Комбинированная клеточная иммунотерапия злокачественных опухолей

Группа изобретений относится к области медицины, а именно онкологии, иммунологии и онкоиммунологии, и предназначена для профилактики прогрессирования и рецидива злокачественных новообразований. Способ комбинированной адоптивной клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований для профилактики их прогрессирования и рецидива у пациентов с отсутствием воспалительных очагов неонкологического характера включает последовательное введение пациенту дендритноклеточной вакцины (ДКВ), стимулирующей специфический противоопухолевый иммунитет, и препарата NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (NKG2D+ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки неспецифическим способом. ДКВ вводят с интервалом в 2-4 недели, а NKG2D+ЦТЛ – на следующий день после введения ДКВ. Также обеспечиваются препарат указанных NKG2D+ЦТЛ и способ его получения. Использование группы изобретений обеспечивает эффективную профилактику злокачественных новообразований после удаления основной опухолевой массы (циторедукции) и завершения цитостатического и цитотоксического лечения. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл., 2 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к области физиологии и медицины, а именно к онкологии, иммунологии и онкоиммунологии и используется для профилактики прогрессирования и предотвращения рецидивов злокачественных новообразований (ЗНО) путем комбинированной клеточной адоптивной иммунотерапии (ИТ) после удаления основной опухолевой массы (циторедукции) и завершения курсов цитостатического и цитотоксического (лучевой терапии и химиотерапии) лечения.

Уровень техники

Несмотря на всестороннее развитие современных медицинских технологий, проблема онкологии остаётся острейшей в современной медицине. Многие попытки ИТ опухолей в основном имели ограниченную эффективность но, тем не менее, поиск новых способов использования клеток иммунной системы и комбинаций уже известных подходов активно продолжаются. Как показывает практика, наибольшего терапевтического действия при использовании клеточной ИТ можно достичь при минимальной опухолевой нагрузке, т.е. по сути, когда речь идёт о профилактике рецидива заболевания.

В клеточной ИТ опухолей существует два основных подхода: первый - специфический, когда цитотоксическое действие осуществляется Т-лимфоцитами, которые распознают свою мишень по наличию опухолевых антигенов; второй - неспецифический, когда эффекторами являются натуральные киллеры и клетки с аналогичной активностью, распознающие мишени по экспрессии стресс-индуцированных молекул и других лигандов. Специфические Т-лимфоциты могут быть стимулированы как внутри организма при вакцинации дендритными клетками (ДК), "нагруженными" опухолевыми антигенами, так и получены в большом количестве вне организма, а потом введены больному. Неспецифические киллерные клетки обычно получают за счёт стимуляции ex vivo мононуклеаров периферической крови больного высокими дозами интерлейкина-2 с последующим возвратом активированных клеток обратно.

Известны комбинированный клеточный трансплантат для лечения и профилактики онкологических заболеваний, способ получения этого препарата и способ лечения и профилактики онкологических заболеваний с использованием этого препарата (патент RU 2309753, МПК A61K 35/14, 10.11.2007). Известный клеточный трансплантат содержит лимфоциты, активированные интерлейкином-2 (ИЛ-2), и дендритные клетки (ДК), полученные путем инкубирования незрелых ДК с лизатом опухоли или вирусными или бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК (ФНОα; ИЛ-1β; ИЛ-6).

Недостатки указанных известных технических решений связаны с в частности тем, что используемые в трансплантате активированные лимфоциты (ЛАК) представляют собой общий лимфоцитарный пул (Т-, В-лимфоциты и натуральные киллеры), выделенный из крови и проинкубированный около суток в присутствии высоких доз интерлейкина-2 (т.е., сколько смогли выделить клеток из полученного объёма крови, столько в итоге и ввели обратно больному). Из этого следует, что для получения адекватной дозы ЛАК для одного введения у онкологического больного необходимо забрать 400 мл и более крови, что не всегда представляется возможным сделать. А если у больного лейкопения, то потребуются ещё бóльшие объёмы крови, чтобы получить на выходе нужное количество ЛАК. Кроме того, в популяции ЛАК непосредственно эффекторными клетками являются натуральные киллеры и CD8 Т-лимфоциты, подвергнутые обработке высокими дозами интрелейкина-2. Необходимо иметь ввиду, что ИЛ-2 не способен активировать указанные выше эффекторы, если они находятся в супрессии или анергии. Из этого следует, что исходное функциональное состояние натуральных киллеров и CD8 Т-лимфоцитов должно быть надлежащего качества, чтобы обработка их интерлейкином-2 привела к усилению их цитотоксических возможностей. Так как у онкологических больных довольно часто наблюдается подавление эффекторного звена иммунитета, то получить ЛАК с высоким содержанием активных киллерных клеток будет зачастую недостижимо. Помимо этого, указанное в известных технических решениях интраартериальное или регионарное (внутрибрюшинно, интраплеврально и в другие полости) введение трансплантата требует особых, в частности, реанимационных, условий для проведения трансфузии, которые тяжело переносятся пациентом.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание способа клеточной ИТ злокачественных новообразований для профилактики их прогрессирования и рецидива с применением клеточных препаратов, обеспечивающих эффективную терапию с исключением вышеописанных недостатков, характерных при использовании известного трансплантата.

Решение указанной задачи достигается тем, что согласно настоящему изобретению предложен способ комбинированной адоптивной клеточной ИТ злокачественных новообразований для профилактики их прогрессирования и рецидива, включающий последовательное введение пациенту дендритноклеточной вакцины (ДКВ), стимулирующей специфический противоопухолевый иммунитет, и препарата NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (NKG2D⁺ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки неспецифическим способом, причем ДКВ вводят с интервалом в 2-4 недели, а NKG2D⁺ЦТЛ - на следующий день после введения ДКВ.

Согласно настоящему изобретению однократные вводимые дозы составляют преимущественно 2-5 млн клеток ДКВ и 100-500 млн клеток NKG2D⁺ЦТЛ. ДКВ вводят внутрикожно, а NKG2D⁺ЦТЛ - внутривенно. Курс ИТ по настоящему изобретению состоит преимущественно из 8-12 введений.

Решение вышеуказанной задачи достигается также тем, что согласно настоящему изобретению предложен способ получения ДКВ для применения в предложенном способе ИТ, включающий получение опухолевого лизата из опухолевого материала пациента или материала того же гистогенеза от другого больного, выделение популяции моноцитов из мононуклеаров периферической крови пациента, культивирование моноцитов в присутствии интерлейкина-4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) для получения незрелых ДК и добавление в культуральную среду опухолевого лизата, а также фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) и простагландина Е₂ (ПГЕ₂) для получения зрелых ДК, которые затем собирают и отмывают от культуральной среды с получением целевой вакцины.

Кроме того, решение вышеуказанной задачи достигается также тем, что согласно настоящему изобретению предложен способ получения препарата NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (NKG2D⁺ЦТЛ) для применения в предложенном способе ИТ, включающий выделение популяции лимфоцитов из мононуклеаров периферической крови пациента, выделение популяции моноцитов из мононуклеаров периферической крови донора и кокультивирование лимфоцитов с алогенными зрелыми ДК, предварительно полученными путем культивирования моноцитов в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ и последующего добавления в культуральную среду фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) и простагландина Е₂ (ПГЕ₂), для получения NKG2D⁺ЦТЛ в результате кокультивирования, которые затем собирают и отмывают от культуральной среды с получением целевого препарата.

В процессе кокультивирования при осуществлении способа получения препарата NKG2D⁺ЦТЛ по настоящему изобретению, как только лимфоциты начинают пролиферировать, их преимущественно переносят в больший объём культуральной среды с добавлением аллогенных ДК, затем с периодичностью в 2-3 дня проводят 4-5 циклов добавления в культуральную среду интерлейкина-2 (ИЛ-2) и добавлений алогенных ДК с увеличением объема культуральной среды в каждом цикле, а после проведения указанных циклов пролиферацию лейкоцитов поддерживают только периодическим внесением ИЛ-2.

Согласно настоящему изобретению предложены также ДКВ и препарат NKG2D⁺ЦТЛ для применения в предложенном способе ИТ, полученные соответствующими предложенными способами.

В настоящем изобретении при получении препарата NKG2D⁺ЦТЛ сниженный функционал лимфоцитов у онкологического больного не является препятствием для генерации большого количества активных эффекторных клеток, так как за счет стимуляции Т-лимфоцитов именно алогенными дендритными клетками индуцируется активная пролиферация Т-лимфоцитов, поэтому даже из 20 мл периферической крови пациента (при отсутствии лейкопении) можно получить 1х10⁹ цитотоксических лимфоцитов.

Преимущество используемого в настоящем изобретении последовательного введения клеточных препаратов заключается в том, что после введения ДКВ происходит взаимодействие специфических Т-лимфоцитов с опухолевыми антигенами, представленными на поверхности дендритных клеток вакцины. После этого активированные Т-лимфоциты становятся способными атаковать свою мишень - опухоль, в результате чего, помимо непосредственного цитотоксического действия, происходит выброс провоспалительных цитокинов, которые делают опухолевый очаг более "заметным" для вводимых на следующий день NKG2D⁺ЦТЛ.

Предлагаемый в настоящем изобретении способ комбинированной клеточной ИТ основан на сочетании специфического и неспецифического иммунных ответов. Стимуляция специфического иммунитета осуществляется за счёт вакцинации пациента дендритными клетками, "нагруженными" опухолевыми антигенами, полученными из опухоли больного. Неспецифический иммунитет реализуется благодаря введению аутологичных цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих NKG2D-рецептор, которые получают ex vivo при аллогенной стимуляции донорскими дендритными клетками.

На фиг. 1 показана коэкспрессия поверхностных антигенов CD80 и CD83 на зрелых ДК (проточная цитометрия) в ДКВ по настоящему изобретению.

На фиг. 2 - коэкспрессия поверхностных и внутриклеточных антигенов NKG2D⁺ цитотоксическими Т-лимфоцитами, полученными в результате аллогенной стимуляции донорскими дендритными клетками (проточная цитометрия) при получении препарата NKG2D⁺ЦТЛ по настоящему изобретению.

Подробное раскрытие изобретения

ДК в ДКВ по настоящему изобретению должны экспрессировать на своей поверхности CD83 антиген - маркер зрелости (>50%), костимуляторные молекулы CD80 и CD86 (>80%), что показано на фиг. 1 (по осям абсцисс и ординат - интенсивности окрашивания клеток антителами к соответствующим маркерам).

ЦТЛ в препарате NKG2D⁺ЦТЛ по настоящему изобретению характеризуются тем, что они должны экспрессировать CD3 антиген (>90%), доля CD8 лимфоцитов, экспрессирующих CD314 (NKG2D) составляет более 50%, а внутриклеточная экспрессия гранзима-Б составляет более 90%, что показано на фиг. 2 (по осям абсцисс и ординат - интенсивности окрашивания клеток антителами к соответствующим маркерам).

ДКВ по настоящему изобретению получают следующим образом. Из опухолевого материала пациента или материала того же гистогенеза от другого больного (донора) получают опухолевый лизат, а из мононуклеаров периферической крови пациента выделяют популяцию моноцитов, т.е. обогащенную моноцитами популяцию клеток. Опухолевый материал забирают во время хирургической операции. Моноциты культивируют в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ для получения незрелых ДК, которые на третий день культивирования "нагружают" ранее полученным лизатом опухоли путем его добавления в культуральную среду. Затем в культуральную среду добавляют индукторы дифференцировки клеток, а именно ФНОα и ПГЕ₂. Через 48 часов зрелые и "нагруженные" опухолевыми антигенами ДК собирают, отмывают от культуральной среды и определяют их общее количество с получением целевой ДКВ, которую разделяют на дозы и криоконсервируют.

Препарат NKG2D⁺ЦТЛ по настоящему изобретению получают следующим образом. Из мононуклеаров периферической крови пациента выделяют общую популяцию лимфоцитов (популяцию клеток, обогащенных лимфоцитами), а из мононуклеаров периферической крови здорового донора (не являющегося носителем опасных инфекций согласно стандартному перечню инфекций, используемому при переливании крови) - популяцию моноцитов (популяцию клеток, обогащенных моноцитами). Для получения зрелых алогенных ДК моноциты культивируют методом, используемым при культивировании моноцитов для получения ДКВ (как описано выше) за исключением добавления в культивируемую среду опухолевого лизата. То есть моноциты культивируют в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ с последующим добавлением ФНОα и ПГЕ₂ в культуральную среду. Затем лимфоциты кокультивируют с полученными зрелыми алогенными ДК. Через 5-7 дней кокультивирования, как только лимфоциты начинают пролиферировать, их переносят в больший объём культуральной среды с добавлением аллогенных ДК. Спустя 2-3 дня проводят повторную стимуляцию аллогенными ДК и добавляют ИЛ-2, при этом объём культуральной среды снова увеличивают. После 4-5 циклов рестимуляций аллогенными ДК пролиферацию в культуре ЦТЛ можно поддерживать только за счёт внесения ИЛ-2. Интенсивность пролиферации лимфоцитов оценивают микроскопически по плотности клеток в поле зрения и визуально по изменению цвета питательной среды, которая содержит краситель феноловый красный. При интенсивном делении клеток питательная среда "закисляется", за счёт продуктов обмена клеток, в результате чего цвет среды из розового становится желтоватым. По окончании культивирования аллогенные ДК погибают, активируя цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) пациента. Эти клетки собирают, отмывают от культуральной среды и определяют их общее количество с получением целевого препарата NKG2D⁺ЦТЛ, который разделяют на дозы и криоконсервируют.

Для выделения популяций моноцитов и лимфоцитов периферическую кровь у пациента и донора забирают в количестве 50-100 мл.

При осуществлении способа комбинированной адоптивной клеточной ИТ по настоящему изобретению ДКВ вводят внутрикожно в несколько точек по ходу лимфатических коллекторов с интервалом 2-4 недели. В начале курса ИТ интервал между инъекциями должен быть 2 недели, а после шести введений интервал может быть увеличен до 4 недель. Количество ДК, вводимых больному за один раз, может варьировать от 2 до 5 млн клеток. Препарат NKG2D⁺ЦТЛ вводят внутривенно на следующий день после инъекции ДКВ. Количество NKG2D⁺ЦТЛ, вводимых больному за один раз, может варьировать от 100 до 500 млн клеток. Курс комбинированной клеточной ИТ состоит из 8-12 введений.

Профилактика рецидивов онкологических заболеваний при использовании предложенного способа терапии с применением предложенных ДКВ и препарата NKG2D⁺ЦТЛ обеспечивает увеличение медианы выживаемости онкологических больных. Эффективность и безопасность предложенного способа терапии была проверена на целом ряде различных опухолей. Комбинированную ИТ, предложенную настоящим изобретением, применяли с июня 2012 года по август 2019 года в рамках ограниченных клинических испытаний. За 7 лет экспериментального и клинического применения данного способа у онкологических больных была оценена его эффективность, которая была основана на клиническом исследовании и ретроспективном многолетнем изучении 183 пациентов с различными онкологическими заболеваниями, проходивших стационарное экспериментальное лечение в Клинике восстановительной интервенционной неврологии и терапии "НейроВита" (г. Москва) и на базе Городской клинической больницы № 7 г. Москвы с сентября 2002 года по февраль 2018 года (438 историй болезни). Распределение больных по нозологиям онкологических болезней представлено в таблице 1.

Таблица 1 Распределение больных с различными онкологическими заболеваниями 3-4 стадий на контрольную и опытные группы
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Количество госпитализаций	Количество пациентов в опытной группе	Контрольная группа
1	Рак легких	81	10	21
2	Рак молочной железы	63	10	13
3	Мультиформная глиобластома (далее МГБ)	72	11	12
4	Рак почки	20	5	10
5	Рак матки и яичников	35	7	10
6	Саркома мягких тканей	38	5	10
7	Рак желудка	29	5	10
8	Колоректальный рак	39	6	10
9	Опухоли головы и шеи	16	3	7
10	Меланома	45	8	10
11	Итого:	438	70	113

Как видно из таблицы 1, количество онкологических пациентов, вошедших в исследовательский протокол, составило 183 человека, из которых 113 человек составили больные контрольных групп по различным онкологическим нозологиям и 70 пациентов с различными опухолями вошли в опытные группы. Было важно иметь данные по выживаемости и эффективности терапии в контрольных группах онкологических больных, пролеченных известными стандартными методами лекарственной иммунотерапии с применением иммуномодуляторов, иммуностимуляторов и иммунодепрессантов, вакцин от туберкулеза типа БЦЖ и т.д., для проведения адекватного сравнения с пациентами, получавшими комбинированную прецизионную (персонифицированную) ИТ по настоящему изобретению. В исследование были включены только больные с определившимся клиническим исходом заболевания: продолжительная ремиссия не менее 6 месяцев или летальный исход. Больные с неопределившимся исходом, находящиеся на момент анализа результатов лечения в процессе прогрессирования болезни или рецидива и находящиеся в активной фазе противоопухолевой терапии, в исследование не были включены.

Распределение больных по возрасту и полу и нозологии заболеваний в контрольных группах представлены в таблице 2, а в опытных группах - таблице 3.

Таблица 2 Распределение больных с онкологическими заболеваниями 3-4 стадий по возрасту и полу в контрольных группах
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Количество больных	Пол муж / жен	Возраст муж / жен
1	Рак легких	21	14 / 7	56,5 / 64,6
2	Рак молочной железы	13	- / 13	- / 54,7
3	МГБ	12	8 / 4	64,7 / 63,5
4	Рак почки	10	5 / 5	62,6 / 63,5
5	Рак матки и яичников	10	- / 10	- / 48,5
6	Саркома мягких тканей	10	7 / 3	48,6 / 54,8
7	Рак желудка	10	10 / -	66,2 / -
8	Колоректальный рак	10	8/2	56,2 / 51,2
9	Опухоли головы и шеи	7	2 / 5	49,1 / 60,2
10	Меланома	10	8 / 2	56,4 / 60,1
11	Итого:	113	62 / 51	57,3 / 57,9

Таблица 3 Распределение больных с онкологическими заболеваниями 3-4 стадии по возрасту и полу в опытных группах
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Количество больных	Пол муж жен	Возраст муж жен
1	Рак легких	10	8 / 2	64,1 / 63,3
2	Рак молочной железы	10	- / 10	- / 52,7
3.	МГБ	11	7 / 4	36,1 / 58,5
4	Рак почки	5	5 / -	55,6 / -
5	Рак матки и яичников	7	- / 7	- / 52,1
6	Саркома мягких тканей	5	4 / 1	56,2 / 44
7	Рак желудка	5	4 / 1	56,2 / 61
8	Колоректальный рак	6	3 / 3	54,3 / 51,8
9	Опухоли головы и шеи	3	3 / -	44,3 / -
10	Меланома	8	6 / 2	46,2 / 48,5
11	Итого:	70	40 / 30	51,6 / 53,9

Учитывая, что у всех больных с раком молочной железы и раком легких имели место метастазы (МТС) в головной и спинной мозг, а также опухолевые очаги в мозге были у больных с МГБ, степень компенсации пациентов оценивалась по шкале Karnofsky/ECOG и представлена в таблицах 4, 5. Общее состояние по шкале Karnofsky 80 баллов и выше считалось компенсированным, 70-60 баллов - субкомпенсированным, а состояние в 50-40 баллов определялось как декомпенсированным.

Тяжесть общего состояния (по классификации ECOG ВОЗ) в контрольных группах была следующей: удовлетворительное состояние или по шкале ECOG 0-2 балла - 30 человек (26,5% ), в состоянии средней тяжести или по шкале ECOG 3 балла - 45 (22,1%), в тяжелом состоянии или по шкале ECOG 4 балла - 38 человек (33,6%). Тяжесть общего состояния (по классификации ВОЗ) в опытных группе была следующей: удовлетворительное состояние 15 (21,4%), в состоянии средней тяжести 40 (57,1%), в состоянии средней тяжести 15 (21,4%).

Таблица 4 Распределение онкологических больных контрольных групп с метастатическим поражением головного мозга по степени компенсации по шкале Karnofsky/ECOG
Шкала Karnofsky/ECOG (в % / в баллах)	Число больных с раком молочной железы с МТС в головной мозг абс / %	Число больных с раком легкого с МТС в головной мозг абс / %	Число больных с МГБ головного мозга абс / %
90 /1	1 / 7,7	1 /4,8	- / -
80 / 1	1 / 7,7	4 / 19	2 / 16,6
70 / 2	2 / 15,4	4 / 19	2 / 16,6
60 / 2	4 / 30,8	5 / 23,8	3 / 25
50 / 3	3 / 23,1	1 / 4,8	2 / 16,6
40 / 3	- / -	2 / 9,6	1 / 8,3
20-30 / 4	2 / 15,4	4 / 19	2 / 16,6

Таблица 5 Распределение онкологических больных опытных групп с метастатическим поражением головного мозга по степени компенсации по шкале Karnofsky/ECOG
Шкала Karnofsky/шкала ECOG (в % / в баллах)	Число больных с раком молочной железы с МТС в головной мозг абс / %	Число больных с раком легкого с МТС в головной мозг абс / %	Число больных с МГБ головного мозга абс / %
90 / 1	- / -	1 / 10	1 / 9.1
80 / 1	1 / 10	1 / 10	2 / 18.1
70 / 2	2 / 20	2 / 20	2 / 18.1
60 / 2	4 / 40	3 / 30	1 / 9.1
50 / 3	2 / 20	1 / 10	1 / 9.1
40 / 3	1 / 10	1 / 10	2 / 18.1
20-30 / 4	- / -	1 / 10	2 / 18.1

Оценка эффективности комбинированной адоптивной ИТ по настоящему изобретению во многом зависела от нозологической принадлежности заболевания и целей применения ИТ. Анализ результатов эффективности ИТ при различных нозологиях онкологических заболеваний представлен в таблице 6.

Комбинированная адоптивная иммунотерапия рака и ЗНО не является столь безопасной лечебной процедурой, как это казалось раньше. Из таблицы 6 видно, что у четырех онкологических больных, получавших комбинированную ИТ по изобретению, наблюдалось ухудшение состояния. Во всех случаях ухудшение было связано с выраженным цитотоксическим действием клеточного препарата NKG2D⁺ЦТЛ. В одном случае применения NKG2D⁺ЦТЛ у больного с МГБ завершилось летальным исходом, но в другом случае подобного смертельного осложнения удалось избежать, профилактируя это осложнение. В обоих случаях причиной резкого ухудшения состояния пациента этих пациентов стала цитотоксическая пневмония, возникшая на фоне внутривенного введения препарата NKG2D⁺ЦТЛ у иммунноослабленных больных с МГБ после ряда курсов химио- и лучевой терапии пациентов. Профилактика развития цитотоксической терапии путем лекарственной коррекции иммунного статуса до введения препарата NKG2D⁺ЦТЛ, а также профилактический курс антибиотикотерапии (2 антибиотика) позволил в дальнейшем избежать возможного цитотоксического поражения легких и подобных осложнений у других пациентов. Отсутствие клинического эффекта у больных с раком легкого (10,5%), раком молочной железы (5,3%) и МГБ (15,7 %) было связано с крайне тяжелым состоянием пациентов, взятых на лечение. По-видимому, существует определенная «точка невозврата», которую нужно четко представлять при применении ИТ рака вообще и комбинированной ИТ в частности. Нельзя брать на комбинированную адоптивную ИТ не подготовленных больных с очевидными нарушениями витальных функций, нестабильностью гемодинамики и структурными нарушениями в системе гемопоэза после лучевой и химиотерапии. Подготовка больных к данному виду ИТ должна быть направлена на максимальное снятие опухолевой интоксикации, стабилизацию и нормализацию функций жизнеобеспечения и коррекцию иммунного статуса. Недоучет этих параметров состояния больного может стать причиной неудач в проведении иммунотерапии и даже смерти пациента. Вероятно, ухудшение состояния пациентов при экспериментальном проведении ИТ по настоящему изобретению было связано с тем, что введённые NKG2D⁺ЦТЛ вызвали пневмонию за счёт воздействия на очаг хронической инфекции, который был в лёгких у данных больных. Так как больные после длительного лечения были ослаблены, то инфекция в выраженной форме могла и не проявляться, однако после введения ЦТЛ развилась выраженная воспалительная реакция, что и привело к пневмонии и последующим осложнениям. В связи с этим, перед началом курса комбинированной ИТ следует внимательно отслеживать и купировать очаги инфекции или другие воспалительные очаги не онкологического характера.

Учитывая особенности и специфику контингента онкологических больных, взятых на комбинированную ИТ, эта терапия показала достаточную эффективность, так как в данный протокол были включены онкологические пациенты, у которых был исчерпан ресурс конвенциональной противоопухолевой помощи или в традиционном противоопухолевом лечении им было отказано по медицинским показаниям. Включенные в протокол онкологические пациенты поступали преимущественно на паллиативную помощь или в хоспис, и эффективность предлагаемой терапии была достаточно очевидной для их родственников и самих пациентов, не смирившихся с "приговором" онкологов о невозможности их дальнейшего противоопухолевого лечения.

Таблица 6 Эффективность противоопухолевой комбинированной иммунотерапии по изобретению при различных онкологических заболеваниях 3-4 стадий
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Ухудшение абс / %	Нет эффекта абс / %	Эффективна абс / %	Высоко эффективна абс / %
1	Рак легких	1 / 25	2 / 10,5	5 / 18,5	1 / 25
2	Рак молочной железы	1 / 25	1 / 5,3	3 / 11,1	3 / 75
3	МГБ	2 / 50	3 / 15,7	5 /18,5	- / -
4	Рак почки	- / -	1 / 5,3	1 / 3,7	- / -
5	Рак матки и яичников	- / -	1 / 5,3	2 / 7,4	- / -
6	Саркома мягких тканей	- / -	1 / 5,3	2 / 7,4	- / -
7	Рак желудка	- / -	2 / 10,5	2 / 7,4	- / -
8	Колоректальный рак	- / -	2 / 10,5	3 / 11,1	- / -
9	Опухоли головы и шеи	- / -	2 / 10,5	- / -	- / -
10	Меланома	- / -	4 / 21	4 / 14,8	- / -
11	Итого:	4 / 100	19 / 100	27 / 100	4 / 100

В таблице 7 представлены сроки жизни различных больных с раком легких и раком молочной железы с метастазами в головной мозг и больных с МГБ. Как видно из таблицы 7, комбинированная адоптивная ИТ по изобретению увеличила среднее время жизни онкологических пациентов с раком легких и раком молочной железы и МГБ с 22,8 месяцев до 35,6 месяцев, а время жизни после прогрессирования/рецидива болезни почти в 2,5 раза,. с 4,51 месяца до 11,3 месяцев.

Эти данные согласуются с результатами иммунотерапии МГБ, представленными петербуржской группой исследователей иммунотерапии МГБ из НИИ нейрохирургии им. Поленова под руководством профессора В.Е. Олюшина (В.Е .Олюшин с соавт.,2012) и показавшими, что применение персонализированной иммунотерапии по настоящему изобретению позволяет продлить время жизни больных с МГБ до 36 месяцев при стандартной медиане выживаемости этих пациентов от 8 до 15 месяцев. Представленные выше данные о выживаемости онкологических больных раком молочной железы с метастазами в головной мозг (в контрольной группе) также полностью согласуются с данными профессора Д.В. Комова из ФГБУ НМИУ онкологии им Н.Н. Блохина Минздрава РФ (Комаров И.Г., Комов Д.В, Слетина С.Ю., Кочоян Т.М., 2007, Комов Д.В., Комаров И.Г., 2008). Таким образом, результаты проведения комбинированной адоптивной ИТ рака позволяют утверждать, что применение этой терапии в лечении онкологических больных в 1,5 раза увеличивает сроки выживаемости больных с момента диагностики заболевания и в 2,5 раза увеличивает время жизни пациентов до момента появления рецидива или прогрессирования болезни.

Таблица 7 Длительность жизни больных с раком легких и раком молочной железы с метастазами в головной мозг (ГМ) и глиобластомой в исследуемых опытных группах
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Время жизни с момента диагностики ЗНО до смерти (контрольная группа)	Время жизни до момента появления опухолевого очага в ГМ (контрольная группа)	Время жизни с момента диагностики ЗНО до смерти (опытные группы)	Время жизни до момента появления опухолевого очага в ГМ (опытные группы)
Месяцы
1	Рак легких	10,6	6,1	11,2	12,6
2	Рак молочной железы	45.7	2,25	59,6	8,7
3	МГБ	12,3	5,2	36	12,6
4	Итого:	22,8	4,51	35,6	11,3

Безопасность применения комбинированной ИТ представлена в таблице 8. Как видно из представленных данных, без осложнений комбинированная ИТ рака и других ЗНО прошла только у 39 пациентов (55,7%), минимальные осложнения имели место в 9 случаях (12,8%), побочные эффекты средней степени тяжести отмечены в 3 случаях (4,2%) и тяжелые витальные осложнения имели место в 2,8% случаев. Профилактика возможных осложнений комбинированной адоптивной ИТ позволит значительно снизить процент нежелательных побочных явлений этой терапии.

Таблица 8 Безопасность применения ИТ рака и других злокачественных новообразований по изобретению
№ п/п	Онкологические заболевания по нозологическим подгруппам	Без осложнений абс / %	Минимальные осложнения абс / %	Побочные эффекты средней тяжести абс / %	Тяжелые (витальные) осложнения абс / %
1	Рак легких	6 / 15,3	2 / 22,2	1 / 33,3	- / -
2	Рак молочной железы	7 / 17,9	- / -	1 / 33,3	- / -
3	МГБ	5 / 12,9	3 / 33,3	- / -	2 / 100
4	Рак почки	2 / 5,1	- / -	- / -	- / -
5	Рак матки и яичников	3 / 7,6	- / -	- / -	- / -
6	Саркома мягких тканей	3 / 7,6	- / -	- / -	- / -
7	Рак желудка	4 /10,2	- / -	- / -	- / -
8	Колоректальный рак	2 / 5,1	1 / 11,1	1 / 33,3	- / -
9	Опухоли головы и шеи	2 / 5,1	- / -	- / -	- / -
10	Меланома	5 / 12,9	3 / 33,3	- / -	- / -
11	Итого:	39 / 100	9 / 100	3 / 100	2 / 100

Комбинированная клеточная ИТ по настоящему изобретению преимущественно проводится в адъювантном режиме в целях профилактики прогрессирования и рецидива ЗНО после удаления опухоли (циторедуктивного лечения) и проведения цитостатической и цитотоксической терапии, но при неоперабельности онкологического больного, наличии абсолютных противопоказаний проведения лучевой и химиотерапии пациенту. Для пациента пожилого возраста предложенная комбинированная ИТ может быть использована как персонализированная противоопухолевая терапия выбора.

Клинический пример 1

Пациент: Ж-цов Анатолий Николаевич, 13.01.1951 г. рождения; находился в клинике с 19.03.2019 г. по 21.03.2019 г., поступил повторно с клиническим диагнозом:

Основной: Рак предстательной железы, IV ст., метастатическое поражение легких, костей скелета, левой орбиты с распространением на основание черепа. В процессе гормональной терапии (с 25.09.2017 г.), в процессе иммунотерапии. Прогрессирование 01.2019: появление новых очагов в легких, плевре.

Сопутствующие заболевания: Артериальная гипертензия. ИБС: стенокардия напряжения ФК 2ст. Хроническая вертеброгенная люмбалгия. Дисциркуляторная энцефалопатия на фоне распространенного атеросклероза. Резидуально-органическое поражение ЦНС: расходящееся косоглазие.

Жалобы при поступлении: сохраняется снижение зрения на левый глаз, нарушение мочеиспускания. Расходящееся косоглазие, учащенное мочеиспускание.

Анамнез заболевания: Со слов пациента с 24 августа 2017 г. отмечалось нарушение зрения на левый глаз. При обследовании у врача офтальмолога по месту жительства заподозрено ЗНО левой орбиты.

02.09.2017 г. МРТ головного мозга, орбиты. МР признаки объемного образования левой орбиты солидного характера с признаками экстраорбитального распространения.

05.09.2017 г. КТ орбит, околоносовых пазух. КТ признаки остеолитического образования левой орбиты с распространением на околоносовые пазухи, переднюю и среднюю черепную ямку слева, с компрессией мышц орбиты.

Пациент обследован в условиях клиники "Нейровита".

08.09.2017 г. Рентгенография ОГК. В легких с обеих сторон определяются множественные мелкоочаговые тени до 0,5-1,1 см. Корни и средостение не расширены. Синусы жидкость не содержат. Рентгенологическая картина изменений не исключает метастатический процесс. мЗв - 0,004.

11.09.2017 г. КТ ОГК с контрастным усилением. Множественное МТС поражение легких. МТМ (литического характера) в 3 ребро справа. Участок разряжения в теле Th6 позвонка - гемангиома? очаг?

11.09.2017 г. Описание представленных данных КТ и МРТ исследования лицевого скелета, орбит от 02.09.17 и 05.09.17. Заключение: КТ и МР картина более соответствует опухолевому поражению костей черепа с внекостным мягкотканным компонентом.

12.09.2017 г. ФБС. При осмотре верхних дыхательных путей опухолевой патологии не выявлено.

12.09.2017 г. УЗИ предстательной железы. При трансректальном исследовании предстательная железа размерами 60х39х43мм, контуры левой доли нечеткие, паренхима повышенной эхогенности, транзиторные зоны гиперплазированы, периферическая зона левой доли пониженной эхогенности, неоднородная. Заключение: Гиперплазия, очаговые изменения левой доли предстательной железы характерные для злокачественных.

Консультация онкохирурга. Д.м.н. Романов И.С. Учитывая данные КТ органов грудной клетки вероятен метастатический процесс в орбите. Для получения биопсийного материала рекомендовано фиброскопия полости носа и носоглотки.

13.09.2017 г. КТ ОБП с контрастным усилением. Убедительных данных за очаговое поражение паренхиматозных органов брюшной полости не получено. Мелкие кистовидные образования в левой доле печени и левой почке. Множественное метастатическое поражение легких, очаги деструкции в костях таза.

13.09.2017 г. ПСА общий 48,386 нг/мл.

14.09.2017 г. Биопсия предстательной железы под УЗ-контролем (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) и произведен забор опухолевого материала для приготовления ДКВ и препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

Гистологическое исследование № 36182 от 14.09.2017 г. Микрофрагментны ткани предстательной железы с комплексами аденокарциномы (Глисон 4+4), опухоль занимает от 50 до 100% площади срезов.

21.09.2017 г. Радиоизотопное исследование костной системы. Определяются очаги повышенного накопления радиофармпрепарата в области левой орбиты, отдельных позвонков шейного и грудного отделов позвоночника, лопаток, отдельных верхних ребер. Определяется неравномерное повышенное накопление индикатора в поясничном отделе позвоночника на уровне L5, костях таза.

22.09.2017 г. ФЭГДС. Умеренно выраженный гастрит на фоне дуоденогастрального рефлюкса. Очаги кишечной метаплазии.

22.09.2017 г. Колоноскопия. Органической патологии в осмотренных отделах толстой кишки не выявлено.

22.09.2017г. Консультация химиотерапевта. Д.м.н. Буланов А.А. Рекомендовано проведение лечения по программе МАБ: Касодекс 50 мг в день внутрь длительно, постоянно. Залодекс 3,6 мг в/м 1 раз в месяц. ПСА в динамике 1 раз в месяц. Контрольное обследование через 3-4 месяца.

С 25.09.2017г. проводится гормональная терапия: Залодекс 3,6 мг в/м №1; Касодекс 50 мг в день внутрь ежедневно.

Пациент в процессе комбинированной иммунотерапии:

• 02.10.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ.

• 16.10.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 17.10.2017 г. Внутривенное введение препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

• 30.10.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 31.10.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

• 14.11.2017 г. NKG2D⁺ Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

15.11.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 16.11.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

• 28.11.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 29.11.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

• 12.12.2017 г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

13.12.2017 г. Внутрикожное введение ДКВ. 14.12.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

• 26.12.2017 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 27.12.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

При контрольном обследовании:

09.01.2018 г. МРТ малого таза. В левой доле предстательной железы определяется очаговое образование солидной структуры 10х15 мм (ранее 15х22 мм). Увеличенный л/узел мезоректальной группы справа 17х22 мм (ранее 19х14 мм). Объемное образование левой подвздошной кости неоднородной структуры 4х4,5х3,9см - без динамики. Заключение: по сравнению с данными предыдущего исследования от 17.11.2017 отмечается положительная динамика в виде уменьшения размеров образования предстательной железы, уменьшение размеров измененного л/узла.

09.01.2018 г. МРТ орбит. В верхне-латеральной и задне-медиальной стенках левой орбиты определяется объемное образование неоднородной солидной структуры 40х19 мм и 25х16 мм (ранее 37х17 мм и 22х16 мм). Заключение: МРТ картина объемных образований левой орбитальной области с интра- и экстраорбитальным ростом, отека ретробульбарной клетчатки слева, локального сдавления левого зрительного нерва объемным образованием. По сравнению с данными от 02.09.2017 г. отмечается умеренное увеличение размеров образований.

13.01.2018 г. КТ ОГК. С обеих сторон по всем легочным полям, субплеврально, в паренхиме легочной ткани и по ходу междолевой плевры справа определяются множественные мелкоочаговые образования максимальным диаметром 4,5 мм. Заключение: КТ картина множественных мелкоочаговых образований легких. Очаги литической плотности в заднем отрезке 3 ребра справа, теле Th6.

ПСА от 13.01.2018 г. - 0,85нг/мл (0,0 - 4,0).

17.01.2018г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

18.01.2018г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 19.01.2017 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

Проведена консультация иммунолога. Даны рекомендации (повторная иммунограмма через 3 месяца).

20.02.2018 г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

21.02.2018г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 22.01.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

19.03.2018 г. - раствор Залодекс 10,8мг п/к (на 3 месяца).

16.03.2018 г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

20.03.2018 г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ. 21.03.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 22.03.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ. 20.04.2018 г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

24.04.2018 г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ. 25.04.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 26.04.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ. 18.05.2018г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

Пациенту 25 апреля 2018 г. в РОНЦ проведена оценка в динамике предоставленых результатов МРТ орбит с контрастным усилением. КТ ОГК, ОБП, МРТ малого таза, ПСА 0,9 нг/мл (0,0 - 4,0) - положительная динамика.

22.05.2018 г. Интратекальное введение NKG2D⁺ЦТЛ. 23.05.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 24.05.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

23.05.2018г. - исследование иммунограммы в динамике.

Консультация иммунолога к.м.н. Борунова А.А. (от 25.05.2018г.) РЕКОМЕНДОВАНО:

Комбинированная ИТ (введение ДКВ + введение NKG2D⁺ЦТЛ) с интервалом 6 недель.

Между курсами иммунотерапии 2 курса по схеме: ИМУНОФАН амп. по 1мл 0,005% раствора в/м через день - 10 введений.

Консультация химиотерапевта. Д.м.н. Буланов А.А. - повторно (25.05.2018 г.). Рекомендовано: продолжить проведение лечения по программе МАБ: Касодекс 50мг в день внутрь. Раствор Залодекс 3,6 мг в/м 1 раз в месяц. ПСА в динамике 1 раз в месяц. Повторная консультация после контрольного обследования через 3-4 месяца.

22.06.2018 г. - раствор Залодекс 10,8 мг п/к (на 3 месяца).

28.06.2018г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

24.07.2018г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

Представлены результаты обследования: 10.08.2018 г. ПСА 3,47 нг/мл (0,0 - 4,0).

14.08.2018г. Интратекальное введение моноклональных аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. 15.08.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 16.08.2018г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

Представлены результаты обследования: 11.09.2018 г. ПСА 6,34 нг/мл (0,0 - 4,0).

22.09.2018 г. - раствор Залодекс 10,8 мг п/к (на 3 месяца)- 24.09.2018 г. - раствор Зомета 4 мг в/в капельно.

25.09-27.09.2018 г. Плановая госпитализация для контрольного обследования и лечения. Результаты обследования: 26.09.2018 г. ПСА общ. 8,075 нг/мл (0,0 - 4,0). ПСА своб. 4,067 нг/мл (0,01 - 0,950). Иммунный статус в динамике.

В отделении проведено: Описание представленных результатов обследований: Описание с сравнением (МРТ малого таза с КУ (14.09.2018г.)). Заключение: Кости таза: в крыле левой подвздошной кости отмечается кистозная перестройка неоднородной структуры, размерами до 4.0х3,1х3,2 см. МР-картина специфического неопластического процесса предстательной железы в процессе проводимой терапии (гормональная иммунотерапия). Мр признаки последствия хронического цистита. Описание (МРТ органов брюшной полости с забрюшинным пространством (17.09.2018 г.)). Заключение: киста печени. Мелкие очаговые образования в печени - кисты (?) Мр-картина метастатического поражения костей скелета - целесообразно РИД. Описание и сравнение (КТ органов грудной клетки (20.09.2018 г.)). Заключение: КТ-картина немногочисленных мелких очаговых уплотнений в легких, характер которых следует дифференцировать между поствоспалительными и вторичными изменениями. С учетом представленного описания КТ - исследования от 05.01.2018 г. можно думать о положительной динамике метастатического процесса. Вторичное поражение костей скелета. Описание и сравнение (МРТ лицевого скелета, орбит (20.04.2018 г.и 11.09.2018 г.)). Заключение: При сравнении данных - стабилизация без признаков прогрессирования. Оценка проведена с учетом данных сцинтиграфии. РЕНТГЕНОГРАФИЯ: исследование костей скелета, позвоночник (02.10.2018 г.). Заключение: Убедительно признаки вторичных изменений выявляются в костях таза. В других отделах (в позвонках и ребрах) нельзя исключить наличие вторичных изменений. Признаки спондилоартроза, коксартроза. Суммарная лучевая нагрузка 1,5999мЗв.

Консультация химиотерапевта. Д.м.н. Буланов А.А. - повторно (27.09.2018 г.). Рекомендовано: продолжить проведение лечения по программе МАБ: Касодекс 150 мг в день внутрь. Раствор Залодекс 3,6 мг в/м 1 раз в месяц. ПСА в динамике 1 раз в месяц. Повторная консультация после контрольного обследования через 3-4 месяца.

25.09.2018 г. Интратекальное введение моноклональных аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. 26.09.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 27.09.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

26.10.2018 г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

Представлены результаты обследования: 29.10.2018 г. ПСА 13,02 нг/мл (0,0 - 4,0).

06.11.2018 г. Интратекальное введение моноклональных аллогенных гемопоэтических стволовых клеток. 07.11.2018 г. Внутрикожное введение противоопухолевой ДКВ. 08.11.2018 г. Внутривенное введение NKG2D⁺ЦТЛ.

26.11.2018 г. - раствор Зомета 4мг в/в капельно.

Представлены результаты обследования: 14.12.2018 г. ПСА 25 нг/мл (0,0 - 4,0).

18.12.2018 г. С предварительного информированного согласия проведена интратекальная цитотрансфузия аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (МАГСК) ресуспензированных с РНКа-зой.

19.12.2018 г. с предварительного информированного согласия проведено внутрикожное введение персонифицированной противоопухолевой ДКВ.

20.12.2018 г. с предварительного информированного согласия проведено внутривенное введение персонифицированного препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

При контрольном обследовании ПСА общий от 11.01.2019 г. 45,3 нг/мл.

МРТ малого таза от 16.01.2019 г: МР картина состояния после курсов гормональной терапии, иммунотерапии по поводу рака простаты, без явной динамики в предстательной железе и отрицательной динамикой в костях таза. Увеличение единичного мезоректального л/узла.

22.01.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутрикожное введение персонифицированной ДКВ.

23.01.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутривенное введение персонифицированного препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

24.01.2019 г. зомета 4 мг в/в капельно.

23.01.2019 г. МРТ органов брюшной полости: МТС поражение костей, мелкие кисты в печени, поджелудочной железе и почках. За период с 17.09.2018 г. по 20.01.2019 г. не исключено увеличение объема поражения костей. В остальном без отрицательной динамики.

22.01.2019 г. МРТ органов малого таза - МР-картина может соответствовать специфическому неопластическому процессу предстательной железы, без существенной динамики.

24.01.2019 г. СРКТ органов грудной клетки: в S3 справа субплеврально и в язычковых сегментах слева появились единичные новые очаги 0,5х0,4 см и 0,4 см в диаметре соответственно. Множественные очаги смешанной деструкции в костях на уровне исследования остаются без видимой динамики, наблюдаемый очаг в Th 6 со склеротическим ободком существенно не изменился, но появился выраженный внекостный компонент стелющегося характера по плевре в области очага в заднем отрезке IV ребра слева размерами 4,6х1,5 см.

30.01.2019 г. остеосцинтиграфия - очаговое поражение в области костей черепа, костей таза, всех отделов позвоночника, грудины, ребер справа и слева, лопаток, плечевых и бедренных костей. В сравнении с предыдущим исследованием отмечается увеличение уровня и площади накопления РФП в ранее выявляемых и появились новые очаги поражения в грудине, плечевых и бедренных костях, отдельных позвонках, костях таза - отрицательная динамика.

31.01.2019 г. Интратекальное введение моноклональных аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.

01.02.2019 г. R-грамма плечевых поясов, ребер с 2 сторон, грудного, пояснично-крестцового отделов позвоночника, таза, бедренных костей - R-картина МТС смешанного типа с преобладанием пластического компонента без динамики и без признаков прогрессирования процесса.

06.02.2019 г. Консультация химиотерапевта. Д.м.н. Буланов А.А. - повторно: у больного диссеминированный рак предстательной железы. В течении 1,5 лет получает МАБ (касодекс+залодекс). По данным контрольного клинического обследования выявлено прогрессирование основного заболевания - рост ПСА 45,3 нг/мл, появление новых МТС в легких, МТС изменения по плевре в области IV ребра, костные МТС без динамики. Пациент соматически сохранен, новых жалоб не предъявляет. С учетом соматического состояния больного, сроков проведения МАБ рекомендуется назначить эндокринную терапию 2 линии: Абиратерон 1000 мг в стуки per os постоянно + Преднизолон 10 мг в сутки постоянно; продолжить Золадекс 3,6 мг в/м 1 раз в 28 дней; Зомета 4 мг в/в кап. 1 раз в 3 месяца. Анализ на тестостерон. Оценка эффекта через 2-3 месяца.

06.02.2019 г. Консультация иммунолога к.м.н. Борунова А.А. По данным иммунологического исследования от 22.01.2019 г. выявлено: перераспределение в популяции Т-лимфоцитов, характеризующееся увеличением количества CD8+ цитотоксических клеток, при одновременном уменьшении субпопуляции CD4+ хелперных лимфоцитов, сопровождающееся значительным снижением иммунорегуляторного процесса; количество NK-клеток и их функциональная активность в пределах нормальных показателей; увеличение популяции NKT-клеток; уменьшение количества В-лимфоцитов, при нормальном уровне сывороточных иммуноглобулинов.

РЕКОМЕНДОВАНО:

- Иммунотерапия (введение ДКВ + введение NKG2D⁺ЦТЛ) с интервалом 4-6 недель.

- Полиоксидоний 6 мг в/м х 10 дней провести 3 курса в перерывах между введением ДКВ.

- Иммунный контроль через 3 месяца.

20.02.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутрикожное введение персонифицированной ДКВ.

21.02.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутривенное введение персонифицированного препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

Пациент госпитализирован повторно в клинику «НейроВита» для продолжения лечения в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы: «Протеом-основанная персонифицированная иммунотерапия рака простаты с метастазами в ЦНС».

Аллергические реакции: отрицает.

Раннее развитие: в физическом развитии от родственников не отставал; с рождения отмечается расходящееся косоглазие, за счет слабости приводящей мышцы глаза справа (резидуально-органическое поражение ЦНС).

Объективный статус: состояние пациента относительно удовлетворительное, в сознании, контактен, адекватен, активность сохранена, ECOG 1. Кожные покровы физиологической окраски смуглые, влажные, тургор сохранен. Периферические лимфоузлы не пальпируются. Т - 36,6°С. При аускультации - везикулярное дыхание, проводится над всеми отделами лёгких равномерно, хрипов нет, ЧДД=17 в минуту. Тоны сердца приглушены, ритмичные, ЧСС=82 уд/мин. АД 120/83 мм рт. ст. Язык влажный, чистый, физиологической окраски. Живот участвует в акте дыхания всеми отделами, при пальпации мягкий, безболезненный, перитонеальных симптомов нет. Выслушивается вялая перистальтика. Кишечные газы отходят самостоятельно. Диурез адекватный.

В отделении проведено:

19.03.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутрикожное введение персонифицированной ДКВ.

20.03.2019 г. с предварительного информированного согласия проведено внутривенное введение персонифицированного препарата NKG2D⁺ЦТЛ.

Рекомендовано:

1. Контроль показателей клинического, биохимического анализов крови, коагулограммы и общего анализа мочи ПСА общий и свободный, анализ на тестостерон - через 1 месяц.

2. Гормональная терапия: р-р Залодекс 3,6 мг п/к 1 раз в 28 дней; Абиратерон 1000 мг в стуки per os постоянно + Преднизолон 10 мг в сутки постоянно.

3. Продолжить терапию бисфосфонатами (р-р Зомета 4мг 1 раз через каждые 3 месяца - в/в; таблетки Кальций Д3 Никомед по 1 таб. 2 раза в день в течение 2 недель). Гипотензивную терапию - согласно подобранной схемы.

4. Повторная госпитализация после 16.04.2019 г. для продолжения лечения в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы.

Клинический пример № 2

Пациентка В-ва Людмила Николаевна, 19.04.1938 г.р., находилась в клинике «НейроВита» с 29.01.2018 г. по 02.02.2018 г., поступила повторно с диагнозом:

Основной: Рак левой молочной железы. Гистологическое исследование: инвазивный рак неспецифического типа 2-й степени злокачественности. Индекс пролиферации Ki67=30%. В процессе гормонотерапии, комбинированной иммунотерапии.

Сопутствующие заболевания: ИБС: атеросклеротический кардиосклероз. Атеросклероз аорты, сосудов сердца, головного мозга. Комбинированный порок сердца. Постоянная форма фибриляции предсердий. Состояние после имплантации ЭКС (2014 г.), МК 2А. Дисциркуляторная энцефалопатия II-III ст. Хроническая ишемия ГМ, преимущественно в вертебро-базилярном бассейне, на фоне распространенного атеросклероза. Гипертоническая болезнь III ст., очень высокий риск. Сахарный диабет 2 типа, средняя степень тяжести. Хронический панкреатит, ремиссия. Аденома правого надпочечника. Киста левой почки. Посттромбофлеботическая болезнь нижних конечностей. Варикозная болезнь. Распространенный остеохондроз суставов позвоночника, крупных суставов конечностей; деформирующий остеоартроз кистей. Гонартроз справа. Состояние после операции: эндопротезирование левого коленного сустава. Холицистэктомия 2006 г.

Состояние после проведенной операции: Ляпаротомия. Аппендектомия (местный гнойный перитонит) (22.03.2017 г.).

Жалобы при поступлении: образование левой молочной железы. Эпизодические боли в коленных суставах с акцентом справа.

Анамнез заболевания: В течение последних 25 лет гипертоническая болезнь. Адаптирован к цифрам Ад 140/85 мм рт. ст. (максимальные цифры 160/100 мм рт. ст.) Принимает: таб. Продакса 110 мг х 1 р/д. Конкор 5 мг х 1 p/д. На боли в области сердца не жалуется.

В анамнезе: ИБС постоянная форма фибрилляции предсердий с 2012 г. Пациентке проведена имплантация ЭКС в 2014 г в ГКБ № 4. Отрицает перенесенный инфаркт миокарда. Со слов пациентки в 2004 году был эпизод вертебробазиллярной недостаточности. Хроническая ишемия головного мозга диагностируется около 8 лет. Холецистэктомия 2006 г. Хронический панкреатит вне обострения. Киста почки. Протезирование левого коленного сустава в 2010 г. Тромбофлебит нижних конечностей. Варикозная болезнь НК. Заболевание левой молочной железы диагностировано в июле 2016 года. УЗИ молочной железы (10.08.2016 г.) Правая молочная железа: молочная железа деформирована за счет рубца в верхнем наружном квадранте. Кожа, сосок и ареолы не изменены. Подкожный жировой слой без особенностей. Ткань молочной железы - преимущественно узловые образования не определяются. Плотность ткани <25%. В в/н квадранте правой молочной железы зона скопления микрокальцинат на площади 0,5x0,4 см. У границы внутренних квадрантов аналогичная зона на площади 0,7х05 см. По ткани внутренних также разрозненные кальцинаты до 0,2 см в Д. В нижне-внутреннем квадранте образование малой плотности 0,7x0,8 см, с ровным контуром - фибролипома? Заключение: BIRADS-3. Левая молочная железа. Молочная железа не деформирована. Кожа, сосок и ареолы не изменены. Подкожный слой без особенностей. Ткань молочной железы - преимущественно жировая ткань. Плотность ткани < 25%. В верхне-наружном квадранте узловое образование с тяжистыми контурами,дорожкой к соску, размерами 18x16x17 мм. В аксиллярных областях гиперплазированные л/у до 1-1.5 см в диаметре. Другие рег. зоны свободны.

Заключение: BIRADS-5. Злокачественное образование молочной железы.

ЭКГ 24.08.2016 г. Ритм ЭКС. ЧСС-76 в мин. Отклонение ЭОС влево. Недостаточность коронарного кровоснабжения и ишемия в верхушечной, боковой стенках ЛЖ. Гипертрофия миокарда ЛЖ. Отрицательный Зубец T с V3-V6 г.

ЭХО-Кг от 24.08.2016 г. Дилатация полостей сердца: ЛП-56 мм, ПП - 63х38 мм; ЛЖ-КДР-60 мм. КСР - 42 мм. Гипертрофия миокарда ЛЖ. Недостаточность МК(+ +); АО(++); ТК(+ +). Зон гипокинезии нет. ФВ 57%. Комбинированный порок сердца.

09.08.2016 г. проведена Cor-биопсия узлового образования левой полочной железы. Заключение: Гистологическое исследование № 31890 (от 10.08.2016 г.) Частицы ткани молочной железы с комплексами инвазивного рака неспецифического типа 2-й степени злокачественности. Индекс пролиферации Ki67 = 30%. Состояние после имплантации ЭКС (2014 г.). с 15.09.2016 г. началось лечение Фемара 1 таблетка днем - длительно. У больной имелись хронические заболевания: Тромбофлебит нижних конечностей. Варикозная болезнь. Распространенный остеохондроз суставов позвоночника, крупных суставов конечностей. Гонартроз справа. Состояние после эндопротезирования левого коленного сустава. ИБС стенокардия. Постоянная форма фибриляции предсердий. Комбинированный порок сердца. Гипертоническая болезнь. Состояние после операции: Холицистэктомия. В специфическом противоопухолевом лечении (хирургическом, лучевой терапией и химиотерапией) данной онкологической больной в ФГБУ НМИНЦ онкологии им. Н.Н. Блохина было отказано. Осмотрена академиком РАН проф. Давыдовым, было рекомендовано включить в группу комбинированной иммунотерапии. Начат первый курс иммунотерапии введением ДКВ подкожно и внутривенным введением препарата NKG2D⁺ЦТЛ. Проведено 8 цитотранфузий каждые 2 недели.

22.03.2017 г. Госпитализирована бригадой скорой помощи в ГКБ с ДЗ: Острый гангренозный аппендицит. Тифлит. Местный гнойный перитонит. Проведена операция: Аппендектомия (22.03.2017 г.).

С 22.05.2017 года проведен повторный курс комбинированной иммунотерапии введением ДКВ подкожно и внутривенным введением NKG2D⁺ЦТЛ. Проведено еще 8 цитотранфузий дендритных клеток и цитотоксических лимфоцитов каждые 2 недели.

Маммография (12.2017 г.) Заключение: Правая молочная железа: BIRADS-2. Доброкачественная кальцификация, без динамики. Левая молочная железа: BIRADS-6. Злокачественная образование молочной железы в верхнем наружном квадранте МЖ. Размер 1,7х1,3х1,75 см. УЗИ - выявляется гипоэхогенное объемное образование в верхнем наружном квадранте левой молочной железы, неправильной формы, размер 1,3х1,0х0,75 см. В обеих подмышечных областях гиперплазированные л/узлы с сохраненной структурой до 0,7 см. В других зонах без увеличенных л/узлов.

Пациентка госпитализирована в клинику «НейроВита» для контрольного обследования и продолжения лечения пациентки в группе консервативной иммунотерапии согласно протоколу научно-исследовательской программы при участии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, ФГБУ ФНКЦ ФМБА России.

Соматический статус: Состояние относительно удовлетворительное, стабильное. Сознание ясное. Положение активное. Конституция - гиперстеник. Кожные покровы: чистые, бледно-розового цвета. Отмечается пастозность нижних конечностей преимущественно в нижней трети голени с двух сторон. Дыхательная система: ЧДД-16 в 1 мин. Перкуторно над всей поверхностью легких - звук легочный, при аускультации дыхание везикулярное. Хрипов нет. Сердечно-сосудистая система: ЧСС-66 уд. в 1 мин. АД 125/80 мм рт.ст. Границы сердца не расширены. Признаки расширения вен н/конечностей. Пищеварительная система - язык чистый, влажный. При пальпации живот мягкий безболезненный. Печень не увеличена. Селезенка не увеличена .Стул регулярный, оформленный. Мочеполовая система: Мочеиспускание свободное, безболезненное. Симптом поколачивания отрицательный с обеих сторон.

Локально: В левой молочной железе в верхнем наружном квадранте определяется плотное образование менее 1,0 см диаметром с бугристой поверхностью. Периферические лимфоузлы не увеличены.

Результаты лабораторных, инструментальных исследований.

ЭКГ. Заключение (29.01.2018 г.): Сердечный ритм (фибриляция предсердий) в сочетании с ритмом ЭКС. Нормальное положение ЭОС. Единичные желудочковая экстрасистола. Единичный сливной комплекс. Ишемия миокарда нижней и верхушечной области. ЧСС 68 в мин. Стимулирующий электрод расположен в правом желудочке.

Исследование молочных желез: Маммография + УЗИ молочных желез + регионарных зон с 2 сторон в динамике (29.01.2018 г.).

Заключение: Правая молочная железа: без узловых образований.

Левая молочная железа: BIRADS-6. Злокачественная образование молочной железы в верхнем наружном квадранте МЖ. Размер 1,7х1,2х1,78 (было 1,7х1,3х1,75см).

УЗИ - Выявляется гипоэхогенное объемное образование в верхнем наружном квадранте левой молочной железы, неправильной формы. В обеих подмышечных областях гиперплазированные л/узлы с сохраненной структурой до 1,7 см. В других зонах без увеличенных л/узлов.

КТ органов грудной клетки, брюшной полости. (26.10.2017 г.). Заключение: Убедительных КТ признаков наличия очагов специфического неопластического процесса на уровне исследования не обнаружено. Аденома правого надпочечника. Киста левой почки.

ЦДС вен нижних конечностей. Заключение: Варикозное расширение вен нижних конечностей. Исследованные поверхностные и глубокие вены нижних конечностей проходимы.

Проведены процедуры:

30.01.2018 г. Внутривенная цитотрансфузия NKG2D⁺ЦТЛ с предварительного информированного согласия.

31.01.2018 г. Внутрикожное введение персонифицированной противоопухолевой ДКВ.

02.02.2018 г. Внутривенное введение персонифицированных NKG2D⁺ЦТЛ.

Лечение проведено согласно Московским городским стандартам оказания стационарной медицинской помощи для взрослого населения с учётом индивидуальных пожеланий пациента.

Пациентка выписывается в стабильном состоянии под наблюдение онколога, кардиолога, артролога, эндокринолога по месту жительства.

РЕКОМЕНДОВАНО:

• Расписана симптоматическая, гипотензивная кардиотропная терапия:

• Постоянный прием: таблетки Дигоксин 2,5 мг 1 раз вдень (5 дней прием , 2 дня перерыв).

Таблетки ГЛЮКОФАЖ ЛОНГ 750 мг 1 таблетка 2 раза в день.

Таблетки Продакса 110мг 1 таблетка днем.

Таблетка Престариум 5мг 1 таблетка утром.

Таблетки Конкор 5 мг 1 таблетка вечером;

Таблетки Диувер 5мг 1 таблетка утром - через день.

Таблетки Фемара 1 таблетка днем - постоянно.

• Продолжить прием: Таблетки ПРЕДУКТАЛ МБ 35мг 1 таблетка днем- 1 месяц.

Таблетки БЕРЛИТИОН 600мг 1 таблетка утром за 40 минут до еды - 4 недели.

• Повторная госпитализация через 8 недель для повторного курса иммунотерапии.

Катамнез на 1 сентября 2019 года: опухоль в левой молочной железе практически не пальпируется, болевой синдром при пальпации опухоли купирован полностью, при маммографии отмечается тень в проекции опухоли левой молочной железы, больная активна, ходит на кружок танцев в Дом культуры, довольна своим состоянием, стала ходить на прогулки, отмечает существенное улучшение качества жизни после проведенной иммунотерапии.

Как видно из представленных примеров и результатов, комбинированная ИТ по настоящему изобретению способна профилактировать рецидив заболевания и усиливать эффективность конвенциональной противоопухолевой терапии, а также может быть использована для терапии опухолей как монотерапия при невозможности проведения специализированной противоопухолевой терапии.

Перечень используемых сокращений

NKG2D⁺ЦТЛ - NKG2D-экспрессирующие цитотоксические Т-лимфоциты

ГМ - головной мозг

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДК - дендритные клетки

ДКВ - дендритноклеточная вакцина

ЗНО - злокачественное новообразование

ИЛ-2 - интерлейкин-2

ИЛ-4 - интерлейкин-4

ИТ - иммунотерапия

ЛАК - активированные лимфоциты

МГБ - мультиформная глиобластома

МТС - метастазы

ПГЕ₂ - простагландин Е₂

ФНОα - фактора некроза опухоли альфа

ЦТЛ - цитоксические лимфоциты

1. Способ комбинированной адоптивной клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований для профилактики их прогрессирования и рецидива у пациентов с отсутствием воспалительных очагов неонкологического характера, включающий последовательное введение пациенту дендритноклеточной вакцины (ДКВ), стимулирующей специфический противоопухолевый иммунитет, и препарата NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (NKG2D+ЦТЛ), способных убивать опухолевые клетки неспецифическим способом, причем ДКВ вводят с интервалом в 2-4 недели, а NKG2D+ЦТЛ – на следующий день после введения ДКВ.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что однократные вводимые дозы составляют 2-5 млн клеток ДКВ и 100-500 млн клеток NKG2D+ЦТЛ.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДКВ вводят внутрикожно, а NKG2D+ЦТЛ – внутривенно.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что курс иммунотерапии состоит из 8-12 введений.

5. Способ получения препарата NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов (NKG2D+ЦТЛ) для применения в способе по пп. 1-4, включающий выделение популяции лимфоцитов из мононуклеаров периферической крови пациента,

выделение популяции моноцитов из мононуклеаров периферической крови донора и кокультивирование лимфоцитов с алогенными зрелыми дендритными клетками, предварительно полученными путем культивирования моноцитов в присутствии интерлейкина-4 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и последующего добавления в культуральную среду фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) и простагландина Е2 (ПГЕ2), для получения NKG2D+ЦТЛ в результате кокультивирования, которые затем собирают и отмывают от культуральной среды с получением целевого препарата.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что в процессе кокультивирования, как только лимфоциты начинают пролиферировать, их переносят в больший объём культуральной среды с добавлением аллогенных ДК, затем с периодичностью в 2-3 дня проводят 4-5 циклов добавления в культуральную среду интерлейкина-2 (ИЛ-2) и добавления алогенных ДК с увеличением объема культуральной среды в каждом цикле, а после проведения указанных циклов пролиферацию лейкоцитов поддерживают только периодическим внесением ИЛ-2.

7. Препарат NKG2D-экспрессирующих цитотоксических Т-лимфоцитов для применения в способе по пп. 1-4, полученный способом по пп. 5, 6.