Способ получения безвирусного, генетически однородного посадочного материала батата (ipomoea batatas l.) in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов из микрочеренков батата in vitro, относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro микрочеренков растений батата и может быть использовано для массового получения безвирусного, генетически однородного, высококачественного посадочного материала ценных сортов батата. Это достигается за счет того, что в качестве первичного экспланта используют микрочеренки, содержащие сегмент стебля с одной пазушной меристемой, которые культивируют на питательной среде, содержащей ^х/г нормы минеральных солей по прописи Мурасиге и Скуга, а также гормоны - кинетин в концентрации 0,5 мг/л и индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5 мг/л, и проводят адаптацию микроклонов к условиям ex vitro с применением аэропоники. Изобретние позволяет ускорить процесс массового получения безвирусного, генетически однородного, высококачественного посадочного материала батата.

 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, предназначено для культивирования in vitro микрочеренков, содержащих сегмент стебля и одну пазушную меристему (почку) растений батата и может быть использовано для ускоренного получения генетически однородного, безвирусного посадочного материала ценных сортов батата.

В настоящее время наиболее перспективной областью развития пищевой промышленности является производство продуктов питания функционального и диетического назначения. Потребление таких продуктов в России составляет примерно 1400 тонн в год. К функциональным продуктам можно отнести продукты, в состав которых входят, например, пищевые волокна, антиоксиданты, пребиотики и др. Необходимость потребления такой продукции связано, прежде всего, с повышением иммунного статуса человека. Особый интерес, в последнее время, привлекают растения, способные образовывать в тканях инулин - природный полисахарид, не имеющий синтетических аналогов. Он содержится более чем в 3000 растениях, преимущественно в их корнях и клубнях. Анализ состояния рынка по производству функциональных ингредиентов, в частности, инулина, показывает, что производство в Российской Федерации таких веществ практически отсутствует. Как правило, российские производители используют импортный инулин. Поиск альтернативных источников инулина остается актуальным направлением исследований. Одной из перспективных таких сельскохозяйственных культур является батат. Интерес к данной культуре связан, прежде всего, с тем, что клубни являются источником минералов, витаминов, антиоксидантов и, конечно, инулина, а также является хорошим источником бета-каротина, предшественника витамина А. Благодаря содержанию в клубнях различных компонентов, его диетологи считают более здоровым продуктом, чем картофель. Он менее калориен, обладает низким гликемическим индексом, а значит, не влияет на уровень сахара в организме. Поэтому его смело можно использовать в рационе питания диабетикам.

Основной способ размножения батата - вегетативный - черенками. Однако при таком способе размножения, не редко, происходит передача инфекции, в частности вирусов, от исходного растения-донора к последующему посадочному материалу (см. Hettiarachchi A. Tissue culture and meristem culture in sweet potato (Ipomea batatas (L.) Lam.). A report by ARC, - 1988. - pp.1-7.; Dugassa G., Feyissa T. In vitro production of virus-free sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam] by meristem culture and thermotherapy. // Ethiop.J. Sci., - 2011. - 34(1):17-28.; Melissa S. S., Blay E.T., Amissah N. Responses of Four Sweet Potato {Ipomoea Batatas L.) Accessions to In Vitro Regeneration and Slow Growth Preservation // Agri Res & Tech: Open Access J. -2019. - 22(5):556210. doi: 10.19080/ARTOAJ.2019.22.556210). Кроме того, размножение батата черенками приводит к получению ограниченного количества посадочного материала. Как правило, с одного клубневидного корня батата можно получить от 30 до 50 шт черенков.

Культура изолированных клеток и тканей растений - перспективное направление исследований, позволяющее получать генетически однородный, оздоровленный посадочный материал в течение всего календарного года, не зависимо от сезона. Работы по культивированию батата в условиях in vitro проводятся в различных лабораториях ряда стран Африки, Азии, Латинской Америки (см. Dolinski R., Olek О. Micropropagation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) from node explants. // Acta Sci Pol., Hortorum Cultus. - 2013. 1-2(4): 117-127.; Onwubiko N.C., Ihezie С.J., Mozie M.U. In vitro Regeneration of Sweet Potato {Ipomoea batatas (L.) Lam.) from Node Explants. // American Journal of Experimental Agriculture. - 2015. - 8(2): 87-92.). Однако предлагаемые технологии мало эффективны, так как они зависят от количества и качества исходного материала.

Известен способ размножения растений батата in vitro - получение растений-регенерантов в первичной и пересадочной каллусной ткани. В качестве первичного экспланта авторы предлагают использовать листовые пластинки (см. Addae-Frimpomaah F., Amponsah J., Tengey Т.К. Regeneration of three sweet potato (Ipomoea batatas L.) accessions in Ghana via meristem and nodal culture // International Journal of Plant Breeding and Genetics. - 2014. - Vol. 8, - No 3. - P. 121-138). Каллусную ткань получали на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей низкие концентрации БАП или кинетина (Кин). Сообщается, что содержание в среде БАП в концентрации 0,25 мг/л приводило к формированию растений-регенерантов из каллусной ткани в 80% случаев.

Недостатком данного способа является то, что растения-регенеранты, полученные из дедифференцированных клеток каллусной ткани, как правило, генетически неоднородны между собой (наблюдается сомаклональная вариабельность, проявляющаяся как на морфологическом, так и на генетическом уровне) и отличаются от растения-донора. Такие растения представляют интерес только для селекционеров, но не для производителей высококачественного посадочного материала.

Прототипом заявленного изобретения явился способ, предусматривающий размножение батата in vitro на питательной среде Мурасига и Скуга (МС), содержащей различные регуляторы роста (6-бензиламинопурин (БАП), гибберелловую кислоту, α-нафтилуксусную кислоту (НУК)) в различных концентрациях и соотношениях. Черенки с одной или двумя пазушными почками нарезают с растения-донора и подвергают стерилизации в течение 10-12 минут 7-9%-ным раствором гипохлорида натрия. Это позволило авторам получить выход 90-100% стерильных эксплантов, однако их жизнеспособность не превышала 73%. Гибель эксплантов наблюдали уже на 14 сутки с начала культивирования. На этапе микроразмножения для получения высокого коэффициента размножения авторы применяли регуляторы роста - БАП и НУК в концентрациях от 1 до 3 мг/л. В этих условиях формируется множество побегов, которые характеризуются аномальным развитием. Формируются укороченные и витрифицированные (оводненные) побеги. Как правило, такие растения не способны к длительному культивированию в условиях in vitro и плохо переносят адаптацию к условиям ex vitro. Кроме того, в представленном способе не приводятся технологии адаптации клонированных растений к условиям ex vitro (см. Abubakar A.S., Yahaya S.U., Shaibu A.S., et al. In vitro propagation of sweet potato {Ipomoea batatas (L.) Lam.) cultivars. //Agric. Sci. Digest. 2018. 38 (1): 17-21. doi: 10.18805/ag.D-128) Из анализа известных аналогичных технических решений выявлено, что технической проблемой в данной области является необходимость расширения арсенала технологий для получения безвирусного, генетически однородного посадочного материала батата in vitro.

Техническим результатом изобретения является ускорение процесса массового получения генетически однородного, высококачественного посадочного материала батата.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного технического результата в способе получения безвирусного, генетически однородного посадочного материала батата in vitro в качестве первичного экспланта используют пазушные меристемы, которые изолируют с побегов проросших клубнеплодов батата и культивируют на питательной среде, содержащей концентрации минеральных солей по прописи Мурасига и Скуга (МС). В качестве индуктора роста пазушных почек служат гормоны - кинетин в концентрации 0,5 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л. Культивирование в этих условиях приводит к формированию из пазушных меристем побегов, которые характеризуются интенсивным ростом и формированием мощной корневой системы. Сформировавшиеся микроклоны батата переносят в нестерильные условия для адаптации на аэропонику. Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.

Для размножения батата можно использовать один клубнеплод, на котором имеется несколько спящих почек. Предварительно клубнеплод помещают в увлажненный земляной субстрат, заглубив его примерно на половину. Через 5-7 суток из спящих почек начинают формироваться ростки, которые продолжают свой рост в течение последующих 10 суток. В среднем на одном клубнеплоде формируется до 10 ростков. Каждый росток делят на сегменты (микрочеренки), состоящие из части побега и пазушной меристемы. С одного клубнеплода батата можно изолировать до 100 шт микрочеренков, которые помещают в марлевые мешочки и в условиях ламинар-бокса проводят поверхностную их стерилизацию 0,1%-ным раствором сулемы в течение 6 минут с последующим выдерживанием в стерильной дистиллированной воде. Микрочеренки вынимают из марлевого мешочка, подрезают стерильным скальпелем базальную часть и переносят на питательную среду в биологические пробирки. Культивирование микрочеренков батата проводят на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга. В качестве индуктора роста пазушных почек служат гормоны - кинетин в концентрации 0,5 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л. Пробирки с эксплантами переносят в световую комнату, где поддерживается температура 23°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами, интенсивность освещения 3 тыс.лк. Через 7 суток отмечается начало формирования микропобегов, в базальной части которых формируется корневая система. К концу пассажа (30 суток) из пазушных меристем формируются микропобеги высотой 15-20 см, которые вновь делят на микрочеренки (сегмент стебля с одной пазушной почкой) и самостоятельно культивируют на среде содержащей нормы минеральных солей по прописи МС, а также кинетин 0,5 мг/л и ИУК 0,5 мг/л. При среднем коэффициенте размножения 7-8 и изолировании с одного клубнеплода всего 100 шт микрочеренков, то в течение 6 месяцев культивирования можно получить 1680700 шт растений батата.

Одним из трудоемких этапов, от которых зависит успех клонального микроразмножения, является адаптация микроклонов к естественным условиям произрастания. Перевод укоренившихся микрорастений в нестерильные условия нередко бывает затруднен. Растения, культивируемые в условиях in vitro, чувствительны к шокам акклиматизации, приводящим к высокой их гибели во время заключительной стадии размножения. Это связано с тем, что микроклоны имеют слабо развитую корневую систему, нефункциональный устьичный аппарат и плохо развитую кутикулу. Дополнительная гибель микроклонов может достигаться при использовании нестерильного почвенного субстрата, где при благоприятной температурной и влажностной среде, недостатке аэрации создаются условия для развития бактерий, грибов, а иногда и насекомых паразитов. В работах разных авторов приводится технология адаптации микроклонов батата в условиях почвенной культуры (см. Dolinski R., Olek О. Micropropagation of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) from node explants. // Acta Sci Pol., Hortorum Cultus. - 2013. 1 - 2(4): 117-127.; Onwubiko N.C., Ihezie С.J., Mozie M.U. In vitro Regeneration of Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) from Node Explants. // American Journal of Experimental Agriculture. - 2015. - 8(2): 87-92), приводящая к гибели, как правило, 20-25% микроклонов.

Предлагаемый способ включает адаптацию микроклонов батата на аэропонике и позволяет получать 100% их адаптацию к условиям ex vitro. Данный технологический прием ранее не был использован в технологиях клонального микроразмножения батата.

Предлагаемый способ получения генетически однородного посадочного материала батата сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе:

1. Технология предполагает использовать в небольших количествах легкодоступный материал (всего один клубнеплод) для клонирования.

2. Присутствие в составе питательной среды минеральных солей по прописи МС в концентрации нормы, а также кинетина и ИУК в концентрациях 0,5 мг/л (дешевая технология).

3. Предлагаемый способ легок в исполнении по сравнению с ранее предложенными разработками авторов.

4. Предлагаемая технология адаптации позволяет получить 100% адаптацию микроклонов к нестерильным условиям выращивания.

5. Предлагаемый способ позволяет ускоренно получать высококачественный посадочный материал в неограниченном количестве.

Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения высококачественного посадочного материала растений батата. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением технологии клонального микроразмножения с использованием пазушных меристем, бедной по составу питательной среды и аэропоники на последнем этапе данной технологии, не достигался в известных решениях.

Использование изобретения позволит увеличить выход генетически стабильного материала батата, что дает возможность получать высококачественный посадочный материал в количестве, достаточном для сельского хозяйства.

Способ получения безвирусного, генетически однородного посадочного материала батата in vitro, характеризующийся тем, что в качестве первичного экспланта используют пазушные меристемы, изолированные с побегов проросших клубнеплодов батата, и культивируют на питательной среде, содержащей концентрации минеральных солей по прописи Мурасига и Скуга, в качестве индуктора роста пазушных почек используют гормоны - кинетин в концентрации 0,5 мг/л и индолилуксусную кислоту в концентрации 0,5 мг/л, при этом адаптацию микроклонов к условиям ex vitro проводят на аэропонике.