Трехмерные полимерные сетки и их применение

Изобретение относится к способу получения трехмерной гидрогелевой сетки, имеющей один или большее количество транспортных каналов. Способ включает: (a) обработку смеси, включающей: (i) по меньшей мере два типа одновалентных ионов щелочных металлов, обладающих полной концентрацией, равной по меньшей мере 500 мМ, (ii) растворимые в воде полимерные цепи, (iii) фрагменты сшивающего реагента и (iv) необязательно молекулы-зонды, при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, необязательно, в котором смесь находится на поверхности субстрата, и необязательно в котором условия, обеспечивающие образование кристаллов соли, содержат дегидратацию смеси или охлаждение смеси, пока относительное содержание соли в смеси не увеличивается до превышающего предел растворимости, тем самым образуя смесь, содержащую один или большее количество кристаллов соли; (b) сшивание полимерных цепей в смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли, тем самым образуя гидрогель, содержащий один или большее количество кристаллов соли; и (c) взаимодействие гидрогеля, содержащего один или большее количество кристаллов соли, с растворителем, в котором растворимы один или большее количество кристаллов соли, тем самым растворяя кристаллы соли; и тем самым получая трехмерную гидрогелевую сетку, которая содержит один или большее количество транспортных каналов. Также предложены трехмерная сетка, массив и способ его получения, способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце. Предложенные трехмерные сетки могут связать большее количество анализируемого вещества, поступающее благодаря транспортным каналам, что обеспечивает более высокую чувствительность при обнаружении анализируемого вещества и количественное определение в более широком диапазоне концентраций анализируемого вещества. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 пр.

 

1. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В публикации U.S. №2008/0293592 описан способ ковалентной иммобилизации биомолекул-зондов на органических поверхностях с помощью обладающих фотохимической реакционной способностью сшивающих реагентов. На практике показано, что способ является полезным, поскольку он позволяет провести иммобилизацию биомолекул-зондов на нереакционноспособных поверхностях, таких как силанизированные стеклянные подложки и субстраты, изготовленные из стандартных промышленных пластмасс. Полимер используют в способе, описанном в US 2008/0293592, для получения типа трехмерной сетки, с которыми биомолекулы-зонды могут быть связаны на поверхности сетки или внутри сетки. По сравнению с органической поверхностью, на которой биомолекулы-зонды иммобилизуются только в двухмерной форме, трехмерная иммобилизация биомолекул в полимерных и/или сополимерных сетках обеспечивает более значительную плотность биомолекул-зондов на органической поверхности. Это увеличивает количество анализируемого вещества, которое может связаться с единицей площади органической поверхности. Таким образом, использование поверхности в качестве биологического сенсора обеспечивает более высокую точность измерения и высокую скорость измерения.

Однако недостатком способов и полимерных сеток, описанных в U.S. 2008/0293592, является то, что молекулы анализируемого вещества или компоненты анализируемого вещества, которые связываются с биомолекулами-зондами, находящимися на поверхности полимерной сетки или вблизи от нее, могут блокировать сетку. Последующие молекулы анализируемого вещества или компоненты анализируемого вещества, а также еще не связавшиеся биомолекулы-зонды, находящиеся на большем расстоянии от поверхности сетки в ее внутренней части, больше не могут участвовать в связывании.

Таким образом, необходимы улучшенные полимерные сетки.

2. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к трехмерным полимерным сеткам, включающим сшитые полимерные цепи, например, растворимые в воде полимерные цепи и один или большее количество транспортных каналов. Транспортные каналы обеспечивают находящимся в растворе молекулам, например, молекулам анализируемых веществ, доступ к полимерным цепям в сетке. В некоторых объектах полимерные цепи сшиты с молекулами-зондами и транспортные каналы обеспечивают более значительную площадь поверхности для связывания анализируемых веществ с молекулами-зондами.

Сетки предпочтительно ковалентно связаны с поверхностью. Как указано в предыдущем абзаце, один или большее количество зондов, таких как биомолекула, можно иммобилизовать на поверхности сетки и повсюду во внутренней части сетки и получить сенсор для обнаружения наличия и/или измерения количества анализируемого вещества в образце. Например, нуклеиновые кислоты-зонды можно использовать для обнаружения комплементарных нуклеиновых кислот, содержащихся в образце, и антитела-зонды можно использовать для обнаружения антигенов, содержащихся в образце. Сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают более быструю гибридизацию данного количества анализируемого вещества, чем сетки, не содержащие транспортные каналы, поскольку транспортные каналы могут эффективно увеличивать площадь поверхности сетки, открывая большее количество зондов для образца в данный момент времени. Кроме того, сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут связать большее количество анализируемого вещества, чем такой же объем сетки, не содержащей транспортные каналы, поскольку транспортные каналы уменьшают или устраняют затруднение, вследствие которого анализируемое вещество или другие компоненты образца, связанные с зондами на поверхности сетки или вблизи от нее, блокируют доступ к зондам, находящимся во внутренней части сетки.. Другим преимуществом сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что большое количество анализируемого вещества, поступающее благодаря транспортным каналам, обеспечивает более высокую чувствительность при обнаружении анализируемого вещества, чем возможная при использовании сетки, не содержащей транспортные каналы, т.е. можно увеличить отношение сигнал/шум по сравнению с использованием сеток, не содержащих транспортные каналы, поскольку данное количество анализируемого вещества может сконцентрироваться в меньшем объеме сетки. Еще одним преимуществом сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что большое количество анализируемого вещества, поступающее благодаря транспортным каналам, обеспечивает количественное определение в более широком диапазоне концентраций анализируемого вещества, чем при использовании сеток, не содержащих транспортные каналы.

Настоящее изобретение также относится к массивам, включающим множество трехмерных сеток, предлагаемых в настоящем изобретении, и субстрат. Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для обнаружения и/или измерения содержания одного или большего количества анализируемых веществ одновременно в одном или большем количестве образцов. Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно промыть и повторно использовать, и обеспечить значительную экономию затрат по сравнению с однократным использованием массивов. Другим преимуществом массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, является то, что их можно получить простым образом, поскольку все компоненты, необходимые для получения отдельной сетки, можно нанести в виде единой смеси на поверхность субстрата во время процедуры получения.

Настоящее изобретение также относится к способам получения трехмерных сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получить путем сшивки полимера в присутствии по меньшей мере двух типов кристаллов соли, предпочтительно игольчатых кристаллов соли и компактных кристаллов соли, и путем последующего растворения кристаллов соли с образованием транспортных каналов в сшитой полимерной сетке. Если не ограничиваться теорией, то авторы настоящего изобретения полагают, что наличие компактных кристаллов соли во время сшивки приводит к губкообразному полимеру с короткими каналами, через которые проходят длинные каналы, образовавшиеся вследствие присутствия игольчатых кристаллов соли во время сшивки.

Настоящее изобретение также относится к способам применения трехмерных сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, для обнаружения и/или измерения содержания анализируемого вещества в образце, предпочтительно в жидком образце.

3. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 приведено схематичное представление смеси, которая включает биомолекулу-зонд (1) и полимер (3), включающий две обладающие фотохимической реакционной способностью группы (4) в одной молекуле, растворенной в водном растворе соли (как описано в разделе 4.3.1).

На фиг. 2 представлено сечение капли смеси (5), такой как приведенная на фиг. 1, обладающей поверхностью (10), находящейся на пятне (7) поверхности (2), которая расположена на держателе (6). Поверхностью предпочтительно является поверхность органической подложки или подложки, содержащей органическое вещество. Поверхность предпочтительно является жесткой. Держателем может быть нагревающий держатель или охлаждающий держатель, обеспечивающий регулируемую кристаллизацию солей в водном растворе соли.

На фиг. 3 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 2, после нагревания смеси и когда (а) игольчатые кристаллы соли (8), простирающиеся от зародышей кристаллизации (9), и (b) компактные кристаллы (14) образовались в растворе соли.

На фиг. 4 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 3, после сушки и облучения смеси излучением в видимой области спектра (11) с образованием полимерной сетки (15), обладающей поверхностью (16).

На фиг. 5 приведено схематичное представление смеси, приведенной на фиг. 1, после облучения излучением в видимой области спектра.

На фиг. 6 представлено сечение системы, приведенной на фиг. 4, после растворения кристаллов соли в растворителе (12) с образованием транспортных каналов в виде длинных каналов (13) и коротких каналов (19).

На фиг. 7 представлен путь реакции образования сополимера (диметилакриламид-метакрилоилоксибензофенон-4-винилбензолсульфонат натрия).

На фиг. 8 представлен вид в перспективе биочипа (17), на котором полимерные сетки (15) находятся в пятнах (7), расположенных в виде матрицы из строк и столбцов. Чип предпочтительно обладает органической поверхностью.

На фиг. 9 представлен вид сверху биочипа (17), приведенного на фиг. 8, в котором каждая полимерная сетка (15) обладает диаметром (D) и в котором строки и столбцы разделены расстоянием Y и расстоянием X соответственно, измеренным от центральных точек полимерных сеток (15).

На фиг. 10 представлен биосенсор (17'), включающий гибкую ленту субстрата (18), на которой полимерные сетки (15), обладающие диаметром (D), находятся в пятнах (7), разделенных расстоянием X, измеренным от центральных точек полимерных сеток.

На фиг. 11А-11В представлен биочип с 6 строками (A-F) и 6 столбцами (1-6) в полимерных сетках до (фиг. 11А) и после (фиг. 11Б) сушки, где приведены концентрации соли, использованные для получения полимерных сеток строк D и Е, представленных на фиг. 11В. Полимерные сетки строк D и Е получали с использованием водного раствора соли, содержащего фосфат натрия и фосфат калия. Остальные строки получали с использованием водного раствора соли, содержащего только фосфат натрия при концентрации, равной 350 мМ. Полимерные сетки строк D и Е выглядят более округлыми и однородными.

На фиг. 12А-12В приведены результаты гибридизации продукта реакции ПЦР с использованием S. aureus- и Е. coli-специфической пары праймеров с массивами, соответствующими фиг. 12А - фиг. 12В. На фиг. 12А представлена гибридизация с массивом продукта ПЦР, амплифицированного из 100 копий ДНК S. aureus. На фиг. 12Б представлена гибридизация с массивом продукта ПЦР, амплифицированного из 100 копий ДНК Е. coli. На фиг. 12В представлена карта зонда для массивов, приведенных на фиг. 12А и на фиг. 12Б. Е. coli = зонд Е. coli; Salmonella = зонд Salmonella (с которым продукта ПЦР Е. coli проявляет некоторую перекрестную реакционную способность); Allstaph = кювета зонда Staphylococcus; S. aureus=зонд S. aureus; контроль ПЦР = зонд для детектирования внутреннего контроля для процесса амплификации ПЦР; LL = маячки, которыми являются меченые флуорофором олигонуклеотиды, сшитые с полимерными цепями в сетках, использующиеся в качестве массива контролей.

На фиг. 13 представлено количественное описание сигналов флуоресценции от гибридизации продукта ПЦР, амплифицированного с использованием S. aureus- и Е. coli-специфической пары праймеров при отсутствии шаблона, представляющего собой фоновый "шум". №1 представляет пятно D1, Е1; №2 представляет пятно D1, Е2; №3 представляет пятно D1, Е3; №4 представляет пятно D1, Е4; №5 представляет пятно D1, Е5; и №6 представляет пятно D1, Е6.

4. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

4.1. Трехмерные полимерные сетки

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, включают сшитый полимер, например, полимер, соответствующий публикациям Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123 или US 2008/0293592, содержание которых во всей своей полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, дополнительно включают один или большее количество транспортных каналов и необязательно могут дополнительно включать один или большее количество зондов, иммобилизованных на сетке, например, путем сшивки с полимерными цепями.

Сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут обладать отверстиями размером (измеренным в гидратированном состоянии сетки), равным, например, от 5 до 75 нм (например, от 10 до 20 нм, от 10 до 30 нм, от 10 до 40 нм, от 10 до 50 нм, от 20 до 30 нм, от 20 до 40 нм, от 20 до 50 нм, от 30 до 40 нм, от 30 до 50 нм или от 40 до 50 нм). "Гидратированное состояние сетки" означает, что сетка находится в равновесном состоянии по абсорбции воды, т.е. в водном растворе она абсорбирует столько воды, сколько из нее десорбируется.

Полимеры, которые можно использовать для получения сеток, описаны в разделе 4.1.1. Сшивающие реагенты, которые можно использовать для получения сеток, описаны в разделе 4.1.2. Характеристики одного или большего количества транспортных каналов описаны в разделе 4.1.3. Зонды, которые можно иммобилизовать на сетках, описаны в разделе 4.1.4.

4.1.1. Полимеры

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать сшитый гомополимер, сополимер, смеси гомополимеров, смеси сополимеров или смеси одного или большего количества гомополимеров и одного или большего количества сополимеров. Термин "полимер" при использовании в настоящем изобретении включает гомополимеры и/или сополимеры. Термин "сополимер" при использовании в настоящем изобретении включает полимеры, полимеризованные из двух или большего количества типов мономеров (например, биополимеры, тройные сополимеры, четверные сополимеры и т.п.). Сополимеры включают чередующиеся сополимеры, периодические сополимеры, статистические сополимеры, случайные сополимеры, блок-сополимеры, линейные сополимеры и разветвленные сополимеры. Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать любую комбинацию указанных выше типов полимеров. Реагенты и методики получения таких полимеров известны в данной области техники (см., например, Ravve, A., Principles of Polymer Chemistry, Springer Science + Business Media, 1995; Cowie, J.M.G., Polymers: Chemistry & Physics of Modern Materials, 2^nd Edition, Chapman & Hall, 1991; Chanda, M., Introduction to Polymer Science and Chemistry: A Problem-Solving Approach, 2^nd Edition, CRC Press, 2013; Nicholson, J.W., The Chemistry of Polymers, 4^th Edition, RSC Publishing, 2012; содержание которых во всей своей полноте включено в настоящее изобретение в качестве ссылки).

Предпочтительными полимерами являются гидрофильные и/или содержащие гидрофильные группы. Полимер предпочтительно растворим в воде. В одном варианте осуществления полимером является сополимер, который полимеризован из двух или большего количества типов мономеров, выбранных для обеспечения желательной степени растворимости в воде. Например, растворимость сополимера в воде можно регулировать путем изменения количества заряженного мономера, например, 4-винилсульфоната натрия, использующегося для получения сополимера.

После сшивки растворимые в воде полимеры образуют набухающие в воде гели или гидрогели. Гидрогели абсорбируют водные растворы посредством водородных связей с молекулами воды. Полную емкость при абсорбции и набухании гидрогеля можно регулировать путем изменения типа и количества сшивающих реагентов, использующихся для получения геля. Полимеры с низкой плотностью сшивок обычно обладают большей емкостью при абсорбции и набухают в большей степени, чем полимеры с высокой плотностью сшивок, но прочность геля полимеров с высокой плотностью сшивок обычно выше и она может обеспечивать сохранение формы сетки даже при умеренном давлении.

Способность гидрогеля абсорбировать воду зависит от концентрации ионов в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления гидрогель, предлагаемый в настоящем изобретении, может абсорбировать массу деионизованной дистиллированной воды, до 50 раз превышающую его массу (объем, в 5-50 раз превышающий его объем), и массу физиологического раствора, до 30 раз превышающую его массу (объем, в 4-30 раз превышающий его объем). Сниженная способность абсорбировать физиологический раствор обусловлена наличием одновалентных катионов, которые препятствуют связыванию полимера с молекулами воды.

Трехмерная сетка, предлагаемая в настоящем изобретении, может включать сополимер, который полимеризован из одного, двух, трех или большего трех типов мономеров, где один, два, три или больше трех типов мономеров включают полимеризующуюся группу, независимо выбранную из группы, включающей акрилатную группу (например, акрилатную, метакрилатную, метилметакрилатную, гидроксиэтилметакрилатную, этилакрилатную, 2-фенилакрилатную), акриламидную группу (например, акриламидную, метакриламидную, диметилакриламидную, этилакриламидную), итаконатную группу (например, итаконатную, 4-метилитаконатную, диметилитаконатную) и стирольную группу (например, стирольную, 4-метилстирольную, 4-этоксистирольную). Предпочтительными полимеризующимися группами являются акрилатная, метакрилатная, этакрилатная, 2-фенилакрилатная, акриламидная, метакриламидная, итаконатная и стирольная. В некоторых вариантах осуществления в один из мономеров, использующийся для получения сополимера, вводят, например, 4-винилбензолсульфонат натрия.

Полимер, использующийся для получения сетки, предлагаемой в настоящем изобретении, может включать по меньшей мере одну, по меньшей мере две или больше, чем две сшивающие группы в одной молекуле. Сшивающая группа является группой, которая ковалентно связывает молекулы полимера сетки друг с другом и необязательно с зондами и/или субстратом. Сополимеры, которые полимеризованы из двух или большего количества мономеров (например, мономеры, включающие полимеризующуюся группу, независимо выбранную из числа описанных в предыдущем абзаце), по меньшей мере один из которых включает сшивающий реагент, являются подходящими для получения трехмерной сетки, предлагаемой в настоящем изобретении. Типичные сшивающие реагенты описаны в разделе 4.1.2. Предпочтительным мономером, включающим сшивающий реагент, является метакрилоилоксибензофенон (МАБФ) (см. фиг. 7).

В предпочтительном варианте осуществления сополимер представляет собой биополимер или тройной сополимер, включающий сшивающий реагент. В особенно предпочтительном варианте осуществления сополимером является сополимер (диметилакриламид-метакрилоилоксибензофенон-4-винилбензолсульфонат натрия) (см. фиг. 7).

4.1.2. Сшивающие реагенты

Сшивающие реагенты (или сшивающие агенты), подходящие для получения сшивок в трехмерных сетках, включают активируемые ультрафиолетовым излучением (например, длинноволновым УФ излучением), излучением в видимой области спектра и нагреванием. Типичные сшивающие реагенты, активируемые УФ излучением, включают бензофенон, тиоксантоны (например, тиоксантен-9-он, 10-метилфенотиазин) и бензоиновые эфиры (например, метиловый эфир бензоина, этиловый эфир бензоина). Типичные сшивающие реагенты, активируемые излучением в видимой области спектра, включают этилэозин, эозин Y, бенгальский розовый, камфорхинон и эритрозин. Типичные сшивающие реагенты, активируемые нагреванием, включают 4,4'-азобис(4-циклопентановую) кислоту и 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорид и бензоилпероксид. Также можно использовать другие сшивающие реагенты, известные в данной области техники, например, которые при облучении могут образовывать радикалы или другие реакционноспособные группы.

4.1.3. Транспортные каналы

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат один или большее количество транспортных каналов.

Транспортные каналы могут обеспечить доступ к внутренней части сетки. Хотя транспортные каналы могут обладать относительно большим сечением, сетка может оставаться механически стабильной, поскольку размер отверстий сетки может быть значительно меньше, чем сечение транспортного канала.

Транспортные каналы могут образовать некоторый тип магистрали, по которой анализируемые вещества могут быстро входить во внутреннюю часть сетки и выходить из нее. Транспорт анализируемых веществ в транспортных каналах может протекать путем диффузии и/или конвекции.

Транспортные каналы образуются, когда сетка создается путем сшивки полимерных цепей в присутствии кристаллов соли, как описано в разделе 4.3. После вымывания кристаллов соли остаются транспортные каналы.

Если не ограничиваться теорией, то авторы настоящего изобретения полагают, что способы получения сеток, предлагаемые в настоящем изобретении, приводят к образованию по меньшей мере двух типов кристаллов соли, образующихся из разных пар ион металла - соль. При вымывании кристаллов соли остаются по меньшей мере два типа транспортных каналов в соответствии с принципом потери формы. Транспортные каналы позволяют анализируемым веществам проникать во внутреннюю часть сетки и специфически связываться с зондом, расположенным внутри сетки. Кроме того, транспортные каналы позволяют несвязанным анализируемым веществам существовать внутри сетки после промывки, что уменьшает интенсивность неспецифического сигнала анализируемых веществ, введенных в сетку.

Предполагается, что одним типом транспортного канала является длинный канал, образованный из игольчатых кристаллов соли. При использовании в настоящем изобретении "длинный канал" является удлиненным проходом в сетке, который (1) является в основном прямым и (2) в гидратированном состоянии сетки обладает минимальным сечением, которое равно по меньшей мере 300 нм, и длиной, которая по меньшей мере в 3 раза, предпочтительно в 5 раз и более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше минимального сечения прохода. Например, длина длинного канала может быть в 5-15 раз, 5-10 раз или 10-15 раз больше минимального сечения длинного канала. Длинный канал, который является "в основном прямым", является таким, который простирается от точки зародышеобразования в одном направлении без изменения направления более, чем на 45 градусов в любом направлении, т.е. в направлении X, Y или Z. Поскольку длинные каналы образуются из игольчатых кристаллов, которые простирается от общей точки зародышеобразования, сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать группы из (например, 5, 10 или большего количества) длинных каналов, которые сходятся в точке, расположенной в сетке, соответствующей исходной точке зародышеобразования кристаллизации. Длинные каналы обычно расположены так, сто направлены от поверхности сетки внутрь, боковое расстояние между длинными каналами уменьшается.

Предполагается, что в других объектах одним типом транспортного канала является короткий канал, например, образованный из кубических или палочкообразных кристаллов. При использовании в настоящем изобретении "короткий канал" является удлиненным проходом в сетке, который (1) является в основном прямым и (2) в гидратированном состоянии сетки обладает минимальным сечением, которое предпочтительно по меньшей мере в 10 раз больше размера отверстий сетки, и длиной, которая по меньшей мере в 3 раза (например, может находиться в диапазоне от 1 раза до 2,75 раз, от 1 раза до 2,5 раз, от 1 раза до 2 раз или от 1 раза до 1,5 раз) больше минимального сечения прохода. Короткий канал, который является "в основном прямым", является таким, который простирается от точки зародышеобразования в одном направлении без изменения направления более, чем на 45 градусов в любом направлении, т.е. в направлении X, Y или Z. Для поддержания прочности сетки короткий канал предпочтительно обладает сечением, равным не более 1/20 ширины или диаметра сетки, например, для сетки, которая находится в форме "пятна" в массиве и обладает диаметром, равным 200 мкм, сечение короткого канала предпочтительно равно не более 10 мкм и у пятна в массиве, которое обладает диаметром, равным 100 мкм, сечение короткого канала предпочтительно равно не более 5 мкм. В некоторых объектах сечение короткого канала равно примерно 20 нм или более, примерно 50 нм или более, примерно 100 нм или более, примерно 250 нм или более, по меньшей мере 500 нм или более или примерно 1 мкм или более. Короткие каналы в сетке могут обладать примерно (например, с точностью +/- 10% или +/- 25%) одинаковыми диаметрами или разными диаметрами. В предпочтительных вариантах осуществления короткие каналы в сетке обладают диаметром, в диапазоне между любыми двумя из приведенных выше значений, например, он может находиться в диапазоне от 100 нм до 10 мкм, от 50 нм до 1 мкм, от 500 нм до 5 мкм, от 250 нм до 10 мкм и т.д. и т.п.

Если не ограничиваться теорией, то авторы настоящего изобретения полагают, что короткие каналы образуют губчатый полимер, через который проходят длинные каналы.

4.1.4. Зонды

Зонд, иммобилизованный на сетке, предлагаемой в настоящем изобретении, может представлять собой биомолекулу или молекулу, которая связывается с биомолекулой, например, компонент специфически взаимодействующей системы комплементарных связывающихся компонентов (рецептор/лиганд). Например, зонды могут включать нуклеиновые кислоты и их производные (такие как РНК, ДНК, замкнутые нуклеиновые кислоты (ЗНК) и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК)), белки, пептиды, полипептиды и их производные (такие как глюкозамин, антитела, фрагменты антител и ферменты), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, моноглицериды, диглицериды и триглицериды), углеводы, ингибиторы ферментов, субстраты ферментов, антигены и эпитопы. Зонды также могут включать более крупные и составные структуры, такие как липосомы, мембраны и фрагменты мембран, клетки, лизаты клеток, фрагменты клеток, споры и микроорганизмы.

Специфически взаимодействующая система комплементарных связывающихся компонентов может быть основана, например, на взаимодействии нуклеиновой кислоты с комплементарной нуклеиновой кислотой, взаимодействии ПНК с нуклеиновой кислотой или взаимодействии фермент/субстрат, рецептор/лиганд, лектин/сахар, антитело/антиген, авидин/биотин или стрептавидин/биотин.

Нуклеиновые кислоты-зонды могут представлять собой ДНК или РНК, например, олигонуклеотид или аптамер, ЗНК, ПНК или ДНК, включающую метакрилатную группу на 5'-конце (5' Acrydite™). Зонды-олигонуклеотиды могут включать, например, от 12 до 30, от 14 до 30, от 14 до 25, от 14 до 20, от 15 до 30, от 15 до 25, от 15 до 20, от 16 до 30, от 16 до 25, от 16 до 20, от 15 до 40, от 15 до 45, от 15 до 50, от 15 до 60, от 20 до 55, от 18 до 60, от 20 до 50, от 30 до 90, от 20 до 100, от 20 до 60, от 40 до 80, от 40 до 100, от 20 до 120, от 20 до 40, от 40 до 60, от 60 до 80, от 80 до 100, от 100 до 120 или от 12 до 150 нуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления зонд-олигонуклеотид включает от 15 до 60 нуклеотидов.

При использовании нуклеиновой кислоты-зонда весь зонд или только часть зонда может быть комплементарна последовательности-мишени. Часть зонда, комплементарная последовательности-мишени, предпочтительно включает не менее 12 нуклеотидов и более предпочтительно не менее 15, не менее 18 или не менее 20 нуклеотидов. В нуклеиновых кислотах-зондах, включающих более 40 или 50 нуклеотидов, часть зонда, комплементарная последовательности-мишени, может включать не менее 25, не менее 30 или не менее 35 нуклеотидов.

Антитело может представлять собой, например, поликлональное, моноклональное или химерное антитело или его фрагмент, связывающий антиген (т.е. "антиген-связывающая часть"), или одну его цепь, белки слияния, включающие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена, включая, например, без наложения ограничений, одноцепочечные (scFv) и доменные антитела (например, доменные антитела человека, верблюда или акулы), максиантитела, миниантитела, интраантитела, диатела, триатела, тетратела, vNAR и bis-scFv (см. например, публикацию Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136). Антитела включают антитела любого класса, такие как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), и антитела не должны относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности С-домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулинов можно отнести к разным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. "Антитела" также включают любой из указанных выше типов антитело/иммуноглобулин.

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать один тип зонда или больше, чем один тип зонда (например, 2, 3, 4 или 5, или большее количество типов). Трехмерные сетки могут включать больше одного типа зонда для одной и той же мишени (например, антитела, связывающие разные эпитопы одной и той же мишени) и/или включать зонды, которые связывают множество мишеней.

Сетки могут включать меченую (например, флуоресцентно меченую) контрольную молекулу-зонд, которую можно использовать, например, для определения количества зонда, содержащегося в сетке.

Зонды могут быть распределены по сетке (например, на поверхности и во внутренней части сетки). Предпочтительно, если по меньшей мере один зонд расположен не на поверхности сетки и соприкасается по меньшей мере с одним каналом. Тогда расположенный таким образом зонд непосредственно доступен для молекул анализируемого вещества или компонентов анализируемого вещества через канал. В некоторых вариантах осуществления большинство зондов расположено во внутренней части сетки.

Один или большее количество зондов можно иммобилизовать на сетке ковалентно или нековалентно. Например, зонд можно сшить со сшитым полимером или зонд можно нековалентно связать с сеткой (например, путем связывания с молекулой, ковалентно связанной с сеткой). В предпочтительном варианте осуществления один или большее количество зондов сшиты со с шитым полимером. В некоторых вариантах осуществления большинство зондов ковалентно связаны во внутренней части сетки (например, так, что по меньшей мере часть зондов соприкасается с транспортным каналом).

Если не ограничиваться теорией, то авторы полагают, что способы, описанные в разделе 4.3 для получения трехмерных сеток в присутствии кристаллов соли (в особенности кристаллов фосфата), могут привести к большей концентрации молекул-зондов на границе раздела между полимером и каналом или вблизи от нее вследствие электростатических взаимодействий между молекулами-зондами (в особенности молекулами-зондами нуклеиновых кислот) и кристаллами соли. Поэтому в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к сеткам, предлагаемым в настоящем изобретении, в которых плотность зондов на границе раздела между полимером и каналами больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с каналом. В различных вариантах осуществления плотность зондов на границе раздела между полимером и транспортными каналами по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50% больше, чем на участках полимера, не соприкасающихся с транспортным каналом.

Плотность молекул-зондов в сетке можно проверить по следующей методике:

Сетку вводят во взаимодействие с водной жидкостью при комнатной температуре, например, в чашке. Жидкость содержит множество наночастиц, присоединенных к фрагменту, который взаимодействует с молекулами-зондами в сетке, например, со стрептавидином, если молекулы-зонды биотинилированы. Размер наночастиц меньше, чем размер отверстий сетки, и меньше, чем минимальное сечение по меньшей мере одного типа транспортного канала в сетке, что обеспечивает распределение наночастиц по полимеру. Подходящие наночастицы являются квантовыми точками диаметром 2-5 нм.

Инкубационный период выбирают так, чтобы сетка в жидкости была полностью гидратированной, т.е. чтобы сетка в среднем поглощала такое же количество воды, как то, которое она выделяет. Инкубационный период может составлять, например, 1 ч. Проникновение наночастиц в сетку можно ускорить путем перемещения сетки и/или жидкости во время инкубации, например, путем обеспечения вибрации сетки и/или жидкости, предпочтительно с помощью ультразвуковых волн.

После завершения инкубации жидкость отделяют от сетки, например, путем сливания жидкости из чашки или извлечения сетки из чашки.

Затем гидратированную сетку замораживают, например, с помощью жидкого азота. Затем замороженную сетку с помощью криомикротома можно нарезать по параллельным плоскостям и получить тонкие срезы. Плоскости среза расположены перпендикулярно продольной протяженности транспортного канала и проходят в транспортный канал. Нарезку предпочтительно проводят с помощью охлажденного жидким азотом алмазного ножа. Толщина срезов может равняться, например, примерно 100 нм или 200 нм.

С помощью микроскопа определяют положения наночастиц, находящихся на дисках, полученных нарезкой замороженной сетки. Наночастицы могут быть флуоресцирующими и при необходимости подсвеченными, чтобы их было легче отличить от сетки. Положения наночастиц можно определить с помощью подходящего программного обеспечения, включающего методику обработки изображений. Для исследования дисков предпочтительно использовать конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с флуоресцентной оптикой или электронный микроскоп.

Информацию о геометрии и/или положениях наночастиц, полученную таким образом, можно с помощью компьютера использовать для построения трехмерной геометрической модели распределения наночастиц в сетке. Затем модель можно использовать для определения того, отражает ли распределения наночастиц наличие большей плотности молекул-зондов вблизи стенок транспортных каналов.

4.2. Массивы

Трехмерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, можно расположить (например, осадить) на субстрате и их предпочтительно иммобилизуют на субстрате (например, с помощью ковалентной сшивки сетки и субстрата). Множество сеток можно иммобилизовать на субстрате с образованием массива, применимого, например, в качестве биочипа.

Подходящие субстраты включают органические полимеры, например, сополимеры циклоолефинов (СЦО), полистирол, полиэтилен, полипропилен и полиметилметакрилат (ПММА, Plexiglas®). Фирма Ticona продает подходящий СЦО под торговым названием Topas®. Неорганические материалы (например, металл, стекло) также можно использовать в качестве субстрата. На такие субстраты можно нанести покрытие из органических молекул для обеспечения сшивки сетки и поверхности субстрата. Например, на неорганические поверхности можно нанести самоагрегированные монослои (САМ). Сами САМ могут быть совершенно нереакционноспособным и например, включают или состоят из чистых алкилсиланов. Другие субстраты также могут быть подходящими для сшивки с трехмерной сеткой, если они могут участвовать в стабильных связях с органическими молекулами при свободнорадиальных реакциях (например, борорганические соединения).

Субстрат может быть жестким или эластичным. В некоторых вариантах осуществления субстрат находится в форме планшета (например, прямоугольного планшета, квадратного планшета, круглого диска и т.п.). Например, субстрат может включать микропланшет и трехмерные сетки могут быть расположены в лунках планшета.

Отдельные сетки могут быть расположены на разных пятнах на поверхности субстрата, например, в матрице, включающей множество столбцов и строк. В варианте осуществления, представленном на фиг. 11, сетки расположены на 36 пятнах, сгруппированных в 6 столбцов и 6 строк. Предусмотрены массивы, обладающие разным количеством строк и столбцов, количества каждых из которых можно выбрать независимо (например, от 2 до 64 столбцов и от 2 до 64 строк). Столбцы могут быть разделены расстоянием X и строки могут быть разделены расстоянием Y (например, как показано на фиг. 12), так что образуется сетка пятен, на которых могут быть расположены отдельные сетки. X и Y можно выбрать так, что сетки, расположенные на пятнах решетки, не соприкасаются друг с другом в дегидратированном состоянии и не соприкасаются друг с другом в гидратированном состоянии. Размеры X и Y могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления X и Y являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления X и Y являются разными. В некоторых вариантах осуществления X и Y независимо выбраны из числа расстояний, равных не менее примерно 500 мкм (например, от 500 мкм до 5 мм, от 500 мкм до 4 мм, от 500 мкм до 3 мм, от 500 мкм до 2 мм или от 500 мкм до 1 мм). В некоторых вариантах осуществления X и Y оба равны примерно 500 мкм. В других вариантах осуществления X и Y оба равны 500 мкм.

В некоторых вариантах осуществления субстрат является лентообразным (например, как показано на фиг. 10). Сетки могут быть расположены в виде одной строки, простирающейся в продольном направлении лентообразной органической поверхности, или могут быть расположены в виде множества строк, простирающихся в продольном направлении лентообразной поверхности. Строки и столбцы в таких лентообразных массивах могут обладать размерами решетки X и Y, как описано выше.

Каждая отдельная сетка может занимать участок поверхности массива, который является круглым или в основном круглым. Обычно диаметр участка на поверхности массива, покрытого отдельными сетками (т.е. диаметр пятна), равен от 80 мкм до 1000 мкм. В различных вариантах осуществления диаметр пятна равен 80 мкм, 100 мкм, 120 мкм, 140 мкм, 160 мкм, 180 мкм, 200 мкм, 300 мкм, 400 мкм, 500 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм, 900 мкм или 1000 мкм, или выбран из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 80 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 120 мкм, от 120 мкм до 140 мкм, от 120 мкм до 180 мкм, от 140 мкм до 160 мкм, от 160 мкм до 180 мкм, от 180 мкм до 200 мкм, от 120 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 400 мкм, от 160 мкм до 600 мкм или от 120 мкм до 700 мкм и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления диаметр находится в диапазоне от 100 мкм до 200 мкм или в его поддиапазоне.

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, обычно содержат не менее 8 отдельных трехмерных сеток. В некоторых объектах массивы включают не менее 16, не менее 24, не менее 48, не менее 96, не менее 128, не менее 256, не менее 512 или не менее 1024 отдельных трехмерных сеток. В некоторых вариантах осуществления массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат 24, 48, 96, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096 или 8192 отдельных сеток или содержат количество трехмерных сеток, выбранное из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 8 до 128, от 8 до 512, от 24 до 8192, от 24 до 4096, от 48 до 2048, от 96 до 512, от 128 до 1024, от 24 до 1024, от 48 до 512, от 96 до 1024 или от 128 до 512 трехмерных сеток и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления количество трехмерных сеток в массиве находится в диапазоне от 8 до 1024. В особенно предпочтительном варианте осуществления количество трехмерных сеток в массиве находится в диапазоне от 25 до 400.

Отдельные сетки, которые включают массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать одинаковые или разные зонды (например, каждая сетка может содержать особый набор зондов, множество сеток может содержать одинаковый набор зондов и другие сетки могут содержать другой набор или другие наборы зондов, или все сетки могут содержать один и тот же набор зондов). Например, сетки, находящиеся в одной строке матрицы, могут содержать одинаковые зонды и сетки, находящиеся в разных строках матрицы, могут содержать разные зонды.

Обычно для отдельных сеток массива диаметры пятен и/или объемы отдельных сеток отличаются друг от друга не более, чем на 20%, не более, чем на 15%, не более, чем на 10% или не более, чем на 5%.

В некоторых вариантах осуществления массивы включают одну или большее количество отдельных сеток (например, пятна в массиве) с одним или большим количеством контрольных олигонуклеотидов или молекул-зондов. Контрольные олигонуклеотиды могут быть мечеными, например, флуоресцентно мечеными, для использования в качестве пространственного контроля (для пространственной ориентации массива) и/или определения количества молекул-зондов, связанных с сетками, например, при промывке и повторном использовании массива, предлагаемого в настоящем изобретении (т.е. для "контроля возможности повторного использования"). Зонды для пространственного контроля и контроля возможности повторного использования могут быть одинаковыми или разными.

Одно и то же пятно в массиве или разные пятна в массиве могут дополнительно включать немеченый зонд, который является комплементарным известной мишени. При использовании для исследования гибридизации путем определения интенсивности сигнала гибридизации немеченого зонда с меченой мишенью можно определить эффективность реакции гибридизации. Если отдельную сетку (т.е. пятно в массиве) используют для контроля возможности повторного использования и/или пространственного контроля и контроля гибридизации, для мечения молекулы-мишени можно использовать флуоресцентный фрагмент, не такой, как флуоресцентный фрагмент для зондов для контроля возможности повторного использования или пространственного контроля.

В некоторых вариантах осуществления массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно повторно использовать не менее 5 раз, не менее 10 раз, не менее 20 раз, не менее 30 раз, не менее 40 раз или не менее 50 раз (например, от 5 до 20 раз, от 5 до 30 раз, от 10 до 50 раз, от 10 до 20 раз, от 10 до 30 раз, от 20 до 40 раз или от 40 до 50 раз, предпочтительно повторно использовать массив от 10 до 50 раз). Массив можно промыть раствором соли при условиях, обеспечивающих денатурацию (например, при низкой концентрации соли и высокой температуре). Например, между использованиями массив можно промыть 1-10 мМ фосфатным буфером при температуре, равной 80-90°С. Температуру промывки можно выбрать на основе протяженности (Tm) гибрида мишень : зонд.

Целостность массива можно определить с помощью зонда для "контроля возможности повторного использования". Зонд для контроля возможности повторного использования может быть флуоресцентно меченым или его можно образовать путем гибридизации с флуоресцентно меченой комплементарной нуклеиновой кислотой. Флуоресцентная метка флуоресцентно меченого зонда для контроля возможности повторного использования может обесцветиться при повторяющемся возбуждении до того, как будет нарушена целостность нуклеиновой кислоты; в таких случаях любые дополнительные повторные использования могут включать обнаружение гибридизации с флуоресцентно меченой комплементарной нуклеиновой кислотой в качестве контроля. Обычно массив, предлагаемый в настоящем изобретении, стабилен в течение не менее 6 месяцев.

В различных вариантах осуществления интенсивность сигнала флуоресценции флуоресцентно меченого зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 99%, 95% 90%, 80%, 70%, 60% или 50% от начальной интенсивности своего сигнала флуоресценции после 5, 10, 20, 30, 40 или 50 использований. Предпочтительно, если интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 75% от интенсивности своего сигнала флуоресценции после 5 или 10 использований. Массив можно продолжать повторно использовать, пока интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования составляет не менее 50% от интенсивности своего сигнала флуоресценции, например, после 20, 30, 40 или 50 повторных использований. Интенсивность сигнала флуоресценции контрольного зонда можно определять после каждого повторного использования, после каждого второго повторного использования, после каждого третьего повторного использования, после каждого четвертого повторного использования, после каждого пятого повторного использования, после каждого шестого повторного использования, после каждого седьмого повторного использования, после каждого восьмого повторного использования, после каждого девятого повторного использования, после каждого десятого повторного использования или комбинации указанных выше. Например, интенсивность сигнала можно определять периодически через 5 или 10 повторных использований вначале и частоту определения увеличивать при увеличении количества повторных использований так, что ее определяют после каждого повторного использования после некоторого количества (например, 5, 10, 20, 30, 40 или 50) использований. В некоторых вариантах осуществления частота определения составляет в среднем один раз после 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5 или 10 использований или в среднем находится в диапазоне между любыми двумя из указанных выше значений, например, один раз после 1-2 использований, один раз после 1-1,5 использований, один раз после 1-3 использований или один раз после 1,5-3 использований.

Следует отметить, что термины "пространственный контроль", "контроль возможности повторного использования" и "контроль гибридизации" включены для удобства и ссылок, и они не предназначены для указания на то, что зонды для "пространственного контроля", "контроля возможности повторного использования" и "контроля гибридизации" можно использовать сами по себе.

4.3. Способы получения трехмерных полимерных сеток

В одном объекте способы, предлагаемые в настоящем изобретении для получения трехмерных полимерных сеток, включают (а) обработку смеси, включающей водный раствор соли, полимер, сшивающий реагент и необязательно один или большее количество зондов, при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, (b) обработку смеси при условиях, обеспечивающих сшивку, для сшивки полимера с образованием сшитой полимерной сетки и (с) взаимодействие сшитой полимерной сетки с растворителем для растворения кристаллов соли и образования одного или большего количества транспортных каналов.

Способы могут дополнительно включать стадию образования смеси путем объединения водного раствора соли, полимера, сшивающего реагента и необязательно одного или большего количества зондов, и/или дополнительно включать стадию нанесения смеси на субстрат (например, субстрат, описанный в разделе 4.2) до обработки смеси при условиях, обеспечивающих образование соли. Если использующийся полимер содержит предварительно присоединенный сшивающий реагент (например, при использовании сополимера, полимеризованного из мономера, включающего сшивающий реагент), то стадия образования смеси может включать объединение водного раствора соли с полимером и необязательно с одним или большим количеством зондов.

Смесь можно нанести на субстрат до обработки смеси при условиях, обеспечивающих образование соли, например, путем распыления смеси на поверхность субстрата (например, на 1024 центра на поверхности). Смесь можно нанести на поверхность, например, с помощью устройства для нанесения пятен ДНК на чип или струйного принтера. В предпочтительном варианте осуществления смесь распыляют с помощью струйного принтера. Это обеспечивает простое и быстрое нанесение смеси на большое количество пятен на субстрате. Пятна могут быть расположены, например, в форме матрицы в нескольких строках и/или столбцах. Предпочтительно, если содержание соли в смеси во время печати меньше предельного значения растворимости, так чтобы смесь не кристаллизовалась в печатающей головке принтера. Объем смеси, наносимой на отдельные пятна, может составлять, например, 100 пл, 200 пл, 300 пл, 400 пл, 500 пл, 750 пл, 1 нл, 2 нл, 3 нл, 4 нл или 5 нл, или может быть выбран из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений (например, от 100 пл до 5 нл, от 100 пл до 1 нл, от 300 пл до 1 нл, от 200 пл до 750 нл, от 100 пл до 500 пл, от 200 пл до 2 нл, от 500 пл до 2 нл, от 1 нл до 2 нл и т.д., и т.п.). В предпочтительных вариантах осуществления объем пятна равен от 200 пл до 4 нл.

Диаметр отдельных пятен зависит от состава смеси, объема наносимой смеси и химических характеристик поверхности субстрата. Диаметры пятен обычно находятся в диапазоне от 80 мкм до 1000 мкм и его можно обеспечить путем изменения указанных выше параметров. В различных вариантах осуществления диаметры пятен равны 80 мкм, 100 мкм, 120 мкм, 140 мкм, 160 мкм, 180 мкм, 200 мкм, 300 мкм, 400 мкм, 500 мкм, 600 мкм, 700 мкм, 800 мкм, 900 мкм или 1000 мкм, или могут быть выбраны из диапазона, находящегося между любыми двумя из указанных выше значений, например, от 80 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 120 мкм, от 120 мкм до 140 мкм, от 120 мкм до 180 мкм, от 140 мкм до 160 мкм, от 160 мкм до 180 мкм, от 180 мкм до 200 мкм, от 120 мкм до 200 мкм, от 100 мкм до 400 мкм, от 160 мкм до 600 мкм или от 120 мкм до 700 мкм и т.д., и т.п. В предпочтительном варианте осуществления диаметр находится в диапазоне от 100 мкм до 200 мкм или в его поддиапазоне.

Подходящие полимеры, сшивающие реагенты и зонды, которые можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, описаны в разделах 4.1.1, 4.1.2 и 4.1.4 соответственно. В некоторых вариантах осуществления полимер, использующийся в способах, содержит по меньшей мере одну сшивающую группу в одной молекуле полимера. В предпочтительном варианте осуществления полимер содержит по меньшей мере две сшивающие группы в одной молекуле. В особенно предпочтительном варианте осуществления полимер содержит по меньшей мере две обладающие фотохимической реакционной способностью группы в одной молекуле. В этих вариантах осуществления отдельные молекулы полимера и сшивающего реагента не требуются.

Подходящие соли, которые можно включать в смесь, описаны в разделе 4.3.1. Подходящие условия, обеспечивающие образование соли, описаны в разделе 4.3.2. Подходящие условия, обеспечивающие сшивку, описаны в разделе 4.3.3. Подходящие растворители для растворения кристаллов соли описаны в разделе 4.3.4.

4.3.1. Соль

Полимерные сетки, предлагаемые в настоящем изобретении, характеризуются транспортными каналами, которые образуются, когда полимеры сшиты в смеси, содержащей кристаллы соли, образованные из водного раствора, содержащего по меньшей мере два типа солей.

Соли предпочтительно выбирают по их совместимости с одним или большим количеством зондов. В идеальном случае соль обладает одной или большим количеством из следующих характеристик, (i) соль нетоксична для зондов (например, соль не денатурирует зонды), (ii) соль не вступает в химическую реакцию с зондами, (iii) соль не взаимодействует с флуорофорами, такими как цианиновые красители, которые являются подходящими для оптической маркировки зондов, (iv) соль не вступает в химическую реакцию с анализируемыми веществами, детектирующими молекулами и/или связывающимися с ними компонентами. Предпочтительно, если по меньшей мере одна из солей образует игольчатые кристаллы.

В предпочтительном варианте осуществления раствор соли включает по меньшей мере два типа одновалентных катионов, например, два типа катионов щелочных металлов. Катионы щелочных металлов, которые можно использовать, включают катионы натрия и катионы калия, хотя также можно использовать другие катионы щелочных металлов, такие как катионы лития.

Для отношения сигнал: шум, оптимального для детектирования анализируемых нуклеиновых кислот, водный раствор соли предпочтительно содержит катионы натрия и калия и/или обладает такой полной концентрацией одновалентных катионов, что при объединении с раствором полимера и необязательным раствором зонда (до сшивки) полученная смесь обладает полной концентрацией одновалентных катионов, равной по меньшей мере 500 мМ. В предпочтительных вариантах осуществления концентрация ионов натрия в смеси равна по меньшей мере 250 мМ и может находиться в диапазоне от 250 мМ до 500 мМ, более предпочтительно в диапазоне от 300 мМ до 400 мМ. В предпочтительном варианте осуществления концентрация ионов натрия в смеси равна 350 мМ. Концентрация ионов калия в смеси предпочтительно равна по меньшей мере 150 мМ и предпочтительно находится в диапазоне от 150 мМ до 500 мМ, более предпочтительно находится в диапазоне от 200 мМ до 400 мМ и еще более предпочтительно находится в диапазоне от 250 мМ до 350 мМ.

Водный раствор соли можно получить с использованием динатрийгидрофосфата (Na₂HPO₄) и/или дигидрофосфата натрия (NaH₂PO₄), который в водном растворе, выделяет катионы Na⁺и фосфат-ионы РО₄^3-. Водный раствор соли также можно получить с использованием гидрофосфата калия (K₂HPO₄) и/или дигидрофосфата калия (KH₂PO₄).

Предпочтительно, если водный раствор соли может представлять собой буфер на основе фосфата натрия, содержащий динатрийгидрофосфат и дигидрофосфат натрия, с добавкой гидрофосфата калия (K₂HPO₄) и/или дигидрофосфата калия (KH₂PO₄). В одном варианте осуществления буфер на основе фосфата натрия, содержащий динатрийгидрофосфат и дигидрофосфат натрия, и буфер на основе фосфата калия, содержащий гидрофосфат калия и дигидрофосфат калия получают по отдельности и объединяют в одном водном растворе до или после смешивания с растворами полимера и/или зонда.

Обычно водный раствор соли предпочтительно обладает значением рН в диапазоне от 6 до 9 и более предпочтительно в диапазоне 7-8,5. В некоторых типичных вариантах осуществления рН равно 7,5, 8 или 8,5, наиболее предпочтительно 8.

Для сеток, содержащих биомолекулы-зонды на основе белка, водный раствор соли может включать забуференный фосфатом физиологический раствор ("ЗФФ") и/или сульфат одновалентного катиона.

4.3.2. Условия, обеспечивающие образование кристаллов соли Условия, обеспечивающие образование кристаллов соли, могут включать образование в смеси по меньшей мере одного кристалла соли, предпочтительно игольчатого кристалла соли, путем дегидратации смеси или охлаждения смеси, пока относительное содержание соли в смеси не увеличивается до превышающего предел растворимости, и это означает, что смесь пересыщена солью. Это стимулирует рост кристаллов соли по направлению к поверхности смеси из зародыша кристаллизации, расположенного в объеме смеси. Если не ограничиваться теорией, то можно полагать, что использование водных растворов, содержащих по меньшей мере два разных одновалентных иона металлов приводит к образованию по меньшей мере двух разных типов кристаллов соли.

Смесь можно дегидратировать путем нагревания смеси, вакуумирования смеси и/или снижения влажности атмосферы вокруг смеси.

Смесь можно нагреть (например, от примерно 50°С до примерно 70°С) путем размещения смеси на нагревательной подложке или поверхности, нагревания подложки или поверхности, на которую помещена смесь (например, от примерно 50°С до примерно 70°С), и/или взаимодействия смеси с горячим газом (например, воздухом, азотом или диоксидом углерода, температура которого выше температуры смеси), так чтобы вода выпаривалась из смеси. Взаимодействие с горячим газом, например, можно обеспечить путем помещения смеси в нагревательную печь. Во время переноса в нагревательную печь смесь можно поддерживать при влажности, равной 40% или более, например, при относительной влажности, равной примерно 60%, хотя также являются подходящими более высокие относительные влажности, даже столь высокие, как равные 75% или более. Смеси с более высокими концентрациями иона калия могут выдерживать более низкие относительные влажности и смеси с более низкими концентрациями соли калия при транспортировке предпочтительно держать при более высоких относительных влажностях.

В некоторых вариантах осуществления температура нагревательной подложки и/или воздуха, использующегося для дегидратации смеси, на 20°С или более выше температуры смеси до нагревания смеси, но ниже 100°С.

Смесь можно охладить (например, от примерно 5°С до примерно 15°С) путем размещения смеси на охлаждающей подложке или поверхности, путем охлаждения подложки или поверхности, на которую помещена смесь (например, от примерно 5°С до примерно 15°С) и/или взаимодействия смеси с холодным газом (например, воздухом, азотом или диоксидом углерода, температура которого ниже температуры смеси). При охлаждении зависящий от температуры предел растворимости соли в смеси снижается, пока смесь в конечном счете не станет пересыщена солью. Это стимулирует образование одного или большего количества кристаллов соли, предпочтительно игольчатых. В некоторых вариантах осуществления смесь охлаждают путем выдерживания в холодной камере с низкой влажностью (например, при температуре от 0°С до 10°С, относительной влажности < 40%).

Во время образования одного или большего количества кристаллов соли температуру в смеси предпочтительно поддерживают выше температуры точки росы атмосферы вокруг смеси. Это препятствует разбавлению смеси водой, конденсирующейся из атмосферы, что может привести к уменьшению относительного содержания соли в смеси.

4.3.3. Условия, обеспечивающие сшивку

Условия, обеспечивающие сшивку, можно выбрать на основании типа использующегося сшивающего реагента. Например, при использовании сшивающий реагента, активируемого ультрафиолетовым излучением (например, бензофенона, тиоксантона или бензоинового простого эфира), условия, обеспечивающие сшивку, могут включать обработку смеси ультрафиолетовым (УФ) излучением. В некоторых вариантах осуществления используют УФ излучение, обладающее длиной волны, равной от примерно 250 нм до примерно 360 нм (например, 260±20 нм или 355±20 нм). Использование УФ излучения с меньшей энергией/большей длиной волны (например, 360 нм УФ излучения по сравнению с 254 нм УФ излучением) может потребовать более длительного облучения. При использовании сшивающего реагента, активируемого излучением в видимой области спектра (например, этилэозина, эозина Y, бенгальского розового, камфорхинона или эритрозина), условия, обеспечивающие сшивку, могут включать обработку смеси излучением в видимой области спектра. При использовании термически активируемого сшивающего реагента (например, 4,4'-азобис(4-циклопентановой)кислоты и 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорида или бензоилпероксида) условия, обеспечивающие сшивку, могут включать нагревание смеси.

Продолжительность и интенсивность воздействия условий сшивки можно выбрать для обеспечения сшивки молекул полимера с молекулами другого полимера, сшивки молекул полимера с молекулами-зондами (если они содержатся) и сшивки молекул полимера с молекулами субстрата или органическими молекулами, находящимися на субстрате (если они содержатся). Продолжительность и интенсивность воздействия условий сшивки для смеси, содержащей зонды, можно определить экспериментально, например, для балансирования прочности иммобилизации и нативности молекул-зондов.

4.3.4. Растворение кристаллов соли

После сшивки полимера кристаллы соли могут растворяться в растворителе таким образом, что в сетке образуется по меньшей мере один транспортный канал. Если не ограничиваться теорией, то можно полагать, что использование двух типов катионов одновалентной соли во время образования кристалла приводит по меньшей мере к двум типам кристаллов, компактным кристаллам и игольчатым кристаллам. Растворение компактных кристаллов предположительно приводит к коротким каналам, которые приводят к губкообразному эффекту в сетке, через которую проходят длинные каналы, образовавшиеся при растворении игольчатых кристаллов.

При использовании массива, полученного способом, предлагаемым в настоящем изобретении, в качестве биологического сенсора становится возможным высокая точность измерения и высокая скорость измерения.

Растворитель для растворения одного или большего количества кристаллов соли можно выбрать таким образом, чтобы он был совместим с полимером и зондами, если они содержатся (например, растворитель можно выбрать так, чтобы он не растворял полимер и зонды). Предпочтительно, если использующимся растворителем являлся буфер на водной основе, такой как разбавленный фосфатный буфер. Метанол, этанол, пропанол или смесь этих жидкостей можно добавить к буферу, чтобы облегчить удаление несвязанного полимера из сетки.

После удаления кристаллов соли сетка может схлопнуться вследствие сушки и ее можно повторно гидратировать. Сушка сетки полезна для транспортировки и стабилизации биомолекул-зондов.

4.3.5. Способы применения трехмерных сеток

Сетки и массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для определения наличия или отсутствия анализируемого вещества в образце, предпочтительно в жидком образце. Поэтому настоящее изобретение относится к способам определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце или множестве образцов, включающим взаимодействие сетки или массива, предлагаемого в настоящем изобретении, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом, с образцом или множеством образцов, и обнаружение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце или множестве образцов. Если в способах используют массивы, содержащие разные типы зондов, способные связываться с разными типами анализируемого вещества, то наличие разных типов анализируемых веществ можно установить путем обнаружения связывания разных типов анализируемых веществ с зондами. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают стадию определения количества анализируемого вещества или анализируемых веществ, связанных с массивом.

Анализируемым веществом может быть, например, нуклеиновая кислота, такая как ампликон полимеразной цепной реакции (ПЦР). В некоторых вариантах осуществления ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца или образца окружающей среды (например, кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки, клеточный мазок или их экстракт или производное). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота является меченой (например, флуоресцентно меченой).

Анализируемое вещество, помещенное на поверхность сетки, может проникать во внутреннюю часть сетки через канал для специфического связывания с зондом (например, биомолекулой), ковалентно связанном там с полимером. При использовании массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, с сетками, иммобилизованными на нем в качестве биологического сенсора, становится возможным высокая точность измерения и высокая скорость измерения.

Сетки и массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно регенерировать после использования в качестве биосенсора и можно использовать несколько раз (например, 5 раз, не менее 10 раз, не менее 20 раз, не менее 30 раз, не менее 40 раз или не менее 50 раз). Если молекулами-зондами являются ДНК, это можно обеспечить, например, путем нагревания сетки (сеток) в 1× забуференном фосфатом физиологическом растворе при температуре, равной от 80°С до 90°С, в течение примерно 10 мин. Затем забуференный фосфатом физиологический раствор можно заменить на новый забуференный фосфатом физиологический раствор для вымывания денатурированной ДНК из сетки (сеток). Если молекулами-зондами сетки (сеток) или массива являются антигены, сетку (сетки) или массив можно регенерировать путем обработки сетки (сеток) 0,1 н. раствором NaOH в течение примерно 10 мин. Затем 0,1 н. раствор NaOH можно заменить на забуференный фосфатом физиологический раствор для вымывания антигенов из сетки. Таким образом, некоторые варианты осуществления способов применения сеток и массивов, предлагаемых в настоящем изобретении, включают применение сетки или массива, который промывали до взаимодействия с образцом или множеством образцов.

4.4. Применение массивов, предлагаемых в настоящем изобретении

Поскольку массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, обеспечивают экономичное определение наличия нуклеиновых кислот в образце и их количественное определение, оно имеет непосредственное отношение к затруднениям, связанным со здоровьем и болезнями людей и животных, не являющихся людьми.

В этих случаях применения препарат, содержащий молекулу-мишень, получают или экстрагируют из биологических источников или источников окружающей среды по протоколам, известным в данной области техники. Молекулы-мишени можно получить или экстрагировать из клеток и тканей организмов всех таксономических классов, включая вирусы, бактерии и эукариоты, прокариоты, одноклеточные организмы, растения, грибы и животных всех типов и классов. Животными могут быть позвоночные, млекопитающие, приматы и предпочтительно люди. Кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки и клеточные мазки являются подходящими источниками молекул-мишеней.

Молекулами-мишенями предпочтительно являются нуклеиновые кислоты, амплифицированные (например, с помощью ПЦР) из любых из указанных выше источников.

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать зонды, которые применимы для обнаружения патогенов людей и животных, не являющихся людьми. Такие зонды включают олигонуклеотиды, комплементарные по меньшей мере частично бактериальным, вирусным или грибковым мишеням или любой комбинации бактериальных, вирусных и грибковых мишеней.

Массивы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать зонды, применимые для обнаружения экспрессии генов в клетках людей и животных, не являющихся людьми, например, экспрессии генов, связанных с заболеванием или нарушением, таким как рак, сердечно-сосудистое заболевание или метаболическое заболевание, для диагностики субъекта, мониторинга лечения субъекта или прогноза результата лечения субъекта. Затем информация об экспрессии генов может обеспечивать прослеживание прогрессирования или ремиссии заболевания и такая информация может содействовать мониторингу завершения лечения или изменению проведения начального лечения.

5. ТИПИЧНЫЕ ПРОТОКОЛЫ

Приведенные ниже типичные протоколы, в которых использованы номера, находящиеся на прилагаемых чертежах, входят в объем настоящего изобретения, и их можно использовать для полимеров, сшивающих реагентов и зондов разделов 4.1.1, 4.1.2 и 4.1.4 соответственно. Другие полимеры (включая сополимеры) и сшивающие группы, подходящие для применения в описанных ниже методиках, описаны в публикациях Rendl et al., 2011, Langmuir 27:6116-6123 и US 2008/0293592, содержания которых включены в настоящее изобретение в качестве ссылки. В одном варианте осуществления используют смесь полимеров раздела 6.2.

5.1. Типичный протокол 1

После образования зародышей кристаллов (8), (14) пятна (7) в УФ сшивающем реагенте сразу облучают УФ излучением (11) (см. фиг. 4), так что биомолекулы-зонды (1) ковалентно связываются с полимером (3) и полимер (3) связывается с органической поверхностью (2) и сшивается (см. фиг. 5). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы высушенная, сшитая смесь (5) не поглотила влагу и повторно не стала жидкой.

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для кристаллов (8), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), (14), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются каналы (13) (см. фиг. 6), образуются длинные (13) и короткие (19) каналы. Затем растворитель (12) удаляют. Длинные каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), (14), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулой-зондом (1) и также с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

5.2. Типичный протокол 2

Смесь (5), содержащую полимер (3), биомолекулы-зонды (1) и водный раствор соли, наносят в виде пятен на органическую поверхность (2), находящуюся на планшете, с помощью стандартного устройства для нанесения пятен ДНК на чип (например, Scienion, Germany). Объемы, наносимые с помощью печати на каждое пятно (7), равны от 0,5 до 4 нл (см. фиг. 2). Планшет с пятнами (7) на поверхности (2), предпочтительно органической, помещают на охлаждающий держатель (6) (см. фиг. 3). Температуры от 5°С до 15°С являются подходящими. Жидкость этих пятен охлаждают до пересыщения буфера, что почти сразу приводит образованию зародышей кристаллов. После образования зародышей игольчатые кристаллы соли (8) могут простираться по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси (5), к поверхности (10) смеси (5). Кроме того, предположительно происходит образование более коротких кубических или палочкообразных кристаллов (14) (см. фиг. 3). После печати эти мишени помещают в печь (например, при 70°С) для полного высыхания. После образования зародышей кристаллов пятна в УФ сшивающем реагенте сразу облучают УФ излучением (11) (см. фиг. 4), так что биомолекулы-зонды (1) ковалентно связываются с полимером (3) и полимер (3) ковалентно связывается с органической поверхностью (2) и сшивается. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы высушенная, сшитая смесь не поглотила влагу и повторно не стала жидкой.

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для растворения кристаллов (8), (14), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), (14), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются транспортные каналы, например, длинные каналы (13) и короткие каналы (19). Затем растворитель (12) удаляют. Длинные каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), (14), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулой-зондом (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

Как можно видеть на фиг. 6, в сетке (15) можно образовать множество длинных каналов (13) и коротких каналов (19). Длинные каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) по меньшей мере до одной точки, расположенной в сетке (15). Длинные каналы (13) можно расположить таким образом, что, начиная от поверхности (16) по направлению к внутренней части, уменьшается боковое расстояние между каналами (13).

5.3. Типичный протокол 3

Смесь (5), содержащую полимер (3), биомолекулы-зонды (1) и водный раствор соли, печатают на поверхности (2), предпочтительно органической, планшета при нормальных условиях, при влажности, находящейся в диапазоне 40-80%, предпочтительно 50-70%. Смесь может содержать, например, 350 мМ фосфат натрия, рН 8 и 250-300 мМ фосфат калия, рН 8. Объемы, наносимые с помощью печати на каждое пятно (7), равны от 0,5 до 4 нл. Влажность в камере для печати приводит к тому, что пятна (7) остаются жидкими без образования кристалла (т.е. образование зародышей не происходит). Затем планшет помещают в контейнер, например в картонную коробку. Для переноса на планшет надевают крышки. Затем планшет с пятнами (7) помещают в сушильную печь или на нагревательную плитку, чтобы быстро вызвать образование зародышей, так что игольчатые кристаллы соли (8) простираются по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси, по направлению к поверхности (10) смеси (5). Кроме того, предполагается образование более коротких кубических или палочкообразных кристаллов (14).

Температура печи/нагревательной плитки должна быть на 20°С или более выше температуры печати. Температуры выше 100°С необязательны.

После сушки смесь облучают для сшивки полимера (3), биомолекул-зондов (1) и органической поверхности (2).

Затем высушенную, сшитую смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для растворения кристаллов (8), (14), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), (14), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются длинные каналы (13) и короткие каналы (19). Затем растворитель (12) удаляют. Длинные каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), (14), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулами-зондами (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

5.4. Типичный протокол 4

Альтернативно, планшет с пятнами (7) на поверхности (2), предпочтительно являющейся органической, подготовленный, как описано в типичном протоколе 3, можно охладить для обеспечения образования зародышей, помещая его в холодную камеру с низкой влажностью (например, при температуре < 10°С, относительной влажности < 40%). Сушку можно провести путем снижения влажности или путем вакуумирования после начала образования зародышей. После образования зародышей игольчатые кристаллы соли (8) могут простираться по меньшей мере от одного зародыша кристаллизации (9), находящегося в объеме смеси (5), по направлению к поверхности (10) смеси (5). Планшет с пятнами (7) на органической поверхности (2) помещают в печь при 60°-70°С на 1 ч для полного высыхания пятна. Пятна (7) облучают УФ излучением с энергией 1,00 Дж при 254 нм в УФ сшивающем реагенте, т.е. Stratalinker 2400. Для этого планшет с пятнами (7) можно поместить в центр камеры, располагая его короткую сторону параллельно двери камеры. Затем крышку удаляют и начинает действовать сшивающий реагент. После окончания работы прибора массив извлекают и закрывают крышкой.

Альтернативно, можно использовать другие сшивающие при воздействии УФ излучения реагенты при такой же длине волны (например, 240-270 нм) или боле значительных длинах волн, например, 360 нм.

Затем смесь (5) вводят во взаимодействие с растворителем (12) для растворения кристаллов (8), (14), так что на местах, на которых находились кристаллы (8), (14), в сетке (15), включающей полимер (3) и биомолекулы-зонды (1), образуются длинные каналы (13) и короткие каналы (19). Затем растворитель (12) удаляют. Длинные каналы (13) могут простираться от поверхности (16) сетки (15) во внутреннюю часть сетки (15). Растворитель (12), в котором растворяются кристаллы соли (8), (14), выбирают таким образом, чтобы он был совместим с биомолекулами-зондами (1) и с полимером (3). Предпочтительно, если используют растворитель (12) на водной основе.

6. ПРИМЕРЫ

6.1. Фон

Полимерные сетки, полученные в основном как описано в настоящем изобретении, но содержащие буфер на основе фосфата натрия ("NaPi") при концентрации, равной 350 мМ, без второй соли, можно высушить и они подвергаются фазовому превращению, если во время сушки на нагревательной плитке влажность не поддерживается равной 60% или более. Это обусловлено тем, что при более низких влажностях кристаллизации может протекать неконтролируемым образом.

Было бы желательно увеличить концентрацию фосфата натрия для исключения неконтролируемой кристаллизации. Однако концентрацию NaPi нельзя значительно увеличить, поскольку в этом случае кристаллы NaPi могут осадиться в принтере и заблокировать печатающую головку.

Различные соли (хлорид натрия, бромид натрия) использовали в тестовых экспериментах в комбинации с NaPi. Но ни одна из них не приводила к боле значительным сигналам, чем только NaPi. Обычно сигналы гибридизации от этих пятен были слабыми (данные не приведены).

Другие попытки сведения к минимуму высыхания при нормальных степенях влажности включали тестирование забуференного фосфатом физиологического растворе, буфера на основе цитрата натрия или буфера на основе фосфата калия вместо NaPi привели к более слабым сигналам гибридизации в полимерных сетках.

Однако, когда буфер на основе NaPi подкрепляли буфером на основе фосфата калия (как описано в разделе 6.2) наблюдалась стабилизация пятен жидкости без уменьшения сигнала, в особенности когда концентрация фосфата калия превышала 150 мМ.

При проведении этих экспериментов неожиданно обнаружено следующее. При более высоких концентрациях фосфата калия (150 мМ и более) фоновый сигнал ("шум") уменьшался и при концентрациях, равных 200 мМ, почти полностью отсутствовал шум от реакции гибридизации (как описано в разделе 6.3). Причиной этого эффекта наиболее вероятно является то, что короткие каналы приводят к губкообразной полимерной матрице, через которую проходят длинные каналы от фосфата натрия. Тогда комбинация этих двух структур улучшает не только кинетику включения (гибридизацию), но и кинетику выключения (вымывание несвязанного или слабо связанного материала). Менее интенсивный фоновый сигнал уменьшает фоновый сигнал и поэтому улучшает ПОБ (предел обнаружения) в лбом проводимом тесте, выполняемом с использованием полимерных сеток, полученных с одновременным использованием фосфата натрия и фосфата калия.

6.2. Пример 1: Образование трехмерных полимерных сеток

Исходный раствор полимера 10 мг/мл получают путем растворения 10 мг сшитого сополимера диметилакриламид - 5% метакрилоилоксибензофенона - 2,5% 4-винилбензолсульфоната натрия в 1,0 мл не содержащей ДНКазы воды. Это делают путем энергичного встряхивания и взбалтывания в течение примерно 5 мин, пока не растворится весь видимый полимер. Затем исходный раствор оборачивают фольгой для защиты от света и помещают в холодильник на ночь для обеспечения полного растворения полимера и уменьшения количества пены. Полимер содержит по меньшей мере две обладающие фотохимической реакционной способностью группы в одной молекуле.

Различные смеси, содержащие 10 мг/мл полимера (PDMAA-5%МАБФ-2,5%SSNa), биомолекулы-зонды (включая олигонуклеотиды ДНК с флуоресцентным фрагментом Су3) и водный раствор соли с 350 мМ буфером на основе фосфата натрия и в некоторых случаях с переменным количеством фосфата калия путем печати наносили на органическую поверхность планшета при равной 65% влажности. Объемы по 1,6 нл путем печати наносили на каждое пятно с помощью принтера Scienion Sciflex. Затем планшет помещали в контейнер, картонную коробку. Затем на планшет для транспортировки, обладающий органической поверхностью помещали крышки. Затем планшет с пятнами на органической поверхности помещали в печь для сушки или на нагревательную плитку (70°С) для инициирования образования кристаллов соли. После сушки в течение 1 ч планшет облучали для сшивки полимера, биомолекул-зондов и органической поверхности.

После печати планшет промывали буфером 10 мМ NaPi для удаления несвязанного материала и затем сушили и хранили. Планшет сканировали сканером Sensovation Fluorescence для визуальной оценки морфологии пятен. Полученные изображения приведены на фиг. 11А (после промывки) и на фиг. 11Б (после сушки).

Пятна в строках D и Е включают фосфат калия в переменных количествах (как показано на фиг. 11В), а пятна в оставшихся строках генерировали с помощью раствора соли, содержащего только буфер на основе фосфата натрия. Включение фосфата калия приводил к более однородным и округлым полимерным сеткам, чем для пятен, полученных с использованием только фосфата натрия (фиг. 11А - фиг. 11Б). Включение фосфата калия также всегда регулировало кристаллизацию, когда относительная влажность не увеличивалась, например, представляла собой примерно нормальную атмосферную влажность, составляющую примерно 40%.

6.3. Пример 2: Качество гибридизации полимерных сеток

Массивы, описанные в примере 1, получали с использованием зондов для детектирования S. aureus или Е. coli.

Пары праймеров для амплификации S. aureus и Е. coli использовали в реакциях ПЦР со 100 копиями геномной ДНК S. aureus и Е. coli соответственно в качестве шаблонов и продукты ПЦР гибридизировали с массивами, содержащими зонды S. aureus и Е. coli, соответственно. Результаты приведены на фиг. 12А-12Б. На фиг. 12А представлена гибридизация с массивом продукта ПЦР, амплифицированного из 100 копий ДНК S. aureus. На фиг. 12Б представлена гибридизация с массивом продукта ПЦР, амплифицированного из 100 копий ДНК Е. coli. Карта зонда для массивов, приведенных на фиг. 12А и фиг. 12Б, приведена на фиг. 12В. Это исследование показывает, что сигналы от полимерных сеток, полученных с использованием водного раствора соли, содержащего буфер на основе фосфата калия, а также буфер на основе фосфата сравнимы с сигналом от полимерных сеток, полученных с использованием водного раствора соли, содержащего только фосфат натрия.

Неожиданно было установлено, что полимерные сетки, полученные с использованием водного раствора соли, содержащего фосфат калия, характеризуются уменьшенным фоновым "шумом" по сравнению с полимерными сетками, полученными с использованием водного раствора соли, содержащего только фосфат натрия, как показано на фиг. 13. См. фиг. 13 на котором приведены количественные данные для сигналов флуоресценции от гибридизации продукта ПЦР, амплифицированного с использованием таких же S. aureus- или Е. coli-специфических пар праймеров при отсутствии шаблона. Таким образом, любой сигнал гибридизации представляет собой фоновый "шум". Фоновый "шум" отсутствует для полимерных сеток, полученных в присутствии фосфата калия в более высоких концентрациях.

7. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Примерами настоящего изобретения являются приведенные ниже предпочтительные варианты осуществления.

1. Способ получения трехмерной гидрогелевой сетки, включающий: (а) обработку смеси (необязательно находящейся на поверхности субстрата, при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, включающих:

(i) по меньшей мере два типа одновалентных ионов металлов, обладающих полной концентрацией, равной по меньшей мере 500 мМ,

(ii) растворимые в воде полимерные цепи,

(iii) фрагменты сшивающего реагента и

(iv) необязательно молекулы-зонды и

тем самым образование смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли;

(b) обработку смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли, при условиях, обеспечивающих сшивку, тем самым образование гидрогеля, содержащего один или большее количество кристаллов соли; и

(c) взаимодействие гидрогеля, содержащего один или большее количество кристаллов соли, с растворителем, в котором растворимы один или большее количество кристаллов соли, тем самым растворение кристаллов соли;

тем самым образование трехмерной гидрогелевой сетки.

2. Способ, соответствующий варианту осуществления 1, в котором смесь содержит по меньшей мере два типа одновалентных ионов металлов, обладающих полной концентрацией, равной от 500 мМ до 1000 мМ.

3. Способ, соответствующий варианту осуществления 2, в котором полная концентрация одновалентных ионов металлов в смеси равна от 550 мМ до 800 мМ.

4. Способ, соответствующий варианту осуществления 3, в котором полная концентрация одновалентных ионов металлов в смеси равна от 600 мМ до 750 мМ.

5. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-4, в котором смесь содержит два типа одновалентных ионов металлов.

6. Способ, соответствующий варианту осуществления 5, в котором концентрация каждого одновалентного иона равна по меньшей мере 150 мМ или по меньшей мере 200 мМ.

7. Способ, соответствующий варианту осуществления 5 или варианту осуществления 6, в котором одновалентные ионы металлов выбраны из группы, включающей ионы натрия, ионы калия и ионы лития.

8. Способ, соответствующий варианту осуществления 5 или варианту осуществления 6, в котором одновалентными ионами металлов являются ионы натрия и ионы калия.

9. Способ, соответствующий варианту осуществления 8, в котором концентрация ионов натрия равна по меньшей мере 300 мМ.

10. Способ, соответствующий варианту осуществления 9, в котором концентрация ионов натрия равна от 300 мМ до 500 мМ.

11. Способ, соответствующий варианту осуществления 10, в котором концентрация ионов натрия равна от 300 мМ до 400 мМ.

12. Способ, соответствующий варианту осуществления 11, в котором концентрация ионов натрия равна от 350 мМ.

13. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 8-12, в котором концентрация ионов калия равна от 150 мМ до 500 мМ.

14. Способ, соответствующий варианту осуществления 13, в котором концентрация ионов калия равна от 175 мМ до 400 мМ.

15. Способ, соответствующий варианту осуществления 14, в котором концентрация ионов калия равна от 200 мМ до 350 мМ.

16. Способ, соответствующий варианту осуществления 15, в котором концентрация ионов калия равна от 250 мМ до 350 мМ.

17. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-4, в котором смесь содержит три типа одновалентных ионов металлов.

18. Способ, соответствующий варианту осуществления 17, в котором концентрация по меньшей мере двух одновалентных ионов равна по меньшей мере 150 мМ каждого или по меньшей мере 200 мМ каждого.

19. Способ, соответствующий варианту осуществления 17 или варианту осуществления 18, в котором одновалентными ионами металлов являются ионы натрия, ионы калия и ионы лития.

20. Способ, соответствующий варианту осуществления 19, в котором концентрация ионов натрия равна по меньшей мере 250 мМ.

21. Способ, соответствующий варианту осуществления 20, в котором концентрация ионов натрия равна от 250 мМ до 500 мМ.

22. Способ, соответствующий варианту осуществления 21, в котором концентрация ионов натрия равна от 300 мМ до 400 мМ.

23. Способ, соответствующий варианту осуществления 22, в котором концентрация ионов натрия равна 350 мМ.

24. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 19-23, в котором концентрация ионов калия равна от 150 мМ до 500 мМ.

25. Способ, соответствующий варианту осуществления 24, в котором концентрация ионов калия равна от 200 мМ до 400 мМ.

26. Способ, соответствующий варианту осуществления 25, в котором концентрация ионов калия равна от 250 мМ до 350 мМ.

27. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-26, который дополнительно включает, до стадии (а), образование смеси.

28. Способ, соответствующий варианту осуществления 27, в котором образование смеси включает объединение водного раствора соли, содержащего одновалентные катионы металлов и один или большее количество растворов, содержащих растворимые в воде полимерные цепи, фрагменты сшивающего реагента и, если они содержатся, необязательные молекулы-зонды.

29. Способ, соответствующий варианту осуществления 28, в котором растворимые в воде полимерные цепи, фрагменты сшивающего реагента находятся в одном растворе.

30. Способ, соответствующий варианту осуществления 29, в котором сшитые фрагменты ковалентно связаны с полимерными цепями.

31. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 29-30, в котором водный раствор соли обладает значением рН в диапазоне от 6 до 9.

32. Способ, соответствующий варианту осуществления 31, в котором водный раствор соли обладает значением рН в диапазоне от 7 до 8,5.

33. Способ, соответствующий варианту осуществления 32, в котором водный раствор соли обладает значением рН, равным 8.

34. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 29-33, в котором водный раствор соли включает раствор, полученный по методике, включающей растворение динатрийгидрофосфата, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия, сульфата натрия, сульфата калия или их комбинации в воде или водном растворе.

35. Способ, соответствующий варианту осуществления 34, в котором водный раствор соли получен по методике, включающей растворение динатрийгидрофосфата, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия или их комбинации в воде или водном растворе.

36. Способ, соответствующий варианту осуществления 35, в котором водный раствор соли получен по методике, включающей растворение динатрийгидрофосфата, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия и дигидрофосфата калия или их комбинации в воде.

37. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-36, в котором концентрация фосфатных ионов в смеси равна по меньшей мере 250 мМ.

38. Способ, соответствующий варианту осуществления 37, в котором концентрация фосфатных ионов в смеси равна от 250 мМ до 1000 мМ.

39. Способ, соответствующий варианту осуществления 38, в котором концентрация фосфатных ионов в смеси равна от 550 мМ до 800 мМ.

40. Способ, соответствующий варианту осуществления 39, в котором концентрация фосфатных ионов в смеси равна от 600 мМ до 750 мМ.

41. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-40, в котором условия, обеспечивающие образование кристалла соли, приводят к образованию одного или большего количества игольчатых кристаллов, так что после растворения кристаллов соли образуются один или большее количество длинных каналов.

42. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-41, в котором условия, обеспечивающие образование кристалла соли, приводят к образованию одного или большего количества компактных кристаллов, так что после растворения кристаллов соли образуются один или большее количество коротких каналов.

43. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-42, в котором условия, обеспечивающие образование кристалла соли, включают дегидратацию смеси.

44. Способ, соответствующий варианту осуществления 43, который включает дегидратацию смеси путем нагревания смеси, вакуумирования смеси, снижения влажности атмосферы вокруг смеси или их комбинации.

45. Способ, соответствующий варианту осуществления 44, который включает дегидратацию смеси путем вакуумирования смеси.

46. Способ, соответствующий варианту осуществления 44, который включает дегидратацию смеси путем нагревания смеси.

47. Способ, соответствующий варианту осуществления 46, в котором нагревание смеси включает взаимодействие смеси с газом, температура которого выше температуры смеси.

48. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-42, в котором условия, обеспечивающие образование кристалла соли, включает охлаждение смеси, пока смесь не станет пересыщена солью.

49. Способ, соответствующий варианту осуществления 48, который включает охлаждение смеси путем взаимодействие смеси с газом, температура которого ниже температуры смеси.

50. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-49, в котором температуру смеси на стадии (а) поддерживают выше температуры точки росы атмосферы вокруг смеси.

51. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-50, в котором фрагменты сшивающего реагента активируют ультрафиолетовым (УФ) излучением и условия, обеспечивающие сшивку, включают обработку смеси ультрафиолетовым излучением.

52. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-50, в котором фрагменты сшивающего реагента активируют излучением в видимой области спектра и условия, обеспечивающие сшивку, включают обработку смеси излучением в видимой области спектра.

53. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-50, в котором фрагменты сшивающего реагента активируют нагреванием и условия, обеспечивающие сшивку, включают нагревание смеси.

54. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-53, в котором растворимые в воде полимерные цепи включают гомополимерные цепи.

55. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-54, в котором растворимые в воде полимерные цепи включают сополимерные цепи.

56. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-54, в котором растворимые в воде полимерные цепи включают смесь гомополимерных и сополимерных цепей.

57. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 54-56, в котором растворимые в воде полимерные цепи включают полимерные цепи, полимеризованные из одного или большего количества типов мономеров.

58. Способ, соответствующий варианту осуществления 57, в котором каждый тип мономера содержит полимеризующуюся группу, независимо выбранную из группы, включающей акрилатную группу, метакрилатную группу, этакрилатную группу, 2-фенилакрилтатную группу, акриламидную группу, метакриламидную группу, итаконатную группу и стирольную группу.

59. Способ, соответствующий варианту осуществления 58, в котором по меньшей мере один тип мономера в растворимом в воде полимере содержит метакрилатную группу.

60. Способ, соответствующий варианту осуществления 59, в котором по меньшей мере один тип мономера, содержащий метакрилатную группу, представляет собой метакрилоилоксибензофенон (МАБФ).

61. Способ по любому из вариантов осуществления 57, в котором растворимый в воде полимер включает полимер, полученный сополимеризацией диметилакриламида (ДМАА), метакрилоилоксибензофенона (МАБФ) и 4-винилбензолсульфоната натрия (SSNa).

62. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-61, в котором растворимые в воде полимерные цепи являются цепями сополимера, содержащего фрагменты сшивающего реагента.

63. Способ, соответствующий варианту осуществления 62, в котором растворимые в воде полимерные цепи содержат по меньшей мере два фрагмента сшивающего реагента на молекулу полимера.

64. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-63, в котором фрагменты сшивающего реагента выбраны из группы, включающей бензофенон, тиоксантон, бензоиновый эфир, этилэозин, эозин Y, бенгальский розовый, камфорхинон, эритрозин, 4,4'-азобис(4-циклопентановую) кислоту, 2,2-азобис[2-(2-имидазолин-2-ил)пропан]дигидрохлорид и бензоилпероксид.

65. Способ, соответствующий варианту осуществления 64, в котором фрагменты сшивающего реагента представляют собой фрагменты бензофенона.

66. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-65, в котором растворителем является вода или буфер на водной основе.

67. Способ, соответствующий варианту осуществления 66, в котором растворителем является вода.

68. Способ, соответствующий варианту осуществления 66, в котором растворителем является буфер на водной основе.

69. Способ, соответствующий варианту осуществления 68, в котором буфер на водной основе включает фосфат, метанол, этанол, пропанол или их смесь.

70. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-69, в котором смесь на стадии (а) дополнительно включает молекулы-зонды.

71. Способ, соответствующий варианту осуществления 70, в котором по меньшей мере некоторые, большинство или все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту, производное нуклеиновой кислоты, пептид, полипептид, белок, углевод, липид, клетку, лиганд или их комбинацию.

72. Способ, соответствующий варианту осуществления 71, в котором по меньшей мере некоторые из молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

73. Способ, соответствующий варианту осуществления 71, в котором по меньшей мере большинство молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

74. Способ, соответствующий варианту осуществления 71, в котором все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту или производное нуклеиновой кислоты.

75. Способ, соответствующий варианту осуществления 70, в котором по меньшей мере некоторые, большинство или все молекулы-зонды включает антитело, фрагмент антитела, антиген, эпитоп, фермент, субстрат фермента, ингибитор фермента, нуклеиновую кислоту или их комбинацию.

76. Способ, соответствующий варианту осуществления 75, в котором по меньшей мере некоторые из молекул-зондов включают нуклеиновую кислоту.

77. Способ, соответствующий варианту осуществления 75, в котором по меньшей мере большинство молекул-зондов включает нуклеиновую кислоту.

78. Способ, соответствующий варианту осуществления 75, в котором все молекулы-зонды включают нуклеиновую кислоту.

79. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 76-78, в котором нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.

80. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 12 до 30 нуклеотидов.

81. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 30 нуклеотидов.

82. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 25 нуклеотидов.

83. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 14 до 20 нуклеотидов.

84. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 30 нуклеотидов.

85. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 25 нуклеотидов.

86. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 20 нуклеотидов.

87. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 30 нуклеотидов.

88. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 25 нуклеотидов.

89. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 16 до 20 нуклеотидов.

90. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 40 нуклеотидов.

91. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 45 нуклеотидов.

92. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 50 нуклеотидов.

93. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 15 до 60 нуклеотидов.

94. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 55 нуклеотидов.

95. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 18 до 60 нуклеотидов.

96. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 50 нуклеотидов.

97. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 30 до 90 нуклеотидов.

98. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 100 нуклеотидов.

99. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 120 нуклеотидов.

100. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 40 нуклеотидов.

101. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 20 до 60 нуклеотидов.

102. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 80 нуклеотидов.

103. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 100 нуклеотидов.

104. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 40 до 60 нуклеотидов.

105. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 60 до 80 нуклеотидов.

106. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 80 до 100 нуклеотидов.

107. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 100 до 120 нуклеотидов.

108. Способ, соответствующий варианту осуществления 79, в котором олигонуклеотид включает от 12 до 150 нуклеотидов.

109. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 1-108, дополнительно включающий до стадии (а) стадию нанесения смеси на поверхность субстрата.

110. Способ, соответствующий варианту осуществления 109, в котором смесь наносят в объеме, равном от 100 пл до 1 нл.

111. Способ, соответствующий варианту осуществления 109, в котором смесь наносят в объеме, равном от 100 пл до 1 нл.

112. Способ, соответствующий варианту осуществления 109, в котором смесь наносят в объеме, равном от 200 пл до 1 нл.

113. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 109-112, в котором стадия нанесения смеси на субстрат включает распыление смеси на поверхность субстрата.

114. Способ, соответствующий варианту осуществления 113, в котором смесь распыляют с помощью струйного принтера.

115. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 109-114, в котором субстрат включает органический полимер или неорганический материал, содержащий самоагрегированный монослой органических молекул на поверхности.

116. Способ, соответствующий варианту осуществления 115, в котором субстрат включает органический полимер.

117. Способ, соответствующий варианту осуществления 116, в котором органический полимер выбран из группы, включающей сополимеры циклоолефинов, полистирол, полиэтилен, полипропилен, поликарбонат и полиметилметакрилат.

118. Способ, соответствующий варианту осуществления 117, в котором субстрат включает полиметилметакрилат, полистирол или сополимеры циклоолефинов.

119. Способ, соответствующий варианту осуществления 115, в котором субстрат включает неорганический материал, содержащий алкилсилановый самоагрегированный монослой на поверхности.

120. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 109-119, в котором субстрат включает микропланшет.

121. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 109-120, в котором полимер сшивают с поверхностью на стадии (b).

122. Способ, соответствующий варианту осуществления 121, получают набухающий в воде полимер, который сшивают с поверхностью.

123. Способ, соответствующий варианту осуществления 122, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать массу деионизованной дистиллированной воды, до 50 раз превышающую его массу.

124. Способ, соответствующий варианту осуществления 122 или варианту осуществления 123, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать объем деионизованной дистиллированной воды, в 5-50 раз превышающий его объем.

125. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 122-124, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать массу физиологического раствора, до 30 раз превышающую его массу.

126. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 122-125, в котором набухающий в воде полимер может абсорбировать объем физиологического раствора, в 4-30 раз превышающий его объем.

127. Способ получения массива, включающий образование множества трехмерных гидрогелевых сеток способом, соответствующим любому из вариантов осуществления 1-126, на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата.

128. Способ, соответствующий варианту осуществления 127, в котором трехмерные гидрогелевые сетки образуются одновременно.

129. Способ, соответствующий варианту осуществления 127, в котором трехмерные гидрогелевые сетки образуются последовательно.

130. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 127-129, дополнительно включающий сшивку множества трехмерных гидрогелевых сеток с поверхностью субстрата.

131. Способ получения массива, включающий размещение множества трехмерных гидрогелевых сеток, полученных или получаемых способом, соответствующим любому из вариантов осуществления 1-126, на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата.

132. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 127-131, дополнительно включающий сшивку трехмерных гидрогелевых сеток с поверхностью.

133. Способ получения массива, включающий размещение множества трехмерных гидрогелевых сеток, полученных или получаемых способом, соответствующий любому из вариантов осуществления 109-126, на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата.

134. Способ, соответствующий варианту осуществления 133, в котором размещение включает нанесение смесей, из которых образуются трехмерные гидрогелевые сетки, на отдельные пятна.

135. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 127-134, в котором пятна расположены в столбцах и/или строках.

136. Трехмерная гидрогелевая сетка, полученная или получаемая способом, соответствующим любому из вариантов осуществления 1-126.

137. Массив, включающий множество трехмерных гидрогелевых сеток, соответствующих любому из вариантов осуществления, 136 на субстрате.

138. Массив, полученный или получаемый способом, соответствующим любому из вариантов осуществления 127-135.

139. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 8 трехмерных гидрогелевых сеток.

140. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 16 трехмерных гидрогелевых сеток.

141. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 24 трехмерные гидрогелевые сетки.

142. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 48 трехмерных гидрогелевых сеток.

143. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 96 трехмерных гидрогелевых сеток.

144. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 128 трехмерных гидрогелевых сеток.

145. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 256 трехмерных гидрогелевых сеток.

146. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 512 трехмерных гидрогелевых сеток.

147. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает по меньшей мере 1024 трехмерные гидрогелевые сетки.

148. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает от 24 до 8192 трехмерных гидрогелевых сеток.

149. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает от 24 до 4096 трехмерных гидрогелевых сеток.

150. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает от 24 до 2048 трехмерных гидрогелевых сеток.

151. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает от 24 до 1024 трехмерных гидрогелевых сеток.

152. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает от 24 трехмерных гидрогелевых сеток.

153. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 48 трехмерных гидрогелевых сеток.

154. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 96 трехмерных гидрогелевых сеток.

155. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 128 трехмерных гидрогелевых сеток.

156. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 256 трехмерных гидрогелевых сеток.

157. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 512 трехмерных гидрогелевых сеток.

158. Массив, соответствующий варианту осуществления 137 или варианту осуществления 138, который включает 1024 трехмерные гидрогелевые сетки.

159. Массив, соответствующий любому из вариантов осуществления 137-158, в котором трехмерные гидрогелевые сетки включают молекулы-зонды и две или большее количество трехмерных гидрогелевых сеток включают одинаковые типы молекул-зондов.

160. Массив, соответствующий любому из вариантов осуществления 137-159, в котором трехмерные гидрогелевые сетки включают молекулы-зонды и две или большее количество трехмерных гидрогелевых сеток включают одинаковые типы молекул-зондов.

161. Массив, соответствующий любому из вариантов осуществления 137-158, в котором трехмерные гидрогелевые сетки включают молекулы-зонды и каждая из трехмерных гидрогелевых сеток включает одинаковые типы молекул-зондов.

162. Массив, соответствующий любому из вариантов осуществления 137-161, в котором множество трехмерных гидрогелевых сеток включает одну или большее количество трехмерных гидрогелевых сеток, включающих меченые контрольные молекулы-зонды.

163. Массив, соответствующий варианту 162, в котором меченые контрольные молекулы-зонды являются флуоресцентно мечеными.

164. Массив, соответствующий любому из вариантов осуществления 137-163, в котором субстрат включает микропланшет и каждая лунка микропланшета содержит не более одной трехмерной гидрогелевой сетки.

165. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце, включающий:

(a) взаимодействие трехмерной гидрогелевой сетки, соответствующего варианту осуществления 136 или массива, соответствующего любому из вариантов осуществления - 164, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом в образце; и

(b) детектирование связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной гидрогелевой сетке или массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце.

166. Способ, соответствующий варианту осуществления 165, который дополнительно включает промывку сетки или массива, включающего молекулы-зонды, между стадиями (а) и (b).

167. Способ, соответствующий варианту осуществления 165 или варианту осуществления 166, который дополнительно включает взаимодействие сетки или массива, включающего молекулы-зонды, с блокирующим реагентом до стадии (а).

168. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 165-167, дополнительно включающий определение количества анализируемого вещества, связанного с трехмерной гидрогелевой сеткой или массивом, включающим молекулы-зонды.

169. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов, включающий:

(a) взаимодействие массива, соответствующего любому из вариантов осуществления 137-167, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом в образцах; и

(b) детектирование связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов.

170. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов, включающий:

(a) взаимодействие массива, соответствующего любому из вариантов осуществления 137-164, включающего молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом в образцах и включающего контрольные молекулы-зонды, в котором массив использовали и промывали до стадии (а); и

(b) детектирование связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в каждом образце множества образцов.

171. Способ определения того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества, включающий:

(а) взаимодействие массива, соответствующего любому из вариантов осуществления 137-164, содержащих разные типы молекул-зондов, которые способны связываться с разными типами анализируемых веществ в образце; и

(b) детектирование связывания анализируемых веществ с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества.

172. Способ определения того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества, включающий:

(a) взаимодействие массива, соответствующего любому из вариантов осуществления 137-164, включающего разные типы молекул-зондов, которые способны связываться с разными типами анализируемых веществ в образце и включающего контрольные молекулы-зонды, в котором массив использовали и промывали до стадии (а); и

(b) детектирование связывания анализируемых веществ с молекулами-зондами в массиве, тем самым определение того, содержится ли в образце больше одного типа анализируемого вещества.

173. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 169-172, в котором:

(a) субстрат массива включает микропланшет;

(b) каждая лунка микропланшета содержит не более одной трехмерной гидрогелевой сетки; и

(c) взаимодействие массива с образцами включает взаимодействие каждой лунки не более, чем с одним образцом.

174. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 169-173, который дополнительно включает промывку массива, включающего молекулы-зонды, между стадиями (а) и (b).

175. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 169-174, который дополнительно включает взаимодействие массива, включающего молекулы-зонды, с блокирующим реагентом до стадии (а).

176. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 169-175, дополнительно включающий определение количества анализируемого вещества или анализируемых веществ, связанных с массивом.

177. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 165-176, дополнительно включающий повторное использование массива.

178. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 5 раз.

179. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 10 раз.

180. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 20 раз.

181. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 30 раз.

182. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 40 раз.

183. Способ, соответствующий варианту осуществления 177, в котором массив повторно используют не менее 50 раз.

184. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 5 до 20 раз.

185. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 5 до 30 раз.

186. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 10 до 50 раз.

187. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 10 до 20 раз.

188. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 10 до 30 раз.

189. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 20 до 40 раз.

190. Способ, соответствующий варианту осуществления 178, который включает повторное использование массива от 40 до 50 раз.

191. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 177-190, который включает промывку массива между повторными использованиями.

192. Способ, соответствующий варианту осуществления 191, в котором массив промывают при условиях, обеспечивающих денатурацию.

193. Способ, соответствующий варианту осуществления 192, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива.

194. Способ, соответствующий варианту осуществления 192, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают обработку массива солью в низких концентрациях.

195. Способ, соответствующий варианту осуществления 192, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива и обработку массива солью в низких концентрациях.

196. Способ, соответствующий варианту осуществления 192, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, исключают перед повторным использованием.

197. Способ, соответствующий варианту осуществления 196, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива и в котором температуру снижают перед повторным использованием.

198. Способ, соответствующий варианту осуществления 196, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают обработку массива солью в низких концентрациях и в котором концентрацию соли повышают перед повторным использованием.

199. Способ, соответствующий варианту осуществления 196, в котором условия, обеспечивающие денатурацию, включают нагревание массива и обработку массива солью в низких концентрациях и в котором температуру снижают и концентрацию соли повышают перед повторным использованием.

200. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 177-199, в котором массив включает по меньшей мере одну трехмерную гидрогелевую сетку, включающую флуоресцентно меченый олигонуклеотид, для контроля возможности повторного использования.

201. Способ, соответствующий варианту осуществления 200, который включает определение интенсивности сигнала флуоресценции.

202. Способ, соответствующий варианту осуществления 201, в котором интенсивность сигнала флуоресценции для контроля возможности повторного использования после 10 использований составляет не менее 70% от исходного значения.

203. Способ, соответствующий варианту осуществления 202, в котором интенсивность сигнала флуоресценции для контроля возможности повторного использования после 20 использований составляет не менее 50% от исходного значения.

204. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 200-203, в котором массив больше повторно не используют после того, как интенсивность сигнала флуоресценции зонда для контроля возможности повторного использования станет составлять менее 50% от исходного значения.

205. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 165-204, в котором анализируемым веществом является нуклеиновая кислота.

206. Способ, соответствующий варианту осуществления 205, в котором нуклеиновая кислота представляет собой ампликон полимеразной цепной реакции (ПЦР).

207. Способ, соответствующий варианту осуществления 205, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца или образца окружающей среды.

208. Способ, соответствующий варианту осуществления 207, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из биологического образца

209. Способ, соответствующий варианту осуществления 207, в котором ампликон ПЦР амплифицирован из образца окружающей среды.

210. Способ, соответствующий варианту осуществления 208, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка, плазма, ткань, клетки, слюна, мокрота, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, молоко, слезы, кал, пот, сперма, цельные клетки, компонент клетки, клеточный мазок или их экстракт или производное.

211. Способ, соответствующий варианту осуществления 210, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка или плазма млекопитающего или их экстракт.

212. Способ, соответствующий варианту осуществления 211, в котором биологическим образцом является кровь, сыворотка или плазма человека или крупного рогатого скота или их экстракт.

213. Способ, соответствующий варианту осуществления 210, в котором биологическим образцом является молоко или его экстракт.

214. Способ, соответствующий варианту осуществления 213, в котором биологическим образцом является коровье молоко или его экстракт.

215. Способ, соответствующий любому из вариантов осуществления 205-214, в котором нуклеиновая кислота является меченой.

216. Способ, соответствующий варианту осуществления 215, в котором нуклеиновая кислота является флуоресцентно меченой.

Хотя проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления, следует понимать, что без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения в него можно внести различные изменения.

8. УКАЗАНИЕ О ССЫЛКАХ

Все публикации, патенты, заявки на патенты и другие документы, указанные в описании, во всей их полноте включены в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов в такой степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент и другой документ были по отдельности указаны, как включенные в настоящее изобретение в качестве ссылки для всех объектов. В случае, если имеются расхождения между положениями одной или большей количества ссылок, включенных в настоящее изобретение, и настоящим изобретением, действуют положения настоящего изобретения.

1. Способ получения трехмерной гидрогелевой сетки, имеющей один или большее количество транспортных каналов, включающий:

(a) обработку смеси, включающей:

(i) по меньшей мере два типа одновалентных ионов щелочных металлов, обладающих полной концентрацией, равной по меньшей мере 500 мМ,

(ii) растворимые в воде полимерные цепи,

(iii) фрагменты сшивающего реагента, и

(iv) необязательно молекулы-зонды,

при условиях, обеспечивающих образование кристаллов соли, необязательно, в котором смесь находится на поверхности субстрата, и необязательно в котором условия, обеспечивающие образование кристаллов соли, содержат дегидратацию смеси или охлаждение смеси, пока относительное содержание соли в смеси не увеличивается до превышающего предел растворимости, тем самым образование смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли;

(b) сшивание полимерных цепей в смеси, содержащей один или большее количество кристаллов соли, тем самым образование гидрогеля, содержащего один или большее количество кристаллов соли; и

(c) взаимодействие гидрогеля, содержащего один или большее количество кристаллов соли, с растворителем, в котором растворимы один или большее количество кристаллов соли, тем самым растворение кристаллов соли;

тем самым образование трехмерной гидрогелевой сетки, которая содержит один или большее количество транспортных каналов.

2. Способ по п. 1, в котором смесь содержит по меньшей мере два типа одновалентных ионов щелочных металлов, обладающих полной концентрацией, равной от 500 мМ до 1000 мМ.

3. Способ по п. 2, в котором смесь включает ионы натрия в концентрации, равной 200 мМ или более, и ионы калия в концентрации, равной 150 мМ или более, необязательно в котором:

(а) концентрация ионов натрия находится в диапазоне от 300 мМ до 400 мМ; и

(b) концентрация ионов калия находится в диапазоне от 200 мМ до 350 мМ.

4. Способ по любому из пп. 1-3, который дополнительно включает, до стадии (а), образование смеси, необязательно путем объединения водного раствора соли, содержащего одновалентные катионы щелочных металлов, и одного или большего количества растворов, содержащих растворимые в воде полимерные цепи, фрагменты сшивающего реагента и, если они содержатся, необязательные молекулы-зонды.

5. Способ по п. 4, в котором водный раствор соли обладает значением рН в диапазоне от 6 до 9.

6. Способ по п. 4 или 5, в котором водный раствор соли получен по методике, включающей растворение динатрийгидрофосфата, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата калия и дигидрофосфата калия или их комбинации в воде.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором растворимые в воде полимерные цепи включают метакрилатные группы и по меньшей мере два фрагмента сшивающего реагента на молекулу, необязательно в котором фрагменты сшивающего реагента представляют собой фрагменты бензофенона.

8. Способ по п. 7, в котором растворимые в воде полимерные цепи полимеризованы из диметилакриламида (ДМАА), метакрилоилоксибензофенона (МАБФ) и 4-винилбензолсульфоната натрия (SSNa).

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором смесь на стадии (а) включает молекулы-зонды, необязательно в котором молекулы-зонды являются молекулами нуклеиновой кислоты.

10. Трехмерная сетка, полученная или получаемая способом по любому из пп. 1-9.

11. Трехмерная сетка, включающая сшитые растворимые в воде полимерные цепи и одну или большее количество молекул-зондов, и имеющая один или большее количество длинных транспортных каналов и один или большее количество коротких транспортных каналов, необязательно, в которой молекулами-зондами являются молекулы нуклеиновой кислоты, в которой

(a) каждый длинный транспортный канал является в основном прямым, и в гидратированном состоянии сетки обладает минимальным сечением, которое равно по меньшей мере 300 нм, и длиной, которая по меньшей мере в 3 раза больше минимального сечения прохода; и

(b) каждый короткий транспортный канал является в основном прямым, и в гидратированном состоянии сетки обладает длиной, которая менее чем в 3 раза больше его минимального сечения прохода.

12. Трехмерная сетка по п. 11, в которой через по меньшей мере один короткий транспортный канал проходит один или большее количество длинных транспортных каналов.

13. Массив, включающий множество трехмерных сеток по любому из пп. 10-12, в котором (а) трехмерные сетки иммобилизованы на субстрате и (b) каждая из трехмерных сеток находится в отдельном пятне на субстрате, необязательно в котором массив можно повторно использовать не менее 10 раз.

14. Способ получения массива, включающий получение множества трехмерных гидрогелевых сеток способом по любому из пп. 1-9 на отдельных пятнах на поверхности одного и того же субстрата и сшивку сеток с субстратом на стадии (b).

15. Способ определения того, содержится ли анализируемое вещество в образце, включающий:

(а) взаимодействие трехмерной гидрогелевой сетки по любому из пп. 10-12 или массива по п. 13, указанная сетка или массив включает молекулы-зонды, которые способны связываться с анализируемым веществом в образце; и

(b) детектирование связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной гидрогелевой сетке или массиве, тем самым определение того, содержится ли анализируемое вещество в образце.

16. Способ по п. 15, в котором сетку или массив использовали и промывали по меньшей мере 10 раз до стадии (а) или который дополнительно включает повторное использование сетки или массива по меньшей мере 10 раз после стадии (b).

17. Способ по п. 16, который дополнительно включает количественное определение связывания анализируемого вещества с молекулами-зондами в трехмерной сетке.