Мультивалентные моно- или биспецифичные рекомбинантные антитела для аналитических целей

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу конструирования не химерного или химерного мультивалентного рекомбинантного антитела для обнаружения антигена. Раскрыты применение мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного указанным способом, и способ обнаружения антигена с помощью антитела, полученного указанным способом. Также раскрыт конъюгат для обнаружения антигена, содержащий антитело, полученное указанным способом. Изобретение позволяет эффективно конструировать антитела для обнаружения антигенов. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 табл., 14 ил., 12 пр.

 

Настоящее описание относится к новым аналитическим специфическим мультивалентным рекомбинантным антителам, которые особенно полезны в иммуноанализах. В частности, описаны шестивалентные, восьмивалентные и десятивалентные антитела, их конструирование, получение, характеристика и использование в анализах по определению целевого антигена.

Предшествующий уровень техники

Иммуноанализом называют биохимический тест, с помощью которого определяют присутствие или концентрацию макромолекулы или небольшой молекулы в растворе, обычно используя антитело в качестве специфического агента для обнаружения. Молекулу, обнаруженную методом иммуноанализа, называют «исследуемым веществом» или «целевым исследуемым веществом», и во многих случаях оно является белком, хотя это могут быть молекулы другого типа и размера, при условии, что используемые в иммуноанализе антитело или антитела способны облегчить специфическое обнаружение исследуемого вещества. В клинической диагностике с помощью иммуноанализов часто обнаруживают исследуемые вещества в биологических жидкостях, таких как сыворотка, плазма или моча. В более общем смысле, как это рассматривают в настоящем изобретении, иммуноанализы качественно или количественно обнаруживают целевое исследуемое вещество в каком-либо типе образца, при условии, что образец является жидким образцом или может быть обработан так, чтобы стать жидким образцом, а также при условии, что исследуемое вещество содержится в водном растворе, являясь частью жидкой фазы образца.

Иммуноанализы, известные специалистам, бывают разных форматов и вариаций. Иммуноанализ может проводиться в несколько этапов с добавлением реагентов и их вымыванием или отделением на разных этапах анализа. Многоступенчатые анализы часто называют разделительными иммуноанализами или гетерогенными иммуноанализами. Некоторые иммуноанализы можно проводить, просто смешивая реагенты и образец и проводя физические измерения. Такие анализы называются гомогенными иммуноанализами или, реже, неразделенными иммуноанализами.

Иммуноанализ основан на способности антитела распознавать, и специфически связываться с исследуемым веществом, даже если это вещество присутствует в образце в малом количестве в сложной смеси других молекул. Конкретная молекулярная структура, распознаваемая антителом, называется «антигеном», а специфическая область на антигене, с которой связывается антитело, называется «эпитопом».

Помимо специфического связывания антитела с исследуемым веществом, другой принципиальной особенностью всех иммуноанализов является способность вырабатывать измеримый сигнал в ответ на связывание. Часто антитело связано с выявляемой меткой. В современных иммуноанализах применяют большое количество меток, которые позволяют выявлять связывание различными методами. Многие метки можно обнаружить, потому что они способны излучать, изменять цвет раствора, флуоресцировать под действием света, вызванного индукцией.

Типичный вариант гетерогенного иммуноанализа с антителами включает так называемый «сэндвич» формат, в котором два (первый и второй) различных неперекрывающихся антигена исследуемого вещества связаны, соответственно, первым и вторым антителом. То есть, благодаря связыванию с первым и вторым антигенами, первое и второе антитела образуют «сэндвич» с исследуемым веществом. Первое антитело связано с выявляемой меткой, второе антитело является иммобилизованным или способным к иммобилизации, что позволяет добавлять и удалять реагенты, а также стадии промывки. Гетерогенный сэндвич-иммуноанализ включает общие этапы (а) контактирования образца, содержащего исследуемое вещество, с первым и вторым антителами, после чего исследуемое вещество становится связанным (зажатым) с первым и вторым антителами, где второе антитело является или становится иммобилизованным, после чего (б) осуществляют стадию определения количества иммобилизованной метки, являющейся частью сэндвича. Количество обнаруженной метки соответствует количеству находящегося в сэндвиче исследуемого вещества и, следовательно, соответствует количеству исследуемого вещества в образце.

В технической области подготовки материала для иммуноанализа применяют олигомеры или полимеры антител, известные в данной области; их часто используют для усиления антигенсвязывающих свойств антитела. В ЕР 0955546 А1 описывают химически полимеризованный конъюгат антитела, который помечен красителем. Продукт полимеризации антитела характеризуется большим количеством функциональных сайтов связывания антигена, то есть является «мультивалентным» связующим. Известно, что использование в иммуноанализе мультивалентного связующего приводит к улучшению антигенсвязывающей чувствительности. Описано, что полимеризованное антитело, связанное с выявляемой меткой, описано для применения в реакциях антиген-антитело в диагностических целях.

Используя фермент в качестве обнаруживаемой метки, в ЕР 175560 А2 сообщают о процессе получения конъюгата полимерного фермента/антитела путем ковалентного связывания предварительно полимеризованного фермента с антителом или его фрагментом, таким как фрагмент Fab, Fab' или F (ab')2. В этом патенте также описывают иммуноанализ для выявления исследуемого вещества в жидком образце, который включает стадии (а) образования комплекса конъюгата с исследуемым веществом, (б) разделения комплекса, (в) обнаружения ферментативной активности в комплексе, и (г) соотнесения обнаруженной ферментативной активности с количеством исследуемого вещества в образце. В цитируемом патенте также упоминают оптимизацию получения конъюгата в отношении стехиометрии антитела или его фрагментов, с одной стороны, и предварительно полимеризованного фермента, с другой стороны. Показано, что стехиометрия оказывает воздействие на чувствительность обнаружения и фоновую активность в иммуноанализе.

В US 20030143638 А1 описывают способ регулирования реактивности взаимодействия антиген-антитело. Этот способ включает стадии (а) получения множества полимеров антител, имеющих различные степени полимеризации; (б) связывание множества полимеров антител с носителями с получением набора комплексов антитело/носитель; и (в) выбор из набора комплексов такого комплекса антитело/носитель, который реагирует с антигеном в необходимой степени.

Каждое плечо антитела, которое связывается с целевым антигеном, называется антигенсвязывающим фрагментом (=Fab). Fab означает «антигенсвязывающий фрагмент»; это область антитела, которая связывается с антигенами, состоящая из одного константного и одного вариабельного домена каждой из тяжелых (Fab_H) и легких цепей (Fab_L). Таким образом, Fab-фрагмент содержит два выровненных полипептида, первый фрагмент тяжелой цепи (Fab_H) и нефрагментированную легкую цепь (Fab_L), которые выровнены с фрагментом тяжелой цепи и связаны через дисульфидный мостик. Хвостовую область антитела обычно называют кристаллизуемым фрагментом (=Fc), который содержится в изотипах антител IgG, IgA и IgD два дополнительных фрагмента тяжелой цепи (каждый из которых называется Fc_H), которые идентичны и выровнены друг с другом и которые связаны с одним или несколькими дисульфидными мостиками. Протеолитический процессинг иммуноглобулина изотипа IgG, IgA или IgD может быть применен для искусственного расщепления антитела с образованием фрагментов Fc и Fab, которые можно разделить и выделить. Фермент папаин можно применять для расщепления одного иммуноглобулина на два фрагмента Fab и один фрагмент Fc. Фермент пепсин расщепляет ниже шарнирной области, в результате чего образуется фрагмент F(ab')2 и фрагмент pFc'. Аналогично, фермент IdeS специфически расщепляет в шарнирной области IgG.

Фрагменты антигенсвязывающих антител без частей Fc (полученных в выделенной форме после протеолитического процессинга, например, пепсином или папаином) являются особенно предпочтительными, если образец с исследуемым веществом является цельной кровью, сывороткой крови или плазмой крови. Известно, что компоненты, содержащиеся в таких образцах, могут неспецифически связываться с частями Fc обычных антител. Неспецифическое взаимодействие компонентов образца с частями Fc может усилить фоновый сигнал иммуноанализа. Увеличение фонового сигнала оказывает негативное влияние на эффективность анализа, поскольку соотношение сигнал/шум уменьшается.

В предшествующем уровне техники один из вариантов осуществления иммуноанализа включает стадию химического перекрестного сшивания фрагментов антигенсвязывающих антител после удаления у них Fc-частей, тем самым образуя полимер из таких фрагментов. Такие полимеризованные фрагменты антигенсвязывающего антитела в настоящее время являются предпочтительными в ряде иммуноанализов, которые требуют высокой чувствительности к антигену-мишени и низкого фонового сигнала. Стадию перекрестного сшивания выполняют с целью создания мультивалентного связующего для исследуемого вещества с улучшенными свойствами связывания. Для ряда коммерчески доступных иммуноанализов производное от антитела мультивалентное специфическое в отношении исследуемого вещества связующее без части Fc и связанное с меткой является предпочтительным агентов обнаружения, известным в данной области. В определенных случаях химически перекрестно сшитые (т.е. полимеризованные) фрагменты антител имеют преимущество перед антителами в их естественной форме, которая все еще включает части Fc, поскольку соотношение сигнал/шум иммунологического анализа, таким образом, может быть улучшено.

Встречающиеся в природе нефрагментированные антитела содержат две тяжелые цепи, которые связаны дисульфидными связями, и две легкие цепи. Каждая легкая цепь связана с одной из тяжелых цепей дисульфидными связями. Каждая часть Fab_H в тяжелой цепи иммуноглобулина имеет на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд константных доменов (три или четыре константных домена, CH1, СН2, СН3 и СН4, в зависимости от класса антитела). Каждая легкая цепь Fab_L имеет вариабельный домен (VL) на N-терминальном конце и константный домен (CL) на своем другом (С-терминальном) конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом (СН1) тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи (VL) выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи (VH). Полагают, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между доменами легкой и тяжелой цепей, которая обеспечивает выравнивание за счет физико-химических взаимодействий.

Константные домены не участвуют непосредственно в связывании антитела с его целевым антигеном, но они участвуют в различных эффекторных функциях in vivo. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей непосредственно участвуют в связывании антитела с его эпитопом. Вариабельные домены встречающихся в природе легких (VL) и тяжелых (VH) цепей имеют одинаковую общую структуру; каждая содержит четыре каркасных области (framework region, FR), чьи последовательности несколько консервативны и соединены тремя областями, определяющими комплементарность (CDR). CDR в каждой цепи находятся в непосредственной близости от FR; сайт связывания эпитопа образован объединенными CDR выровненных легкой и тяжелой цепей в соответствующей Fab-части антитела.

В последнее время было разработано множество форматов рекомбинантных мультиспецифических антител, например четырехвалентных биспецифических антител, полученных путем гибридизации, например, формат антитела IgG и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. с соавт., Nature Biotech. 15, 1997, 159-163; WO 2001/077342; Morrison S.L., Nature Biotech. 25, 2007, 1233-1234). Также было разработано несколько других новых форматов, в которых структура ядра антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) больше не сохраняется; например, диа-, триа- или тетра-тела, мини-тела и несколько одноцепочечных форматов (scFv, Bis-scFv). Ряд из них способен связывать два или более антигенов (Holliger Р. с соавт., Nature Biotech. 23, 2005, 1126-1136; Fischer N., О., Pathobiology 74, 2007, 3-14; Shen J. с соавт., J. Immunol. Methods 318, 2007, 65-74; Wu С. с соавт., Nature Biotech. 25, 2007, 1290-1297). В таких форматах используют линкеры либо для слияния ядра антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с другим связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух фрагментов Fab или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, 3-14).

В WO 2001/077342 описывают различные сконструированные антитела. Описывают конкретное сконструированное антитело класса IgG, которое содержит четыре антигенсвязывающих сайта. В частности, N-концевая часть CH1-VH каждой тяжелой цепи удлиняется еще одной частью CH1-VH. Соответственно, в полностью собранном антителе N-концевой участок каждой тяжелой цепи выровнен и связан не с одной, а с двумя соответствующими легкими цепями. Таким образом, каждое плечо такого четырехвалентного антитела содержит первый и второй антигенсвязывающий сайт, причем оба сайта расположены в тандеме. В этом изобретении упоминают, что такие сконструированные антитела могут быть полезны в диагностических анализах, например, в обнаружении антигенов, представляющих интерес в конкретных клетках, тканях или сыворотке.

Дополнительный обзор по теме сконструированных антител был предоставлен Chiu M.L., Gillilang G.L. Curr Opin Struct Biol 38, 2016, 163-173; Tiller K.L., Tessier P.M. Annu Rev Biomed Eng 17, 2015, 191-216. Ряд разных конструкций мультивалентных антител рассматривается в публикации Deyev S.M., Lebedenko E.N. BioEssays 30, 2008, 904-918.

Шестивалентные сконструированные антитела описаны Blanco-Toribio А. с соавт., mAbs 5, 2013, 70-79. Stone Е. с соавт., J. Immunol. Methods 318, 2007, 88-94. Вышеизложенное иллюстрирует желание в данной области техники предоставить модифицированные иммуноглобулины в качестве исходного материала для иммуноанализов, которые имеют пониженный фоновый сигнал. Кроме того, желательны иммуноглобулины, которые обеспечивают высокую чувствительность анализа в отношении целевого анализируемого вещества.

Получение мультивалентных антигенсвязывающих макромолекул путем химического связывания или перекрестного сшивания (полимеризации) целых антител или фрагментов антител является уже практическим подходом для решения таких технических задач. Но формирование химических связей является вероятностным процессом в нескольких аспектах. Во-первых, что химическое перекрестное сшивание не является сайт-специфичным (или является таковым только в ограниченной степени). То есть в полипептиде всегда есть несколько доступных аминокислотных боковых цепей, которые в принципе могут участвовать в реакции перекрестного сшивания. И для каждой рассматриваемой боковой цепи существует разная вероятность ее участия в реакции. Химическая реакция может быть количественной или неколичественной. Кроме того, в принципе, в химической реакции с антителами или фрагментами антител формируется не один продукт, а ряд различных продуктов. Имеется в виду, что нельзя точно прогнозировать, какие конкретные боковые цепи аминокислот первого и второго полипептида участвуют в формировании поперечных сшивок.

Кроме того, обычно имеется распределение относительно среднего числа полипептидов, которые соединяются с образованием мультивалентной антигенсвязывающей макромолекулы. Химические реакции перекрестного сшивания приводят к распределению молекулярных масс продуктов, отражая количество антител или фрагментов антител, которые связаны между собой. Обычно, однако, только часть продуктов имеет практическое применение и технически подходит в качестве мультивалентных антигенсвязывающих макромолекул в иммуноанализе. Поэтому, чтобы создать достаточно стандартизированный и воспроизводимый анализ, необходимо идентифицировать, разделить, очистить и охарактеризовать необходимую субфракцию продуктов для дальнейшего использования.

Соответственно, в данной области существует потребность в улучшении получения мультивалентных антигенсвязывающих макромолекул, подходящих для использования в качестве выявляющих реагентов в иммуноанализах. Желательно, чтобы такие макромолекулы были биохимически стабильны и сконструированы таким образом, чтобы процесс конструирования был удобным. Кроме того, желательны рекомбинантные конструкции мультивалентных антигенсвязывающих макромолекул, которые могут экспрессироваться в трансформированных клетках-хозяевах, где высока вероятность успеха в отношении экспрессии и продукции желаемого продукта с хорошим выходом. Основой настоящего описания является неожиданное обнаружение того обстоятельства, что мультивалентные рекомбинантные антитела, описанные в настоящем изобретении, могут преимущественно продуцироваться рекомбинантно в больших количествах в стабильно трансформированных клетках. Наблюдаются уровни экспрессии, которые сопоставимы с рекомбинантно экспрессированными обычными иммуноглобулинами. Мультивалентные рекомбинантные антитела, описанные в настоящем изобретении, имеют большое преимущество в качестве реактива для обнаружения исследуемого вещества. В этом отношении описываемые рекомбинантные антитела улучшают соотношение сигнал/шум в иммуноанализах, особенно по сравнению с обычными иммуноглобулинами.

Краткое описание изобретения

В качестве первого объекта, связанного со всеми другими объектами и описанными вариантами осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении предусматривают мультивалентное рекомбинантное антитело, которое содержит ряд р полипептидов легкой цепи Fab_L и димер двух полипептидов тяжелой цепи, где каждый полипептид тяжелой цепи имеет структуру формулы I

где

(а) р означает величину, выбранную из группы, включающей 6, 8 и 10, каждая величина из m и n выбрана независимо как целое число от 1 до 3, и каждая величина из m и n выбрана так, что значение р равно (2+2×(n+m)),

(б) «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи,

(в) каждое обозначение L является необязательным и, если присутствует, является независимо выбранной вариабельной линкерной аминокислотной последовательностью,

(г) каждое обозначение dd(Fc_H) является областью димеризации тяжелой цепи области иммуноглобулина, не являющейся антигенсвязывающей,

(д) в димере два dd(Fc_H) выровнены относительно друг друга в физической близости;

(е) каждое обозначение Fab_H независимо выбрано из А_Н и В_Н, где А_Н и В_Н различны, и А_Н и В_Н независимо выбраны из группы, состоящей из

где

VH обозначает N-концевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина,

VL обозначает N-концевой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина,

СН1 обозначает С-концевой константный домен 1 тяжелой цепи иммуноглобулина,

CL обозначает С-концевой константный домен легкой цепи иммуноглобулина,

(а) каждый Fab_L независимо выбран из A_L и B_L, где A_L и B_L разные, и A_L и B_L независимо выбраны из группы, состоящей из

(б) каждый антигенсвязывающий сайт Fab_H:Fab_L антитела представляет собой выровненную пару (выравнивание обозначено «:»), где каждая выровненная пара независимо выбрана из группы, состоящей из A_H:A_L и B_H:B_L, где A_H:A_L и B_H:B_L выбирают независимо из группы, состоящей из

[VL-CH1]_H:[VH-CL]_L,

[VL-CL]_H:[VH-CH1]_L,

[VH-CH1]_H:[VL-CL]_L,

[VH-CL]_H:[VL-CH1]_L,

где в каждой выровненной паре соответствующие CL и СН1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

В качестве второго объекта, относящегося ко всем другим объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении применяют мультивалентное антитело по настоящему изобретению в анализе для обнаружения антигена. В качестве третьего объекта, относящегося ко всем другим объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении применяют набор, содержащий химерное или не химерное мультивалентное рекомбинантное антитело, описанное в качестве первого объекта настоящего изобретения.

В качестве четвертого объекта, связанного со всеми другими объектами и описанными вариантами осуществления настоящего изобретения, в настоящем изобретении предусматривают способ обнаружения антигена, включающий стадии контактирования мультивалентного рекомбинантного антитела, описанного в качестве первого объекта настоящего изобретения, с антигеном, таким образом, формируя комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела с последующим выявлением образовавшегося комплекса, тем самым обнаруживая антиген. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает стадии (а) смешивания мультивалентного рекомбинантного антитела по настоящему изобретению с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, (б) инкубирования образца и мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), в результате образования комплекса антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, (в) обнаружения комплекса, образованного на стадии (б), тем самым обнаруживая антиген.

Подробное описание изобретения

Понятие «антитело» в настоящем описании применяют в самом широком смысле, поскольку под ним подразумевают различные структуры антител, включая, но, не ограничиваясь ими, структуры, известные как моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют соответствующую антигенсвязывающую активность.

Термин «специфичность антитела» относится к селективному распознаванию антителом определенного эпитопа антигена. Природные антитела, например, являются моноспецифические. В контексте настоящего изобретения понятие «моноспецифическое антитело» обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. Таким образом, «моноспецифические» антитела представляют собой антитела, которые связываются с одним эпитопом. В качестве примера, которым настоящее изобретение не ограничивается, моноклональные антитела являются моноспецифическими. В более общих понятиях антитело, способное связывать только один эпитоп, понимается как моноспецифическое. Очевидно, что для целей настоящего описания, а также всех объектов и вариантов осуществления настоящего изобретения, может существовать или может быть найдено более одного сайта связывания в отношении одного эпитопа, причем сайты связывания являются специфическими для эпитопа. Таким образом, понятие «моноспецифический» охватывает разные сайты связывания, если обычно они определяются по специфичности в отношении одного и того же эпитопа. В этом отношении моноспецифическое антитело может включать сайты связывания, которые различаются по кинетике связывания эпитопа.

«Биспецифические», «триспецифические», «тетраспецифические», «пентаспецифические», «гексаспецифические» и др. антитела, также называемые «мультиспецифические» антителами, связывают два или более разных эпитопов (например, два, три, четыре или более разных эпитопов). Эпитопы могут быть идентичными или не идентичными, они могут быть на одном и том же или на разных антигенах. Примером мультиспецифического антитела является «биспецифические антитело», которое связывает два разных эпитопа. Обычно, когда антитело обладает более чем одной специфичностью, распознанные эпитопы могут быть связаны с одним антигеном или с более чем одним антигеном.

Используемое в настоящем изобретении понятие «валентность» означает наличие определенного числа сайтов связывания в молекуле антитела. Например, природное антитело иммуноглобулинов класса IgG имеет два сайта связывания и поэтому является двухвалентным. Таким образом, понятие «трехвалентный» означает наличие трех сайтов связывания в молекуле антитела, «четырехвалентный» означает четыре сайта связывания, «шестивалентный» означает шесть сайтов связывания и так далее.

«Консервативные замещения» относятся к последовательностям, как аминокислот, так и нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, понятие «консервативно замещенные» относится к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или если нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, по существу, к идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодируют какой-либо определенный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждой позиции, где аланин обозначен кодоном, кодон может быть изменен на какой-либо из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот являются «молчащими вариациями», которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. В настоящем изобретении каждая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждое возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области очевидно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана), можно модифицировать для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, скрыта в каждой описанной последовательности.

Что касается аминокислотных последовательностей, то специалистам в данной области известно, что отдельные замещения в пептидной, полипептидной или белковой последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в аминокислотной последовательности, представляют собой «консервативные замещения», где изменение приводит к замещению аминокислоты химически близкой аминокислотой. Таблицы консервативных замещений, содержащие функционально сходные аминокислоты, известны специалистам в данной области. Таблицы консервативных замен, содержащие функционально близкие аминокислоты, известны специалистам в данной области. Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга:

Термин «консервативные аминокислотные замены» относится ко всем замещениям, в которых замещенная аминокислота имеет сходные структурные или химические свойства с соответствующей аминокислотой в контрольной последовательности. Например, консервативные аминокислотные замещения включают замену одной алифатической или гидрофобной аминокислоты, например аланина, валина, лейцина, изолейцина, метионина, фенилаланина или триптофана, другой; замену одной гидроксилсодержащей аминокислоты, например серина и треонина, другой; замену одного кислотного остатка, например глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты, другим; замену одного амид-содержащего остатка, например аспарагина и глутамина, другим; замену одного ароматического остатка, например фенилаланина и тирозина, другим; замену одного основного остатка, например лизина, аргинина и гистидина, другим; и замену одной малой аминокислоты, например аланина, серина, треонина и глицина, другой.

В контексте настоящего изобретения понятия «делеция» и «инсерция» в отношении аминокислотной последовательности означают удаление или добавление одной или нескольких аминокислот к амино-концу, карбокси-концу, внутренней части аминокислотной последовательности или их комбинации, например, инсерция может произведена к одному из антител, являющихся объектами настоящего изобретения.

В контексте настоящего изобретения понятие «гомологичные последовательности» относится к аминокислотным последовательностям, которые, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или, по меньшей мере, на 99% гомологичны соответствующим контрольным последовательностям. Последовательности, которые являются по меньшей мере на 90% идентичными, имеют не более 1 изменения, то есть какую-либо комбинацию делеций, инсерций или замещений, на 10 аминокислот контрольной последовательности. Процент гомологии определяют путем сравнения аминокислотной последовательности данного варианта с контрольной последовательностью, которое осуществляют, например, по проекту MEG ALIGN ™ в программе DNA STAR ™.

Понятия «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или под-последовательностям, которые являются одинаковыми. Последовательности являются «по существу идентичными», если они имеют процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов, составляющий около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90% или около 95% идентичности при сравнении и выравнивании для определения максимального соответствия в окне сравнения или определенной области, измеренной с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей (или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области) или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Это определение также относится к дополнению тест-последовательности. Идентичность может существовать в области, длина которой составляет, по меньшей мере, около 50 аминокислот или нуклеотидов, или в области, длина которой составляет 75-100 аминокислот или нуклеотидов, или, если конкретно не указано, по всей последовательности полинуклеотида или полипептида. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, включая гомологи, полученные не от человека, а от представителей других видов, может быть получен методом, включающим стадии скрининга библиотеки в строгих условиях гибридизации с меченым зондом, имеющим полинуклеотидную последовательность или ее фрагмент по настоящему изобретению и выделение полноразмерной кДНК и геномных клонов, содержащих указанную полинуклеотидную последовательность. Такие методы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области.

При сравнении последовательностей обычно одну последовательность рассматривают как контрольную последовательность, с которой сравниваются исследуемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей, исследуемые и контрольные последовательности вводят в компьютер, при необходимости обозначают координаты подпоследовательности и программные параметры алгоритма последовательности. Можно использовать параметры программы по умолчанию или указать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичности последовательностей для исследуемых последовательностей относительно их контрольных последовательностей на основе параметров программы.

«Фрагменты антител» включают часть полноразмерного антитела, предпочтительно его вариабельный домен, или, по меньшей мере, его антигенсвязывающий сайт. Примеры фрагментов антител включают диатела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. scFv-антитела описаны, например, в публикации Huston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, 46-88. Кроме того, фрагменты антител содержат одноцепочечные полипептиды, имеющие свойства домена V_H, а именно способность сборки с доменом V_L или связывания домена V_L с IGF-1, а именно способность сборки вместе с доменом V_H с функциональным сайтом связывания антигена и, таким образом, обеспечиваются свойства антитела по настоящему изобретению.

Используемые в настоящем изобретении понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату молекул антитела одного аминокислотного состава.

Понятие «специфический связывающий агент» используют для обозначения используемого агента, который способен либо специфически связываться, либо быть специфически связанным с представляющим интерес исследуемым веществом. В данной области известно множество различных аналитических подходов для проведения иммуноанализов. В зависимости от конкретной схемы анализа могут быть использованы различные биотинилированные специфические связывающие агенты. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биотинилированный специфический связывающий агент выбирают из группы, состоящей из биотинилированного специфического в отношении исследуемого вещества связывающего агента, биотинилированного исследуемого вещества, связанного с твердой фазой, и биотинилированного антигена, связанного с твердой фазой.

Понятие «связывающий агент, специфичный в отношении исследуемого вещества» относится к молекуле, специфически связывающейся с представляющим интерес исследуемым веществом. Связывающий агент, специфичный в отношении исследуемого вещества, в настоящем изобретении обычно включает связывающие или захватывающие молекулы, способные связываться с исследуемым веществом (также называемым представляющим интерес исследуемым веществом; целевой молекулой). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывающий агент, специфичный в отношении исследуемого вещества, проявляет связывающее сродство, по меньшей мере, равное 10⁷ л/моль к соответствующей целевой молекуле, то есть к исследуемому веществу. Связывающий агент, специфичный в отношении исследуемого вещества, в других вариантах осуществления настоящего изобретения проявляет сродство, равное 10⁸ л/моль или даже 10⁹ л/моль в отношении соответствующей целевой молекулы. Специалисту в данной области очевидно, что понятие «специфичный» используют для обозначения того, что другие биомолекулы, присутствующие в образце, не связываются существенным образом со связывающим агентом, специфичным в отношении исследуемого вещества. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровень связывания с биомолекулой, отличной от целевой молекулы, приводит к связывающему сродству, составляющему всего лишь 10%, более предпочтительно, только 5% от связывающего сродства с целевой молекулой или менее. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывающее сродство с другими молекулами, кроме исследуемого вещества, не поддается измерению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения связывающий агент, специфичный в отношении исследуемого вещества, соответствует как вышеуказанным минимальным критериям связывающего сродства (аффинности), так и специфичности.

Понятие «специфичное для исследуемого вещества связывание» в контексте настоящего изобретения означает иммуноспецифическое взаимодействие антитела с его целевым эпитопом на исследуемом веществе, то есть связыванию антитела с эпитопом на исследуемом веществе. Концепция исследуемое вещество-специфическое связывание антитела через его эпитоп на исследуемом веществе полностью понятна специалистам в данной области.

Понятия «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимеру из аминокислотных остатков. Это понятия применяются к природным аминокислотным полимерам, а также к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков не являются кодируемой природой аминокислотой. В контексте настоящего изобретения понятия охватывают аминокислотные цепи, где аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями. Полипептиды, пептиды и белки пишут с использованием стандартной записи последовательности, причем азотный конец находится слева, а карбокси-конец - справа. Стандартные однобуквенные обозначения используют следующим образом: А-аланин, С-цистеин, D-аспарагиновая кислота, Е-глутаминовая кислота, F-фенилаланин, G-глицин, Н-гистидин, S-изолейцин, K-лизин, L- лейцин, М-метионин, N-аспарагин, Р-пролин, Q-глутамин, R-аргинин, S-серин, Т-треонин, V-валин, W-триптофан, Y-тирозин. В настоящем изобретении понятие «пептид» относится к полимеру аминокислот, который имеет длину до 5 аминокислот. В настоящем изобретении понятие «полипептид» относится к полимеру аминокислот, который имеет длину 6 или более аминокислот. Понятие «белок» означает полипептидную цепь или полипептидную цепь с дополнительными модификациями, такими как гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование или другие посттрансляционные модификации.

«Фрагменты антител» включают часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антигенсвязывающую область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv; молекулы одноцепочечных антител; scFv, sc(Fv)2; диатела; мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

При расщеплении антител папаином образуются два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт и остаточный «Fc» фрагмент, название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. В результате обработки пепсином получают фрагмент F(ab')2, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен к перекрестному связыванию антигена.

Фрагмент Fab содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена СН1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. В настоящем изобретении Fab'-SH является фрагментом Fab', в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несут свободную тиоловую группу. Фрагменты F(ab')₂ антител первоначально были получены в виде пар Fab-фрагментов, между которыми находятся шарнирные цистеины. Также известны другие химические объединения фрагментов антител.

В контексте настоящего изобретения понятие «моноклональное антитело» относится к антителу, выделенному из популяции, по существу, гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например, встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на то, что такое антитело как не является смесью отдельных антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такое моноклональное антитело обычно представляет антитело, содержащее полипептидную последовательность, которая связывает мишень, причем полипептидную последовательность, связывающуюся с мишенью, получают методом, который включает выбор одной полипептидной последовательности, связывающей мишень, из множества полипептидных последовательностей. Например, процесс отбора такой последовательности может быть отбором уникального клона из множества клонов, таких как пул гибридомных клонов, фаговых клонов или рекомбинантных клонов ДНК. Следует отметить, что выбранная целевая последовательность, связывающая мишень, может быть дополнительно изменена, например, для улучшения сродства с мишенью, гуманизации последовательности, связывающей мишень, для улучшения ее продукции в культуре клеток, для снижения иммуногенности in vivo, для создания мультиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее измененную последовательность, связывающую мишень, также является моноклональным антителом по настоящему изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности препараты моноклональных антител имеют преимущество, заключающееся в том, что они, как правило, не контаминированы другими иммуноглобулинами.

Понятие «моноклональное» указывает на свойство антитела, получаемого из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее получения антитела каким-либо определенным методом. Например, моноклональные антитела для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены различными способами, включая, например, гибридомный метод (см., например, Kohler и Milstein., Nature, 256, 1975, 495-497; Hongo с соавт., Hybridoma, 14(3), 1995, 253-260; Harlow с соавт., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, 2е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press; Haemmerling с соавт., в кн.: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 1981, 563-681, изд-во Elsevier, Нью-Йорк), методы рекомбинации ДНК (см., например, US 4816567), методы фагового дисплея (см., например, Clackson с соавт., Nature, 352, 1991, 624-628; Marks с соавт., J. Mol. Biol. 222, 1992, 581-597; Sidhu с соавт., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee с соавт., J. Mol. Biol. 340(5), 2004, 1073-1093; Fellouse, PNAS USA 101(34), 2004, 12467-12472; Lee с соавт., J. Immunol. Methods 284(1-2), 2004, 119-132; и технологии получения антител человека или получения у животных антител, подобных антителам человека, которые имеют части или все локусы иммуноглобулина человека или гены, кодирующие последовательности иммуноглобулина человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits с соавт., PNAS USA 90:2551, 1993; Jakobovits с соавт., Nature 362, 1993, 255-258; Bruggemann с соавт., Year in Immunol. 7:33, 1993; US 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; Marks с соавт., Bio/Technology 10 1992, 779-783; Lonberg с соавт., Nature 368, 1994, 856-859; Morrison, Nature 368, 1994, 812-813; Fishwild с соавт., Nature Biotechnol. 14, 1996, 845-851; Neuberger, Nature Biotechnol. 14, 1996, 826; Lonberg и Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 1995, 65-93).

В настоящем изобретении к моноклональным антителам, в частности, относят «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также к фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (см., например, US 4816567 и Morrison с соавт., PNAS USA 81, 1984, 6851-6855). Химерные антитела включают антитела PRIMATIZED®, в которых антигенсвязывающая область антитела получена из антитела, сформированного, например, путем иммунизации макак антигеном, представляющим интерес.

Понятие «гипервариабельная область (hypervariable region)», «HVR» или «HV» в контексте настоящего изобретения относится к областям вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности и/или образуют структурно определено выраженные петли. Обычно антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). В нативных антителах, Н3 и L3 проявляют наибольшее разнообразие из шести HVR, и, в частности, считают, что Н3 играет уникальную роль в придании антителам тонкой специфичности. См., например, Xu с соавт., Immunity 13, 2000, 37-45; Johnson и Wu, в кн.: Methods in Molecular Biology 248, 2003, 1-25, под ред. Lo, изд-во Human Press, Тотова, Нью-Джерси. Действительно, природные антитела верблюдов, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными, хотя легкая цепь отсутствует. См., например, Hamers-Casterman с соавт., Nature 363, 1993, 446-448; Sheriff с соавт., Nature Struct. Biol. 3, 1996, 733-736.

Ряд описаний HVR используют в настоящем изобретении. HVR, которые по Kabat являются областями, определяющими комплементарность (complementarity-determining region, CDR), они основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее часто применимыми (Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e изд., 1991, изд-во Public Health Service, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд). Chothia вместо этого ссылается на расположение структурных петель (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, 901-917). HVR моноклональных антител (AbM) представляют собой компромисс между CDR Kabat и структурными петлями Chothia; их используют в программном обеспечении для моделирования антител AbM Oxford Molecular. «Контактные» HVR основаны на анализе доступных сложных кристаллических структур. Остатки каждого из этих HVR указаны ниже.

HVR могут содержать «протяженные HVR» следующим образом: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) в VH. Остатки вариабельного домена пронумерованы в соответствии с Kabat с соавт., см. выше, для описания каждого из этих протяженных HVR.

Выражения «нумерация остатков вариабельного домена по Kabat» или «нумерация аминокислотных положений по Kabat» и их варианты относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи компиляции антител в Kabat с соавт., см. выше. Используя данную систему нумерации, определенная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или инсерции в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную вставку (остаток 52а по Kabat) после остатка 52 в Н2 и инсертированные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. по Kabat) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной последовательностью по Kabat.

Понятие «экспериментальное животное» не относится к человеку. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экспериментальное животное выбрано из крыс, мышей, хомяков, кролика, верблюдов, лам, приматов (за исключением людей), овец, собак, коров, кур, амфибий, акул и рептилий. В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения экспериментальным животным является кролик.

Эпитоп является областью антигена, которая объединена с сайтом связывания антитела. Понятие «эпитоп» включает какую-либо детерминанту, способную специфически связываться с антителом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения детерминанты эпитопов включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, гликановые боковые цепи, фосфорил или сульфонил, и в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения могут быть определенные трехмерные структурные свойства и/или определенные характеристики заряда.

Используемые в настоящем изобретении понятия «связывание» и «специфическое связывание» относятся к связыванию антитела с эпитопом антигена в анализе in vitro, в частности в анализе методом плазмонного резонанса (фирма BIAcore, GE-Healthcare Уппсала, Швеция) с очищенным антигеном. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело специфически связывается с антигеном, когда оно предпочтительно распознает антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.

Сродство связывания антитела с антигеном определяют в понятиях k_a (константа скорости для ассоциации антитела в комплексе антитело/антиген), (константа скорости диссоциации) и K_D (k_d/k_a). В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывание или то, что конкретно связывается, означает аффинность (связывающее сродство) (K_D) 10^-7 моль/л или менее, в одном варианте осуществления настоящего изобретения от 10^-7 М до 10^-13 моль/л. Таким образом, мультиспецифическое антитело во всех его объектах и вариантах осуществления, предусмотренных в настоящем изобретении, специфически связывается с каждым целевым антигеном, для которого оно является специфичным, со связывающим сродством (K_D) 10^-7 моль/л или менее, например, со связывающим сродством (K_D) от 10^-7 до 10^-13 моль/л. В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающее сродство (K_D) составляет от 10^-8 до 10^-13 моль/л. В связи с этим целевой антиген может представлять собой одну молекулу или разные молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения целевой антиген представляет комплекс, образованный двумя или несколькими различными молекулами, где мультиспецифическое антитело специфически связывается с комплексом со связывающим сродством (K_D) 10^-7 моль/л или менее.

В настоящем изобретении понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» относятся к препарату молекул антитела одной аминокислотной композиции. Рекомбинантное антитело согласно всем предусмотренным объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, относятся к понятию «моноклональное антитело».

Понятие «химерное» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело по всем объектам и вариантам осуществления, описанным в настоящем изобретении, может содержать часть Fab_H:Fab_L, происходящую от первого вида, и часть Fc_H от второго вида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело содержит множество отличительных свойств с различными участками Fab_H:Fab_L, полученными от разных источников или видов.

Понятия «сайт связывания» или «антигенсвязывающий сайт», используемые в настоящем изобретении, означают область (области) молекулы антитела, с которой лиганд (например, его антиген или антигенный фрагмент) фактически связывается, и которая происходит от антитела. Антигенсвязывающий сайт включает вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи антитела (VL) или пары VH/VL.

Антигенсвязывающие сайты, которые специфически связываются с нужным антигеном, могут быть получены а) из известных антител, специфически связывающихся с соответствующим целевым антигеном, или б) из новых антител или фрагментов антител, полученных методами иммунизации de novo с использованием, среди прочего, либо белка антигена, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок в качестве целевого антигена или его фрагменты, или путем фагового дисплея.

Антигенсвязывающий сайт антитела, включая рекомбинантное антитело, описанное во всех объектах и вариантах осуществления настоящего изобретения, может содержать шесть областей, определяющих комплементарность (CDR), которые в различной степени способствуют сродству сайта связывания с эпитопом антигена. Существует три CDR вариабельного домена тяжелой цепи (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и три CDR вариабельного домена легкой цепи (CDRL1, CDRL2 и CDRL3). Степень CDR и каркасных областей (FR) определяют путем сравнения с составленной базой данных аминокислотных последовательностей, в которых эти области были определены в соответствии с вариабельностью среди этих последовательностей. Также в рамках охвата настоящего изобретения находятся функциональные сайты связывания антигена, состоящие из меньшего количества CDR (т.е. где специфичность связывания определяется тремя, четырьмя или пятью CDR). Например, для связывания может быть достаточно менее 6 CDR. В некоторых случаях достаточно домена VH или VL.

«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) из каких-либо видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух различных типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. Легкая цепь дикого типа обычно содержит два домена иммуноглобулина, обычно один вариабельный домен (VL), который важен для связывания с антигеном, и константного домена (CL).

Существует несколько различных типов «тяжелых цепей», которые определяют класс или изотип антитела. Тяжелая цепь дикого типа содержит серию доменов иммуноглобулинов, обычно с одним вариабельным доменом (VH), который важен для связывания антигена, и несколькими константными доменами (CH1, СН2, СН3 и т.д.).

Понятие «домен Fc» используют в настоящем изобретении для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Например, в природных антителах домен Fc состоит из двух идентичных фрагментов белка, полученных из второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей антитела в изотипах IgG, IgA и IgD; Fc-домены IgM и IgE содержат три константных домена тяжелой цепи (домены СН 2-4) в каждой полипептидной цепи. В настоящем изобретении понятие «лишенный домена Fc» означает, что биспецифические антитела по настоящему изобретению не содержат домен СН2, СН3 и СН4; то есть константная тяжелая цепь состоит исключительно из одного или нескольких доменов СН1.

В контексте настоящего изобретения понятия «вариабельные домены» или «вариабельная область» означают каждую из пары легких и тяжелых цепей, которая непосредственно участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельный домен легкой цепи обозначен как «VL», а вариабельный домен легкой цепи обозначен как «VH». Вариабельные домены легких и тяжелых цепей человека имеют одинаковую общую структуру. Каждый вариабельный домен включает четыре каркасные области (FR), последовательности которых в высокой степени консервативны. FR связаны тремя «гипервариабельными областями» (или «областями, определяющими комплементарность», complementarity determining region, CDR). CDR в каждой цепи разделены такими аминокислотами каркасных областей. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. FR принимает конформацию β-листа, и CDR могут образовывать петли, соединяющие структуру β-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в их трехмерной структуре с помощью FR и вместе с CDR из другой цепи образуют «антигенсвязывающий сайт». CDR3 тяжелой цепи является областью, которая в наибольшей степени способствует связыванию антигена. Области CDR и FR определяются в соответствии со стандартным определением Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e изд., 1991, изд-во Public Health Service, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд.

Понятие «константные домены» или «константная область», используемый в настоящей заявке, означает сумму доменов антитела, отличных от вариабельной области. Константная область не участвует непосредственно в связывании антигена, но проявляет различные эффекторные функции.

В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела делят на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Константные области легкой цепи (CL), которые можно найти во всех пяти классах антител, обозначают κ (каппа) и λ (лямбда). В настоящем изобретении понятие «константные домены» являются константными доменами человека, происходящими от константной области тяжелой цепи антитела человека подкласса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и/или константной области каппа или лямбда легкой цепи. Такие константные домены и области известны в данной области и описаны, например, в работе Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e изд., 1991, изд-во Public Health Service, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд.

В контексте настоящего изобретения понятие «третичная структура» относится к геометрической форме антитела по настоящему изобретению. Третичная структура содержит каркас полипептидной цепи, содержащей домены антитела, а боковые аминокислотные цепи взаимодействуют и связываются рядом методов.

Мультивалентное антитело по настоящему изобретению получают методами рекомбинации. Методы рекомбинантного получения антител широко известны в данной области и включают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением антитела и, как правило, очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии антител в клетке-хозяине нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие легкую и тяжелую цепи, как описано в настоящем изобретении, инсертируют в векторы экспрессии стандартными методами. Экспрессия осуществляется в соответствующих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки СНО, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки HEK293, клетки COS, клетки PER.C6, дрожжи или клетки Е. coli, и антитело извлекают из клеток (супернатанта или клеток после лизиса). Общие методы рекомбинантного получения антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.С., Protein Expr. Purif. 17, 1999, 183-202; Geisse S. с соавт., Protein Expr. Purif. 8, 1996, 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, 151-161; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, 870-880.

В контексте настоящего изобретения понятие «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо; оно относится к полимерам нуклеотидов какой-либо длины и представляет ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или каким-либо субстратом, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или реакцией синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Последовательность нуклеотидов может быть прервана компонентами, не являющимися нуклеотидами. Полинуклеотид может содержать модификацию (модификации), произведенные после синтеза, например, полученные конъюгацией с меткой. Другие типы модификаций включают, например, «кэпы», замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), содержащие боковые фрагменты, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, ply-L-лизин и т.д.), содержащие интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), содержащие алкилаторы, содержащие модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и др.), а также немодифицированные формы полинуклеотида (полинуклеотидов). Кроме того, какая-либо из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми или полутвердыми носителями. 5'- и 3'-концевой ОН может быть фосфорилирован или замещен аминами или фрагментами органических кэпирующих групп, содержащих от 1 до 20 атомов углерода. Также могут быть получены производные других гидроксилов с получением стандартных защитных групп. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы Сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые обычно известны в данной области, включая, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил-, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, аналоги карбоциклического сахара, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и основные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или несколько фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, но ими перечень не ограничивают, такие варианты, в которых фосфат заменен на P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR2 («амидат»), P(O)R, P(O)OR', СО или СН2 («формацеталь»), в которых каждый R или R' независимо является Н или замещенным или незамещенным алкилом (1-20 С), необязательно содержащим эфирную (- О-) связь, арилом, алкенилом, циклоалкилом, циклоалкенилом или аралдилом. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание относится ко всем полинуклеотидам, указанным здесь, включая РНК и ДНК.

Понятие «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента естественной окружающей ее среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в таком месте хромосомы, которое отличается от ее естественного хромосомного расположения.

В контексте настоящего изобретения понятие «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной размножать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Понятие включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Понятие включает векторы, которые функционируют, главным образом, для встраивания ДНК или РНК в клетку (например, хромосомная интеграция), репликации векторов, которые функционируют главным образом для репликации ДНК или РНК, и векторы экспрессии, функция которых заключается в осуществлении транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Также в понятие включены векторы, которые обеспечивают более одной из описанных функций.

«Вектор экспрессии» является вектором, способным направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми он функционально связан. Когда вектор экспрессии интродуцируют в соответствующую клетку-хозяина, он может транскрибироваться и транслироваться в полипептид. При трансформации клеток-хозяев способами по настоящему изобретению используют «векторы экспрессии»; тем самым понятие «вектор» в связи с трансформацией клеток-хозяев, как описано в настоящем изобретении, означает «вектор экспрессии». «Система экспрессии» обычно относится к соответствующей клетке-хозяину, состоящей из вектора экспрессии, который может функционировать для получения необходимого продукта экспрессии.

В контексте настоящего изобретения понятие «экспрессия» относится к процессу, посредством которого нуклеиновую кислоту транскрибируют в мРНК, и/или к процессу, посредством которого транскрибированная мРНК (также называемая транскриптом) впоследствии транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и закодированные полипептиды вместе называют генным продуктом. Если полинуклеотид является производным геномной ДНК, экспрессия в эукариотической клетке может включать сплайсинг мРНК.

В контексте настоящего изобретения понятие «трансформация» относится к процессу переноса векторов/нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Если в качестве клеток-хозяев используются клетки без труднопреодолимых барьеров клеточной стенки, то проводят трансфекцию, например, методом осаждения фосфатом кальция, согласно описанному Graham и Van der Eh, Virology 52, 1978, 546ff. Однако также могут быть использованы другие методы интродукции ДНК в клетки, например, ядерная инъекция или слияние протопластов. Если используют прокариотические клетки или клетки, которые содержат трудно преодолимую клеточную стенку, одним из методов трансфекции является, например, обработка кальцием, а именно хлоридом кальция, согласно описанному Cohen F.N. с соавт., PNAS 69, 1972, 7110 et seq.

Понятие «клетка-хозяин», используемое в настоящем изобретении, означает какую-либо клеточную систему, которая может быть разработана для получения антител в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем изобретении понятия «клетка», «линия клеток» и «культур клеток» используют взаимозаменяемо, и все подобные обозначения также относятся к потомству этих клеток. Таким образом, понятия «трансформанты» и «трансформированные клетки» означают первичную субъектную клетку и полученные из нее культуры без учета количества переносов. Также следует отметить, что все потомство может быть не в полной мере идентичным по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Включены в настоящее понятие варианты потомства, которые имеют ту же функцию или биологическую активность, что и выявленную в первоначально трансформированной клетке. Там, где подразумевают другие определения, следует из контекста.

Экспрессию клеток NS0 описывают, например, в публикациях Barnes L.M. с соавт., Cytotechnology 32, 2000, 109-123; Barnes L.M. с соавт., Biotech. Bioeng. 73, 2001, 261-270. Временную экспрессию описывают, например, в публикациях Durocher Y. с соавт., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, Е9. Клонирование вариабельных доменов описывают в публикациях Orlandi R. с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, 3833-3837; Carter P. соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, 4285-4289; Norderhaug L. с соавт., J. Immunol. Methods 204, 1997, 77-87. Предпочтительная система временной экспрессии (HEK 293) описана в публикациях Schlaeger E.-J. и Christensen K., Cytotechnology 30, 1999, 71-83; Schlaeger E.-J., J. Immunol. Methods 194, 1996, 191-199.

Антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или нескольких, особенно одной или двух, аминокислот с С-конца тяжелой цепи. Следовательно, антитело, вырабатываемое клеткой-хозяином путем экспрессии определенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может включать полноразмерную тяжелую цепь или оно может включать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (также упоминаемый в настоящем документе как расщепленный вариант тяжелой цепи). Например, это может быть, когда последние две С-концевые аминокислоты тяжелой цепи являются глицином (G446) и лизином (K447, нумерация по индексу Kabat EU).

Следовательно, аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включая домены СН3, обозначены в настоящем изобретении без С-концевого глицин-лизинового дипептида, если не указано иное.

Композиции по настоящему изобретению, например, описанные в настоящем изобретении фармацевтические композиции, содержат популяцию антител по настоящему изобретению. Популяция антител может включать антитела, имеющие тяжелую цепь полной длины, и антитела, имеющие тяжелую цепь расщепленного варианта. В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяция антител состоит из смеси антител, имеющих полноразмерную тяжелую цепь, и антител, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи, где, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 90% антител имеют расщепленный вариант тяжелой цепи.

Очистку антител (выделение антител из культуры клеток-хозяев) выполняют для удаления клеточных компонентов или других контаминаций, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, градиент CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области. См. Current Protocols in Molecular Biology, 1987, под ред. Ausubel F. С соавт., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Различные методы, известные и широко применяемые для очистки белков, включают аффинную хроматографию с микробными белками (например, аффинную хроматографию с белком А или белком G), ионообменную хроматографию (например, катионный обмен (карбоксиметиловые смолы), анионный обмен (аминоэтиловые смолы) и обмен в смешанном режиме), тиофильную адсорбцию (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими лигандами SH), гидрофобное взаимодействие или ароматическую адсорбционную хроматографию (например, с фенилсефарозой, азааренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), аффинную хроматографию с хелатом металла (например, с помощью Ni(II)- и Cu(II)-связанного материала), эксклюзионную хроматографию и электрофоретические методы (например, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998,93-102).

Понятие «иммуноконъюгат» означает антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая, но ею не ограничиваясь, выявляемую метку.

Иммуноглобулины являются гликопротеинами, специфически связывающимися с целевыми антигенами. Двухвалентные и моноспецифические иммуноглобулины, например, природные формы IgG, имеют четырехцепочечную структуру в качестве основы. Они состоят из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (Н), скрепленных между собой дисульфидными связями между цепями и нековалентными взаимодействиями. Иммуноглобулин класса IgM представляет исключение в отношении количества тяжелых и легких цепей и в дальнейшем не рассматривается. Легкая цепь образована двумя доменами, переменным и постоянным, а тяжелую цепь формируют один вариабельный домен и три константных домена. Последовательности иммуноглобулинов обычно нумеруют в соответствии с общей схемой (Kabat-Chothia), предназначенной для присвоения одного и того же порядкового номера топологически эквивалентным остаткам (Al-Lazikani В. с соавт., J. Mol. Biol. 273, 1997, 927-948). Это широко распространенный единый стандарт для упорядочения и нумерации остатков антител.

В описании настоящего изобретения, относящемся к модульной конструкции рекомбинантного антитела, можно рассматривать один или несколько доменов или областей иммуноглобулина в качестве элементов конструкции. В контексте настоящего изобретения один элемент выбран из группы, состоящей из «СН1», «СН2», «СН3», «CL», «VH», «VL», «<шарнирной области>» и «L». Каждый из этих отдельных элементов также можно назвать в качестве «основного элемента» тяжелой или легкой цепи при рассмотрении структуры рекомбинантного антитела как объекта настоящего изобретения. Несколько основных элементов могут быть объединены в элемент более высокого порядка, например, «Fc_H», «Fab_H» и «Fab_L», но ими перечень не ограничивается, в результате получают комбинацию основных элементов, представленных в формулах с II по X, соответственно.

Специалистам очевидно, что рекомбинантные технологии позволяют конструировать различные не встречающиеся в природе элементы Fab_H и Fab_L, как показано выше, например, VL-CL_H или VH-CH1_L, но ими перечень не ограничивается. Антитело с заменой CL-CH1 в связывающем плече является примером так называемого CrossMab. Перекрестные моноклональные антитела (CrossMab) подробно описаны в WO 2009/080253 и публикации Schaefer W. С соавт., PNAS, 108, 2011, 11187-11191. Как правило, если явно не указано иное, ориентация каждой группы элементов всегда имеет направление от N-конца с левой стороны до С-конца с правой стороны. Во всех представлениях полипептидных цепей с основными элементами и/или элементами более высокого порядка, «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи. Также следует учитывать, что в описании подмножество элементов тяжелой цепи может быть дано как отдельная позиция (например, X=[-L-Fab_H] или Y=[Fab_H-L-], в зависимости от обстоятельств) с целью конкретного объяснения элементов в подмножестве и/или его признаков. Если не указано иное, какую-либо подгруппу тяжелой цепи, которую обсуждают в настоящем изобретении, считают ковалентно связанной неотъемлемой частью полипептида полной смежной тяжелой цепи. Точно так же легкую цепь всегда упоминают как набор элементов, таких как формулы с VI по IX, то есть без дополнительных элементов, присутствующих в соответствующей полипептидной цепи, если не указано иное.

Специалисту, знакомому с конструкцией рекомбинантных иммуноглобулинов, известно, что каждый из основных элементов «СН1», «СН2», «СН3», «CL», «VH», «VL», «<шарнирной области>» и «L» отражает функциональную сущность, которая не изменяется при незначительных изменениях аминокислотной последовательности соответствующего элемента. Например, может быть один или несколько нейтральных аминокислотных обменов, или минимальных добавлений или минимальных делеций аминокислот, в частности, концевых добавлений от 1 до 20 аминокислот к какому-либо из основных элементов, однако при условии, что, несмотря на наличие указанных вариаций, формируется функциональный иммуноглобулин в соответствии с первым объектом по настоящему изобретению, то есть выравнивание тяжелых и легких цепей не подвергается отрицательному воздействию и функциональность сайтов связывания антигена не нарушается. То есть, в присутствии нейтральных аминокислотных обменов, или минорных добавлений, или минорных делеций, выравнивание и ковалентное соединение двух тяжелых цепей остаются неизменными, и выравнивание и ковалентное соединение Fab_H:Fab_L остаются неизменными, а также специфичность и чувствительность связывания антигена неизменны. В этом отношении значения понятий «ненарушенный» и «неизменный» находятся в диапазоне от 95% до 100% каждого отдельного соответствующего свойства по сравнению со свойством соответствующего иммуноглобулина без какой-либо из указанных вариаций.

В контексте настоящего изобретения основная архитектура «изотипа обычного Ig» представлена архитектурой встречающегося в природе моноспецифического и двухвалентного антитела изотипа, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA и IgD, где антитело содержит два полипептида тяжелой цепи иммуноглобулина формулы XI

и два Fab_L легких цепей иммуноглобулина, где « » означает ковалентную связь в полипептидной цепи; где Fc_H означает часть тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую N-концевой шарнирный домен (=<шарнирная область>), за которой следует константный домен 2 тяжелой цепи (=СН2) и С-концевой константный домен 3 тяжелой цепи (=СН3); и где каждый Fab_H является частью VH-CH1 тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащей N-концевой вариабельный домен тяжелой цепи (=VH) и С-концевой константный домен 1 тяжелой цепи (=СН1); где каждый Fab является VL-CL легкой цепи иммуноглобулина, содержащей с N-конца вариабельный домен легкой цепи (=VL) и с С-конца константный домен легкой цепи (=CL); где в антителе соответствующие шарнирные домены, СН2 и СН3, двух тяжелых цепей выровнены друг с другом, и соответствующие шарнирные домены двух тяжелых цепей ковалентно связаны друг с другом через одну или несколько дисульфидных связей; где каждый антигенсвязывающий сайт Fab_H:Fab_L антитела представляет собой выровненную пару части тяжелой цепи иммуноглобулина VH-CH1 и легкой цепи иммуноглобулина VL-CL, где в каждой паре соответствующие CL и CH1, a VL и VH выровнены относительно друг друга, и в каждой паре соответствующие VL-CL и VH-CH1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

Рекомбинантно сконструированные примеры и установленные варианты моноспецифического и двухвалентного антитела общепринятого изотипа Ig, известного специалисту в данной области, включают антитела с Fab_H, который выбран из группы, состоящей из

где VH является вариабельным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, VL является вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина, СН1 является константным доменом 1 тяжелой цепи иммуноглобулина и является константным доменом легкой цепи иммуноглобулина;

и каждый Fab_L независимо выбран из группы, состоящей из

где сайт связывания Fab_H:Fab_L антитела является выравненной парой, выравнивание обозначено знаком «:», где выровненная пара независимо выбрана из группы, состоящей из

[VL-CH1]_H:[VH-CL]_L,

[VL-CL]_H:[VH-CH1]_L,

[VH-CH1]_H:[VL-CL]_L,

[VH-CL]_H:[VL-CH1]_L,

и где в выровненной паре соответствующие CL и СН1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

Особое техническое преимущество, касающееся использования антитела, специфического в отношении исследуемого вещества, для обнаружения исследуемого вещества в качестве мишени в сложной смеси, было обнаружено при экспериментальном расширении обычной базовой архитектуры путем добавления/присоединения дополнительных специфических в отношении исследуемого вещества единиц Fab_H:Fab_L. Неожиданно было обнаружено, что удлинение антитела путем добавления дополнительных сайтов связывания антигена Fab_H:Fab_L на участке Fc обеспечивает дополнительное преимущество в отношении связывающих свойств рекомбинантного антитела. Кроме того, расширение каждого плеча антитела путем добавления дополнительных сайтов связывания антигена Fab_H:Fab_L также улучшает связывающие свойства. В результате, по сравнению с обычной молекулой IgG одно мультивалентное рекомбинантное антитело характеризуется повышенной величиной, касающейся отношения поверхности антигенсвязывающих областей к поверхности не связывающих антиген областей. Особое преимущество заключается в улучшенном соотношении сигнал/шум, когда описанное в настоящем изобретении антитело применяют в качестве агента захвата и/или обнаружения, например, в сэндвич-иммуноанализе для выявления антигена.

Таким образом, в качестве первого объекта, относящегося ко всем другим объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, предусматривают химерное или не химерное поливалентное рекомбинантное антитело, причем антитело содержит р полипептидов легкой цепи Fab_L и димер двух полипептидов тяжелой цепи, где каждый полипептид тяжелой цепи имеет структуру формулы I

в которой

(и) р означает число, выбранное из 6, 8 и 10,

каждое значение m и n выбирают независимо из целых чисел от 1 до 3,

каждое значение m и n выбирают таким образом, что величина р равна (2+2×(n+m));

(к) знак «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи;

(л) каждый L является необязательным и, если присутствует, является независимо выбранной вариабельной линкерной аминокислотной последовательностью;

(м) каждый dd(Fc_H) является областью димеризации тяжелой цепи тяжелой цепи области иммуноглобулина, не связывающей антиген;

(н) в димере два dd(Fc_H) выравнены относительно друг друга в физической близости;

(о) каждый Fab_H независимо выбран из А_Н и В_Н, где А_Н и В_Н разные, и А_Н и В_Н независимо выбраны из группы, состоящей из

где

VH является N-концевым вариабельным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина,

VL является N-концевым вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина,

СН1 является С-концевым константным доменом 1 тяжелой цепи иммуноглобулина, и

CL является С-концевым константным доменом легкой цепи иммуноглобулина;

(п) каждый Fab_L независимо выбран из A_L и B_L, где A_L и B_L разные, и A_L и B_L независимо выбраны из группы, включающей

(р) каждый антигенсвязывающий сайт Fab_H:Fab_L антитела является выравненной парой (выравнивание обозначено знаком «:»), где каждая выровненная пара независимо выбрана из группы, состоящей из A_H:A_L и B_H:B_L, причем A_H:A_L и B_H:B_L выбраны независимо из группы, состоящей из

[VL-СН1]_Н:[VH-CL]_L,

[VL-CL]_H:[VH-CH1]_L,

[VH-CH1]_H:[VL-CL]_L,

[VH-CL]_H:[VL-CH1]_L,

и где в каждой выровненной паре соответствующие CL и СН1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

В настоящем изобретении рекомбинантное антитело не является двухвалентным, как обычное антитело одного из классов иммуноглобулинов IgA, IgD, IgE или IgG, оно мультивалентно. В рекомбинантном мультивалентном антителе по настоящему изобретению легкие цепи подобны или идентичны легким цепям природных иммуноглобулинов. Важно отметить, что именно конструкция тяжелой цепи рекомбинантного иммуноглобулина обеспечивает связывание мультивалентного антигена путем получения множества элементов Fab_H в каждой тяжелой цепи. Новое рекомбинантное антитело, описываемое во всех объектах и вариантах осуществления настоящего изобретения, характеризуется модульной конструкцией, которая объединяет 4 или более сайтов связывания антигена (=Fab=Fab_H:Fab_L) в одной молекуле антитела. Точнее, в настоящем изобретении предусматривают рекомбинантное мультивалентное антитело, имеющее ряд сайтов связывания антигена, обозначенных в величине р, представленной выше в формуле I, где р является целым числом, которое может быть выбрано из группы, состоящей из 6, 8 и 10, и, необязательно, 12. То есть, в одной тяжелой цепи число содержащихся элементов Fab_H равно р/2, то есть целое число, выбранное из группы, состоящей из 3, 4, 5 и, необязательно, 6.

Значения m и n выбирают независимо, и каждое из m и n выбирают так, что значение р равно (2+2×(n+m)). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения значение m выбирают из группы целых чисел, состоящей из 0, 1, 2, 3 и 4. Точнее, m выбирают из группы целых чисел, состоящей из 1, 2, 3 и 4. Более конкретно, m выбирается из группы целых чисел, состоящей из 1, 2 и 3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения n выбирают из группы целых чисел, состоящей из 0, 1, 2, 3 и 4. Точнее, n выбирают из группы целых чисел, состоящей из 1, 2, 3 и 4. Еще точнее, n выбирают из группы целых чисел, состоящей из 1, 2 и 3.

Например, в варианте осуществления настоящего изобретения, где р равно 6, оба значения m и n равны 1. В варианте осуществления настоящего изобретения, где р равно 8, либо n равно 1, и m равно 2, либо n равно 2, и m равно 2. В варианте осуществления, где р равно 10, значение n равно 1, 2 или 3, a m равно 3, 2 или 1, соответственно. В варианте осуществления настоящего изобретения, где р равно 12, n равно 1, 2, 3 или 4 и m равно 4, 3, 2 или 1, соответственно.

Рекомбинантное антитело, относящееся ко всем объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, содержит домены иммуноглобулина, элементы иммуноглобулина и области иммуноглобулина (а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состоит исключительно из них) в соответствии с модульной конструкцией, описанной в настоящем изобретении.

Рекомбинантное антитело, относящееся ко всем объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, содержит выровненные тяжелые цепи формулы I. Каждая тяжелая цепь состоит из структурных элементов, начиная с N-конца в определенном порядке в направлении к С-концу тяжелой цепи.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело, относящееся ко всем описанным объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, является химерным и содержит элементы от разных видов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантное антитело, относящееся ко всем описанным объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, является не химерным и содержит элементы, полученные из одного и того же вида.

Рекомбинантное антитело, относящееся ко всем объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, характеризуется модульной конструкцией, которая объединяет структурные элементы константных доменов Fc_H тяжелых цепей иммуноглобулина, которые известны в данной области. В молекуле иммуноглобулина в ее нативной (т.е. не сконструированной) форме полипептид Fc_H тяжелой цепи состоит из константных доменов СН2 и СН3 в качестве основных элементов. К домену СН2 с N-конца присоединяют домен <шарнирная область>, обеспечивающий группы цистеин-SH для поперечных сшивок тяжелых цепей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения часть Fc_H рекомбинантного антитела содержит сборку доменов в соответствии с формулой X, <шарнирная область>-СН2-СН3 иммуноглобулина принадлежит к классу, выбранному из группы, состоящей из IgG, IgA и IgD. В более конкретном варианте осуществления часть Fc_H представлена аминокислотной последовательностью, происходящей от видов млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из человека, мыши, крысы, овцы и кролика.

В более общем смысле, элемент высшего порядка Fc_H является вариантом домена димеризации тяжелой цепи области иммуноглобулина, не связывающей антиген, обозначаемой в настоящем изобретении dd (FcH). Основное значение имеет то обстоятельство, что dd(Fc_H) облегчает выравнивание и соединение двух полипептидов тяжелой цепи, которые являются частью мультивалентного рекомбинантного антитела по описанию настоящего изобретения. Связь в этом отношении может быть полностью обусловлена физическими силами, например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения dd(Fc_H) содержит один элемент СН3, способный образовывать комплекс СН3/СН3, как в спаренных тяжелых цепях молекулы IgG. В настоящем изобретении вариант dd(Fc_H) является доменом, содержащим один или несколько элементов, выбранных из группы, состоящей из СН3, <шарнирной области>-СН3 и <шарнирной области>-СН2-СН3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения dd(Fc_H) является доменом, состоящим из одного элемента, выбранного из группы, состоящей из СН3, <шарнирной области>-СН3 и <шарнирной области>-СН2-СН3. При наличии шарнирной области соединение двух тяжелых цепей осуществляется не только физическими силами, но и за счет дисульфидных мостиков между остатками цистеина в шарнирной области в первой и второй тяжелой цепи мультивалентного рекомбинантного антитела согласно описанию настоящего изобретения.

Часть Fc_H тяжелой цепи может быть удлинена на N-конце линкерной аминокислотной последовательностью L, которая является необязательной и, если присутствует, представляет собой независимо выбранную вариабельную аминокислотную последовательность линкера.

Как правило, в контексте настоящего изобретения, в связи со всеми объектами и вариантами его осуществления, «аминокислотная последовательность линкера», обозначаемая «L», представляет собой пептидную последовательность, содержащую от 1 до 60 аминокислотных остатков, которая соединяет два домена полипептида, который содержит множество доменов, в частности, множество разных доменов. В тяжелой цепи рекомбинантного антитела, описанного в настоящем изобретении, аминокислотные последовательности линкера рассматривают в качестве необязательных элементов, расположенных в разных местах, как представлено в формуле I.

Аминокислотная последовательность линкера обычно состоит из гибких остатков, таких как глицин и серии, таким образом, что смежные домены полипептида могут свободно перемещаться относительно друг друга. Более длинные последовательности могут быть особенно полезны, если необходимо добиться, чтобы два соседних домена не мешали друг другу стерически. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкерная аминокислотная последовательность содержит, более конкретно, остатки глицина и серина. Аминокислоты глицин и серии являются цвиттер-ионными и гидрофильными. Эти свойства делают их частым выбором для повторяющейся последовательности линкера. Таким образом, в еще более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения каждая аминокислотная последовательность линкера в тяжелой цепи рекомбинантного антитела, относящаяся ко всем объектам и вариантам осуществления, которые описаны в настоящем изобретении, включает независимо выбранную вариабельную аминокислотную последовательность линкера, выбранную из группы формулы XII,

где u является целым числом, выбранным от 1 до 10, q является целым числом от 1 до 5 и r является целым числом от 1 до 10. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения каждая линкерная аминокислотная последовательность содержит независимо выбранную вариабельную линкерную аминокислотную последовательность формулы XII, где и равно 3 или 4, q равно 1 и значение r выбрано из группы, состоящей из 3, 4, 5 и 6. Очень специфическая линкерная аминокислотная последовательность включает, еще более конкретно, состоит из аминокислотной последовательности GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 1). Специалисту в данной области понятно преимущество альтернативных повторяющихся последовательностей, содержащих глицин и серии, которые также служат той же технической цели. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения выбранной линкерной аминокислотной последовательностью является (GSAT)₁, (GSAT)₂, (GSAT)₃ или (GSAT)₄. В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения выбранной линкерной аминокислотной последовательностью является (SEG)₁, (SEG)₂, (SEG)₃ или (SEG)₄.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения выбранной линкерной аминокислотной последовательностью является (EAAAR)₁, (EAAAR)₂, (EAAAR)₃, (EAAAR)₄ или (EAAAR)₅ (Merutka G. с соавт., Biochem. 30, 1991, 4245-4248; Sommese R.F. с соавт., Protein Sci. 19, 2010, 2001-2005; Yan W. с соавт., Biochem. 46, 2007, 8517-8524). В этом контексте специалист понимает, что элементы EAAR являются примерами более жесткого линкера, чтобы два присоединенных домена с обоих концов не сближались.

Расширение Fc_H-части с N-конца домена СН1, соединенного с шарнирным доменом (<шарнирной областью>), происходит необязательно через линкер L. Однако в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь формулы I содержит смежную часть СН1-<шарнирная область>-СН2-СН3, полученную из изотипа иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA и IgD. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен СН1 и часть <шарнирной области>-СН2-СН3 представлены аминокислотной последовательностью, происходящей от видов млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из человека, мыши, крысы, овцы и кролика. Примеры частей СН1 и <шарнирной области>-СН2-СН3 включают соответствующие аминокислотные последовательности, представленные в табл. А.

Несмотря на различия в аминокислотах между изотипами и подклассами внутри изотипа, каждая область СН в тяжелой цепи иммуноглобулина складывается в постоянную структуру, состоящую из трехцепочечного бета-листа из четырех нитей, связанных вместе внутрисистемной дисульфидной связью (Schroeder H.W., Cavacini L. J Allergy Clin Immunol. 125, 2010, S41-S52).

В настоящем изобретении модульная структура также предполагает, что в тяжелой цепи рекомбинантного антитела, как предусмотрено во всех объектах и вариантах осуществления настоящего изобретения, один или несколько элементов СН1 могут быть замещены элементом CL. Типичные элементы CL включают соответствующие аминокислотные последовательности, представленные в таблице Б. Легкие цепи иммуноглобулина классифицируют как каппа или лямбда в соответствии с их серологическими свойствами и последовательностями. Хотя в таблице приведены аминокислоты для каппа-доменов CL, подразумевают, что лямбда-домены CL не исключаются из выбора константных элементов для создания части тяжелой цепи Fab_H.

Специалистам известно, что возможны незначительные изменения аминокислотных последовательностей, представляющих область СН, которые не будут влиять на структурные особенности этих доменов.

Вариабельные домены определяют специфичность антигена. Большая часть разнообразия вариабельных доменов находится в трех областях от каждой (тяжелой и легкой) цепи, называемых гипервариабельными областями или CDR. Они названы в соответствии с цепочкой, к которой они относятся, и в порядке их расположения в последовательности (L1, L2, L3, H1, Н2 и Н3). Области между CDR в вариабельной области называют каркасными областями (framework region, FW).

Находящаяся С-конце часть Fc_H рекомбинантного антитела во всех объектах и вариантах осуществления, представленных в настоящем изобретении, может быть удлинена вариабельным доменом, являющимся частью другой порции Fab_H. Между элементом СН3 части Fab_H и соседним вариабельным доменом необязательно расположена линкерная аминокислотная последовательность L. Подробности и варианты осуществления, касающиеся аминокислотной последовательности линкера, приведены выше.

Внутри тяжелой цепи рекомбинантного антитела каждый элемент СН1 или CL объединяется с элементом VH или VL, тем самым образуя часть тяжелой цепи Fab_H. Элементы VH и VL выбраны из ранее исследованных и охарактеризованных в молекулярном плане моноклональных антител, которые направлены против целевого антигена. В этом контексте «молекулярно охарактеризованный» означает, что были определены аминокислотные последовательности доменов VH и VL выбранного ранее известного моноклонального антитела в качестве важной основы для конструирования антитела. Таким образом, во всех объектах и вариантах осуществления элемент Fab_H выбран из группы, состоящей из

В определенном варианте осуществления настоящего изобретения две тяжелые цепи являются идентичными или не идентичными. Примером двух неидентичных тяжелых цепей является конфигурация «выступ-во-впадину», которая направляет спаривание и выравнивание двух тяжелых цепей при внутриклеточной сборке антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения к С- или N-концу одной тяжелой цепи присоединена метка. В более конкретном варианте осуществления метка является аффинной меткой, например, гистидиновой меткой, известной в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения метка присоединена на С-конце и содержит положительно заряженные аминокислоты. В других конкретных вариантах осуществления две тяжелые цепи являются идентичными.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело является моноспецифическим, а сайты связывания антигена являются идентичными или разными.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело является моноспецифическим, а сайты связывания антигена являются производными от единственного исходного моноспецифического моноклонального антитела и представляют сайт связывания антигена Fab_H:Fab_L исходного моноклонального антитела. Соответственно, мультивалентное рекомбинантное антитело содержит либо A_H:A_L, либо B_H:B_L.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело является моноспецифическим, а сайт связывания антигена A_H:A_L способен связываться с первым эпитопом, а сайт связывания антигена B_H:B_L способен связываться со вторым эпитопом, где первый и второй эпитопы являются идентичными. В этом варианте осуществления структурная композиция двух сайтов связывания антигена различна, и они являются производными двух моноспецифических моноклональных антител разного происхождения, каждое из которых связывается с одним и тем же эпитопом, однако с различиями в соответствующих карманах связывания. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело является моноспецифическим, и сайты связывания антигена идентичны или различны, и сайты связывания антигена способны специфически связываться с эпитопом, содержащимся в одной молекуле или в разных молекулах.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело является биспецифическим, то есть антитело содержит A_H:A_L и B_H:B_L, и первый сайт связывания антигена способен специфически связываться с первым эпитопом, и второй сайт связывания антигена способен специфически связываться с отличающимся вторым эпитопом, где первый эпитоп и второй эпитоп содержатся в одной молекуле.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело является биспецифическим, то есть антитело содержит А_Н:A_L и B_H:B_L, и первый сайт связывания антигена способен специфически связываться с первым эпитопом, и второй сайт связывания антигена способен специфически связываться с отличающимся вторым эпитопом, где первый эпитоп содержится в первой молекуле, а второй эпитоп содержится во второй молекуле. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и вторая молекулы являются идентичными или не идентичными. В другом варианте осуществления настоящего изобретения две молекулы содержатся в совокупности или в комплексе.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения мультивалентное антитело связано с выявляемой меткой. В принципе, возможны все метки, известные специалистам в области разработки иммуноанализов. В частности, выявляемая метка представляет собой фермент, способный катализировать реакцию субстрата, где вступающий в реакцию субстрат является водорастворимым или нерастворимым красителем. В другом варианте, фермент катализирует реакцию субстрата, в результате чего субстрат генерирует фотонную эмиссию. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения метка является хемилюминесцентным агентом, а именно, электрохемилюминесцентным соединением, способным ковалентно связываться с мультивалентным рекомбинантным антителом. Конкретное электрохемилюминесцентное соединение является соединением рутения (комплекс рутения) согласно описанному, например, в публикации Staffilani М. с соавт., Inorg. Chem. 42, 2003, 7789-7798, и другие соединения, содержащие рутений или иридий (комплекс рутения или иридия), известные в данной области.

В качестве второго объекта, связанного со всеми другими объектами и вариантами осуществления настоящего изобретения, предусматривают применение мультивалентного антитела в анализе с целью определения антигена, где антитело является химерным или не химерным мультивалентным рекомбинантным антителом, где антитело содержит р полипептидов легкой цепи FabL и димер двух полипептидов тяжелой цепи, где каждый полипептид тяжелой цепи имеет структуру формулы I

где

(с) р является величиной, выбранной из группы, включающей 6, 8 и 10,

каждое значение m и n выбирают независимо из целых чисел от 1 до 3,

каждое значение m и n выбирают таким образом, что величина р равна (2+2×(n+m));

(т) знак «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи;

(у) каждый L является необязательным и, если присутствует, является независимо выбранной вариабельной линкерной аминокислотной последовательностью;

(ф) каждый dd(Fc_H) является областью димеризации тяжелой цепи области иммуноглобулина, не связывающей антиген;

(х) в димере два dd(Fc_H) выравнены относительно друг друга в физической близости;

(ц) каждый Fab_H независимо выбран из А_Н и В_Н, где А_Н и В_Н разные, и А_Н и В_Н независимо выбраны из группы, состоящей из

где

VH является N-концевым вариабельным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина,

VL является N-концевым вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина,

СН1 является С-концевым константным доменом 1 тяжелой цепи иммуноглобулина,

CL является С-концевым константным доменом легкой цепи иммуноглобулина;

(ч) каждый Fab_L независимо выбран из A_L и B_L, где A_L и B_L разные, и A_L и B_L независимо выбраны из группы, включающей

(ш) каждый сайт связывания антигена Fab_H:Fab_L антитела является выровненной парой (выравнивание обозначено «:»), где каждая выровненная пара независимо выбрана из группы, состоящей из A_H:A_L и B_H:B_L, где A_H:A_L и B_H:B_L выбирают независимо из группы, состоящей из

[VL-CH1]_H:[VH-CL]_L,

[VL-CL]_H:[VH-CH1]_L,

[VH-CH1]_H:[VL-CL]_L,

[VH-CL]_H:[VL-CH1]_L,

и где в каждой выровненной паре соответствующие CL и СН1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описывают применение, согласно которому методом является сэндвич-анализ, в котором антиген связывается первым захватывающим антителом и вторым детекторным антителом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения применение, в соответствии со всеми другими объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, мультивалентное антитело является захватывающим антителом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывают, в соответствии со всеми другими объектами и описанными вариантами осуществления, применение мультивалентного антитела, которое является меченым детекторным антителом.

В качестве третьего объекта, связанного со всеми другими объектами и вариантами осуществления настоящего изобретения, предусматривают набор, содержащий химерное или не химерное мультивалентное рекомбинантное антитело, описанное в первом объекте настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения набор дополнительно содержит выявляемую метку. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения выявляемую метку прикрепляют к мультивалентному рекомбинантному антителу. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор дополнительно содержит магнитные частицы, покрытые анти-Х специфически связывающим партнером, и захватывающий агент, способный связываться с антигеном, с которым также связывается мультивалентное рекомбинантное антитело, где захватывающий агент конъюгирован с X, и X и анти-Х способны образовывать стабильный комплекс.

В качестве четвертого объекта, связанного со всеми другими объектами и вариантами осуществления настоящего изобретения, предусматривают метод обнаружения антигена, включающий этапы контактирования мультивалентного рекомбинантного антитела, описанного в первом объекте настоящего изобретения, с антигеном, в результате чего образуется комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела с последующим обнаружением сформированного комплекса, тем самым с обнаружением антигена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод включает стадии (а) смешивания мультивалентного рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, (б) инкубирования образца и мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым образуя комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, (в) обнаружения комплекса, образованного на стадии (б), то есть обнаружения антигена. Такое обнаружение в другом варианте осуществления настоящего изобретения является качественным, то есть оно выявляет присутствие или отсутствие антигена в жидком образце. В другом варианте осуществления настоящего изобретения обнаружение является количественным, то есть обнаруживают количество антигена в жидком образце, которое в еще более конкретном варианте осуществления предположительно содержит антиген.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения жидкий образец является водным образцом, точнее жидкостью организма, еще более конкретно, жидкостью организма, выбранной из группы, состоящей из цельной крови, сыворотки, гемолизированной крови, плазмы, сыворотки, мочи, синовиальной жидкости, спинномозговой жидкости, слезной жидкостью, мокроты, слюны, выдыхаемого конденсата, бронхо-альвеолярного лаважа, спермы, женского эякулята, вагинальной смазки, грудного молока, легочного аспирата, амниотической жидкости, лимфы, интерстициальной жидкости, слизи, суспензии кала или очищенного супернатанта кала, гомогената клеток или его очищенного супернатанта, экссудата, пота, перитонеальной жидкости, желчи, плевральной жидкости, перикардиальной жидкости и других.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения четвертый объект, описанный в настоящем изобретении, является методом, включающим стадии (а) смешивания мультивалентного рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, (б) инкубирования образца и мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым образуя комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, (в) иммобилизации комплекса, сформированного на стадии (б), и (г) обнаружения иммобилизованного комплекса, тем самым обнаружения антигена, количественно или качественно.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения четвертый объект, описанный в настоящем изобретении, является методом, включающим стадии (а) смешивания меченого мультивалентного рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, (б) инкубирования образца и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым образуя комплекс антигена и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с меченым мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, (в) иммобилизации комплекса, сформированного на стадии (б), и (г) обнаружения иммобилизованной метки, тем самым обнаруживая антиген. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения этот метод преимущественно выполняют, используя набор по настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выявляемую метку, например, метку, которую можно обнаружить с помощью электрохемилюминесценции, присоединяют к мультивалентному рекомбинантному антителу; метод содержит стадии (а) смешивания меченого мультивалентного рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, (б) инкубирования образца и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), магнитных частиц, покрытых специфическим связывающим партнером анти-Х, и захватывающего агента, способного связывать антиген, с которым также связывается мультивалентное рекомбинантное антитело, причем захватывающий реагент конъюгирован с X, образуя тем самым сэндвич-комплекс из магнитных частиц с покрытием, захватывающего реагента, антигена и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с как меченым мультивалентным рекомбинантным антителом, так и с захватывающим реагентом во время инкубирования, (в) иммобилизации сэндвич-комплекса, сформированного на стадии (б), и (г), обнаружения иммобилизованной метки, тем самым обнаружения антигена. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения этот метод преимущественно выполняют с использованием набора по настоящему изобретению.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описываемый метод включает стадии добавления меченого мультивалентного рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению к твердой фазе, предположительно содержащей на поверхности антиген, инкубирования твердой фазы и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым формируя комплекс антигена и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с меченым мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, с последующей промывкой твердой фазы, удаляя тем самым не сформировавшее комплекс меченое мультивалентное рекомбинантное антитело с последующим обнаружением метки на твердой фазе, таким образом обнаруживая антиген. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения твердая фаза способна захватывать антиген, и перед этапом (а) выполняют стадию контакта твердой фазы с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, где антиген захватывается твердой фазой если антиген присутствует и доступен для захвата твердой фазой.

Ниже приводятся примеры и фигуры, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что могут быть произведены модификации в изложенных процедурах без отклонения от сущности настоящего изобретения.

Описание фигур

Фиг. 1. А. схематическое изображение олигомера фрагментов антитела, химически связанных друг с другом. Б. показывает SEC хроматографию, представляющую результат примера эксперимента по перекрестному сшиванию, используя фрагменты F(ab')2 для получения олигомеров. Подробности см. в примере 2.

Фиг. 2. А. схематическое изображение олигомера фрагментов антитела, химически связанных друг с другом. Б. показывает двухвалентное моноклональное антитело изотипа IgG -. В. показывает мультивалентное антитело с четырьмя сайтами связывания антигена. Г. показывает мультивалентное антитело с шестью сайтами связывания антигена. Д. показывает мультивалентное антитело с восьмью сайтами связывания антигена. Е. показывает мультивалентное антитело с двенадцатью сайтами связывания антигена.

Фиг. 3. А. показывает карту типичного вектора экспрессии для тяжелой цепи мультивалентного антитела. Б. показывает карту примера вектора экспрессии для легкой цепи. Для получения дополнительной информации см. пример 3.

Фиг. 4. SEC хроматограммы. Для получения дополнительной информации см. примеры 4 и 5.

Фиг. 5. SEC хроматограммы. Для получения дополнительной информации см. пример 5.

Фиг. 6. PAGE электрофореграмма. Для получения дополнительной информации см. пример 5.

Фиг. 7. Нормализованные величины сигнал/шум антител с меткой. Для получения дополнительной информации см. пример 9.

Фиг. 8. SEC хроматограммы стандартного и мультивалентного антитела TN-T согласно описанию в примере 11.

Фиг. 9. SEC хроматограммы стандартного и мультивалентного антитела против антигена HIV р24 согласно описанию в примере 12, моноспецифическое 2Е7.

Фиг. 10. SEC хроматограммы стандартного и мультивалентного антитела против антигена HIV р24 согласно описанию в примере 12, моноспецифическое 6D9.

Фиг. 11. SEC хроматограммы стандартного и мультивалентного антитела против антигена HIV р24 согласно описанию в примере 12, А. размер маркера, Б. моноспецифическое 6D9, В. биспецифическое 6D9/2E7.

Фиг. 12. Количество сигналов электрохемилюминесценции, генерируемых меченными рутением антителами. Для получения дополнительной информации см. пример 8.

Фиг. 13. SEC хроматограммы стандартного и мультивалентного антитела TN-T согласно описанию в примере 11.

Фиг. 14. SEC хроматограммы стандартных и мультивалентных антител против антигена HIV р24, описанного в примере 12.

Пример 1. Общая информация, методы и техники

Используют стандартные методы, известные в данной области. Методы молекулярного клонирования описаны, например, в кн.: Sambrook J. «The condensed protocols from Molecular cloning: A laboratory manual», 2006, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press. Методы получения рекомбинантных антител, описанные, например, в «Monoclonal Antibodies. Methods in Molecular Biology» под ред. Ossipow V. и Fischer N., 2014, том 1131, изд. Springer. Методы химии белков описаны, например, в кн.: Hermanson G. «Bioconjugate Techniques», 3е изд., 2013, изд-во Academic Press. Методы биоинформатики описаны в кн.: «Bioinformatics» под ред. Keith J.M., том I и том II; в кн.: "Methods in Molecular Biology», 2017, том 1525 и том 1526, изд-во Springer; Martin A.C.R., Allen J. в кн.: «Handbook of Therapeutic Antibodies», 2014, под ред. Dubel S. и Reichert J.M., изд-во Wiley-VCH. Иммуноанализ и близкие методы рассмотрены в кн.: «The Immunoassay Handbook», 2013, 4е изд., под ред. Wild D., изд-во Elsevier. Комплексы рутения в качестве электрохемилюминесцентных рассматривают, например, в публикации Staffilani М. с соавт., Inorg. Chem. 42, 2003, 7789 7798. Обычно для осуществления иммуноанализов, основанных на электрохемилюминесценции (electrochemiluminescence, ECL), используют анализатор Elecsys 2010 или прибор следующей модели выпуска, например, анализатор Roche (фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия), например, Е170, модуль cobas е 601, модуль cobas е 602, модуль cobas е 801 и cobas е 411, а также анализы Roche Elecsys, которые были разработаны для этих анализаторов, каждый из которых используют в стандартных условиях, если не указано иное.

Пример 2. Ранее установленный рабочий процесс для получения спецификатора для применения в иммуноанализе

Используя разработанные методы и протоколы, моноклональное антитело изотипа IgG с желаемой специфичностью и свойствами связывания с мишенью получают методом рекомбинации с использованием клеток гибридомы или трансформированных клеток-хозяев млекопитающих, где клетки, продуцирующие антитело, секретирует его в супернатант. Получают различные антитела, например, происходящие от человека, мыши, овцы или кролика. В каждом случае соответствующее антитело очищают от супернатанта, используя хроматографические методы и фракционирование.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный IgG подвергают ферментативному расщеплению с получением фрагментов Fab или фрагментов F(ab')2. Фрагменты F(ab')2 очищают и тем самым отделяют от частей Fc. Очищенные фрагменты F(ab')2 химически перекрестно сшиты для образования смеси олигомеров с различными молекулярными массами. Фиг. 1А изображает такой олигомер, иллюстрирующий случайность, с которой F(ab')2 объединяются в химическом процессе конъюгации путем перекрестного сшивания. Используя методы хроматографического разделения, смесь фракционируют и объединяют фракции, содержащие олигомеры F(ab')2 желаемого размера.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения очищенный IgG подвергают ферментативному расщеплению с получением фрагментов Fab. Фрагменты Fab очищают и тем самым отделяют от частей Fc. Очищенные фрагменты Fab химически перекрестно сшивают для образования смеси олигомеров с различными молекулярными массами. Используя методы хроматографического разделения, смесь фракционируют и объединяют фракции, содержащие олигомеры Fab желаемого размера.

Необязательно, молекулы IgG олигомеризуют без предварительного ферментативного расщепления.

На фиг. 1Б показано хроматографическое представление результатов примера эксперимента по перекрестному сшиванию с использованием фрагментов F(ab')2 для получения олигомеров, схематично изображенных на фиг. 1А. Важно отметить, что на фиг. 1Б область между пиками, обозначенными (а) и (б), означают олигомеры разных размеров. На практике их собирают как фракции, которые тестируют раздельно и оценивают их пригодность для маркировки и использования в иммуноанализе. Для этой цели технологический процесс, которому подвергают олигомеры, аналогичен технологическому процессу, описанному для мультивалентных рекомбинантных антител в примере 8. То есть, гетерогенную смесь образовавшихся олигомеров фракционируют по размеру, и образцы фракций каждого размера помечают по разных средним плотностям метки на олигомер. Затем соотношение сигнал/шум определяют для каждого меченого образца олигомера, и выбирают образцы с наилучшими характеристиками (то есть те, которые имеют самое высокое соотношение сигнал/шум). Фракции олигомерного размера, соответствующие выбранным образцам, отмечают при плотности в соответствии со значениями, установленными для соответствующих образцов, которые были определены как оптимальные.

Очищенные олигомеры IgG, F(ab')2 или Fab желаемых размеров конъюгируют с обнаруживаемой меткой; обычно метки на основе рутения применяют для создания реагентов для обнаружения. Меченые олигомеры размером, находящимся в желаемом диапазоне размеров, как описано выше, используют в иммуноанализах, где стадию обнаружения проводят путем генерирования сигнала с помощью электрохемилюминесценции (ECL). Пример 3

Вектор экспрессии для получения мультивалентных IgG-производных антител

Примером является конструкция для экспрессии восьмивалентного антитела IgG(P8), как показано на фиг. 2Е. На фиг. 3А показано, что множество последовательностей VH-CH1, фланкированных линкерными последовательностями (например, (G₃S)₄), добавляют вверх и вниз по цепи последовательностей, кодирующих Hinge-CH2-CH3, тем самым формируя тяжелые цепи, кодирующие несколько доменов VH-CH1. На карте вектора кодирующая последовательность тяжелой цепи изображена дважды, во-первых, в виде непрерывно нарисованной стрелки, а во-вторых, в виде комбинации из нескольких стрелок, каждая из которых представляет модульный строительный блок всей тяжелой цепи.

Вектор на фиг. 3А экспрессируется совместно с вектором, показанным на фиг. 3Б. Вектор экспрессии легкой цепи экспрессирует стандартную легкую цепь, состоящую из VL и константного домена (каппа или лямбда).

Фиг. 3А и Б, таким образом, показывают примеры векторов тяжелой и легкой цепей. Строительные блоки, показанные в формуле I, могут быть присоединены, как указано для тех, которые были использованы для экспрессии IgG(P8).

Подобные конструкции получают для совместной экспрессии векторов тяжелых цепей с соответствующими легкими цепями, где векторы тяжелых цепей кодируют разные структуры формулы I

где

(а) каждая величина из m и n выбрана независимо как целое число от 1 до 5, и каждая величина из m и n выбрана так, что величин (2+2×(n+m)) выбрана из группы, состоящей из 6, 8, 10 и 12;

(б) «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи,

(в) каждое обозначение L является необязательным и, если присутствует, является независимо выбранной вариабельной линкерной аминокислотной последовательностью, конкретно, но не исключительно, линкерной аминокислотной последовательность (G₃S)₄;

(г) Fc_H является тяжелой цепью области иммуноглобулина, не связывающей антиген и содержащей N-концевой шарнирный домен; и

(д) каждый Fab_H независимо выбран из А_Н и В_Н, где А_Н и В_Н различны, и А_Н и В_Н независимо выбраны из группы, состоящей из

где

VH является N-концевым вариабельным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина,

VL является N-концевым вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина,

СН1 является С-концевым константным доменом 1 тяжелой цепи иммуноглобулина, и

CL является С-концевым константным доменом легкой цепи иммуноглобулина.

Векторы для экспрессии соответствующих легких цепей, кодирующих полипептиды Fab_L,

где

(а) «-» означает ковалентную связь в полипептидной цепи; и

(б) каждый Fab_L независимо выбирают из A_L и B_L, где A_L и B_L различны, и A_L и B_L независимо выбраны из группы, включающей

Важно, что каждый сайт связывания антигена FabH:FabL антитела должен быть выровненной парой (выравнивание обозначается знаком «:»). Таким образом, последовательности Fab_H и Fab_L, которые экспрессируются совместно в трансформированной клетке-хозяине, выбирают таким образом, чтобы участки Fab_H и Fab_L могли образовывать выровненные пары, и каждую выровненную пару независимо выбирают из группы, состоящей из А_Н:A_L и B_H:B_L, где A_H:A_L и B_H:B_L выбраны независимо из группы, состоящей из

[VL-CH1]_H:[VH-CL]_L,

[VL-CL]_H:[VH-CH1]_L,

[VH-CH1]_H:[VL-CL]_L,

[VH-CL]_H:[VL-CH1]_L.

Также производят указанные выше вариации. Например, элемент высшего порядка Fc_H в тяжелой цепи был сокращен всего лишь до элемента СН3. Кроме того, один или несколько Fab_H, происходящих от другого вида, чем происходит Fc_H, объединяют в экспрессирующий вектор тяжелой цепи, таким образом кодируя химерную тяжелую цепь. В большинстве случаев вектор экспрессии полипептидов легкой цепи содержит одну кодирующую последовательность Fab_L. Однако были также разработаны векторы легкой цепи с двумя разными кассетами экспрессии легкой цепи.

Пример 4. Рекомбинантная экспрессия и очистка мультивалентных рекомбинантных анти-TSH антител

Мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела (thyroid-stimulating hormone, TSH = тиреостимулирующий гормон человека) получают путем рекомбинации. Для целей системного сравнения сайты связывания анти-TSH (A_H:A_L) получают, используя разные конструкции мультивалентных рекомбинантных антител, что показано на фиг. 2В-Е, которые обозначены IgG(P4), IgG(P6), IgG(P8) и IgG(P12), соответственно. Рекомбинантную экспрессию осуществляют временно в клетках эмбриональной почки человека (human embryonic kidney, HEK) или временно или постоянно в клетках СНО. Трансформированные клетки секретируют мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела в культуральном супернатанте без сыворотки, из которого они были выделены.

Подобно исходному двухвалентному анти-TSH моноклональному антителу, мультивалентные анти-TSH могут быть получены с достаточным выходом и без значительных потерь во время очистки культурального супернатанта методом аффинной хроматографии с использованием белка А. В другом варианте, мультивалентные рекомбинантные антитела очищают с использованием ионообменной хроматографии (ion exchange chromatography, IEX), которой подвергают культуральный супернатант.

Процент агрегатов, которые наблюдают во всех протестированных форматах антител, всегда составляет менее 5% от общего белка антител. Связанный с агрегатом пик может быть виден как небольшое плечо слева от соответствующего основного пика, на фиг. 4Б и В.

В табл. 1 показывают выходы экспрессии и количества агрегатов, наблюдаемые путем гель-фильтрации GFC300 или TSK4000 (после хроматографической очистки, как указано). Подробнее о гель-фильтрации также см. пример 5. Ссылка на IgG, приведенная в табл. 1, отражает данные, полученные для исходного двухвалентного анти-TSH моноклонального антитела (TSH = тиреостимулирующий гормон).

Пример 5. Анализ очищенных мультивалентных рекомбинантных антител

Мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела получают и очищают как описано выше в примере 4. Подготовку/выделение с использованием белка А проводят со всеми протестированными антителами. Выделенные двухвалентные и мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела подвергают аналитической эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC). Кроме того, выделенные двухвалентные и мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). В каждом случае моноклональные анти-TSH антитела IgG также выделяют и используют в качестве эталона в аналитических экспериментах.

На фиг. 6 показаны результаты хроматографии PAGE в сравнении с размерами маркерных белков. Примечательно, что можно распознавать тяжелые цепи разных размеров, а также различное количество легких цепей, видимых в виде полос. Гель также демонстрирует чистоту препаратов.

На фиг. 4 показывают результаты экспериментов по эксклюзионной хроматографии (SEC) с хроматографическим материалом TSKgel QC-PAK GFC 300 (фирма Tosoh). На фиг. 4А показан результат калибровки стандарта (маркеры для различных молекулярных масс), в котором шесть пиков представляют следующие маркеры (слева направо): димеры бета-галактозидазы, бета-галактозидаза (465 кДа), IgG овец (150 кДа), Fab овец (50 кДа), легкая цепь миозина (17 кДа), дипептид глицин-тирозин (233 Да).

Что касается мультивалентных рекомбинантных форм МАВ<TSH>клон 1, на фиг. 4Б-Г показаны результаты для IgG (Р4), IgG (Р6) и IgG (Р8), соответственно. На фиг. 4Б и В небольшой пик слева от основного пика интерпретируют как представляющий небольшие количества агрегатов соответствующего рекомбинантного мультивалентного антитела. Примечательно, что дополнительный пик отсутствует на фиг. 4Г, что указывает на то, что агрегаты не выявляются в препаратах при использовании хроматографического материала TSKgel QC-PAK GFC 300 (фирма Tosoh).

Те же эксперименты повторяют с различными хроматографическими материалами. На фиг. 5 показаны результаты, полученные с использованием хроматографического материала TSKgel G4000SWx1 (фирма Tosoh). На фиг. 5А показаны результаты для тех же стандартов, димеров бета-галактозидазы, бета-галактозидазы (465 кДа), IgG овец (150 кДа), Fab овец (50 кДа), легкой цепи миозина (17 кДа), дипептида глицин-тирозин (233 Да).

Пики, которые соответствуют IgG овцы (150 кДа), Fab овцы (50 кДа), не определяются в виде четких отдельных пиков, но демонстрируют широкий пик с плечом справа, соответствующим Fab.

На фиг. 5Б показаны результаты для МАВ<TSH>клон 1 IgG(P8). Плечо слева от основного пика свидетельствует о наличии агрегатов, однако в очень небольших количествах.

Таким образом, был сделан вывод, что рекомбинантно экспрессированные мультивалентные моноспецифические антитела могут быть получены и очищены без значительных усилий и с высокой чистотой.

Пример 6. Характеристика кинетики связывания мишени

Мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела получают и очищают, как описано выше в примере 4. Кинетический анализ проводят при 37°С на приборе GE Healthcare Biacore 4000. Датчик Biacore СМ5 серии S устанавливают в прибор, направляют гидродинамически и налаживают в соответствии с инструкциями производителя. В качестве системного буфера используют HBS-EP (10 мМ HEPES (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,05% (мас./об.) Р20). Буфером для образцов является системный буфер с добавкой 1 мг/мл карбоксиметилдекстрана (CMD, Carboxymethyldextran; фирма Fluka).

Следующую систему захвата устанавливают на биосенсор. Моноклональное антитело захвата против Fc IgG человека иммобилизуют в соответствии с инструкциями производителя с использованием химии NHS/EDC. Впоследствии датчик насыщают 1 М этаноламином, рН 8,5. Иммобилизованные антитела насыщают соответствующим рекомбинантным мультивалентным антителом. Различные точки захвата используют для измерения взаимодействий и для контроля. Полученный рекомбинантным образом антиген TSH крысы разводят в разных пропорциях в буфере для образцов и впрыскивают со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 1 мин. Проводят мониторинг уровня захвата (Capture Level, CL) рекомбинантных антител в единицах ответа (response unit, RU).

В табл. 3 представляют результаты, полученные для различных мультивалентных рекомбинантных антител и IgG для сравнения. KD означает равновесную константу диссоциации между антителом и антигеном, значение которой выражено в [нМ]. Параметр k_on отражает скорость ассоциации, выраженную как [1/мсек], a K_off отражает скорость диссоциации, выраженную как [1/сек]. Параметр t/2_diss описывает время полураспада исследуемого вещества, связанного с антителом, выраженное в [мин]. Соотношение мольного количества антигена, связанного с данным мольным количеством мультивалентного рекомбинантного антитела, выражают в виде соотношения AG/AB.

Обозначение «Е+05» означает известную специалистам величину 10⁵.

Примечательно, что установленные мольные соотношения очень тесно коррелируют с количеством сайтов связывания антигена соответствующего антитела. Из этого результата можно сделать вывод, что мультивалентные рекомбинантные антитела по настоящему изобретению действительно обеспечивают столько функциональных сайтов связывания антигена, сколько заложено в их конструкции. Таким образом, конструкция позволяет просто и воспроизводимо объединять многовалентные функции связывания мишеней (сайты связывания антигена) и фактически отражает прогнозы, основанные на молекулярном конструировании. Это резко контрастирует с мультивалентными олигомерами, полученными с использованием уже известных методов (см. пример 2).

Пример 7. Нанесение метки на мультивалентные рекомбинантные антитела

Конъюгаты рутения получают с увеличением включения метки. Очищенные мультивалентные рекомбинантные антитела используют в экспериментах по нанесению метки. Применяют рекомбинантные антитела, такие же как показано на фиг. 2В-Е, которые обозначают IgG(P4), IgG(P6), IgG(P8) и IgG(P12), соответственно. В экспериментах по нанесению метки различные количества соответствующего антитела реагируют либо с реагентом для нанесения метки трис-бипиридил-рутения, либо с его сульфонатной формой (также называемой «sBPRu»), используя стандартную химию присоединения через сложный эфир NHS. В этих условиях рутениевая метка ковалентно присоединяется к функциональным группам аминокислотных остатков лизина в основной цепи антитела.

Среднее включение метки рутения можно определить как число связанных с белком молекул метки, приходящихся на одно антитело. Это количество можно измерить, отдельно определяя в образце меченого антитела количество белка и количество рутениевой метки. Примерами методологических подходов являются масс-спектрометрия фотометрических определений.

Табл. 4 представляет сравнение различных мультивалентных рекомбинантных антител и IgG относительно скорости включения sBPRu.

Неожиданно было установлено, что специфически антитела Р6 и Р8 показывают особенно высокие значения. Таким образом, Р6 и Р8 обеспечивают особенно эффективную маркировку.

Подобные результаты наблюдают с другими реакциями нанесения метки с использованием других меток, используя стандартную химию присоединения через сложный эфир NHS (N-гидрокси-сукцинимид).

Пример 8. Подсчет сигналов электрохемилюминесценции. генерируемых антителами с меткой рутения

Мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела получают и очищают как описано выше в примере 4.

Анти-TSH Roche Cobas Elecsys анализ по номеру в каталоге Roche 07028091190 проводят в вариациях согласно описанию. Только меченый рутением агент для детекции (олигомерные фрагменты антитела, меченого Ru) в анализе Cobas был заменен рекомбинантным мультимерным антителом со специфической плотностью метки рутения, определенной ранее. Аналогично, IgG используют в качестве эталона. Результаты для IgG и IgG (Р8) как пример изображены на фигуре 12А для калибровки (отсутствие целевого антигена, нулевые измерения) и на фигуре 12Б для измерений с концентрацией целевого антигена 5 мкЕД TSH/мл. На каждой диаграмме ордината представляет силу электрохемилюминесцентного сигнала, то есть количественной оценки света от рутения, зафиксированного прибором Elecsys; абсцисса представляет среднюю плотность включенной метки рутения на единицу антитела.

Данные показывают, что в фоновых экспериментах (антиген TSH отсутствует) увеличение сигнала в качестве функции повышенной плотности метки выше для IgG по сравнению с мультивалентной конструкцией IgG(P8). Сигнал, полученный при отсутствии антигена, также упоминают как «шум».

Сходные результаты наблюдают, когда мишень TSH измеряют при концентрации 5 мкЕД TSH/мл. Значение, измеренное на основе фактически присутствующего антигена, называют «сигналом».

Было обнаружено, что IgG(P8) и IgG могут производить один и тот же шум или сигнал, в результате чего в тестируемых условиях IgG(P8) всегда имеет повышенную плотность метки, чем IgG, который генерирует примерно равноценно большое количество электрохемилюминесцентного свечения.

Этот результат интерпретируют в качестве указания на то, что меченый IgG(P8) способен генерировать технически более выгодное соотношение сигнал/шум, в отличие от IgG.

Таблица 5 представляет значения измерений, полученных для IgG, которые являются основой для графиков на фиг. 12А.

С/Ш: соотношение сигнал/шум

Включение рутения означает среднее количество метки Ru на антитело. Таблица 6 представляет значения измерений, полученных для IgG(P8), которые являются основой для графиков на фиг. 12Б.

С/Ш: соотношение сигнал/шум

Включение рутения означает среднее количество метки Ru на антитело

Пример 9. Определение оптимальной плотности метки для рекомбинантного антитела для получения оптимального соотношения сигнал/шум в иммуноанализах

Мультивалентные моноспецифические анти-TSH антитела получают и очищают согласно приведенному выше описанию в примере 4.

Во-первых, получают необходимое количество антигена TSH для калибровки (5 мкЕД TSH/мл, как определено анализом Roche Cobas Elecsys по каталогу Roche 07028091190, фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). Также получают мультивалентные рекомбинантные анти-TSH антитела, как показано на фиг. 2В-Е, обозначенные IgG(P4), IgG(P6), IgG(P8) и IgG(P12), соответственно. В качестве ссылки применяют TSH-специфический IgG. Важно, что каждое антитело содержится в разных образцах, причем образцы различаются по средней плотности метки для соответствующего антитела.

В серии экспериментов, описанных в примере 8, каждое антитело с предварительно определенной средней плотностью метки используют в прогонах Elecsys, и регистрируют количество сигналов, соответствующее 5 мкЕД TSH/мл. Каждое измеренное значение соотношения сигнал/шум для меченого антитела затем нормализуют по отношению к соответствующему значению, определенному с использованием первоначального анти-TSH анализа Roche Cobas Elecsys, номер по каталогу 07028091190.

Соответственно, каждая из диаграмм на фиг. 7А-Е, иллюстрирующих результаты, содержит ординату со шкалой, указывающей проценты с отметкой 100%, соответствующей измерению, полученному с помощью первоначального анти-TSH анализа Roche Cobas Elecsys. Каждое измеренное значение, нормализованное таким образом по отношению к эталонному значению 100% исходного анализа, указывает на способность обнаружения соответствующего меченого антитела, с которым было получено нормализованное значение. Если нормализованное значение ниже 100%, соответствующее антитело с заданной плотностью метки является технически менее предпочтительным; с другой стороны, нормализованное значение выше 100% представляет собой антитело с более благоприятным отношением сигнал/шум, которое превосходит меченые олигомеры исходного анализа.

Важно учитывать, что в экспериментах с мечеными антителами они являются единственным компонентом, который был изменен в исходном анализе, замещая меченые олигомеры химически связанных фрагментов антител.

На фиг. 7А показывают результаты, полученные для IgG, на фиг. 7Б - результаты, полученные для IgG(P4), на фиг. 7В - результаты, полученные для IgG(P6), на фиг. 7Г - результаты, полученные для IgG(P8), и на фиг. 7Д - результаты полученные для IgG(P12). На фиг. 7Е показывают наложение от А до Е, объединяющее все результаты. Стало очевидным, что специфические IgG(P6) и IgG(P8) с определенными нагрузками метки способны превзойти исходный анализ. Таким образом, средние предпочтительные плотности меток, определенные с использованием нормализованных данных, позволяют определить наиболее эффективные меченые конъюгаты, подходящие для применения в необходимых иммуноанализах, в частности, в диагностических иммуноанализах. Эти рекомбинантные мультивалентные антитела с плотностями меток, приводящими к самым высоким относительным значениям, выбирают для дальнейших экспериментов. То же самое было сделано в отношении меченого IgG.

В этой связи следует отметить, что процесс определения оптимальных плотностей меток, как описано выше, также выполняют для каждой вновь синтезированной партии химически связанных антител или их фрагментов, как описано в примере 2. То есть размеры фракций олигомеров обычно метят для придания различных плотностей, чтобы выяснить, какая комбинация размера олигомера и плотности метки способна дать равные результаты, как и исходный анализ.

Следовательно, процесс выбора для определения оптимальной плотности метки в общем виде представляет собой уже установленную стандартную практику в данной области.

Пример 10. Оценка мультивалентного анти-TSH антитела для обнаружения разных концентраций антигена TSH. и сравнение со стандартными олигомерами фрагментов антител

Исходный анти-TSH Roche Cobas Elecsys анализ по каталогу Roche 07028091190, включающий химически связанные фрагменты IgG, меченые рутением в качестве реагента для определения, используют для измерения серии разведений антигена TSH, где каждую аликвоту, содержащую разбавление антигена TSH, готовят в универсальном коммерчески доступном разбавителе, номер по каталогу Roche 1173277122 (фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). Ряд концентраций TSH, полученных с помощью аликвот разбавления, выбирают для представления диапазона физиологических концентраций по меньшей мере 95% популяции у пациента. Впоследствии реагент обнаружения заменяют мультивалентными анти-TSH антителами с оптимальной плотностью метки (см. пример 9). В табл. 7 и 8 суммируют результаты, в которых соотношения сигнал/шум сведены в таблицы в виде процентных значений относительно стандартного анализа с исходным реагентом обнаружения, то есть содержащего химически связанные фрагменты антител, меченые рутением. Для данных в табл. 8 измерения выполняют после включения дополнительной стадии предварительной отмывки. Иначе говоря, перед тем, как комплексы обнаружения помещают в измерительную ячейку прибора Elecsys, комплексы обнаружения магнитно иммобилизуют и промывают дополнительным объемом буфера, тем самым более эффективно удаляя нежелательные компоненты. В табл. 7 представлены данные измерений без этапа предварительного промывания, что приводит к несколько заниженному соотношению сигнал/шум.

Измерение без предварительного промывания

Измерения с предварительной промывкой

Значения отношения сигнал/шум (С/Ш) рассчитывают и нормализуют в соответствии с текущим коммерческим анализом TSH Elecsys номер 07028091190 по каталогу Roche. Результаты показывают, что конъюгаты мультивалентных IgG(P6) и IgG(P8) показывают наилучшие результаты, касающиеся отношения сигнал/шум, с более чем на 160% лучшими значениями при высоких и низких концентрациях TSH, чем в исходном анализе, который включал стандартный реагент для обнаружения с ковалентно химически перекрестно связанными фрагментами антител.

Пример 11. Анти-тропонин-Т (TN-T) мультивалентное антитело IgG(P8)

Векторы экспрессии легкой и тяжелой цепи для восьмивалентного антитела конструируют и временно экспрессируют в клетках-хозяевах HEK293F, которые секретируют антитело в супернатант культуральной среды без сыворотки. Антитело выделяют из супернатанта, используя аффинную хроматографию с белком А. Очищенное антитело может быть получено с выходом 61 мл/л супернатанта. GFC300 аналитическая SEC хроматография показывает, что очищенные мультивалентные анти-TNT антитела чистые и с низким содержанием агрегатов.

Фиг. 13Б. показывает результаты анализа SEC, фиг. 13А показывает те же стандарты размеров, что и на фиг. 10А.

Конъюгат IgG(P8) с рутением получают для замещения исходного стандартного химически перекрестно связанного конъюгата с рутением исходного анализа Roche Elecsys, номер по каталогу 05092744190 (фирма Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). При всех протестированных концентрациях целевого антигена TN-T в диапазоне 4,5-4000 нг/мл конъюгат IgG (P8)-Ru показал превосходную эффективность в анализе Elecsys TN-T.

Данные в табл. 9 были получены тем же методом, что и в примере 10. Была включена стадия предварительной промывки.

Измерения с предварительной промывкой

Пример 12. Анти-HIV-антиген мультивалентные антитела

В итоге, новые описанные в настоящем изобретении антитела мультивалентного формата тестировали в HIV-антиген анализе, номер в каталоге 11971611122 (фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). В этом анализе используют два отдельных олигомера фрагмента рутенилированного анти-р24 антитела. То есть первый и второй олигомер специфичны для обнаружения первого и второго эпитопа целевого белка р24. Оба анти-р24 моноклональных клона IgG (Е и D) используют для конструирования форматов IgG(P4), IgG(P6) и IgG(P8). Дополнительно был создан вариант IgG(P8) с четырьмя антигенсвязывающими сайтами из клона Е и четырьмя связывающими сайтами из клона D, что привело к получению восьмивалентного и биспецифического антитела. Биспецифическое свойство было получено с использованием последовательностей СН1 и C_kappa человека и мыши, соответственно. Все молекулы экспрессируют в клетках HEK293 и очищают с помощью хроматографии с белком A. Analytical-SEC показывает, что все мультивалентные анти-р24-антитела Е, D и биклональная молекула E/D могут быть получены с высокой чистотой и низким уровнем агрегации в форматах IgG(P4), IgG(P6) и IgG(P8). Все конструкции экспрессируют в клетках HEK293, очищают с помощью хроматографии с белком А. Все белки были конъюгированы с рутением с оптимальной степенью включения метки.

Фиг. 14А показывает стандарт размера, аналогичный хроматограмме, показанной на фиг. 10А; на фиг. 14Б-Г показывают моноспецифические антитела Р4, Р6 и Р8, соответственно, для Е-специфичности. Для конструкций, специфичных для D, на фиг. 14Д показывают стандартные размеры, аналогичные хроматограмме, показанной на фиг. 10А; фиг. 14Е и 14Ж показывают моноспецифические антитела Р4, Р6, соответственно, для D-специфичности.

На фигуре 14З показывают стандарт размера, аналогичный хроматограмме, показанной на фиг. 10А, но с другим материалом SEC, а именно с Superose 6. С использованием того же материала SEC была проанализирована моноспецифическая конструкция Р8 для специфичности D, как показывают на рисунке 14К. На фиг. 14К показывают биспецифический конструктор Р8, имеющий четыре сайта связывания антигена Е и четыре сайта связывания антигена D, также проанализированные с использованием Superose 6 SEC.

Оценка этих конъюгатов в анализе HIV-Ag (фиг. 7) показала, что для Е и D IgG(P6) конъюгаты рутения превосходят конъюгаты рутения из фрагментов химически полимеризованных антител (ori), IgG(P4) и IgG(P8). Соотношения сигнал/шум для 6D7 и Е IgG (P6)-Ru на 31% и 86% выше, чем в анализе с исходным реагентом. Кроме того, анализ, снабженный биспецифическим мультивалентным реагентом IgG(P8) с четырьмя сайтами связывания антигена из клона D и четырьмя из Е, показывает на 18% лучшее соотношение С/Ш, чем оригинал, который содержит фрагменты олигомеризованных антител от D и Е.

Антитела IgG(P4), IgG(P6) и IgG(P8) из HIV-ag Elecsys-анализа метят рутением при оптимальном отношении метки к белку. Анализы Elecsys-HIV-Ag проводят с конъюгатами этих антител IgG(P4), IgG(P6) и IgG(P8)-рутений параллельно с соответствующим анализом с текущими исходными конъюгатами (химически перекрестно связанные олигомеры). HIV-Ag анализ состоит из двух меченых рутением и полимеризованных антител (Д и Г). Каждый из них тестируют и сравнивают с новыми мультивалентными вариантами по отдельности (А и Б), или оба были заменены на E/D мультивалентный биклональный вариант. Величины соотношения сигнала к шуму (С/Ш) рассчитывают и нормализуют.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ МОНО- ИЛИ БИСПЕЦИФИЧНЫЕ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА

ДЛЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

<130> P34395-WO

<150> EP17192532.4

<151> 2017-09-22

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker amino acid sequence

<400> 1

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine IgG1, CAmino acid sequence for CH1 domain

<400> 2

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly

100

<210> 3

<211> 221

2

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine IgG1, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion

(FcH)

<400> 3

Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu

65 70 75 80

Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

85 90 95

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro

115 120 125

Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr

130 135 140

Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly

165 170 175

Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu

180 185 190

Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn

195 200 205

His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

3

<220>

<223> Murine IgG2, amino acid sequence for CH1 domain

<400> 4

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro

100 105

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine IgG2, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion

(FcH)

<400> 5

Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro

20 25 30

Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val

35 40 45

Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

50 55 60

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala

65 70 75 80

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys

85 90 95

Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser

100 105 110

4

Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro

115 120 125

Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val

130 135 140

Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly

145 150 155 160

Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp

180 185 190

Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His

195 200 205

Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 6

<211> 96

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine IgG3, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 6

Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe

20 25 30

Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly

35 40 45

Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile

65 70 75 80

Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile

85 90 95

<210> 7

<211> 233

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

5

<223> Murine IgG3, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion

(FcH)

<400> 7

Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro

1 5 10 15

Ala Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe

50 55 60

Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala

65 70 75 80

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

85 90 95

Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys

100 105 110

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg

115 120 125

Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met

130 135 140

Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser

145 150 155 160

Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp

165 170 175

Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile

195 200 205

Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln

210 215 220

Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 8

<211> 104

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

6

<220>

<223> Human IgG1, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

100

<210> 9

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG1 Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion (FcH)

<400> 9

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

20 25 30

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

50 55 60

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

85 90 95

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

100 105 110

7

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

130 135 140

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

145 150 155 160

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

165 170 175

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

180 185 190

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

195 200 205

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220

Gly Lys

225

<210> 10

<211> 102

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG2, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys

100

8

<210> 11

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG2, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion (FcH)

<400> 11

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

9

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG3, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

<210> 13

<211> 265

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG3, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion (FcH)

<400> 13

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

1 5 10 15

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

20 25 30

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

35 40 45

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

50 55 60

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

65 70 75 80

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

85 90 95

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

10

100 105 110

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

115 120 125

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

130 135 140

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

145 150 155 160

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

165 170 175

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

180 185 190

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

195 200 205

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

210 215 220

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

225 230 235 240

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

245 250 255

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

260 265

<210> 14

<211> 103

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG4, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 14

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

11

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Ser Pro Asn Met Val

100

<210> 15

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG4, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion (FcH)

<400> 15

Pro His Ala His His Ala Gln Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

12

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 16

<211> 101

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rabbit IgG, Amino acid sequence for CH1 domain

<400> 16

Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn

35 40 45

Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Cys Ser

100

<210> 17

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rabbit IgG, Amino acid sequence for <hinge>-CH2-CH3 portion (FcH)

<400> 17

Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val

35 40 45

Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro

50 55 60

13

Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr

65 70 75 80

Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys

85 90 95

Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro

115 120 125

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

130 135 140

Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly

145 150 155 160

Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp

165 170 175

Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Asn Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp

180 185 190

Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

195 200 205

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 18

<211> 103

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Murine IgG, Amino acid sequence for CL kappa domain

<400> 18

Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp

20 25 30

Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val

35 40 45

Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met

50 55 60

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser

65 70 75 80

14

Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys

85 90 95

Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100

<210> 19

<211> 103

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Human IgG, Amino acid sequence for CL kappa domain

<400> 19

Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp

20 25 30

Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val

35 40 45

Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met

50 55 60

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys

85 90 95

Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100

<210> 20

<211> 100

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Rabbit IgG, Amino acid sequence for CL kappa domain

<400> 20

Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val

20 25 30

Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu

35 40 45

Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser

15

50 55 60

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn

85 90 95

Arg Gly Asp Cys

100

<---

1. Способ конструирования не химерного или химерного мультивалентного рекомбинантного антитела для обнаружения антигена, предусматривающий перекрестное сшивание Fab фрагментов, которое содержит p полипептидов легких цепей Fab_L и димер полипептидов двух тяжелых цепей, причем каждый полипептид тяжелых цепей имеет структуру формулы I

_N-конец [Fab_H-L-]_n Fab_H-L-dd(Fc_H)[-L-Fab_H]_{m С-конец} (формула I),

где

(а) p является величиной, выбранной из группы, состоящей из 6, 8 и 10, величина p равна (2+2*(n+m)), и каждая величина m и n независимо выбрана из целых чисел от 1 до 3;

(б) обозначение «-» является ковалентной связью в полипептидной цепи;

(в) каждый L является необязательным и, если присутствует, является независимо выбранной аминокислотной последовательностью вариабельного линкера;

(г) каждая область dd(Fc_H) является областью димеризации тяжелой цепи в тяжелой цепи области иммуноглобулина, не связывающей антиген;

(д) в димере две dd(Fc_H) выровнены друг с другом в физической близости;

(е) каждый Fab_H независимо выбран из A_H и B_H, где A_H и B_H различны, и A_H и B_H независимо выбраны из группы, содержащей

где

VH означает вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина,

VL означает вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина,

CH1 означает константный домен 1 тяжелой цепи иммуноглобулина и

CL означает константный домен легкой цепи;

(ж) каждый Fab_L независимо выбран из A_L и B_L, причем A_L и B_L различны, и A_L и B_L независимо выбраны из группы, включающей

(з) каждый сайт связывания антигена Fab_H:Fab_L антитела является выровненной парой, выравнивание которой обозначено знаком «:», причем каждая выровненная пара независимо выбрана из группы, состоящей из A_H:A_L и B_H:B_L, где A_H:A_L и B_H:B_L выбраны независимо из группы, состоящей из [VL-CH1]_H:[VH-CL]_L, [VL-CL]_H:[VH-CH1]_L, [VH-CH1]_H:[VL-CL]_L, [VH-CL]_H:[VL-CH1]_L,

где в каждой выровненной паре соответствующие CL и CH1 ковалентно связаны через дисульфидную связь.

2. Способ по п. 1, в котором антитело является биспецифическим или моноспецифическим.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором сайт связывания антигена A_H:A_L способен связываться с первым эпитопом и сайт связывания антигена B_H:B_L способен связываться со вторым эпитопом, причем первый и второй эпитопы различны.

4. Способ по п. 3, в котором антитело является биспецифическим, первый сайт связывания антигена способен специфически связываться с первым эпитопом и второй сайт связывания антигена способен специфически связываться с отличающимся вторым эпитопом, причем первый эпитоп и второй эпитоп содержатся в одной молекуле.

5. Способ по п. 3, в котором антитело является биспецифическим и первый сайт связывания антигена способен специфически связываться с первым эпитопом, а второй сайт связывания антигена способен специфически связываться с отличающимся вторым эпитопом, причем первый эпитоп содержится в первой молекуле, а второй эпитоп содержится во второй молекуле.

6. Способ по п. 5, в котором первая и вторая молекулы идентичны или не идентичны.

7. Способ по пп. 5 и 6, в котором две молекулы содержатся в агрегате или в комплексе.

8. Способ по пп. 1 и 2, в котором сайт связывания антигена A_H:A_L способен связываться с тем же эпитопом, что и сайт связывания антигена B_H:B_L.

9. Способ по п. 8, в котором антитело является моноспецифическим, а сайты связывания антигена идентичны или различны.

10. Способ по п. 9, в котором сайты связывания антигена способны специфически связываться с эпитопом, содержащимся в одной молекуле или в разных молекулах.

11. Применение мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного способом по пп. 1-10 и конъюгированного с выявляемой меткой, в анализе для обнаружения антигена.

12. Применение по п. 11, в котором анализом является сэндвич-анализ.

13. Конъюгат для обнаружения антигена, содержащий мультивалентное рекомбинантное антитело, полученное способом по любому из пп. 1-10, которое конъюгировано с выявляемой меткой.

14. Способ обнаружения антигена, включающий стадии контактирования мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного способом по любому из пп. 1-10, с антигеном с формированием комплекса антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела с последующим выявлением сформированного комплекса, тем самым с выявлением антигена.

15. Способ по п. 14, включающий стадии

(а) смешивания мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного способом по любому из пп. 1-10, с жидким образцом, предположительно содержащим антиген,

(б) инкубирования образца и мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым формируя комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования,

(в) обнаружения комплекса, сформированного на стадии (б), тем самым обнаружения антигена.

16. Способ по п. 14, который включает стадии

(а) смешивания мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного способом по любому из пп. 1-10, с жидким образцом, предположительно содержащим антиген,

(б) инкубирования образца и мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым формируя комплекс антигена и мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования,

(в) иммобилизации комплекса, сформированного на стадии (б), и

(г) обнаружения иммобилизованного комплекса, тем самым обнаружения антигена.

17. Способ по п. 14, который включает стадии

(а) смешивания меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного по любому из пп. 1-10, с жидким образцом, предположительно содержащим антиген,

(б) инкубирования образца и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым формируя комплекс антигена и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с меченым мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования,

(в) иммобилизации комплекса, сформированного на стадии (б), и

(г) обнаружения иммобилизованной метки, тем самым обнаружения антигена.

18. Способ по п. 14, который включает стадии

(а) добавления меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, полученного способом по любому из пп. 1-10, к твердой фазе, предположительно содержащей на поверхности антиген,

(б) инкубирования твердой фазы и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела со стадии (а), тем самым формируя комплекс антигена и меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, если антиген присутствует и доступен для контакта с меченым мультивалентным рекомбинантным антителом во время инкубирования, затем

(в) промывания твердой фазы для удаления меченого мультивалентного рекомбинантного антитела, не сформировавшегося в комплекс, затем

(г) обнаружения метки на твердой фазе, тем самым обнаружения антигена.

19. Способ по п. 18, в котором твердая фаза способна захватывать антиген и перед стадией (а) выполняют стадию контакта твердой фазы с жидким образцом, предположительно содержащим антиген, где антиген захватывается твердой фазой, если антиген присутствует и доступен для захвата твердой фазой.