 и 9, соответственно;

(ix) SEQ ID NO: 7 и 9, соответственно;

(x) SEQ ID NO: 12 и 11, соответственно;

(xi) SEQ ID NO: 35 и 34, соответственно;

(xii) SEQ ID NO: 4 и 9, соответственно;

(xiii) SEQ ID NO: 4 и 87, соответственно; или

(xiiii) SEQ ID NO: 4 и 89, соответственно.

2. Антитело по п.1, где антитело содержит:

а) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15;

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19, 20; и

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18; и

VL CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29;

VL CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27; и

VL CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 28;

b) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 или 17,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 26, 27 и 28 соответственно;

c) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 или 17,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 29, 27 и 28 соответственно;

d) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21 или 22,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 29, 27 и 28 соответственно;

e) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 30, 27 и 28 соответственно;

f) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 29, 31 и 28 соответственно;

g) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 30, 27 и 28 соответственно;

h) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 29, 31 и 28 соответственно;

i) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 24 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 32, 31 и 28 соответственно;

j) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 25, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 29, 27 и 33 соответственно;

k) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 26, 27 и 28 соответственно;

l) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 32, 31 и 28 соответственно;

m) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 91, 31 и 28 соответственно; или

n) VH CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 14 или 15,

VH CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 19 или 20,

VH CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18, и

VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3, содержащие последовательности SEQ ID NO: 92, 31 и 28 соответственно.

3. Антитело по п.1, где антитело содержит пару аминокислотных последовательностей VL/VH, выбранную из группы, состоящей из

SEQ ID NO: 1 и 2; SEQ ID NO: 3 и 2; SEQ ID NO: 3 и 4;

SEQ ID NO: 3 и 5; SEQ ID NO: 6 и 7; SEQ ID NO: 8 и 7;

SEQ ID NO: 6 и 4; SEQ ID NO: 8 и 4; SEQ ID NO: 9 и 10;

SEQ ID NO: 9 и 7; SEQ ID NO: 11 и 12; SEQ ID NO: 34 и 35;

SEQ ID NO: 9 и 4; SEQ ID NO: 87 и 4; и SEQ ID NO: 89 и 4.

4. Антитело по п.1, где антитело содержит

VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4, и

VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3.

5. Антитело по любому из пп.1-4, которое выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, химерного антитела, поликлонального антитела, меченого антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела и их фрагментов.

6. Биспецифическое антитело, которое специфически связывается с CD3 и содержит VH CDR1, содержащее SEQ ID NO: 13, 14 или 15;

VH CDR2, содержащее SEQ ID NO: 19, 20; и

VH CDR3, содержащее SEQ ID NO: 18; и

VL CDR1, содержащее SEQ ID NO: 29;

VL CDR2, содержащее SEQ ID NO: 27; и

VL CDR3, содержащее SEQ ID NO: 28,

где биспецифическое антитело также специфически связывается с опухолевым антигеном.

7. Биспецифическое антитело по п.6, содержащее VH, содержащее SEQ ID NO: 4, и VL, содержащее SEQ ID NO: 3.

8. Антитело или биспецифическое антитело по любому из пп.1-7, дополнительно содержащее человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL.

9. Антитело или биспецифическое антитело по любому из пп.1-8, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

10. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая эффективное количество антитела или биспецифическое антитело по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Способ модуляции опосредованного Т-клетками иммунного ответа у пациента, включающий введение пациенту антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10, таким образом модулируя иммунный ответ у пациента.

12. Способ ингибирования роста опухолевых клеток у индивида, включающий введение индивиду антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10 в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток.

13. Способ по п.12, где опухолевые клетки представляют собой раковые клетки.

14. Способ по п.13, в котором рак выбран из группы, состоящей из рака груди, яичников, щитовидной железы, предстательной железы, шейки матки, легких, мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы.

15. Способ по п.14, в котором рак пищеварительной системы выбирают из группы, состоящей из рака пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, прямой кишки, ануса, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

16. Полинуклеотид для получения антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по любому из пп.1-9.

17. Применение антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10 в способе модулирования опосредованного Т-клетками иммунного ответа у пациента.

18. Применение антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10 в способе ингибирования роста опухолевых клеток у индивида.

19. Применение антитела или биспецифического антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10 в способе лечения рака, необязательно, где рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, яичников, щитовидной железы, простаты, шейки матки, легких, мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка, глиобластомы и рака пищеварительной системы.

20. Применение по п.19, где опосредованный Т-клетками иммунный ответ модулируется или где рост опухолевых клеток ингибируется.