Способ очистки ферментов от пигментов1известен сиюсоб очист1ки ферментов от питмвнто|в путем раство.рения фермента и наиесония полученного раствора на колонку с молекулярным ситом с последующим элюйрованием ферментов.

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

368304

Союз Советскик

Социалистических

Республик

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф+ Я

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 16.Х11.1970 (34 149988 3 28-13) с присоединением заявки №

Приор,итет

Опубликовано 26Л.1973. Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 10.IV.1973

М. Кл. С 12d 13/10

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете ввинистров

СССР

УДК 557 15.07 (088.8) Авторы изобретения

И. Н, Войнарский и В. Л, Яровенко

Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения

СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ ОТ ПИГМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной промышленности, точнее к способам очистки ферме нтов от пигментов.

Известен с7пособ очистки ферментов от пигменто|в путем растворения фермента и HaiHeсония получен ното раствора на колонку с молекулярным ситом с последующим элюированием ферментов.

Предлагаемый способ позволяет более полно очистить фер менты от пигментов. Для этого перед HaiHeepHHehI ферментного раствора колон7оу уравновеш и вают ком плексообразующирм веществом. В качестве ком плетосообразующего вещества и спользуют 0,001 — 0,009 М уксусн7ую кислоту (СНзСООН) . В качесгве элюента следует использовать дистиллиро ванную воду или водный распвор нейтрального электролита, на пример поварен!ную соль. Lleлесообразно растворять фермент в уксусной кислоте, п ри этом рН раствора необходимо устанавливать оптималыным для стабильности очоощаемого фермента, нанри|ме р прои очистке протеолитических ферментов рН раствора следует устанаэить palBIHbIM 4,5 — 5,1, а молекулярное сито выбирать с нейтральной матрицей, неразрушающейся под действием очищаемого фермента и неадсорбирующей его.

Способ за ключается в следующем.

В качесттве исход ного материала могут быть использованы ферментные препараты, получезвные из м икроорганизмов. Их растворяют в уксусной к7ислоте, устанавливая значение рН раствора, благоприятное для их стабилизации.

Ферментные препараты, полученные из поверзоносвных кульпу р плесневых грибов Asp.

5 oryzae, Asp. Bwameri, Asp. terri@ala путем осаждения этиловым спиртом, содержат не более 20 — 22% белка, до 40% золыных вещеспв, 38 — 40% пигментов и др. прилтесейт.

Поэтому их предварительно очищают от бал10 ластных веществ. Для этого препарат растворяют в уксусной кислоте и добавляют 20%ный раствор ацетата кальция. Полученную суспензию центрифугируют, осадок удаляют, а супернатант темно-коричневого цвета, со15 держащий ферменты, наносят на колонку с молекулярным ситом, предварительно уравновешенным комплексообразующим веществом, в качестве которого использовали 0,001—

0,009 М уксусную кислоту. Объем вводимого

20 образца равен 0,05 — 0,1 от всего объема геля в колонке. Скорость элюирования не превышает 0,3 площади основания колонки в л7л7л777Н.

Затем элюируют д истиллированной водой

25 или водяным расово,ром нейтральных эле квролитов, например ИаС1.

Отобравные фра кции элюата объединяют, а для концентрирования ферментов добавляют сухую соль (NH4) SO4 до 0,85 пол|ного насы30 щения.

Образовавшийся осадок растворяют в м ини368304

65 малыном объеме 0,01 — 0,1 М СНзСООН и вторич но про пус!кают через колон ку. По втор но отобранные фракциями сушат л иоф ильно или на р аспылительной сушил ке.

B предлагаемом способе используют нейтральные молекуляр|ные сита, не под вергающиеся воздействию ферментов и не адсорбирующие их, Размер пор геля выбирают так, чтобы они не пропускали вещества с молекуляр ным весом более 10000 — 17000.

П ри элю иравании раствора фермент ного препарата через колодину с таким молекулярны м ситом все элеитролипы (включая уксусную кислоту, в которой растворялись препараты и ацета т кальция), а также неадсорбирoIBàiíiíûå белками и ферментами примеси, и мею щие молекулярный вес ме ньше 10000—

17000, постепе н но проникают в поры гранул геля, и CIKopость их движения замедляются.

DHIrIMeIHTbI и другие пpHiMecH, образующие комплексы с фер ментами и имеющие общий молекулярный вес (в комплексе белок — примесь) з начителыно больше 10000 — 17000, движутся по кало нике между гра нулами геля (в пусто м объеме геля) с большей с коростью, чем ниэкомоле кулярные вещества. Благодаря раз ности в скорости движения на пе11вом этапе элюиро ва|ния происходит отделение белков и образующих с ними комплексы прииесей от веществ, не образующих с ними комплексов, имеющих молекулярный вес ме ньше 10000—

17000, включая уксусную кислоту, в которой ра створялись ферме нтные препараты и ацетат кальция. Комплексы фермент-пигмент или фермент-при месь, отделившиеся на первом эта не элюиро вания от .вышеу1казан ных веществ попадают в 0,001 — 0,009М СНзСООН.

В результате связи между фермента ми и пигмента ми разрываются. Белки и. ферменты, имеющие м олекулярный вес больше 10000—

17000, д виж утся с большей с коро стью в,пусто м объеме геля, а пигменты и другие примеси, имеющие молекулярный вес меньше

10000 — 17000, попадая в в нутре нн ий объем геля, замедляют свое движение и отделяются

oiT ферме кто|в. Поэтому белки и ферменты выходят из коло н ки обессолен|ными в 0,001—

0,009М СНзСООН и раньше, чем остальные примеси.

П редла гаемый способ является способом очистки всего комплежса ферменто|в от п игareIHToIB, электролитов и небелковых примесей, имеющих молекуля|рный вес до 10000 — 17000.

Ра зработанный способ очистки ферментов исключает диализ фер ментов, которые в процессе osHicTlrIIH обессол и ваются и выходят из колонки с уксусной кислотой незначительной ианцентрации (0,001 — 0,009 М), что позволяет получен ные ферменты сразу же высуши вать. ,Глубокая очистка ферментов от пигментов и других небелковых примесей значительно облегчает фракциони рование ферментов и на ионообмен н и ках. ,П ри мер 1. Для очистки используют ферме нтный препарат, выделенный из глубинной

60 культуры Asp. niger путем осаждения этиловым спиртом. Получают 5 /о- ный раствор препарата (рН 4,5) в 0,1 М СНзСООН, осадок отбрасывают, а полученный образец наносят на слой би огеля П-10, уравновешенный

0)007 М СНзСООН.

На фланг. 1 приведена х роматограмма, где

1 — поглощение ciBera,при 280 лак, 2 — поглощение с вета при 454 л лк (к ри вая распределения пипме нтов) и 8 —,протеолитическая активн о сть.

Верти каль ный пунктир показывает границу пустого объема геля, находящегося влево от нег,о.

Из графика видно, что вся а ктивность ферменго в сконценTpHpoBBIHa в первом пике и практически пол постыл отделяется от пигментов и других при месей, которые отстают и выходят из KoJIDIHKIH вторым, пиком.

Пример 2. Осуществляют очистку фермент ных препарато в, выделенных из поверхно стных культур Asp. Oryzae u Asp. awamori.

Для приготовления 10О/о-ных растворов препаратов (ipH 4,8 — 5,0) используют 0,1 М

СНзСООН. ,П редвар ительную очистку от балластных веществ проводят согласно описанию.

Дальнейшую очистку ферментов проводят на коло н нах с биогелем П-10, ура внс|вешен ным 0,001 М СНзСООН.

Хроматограммы опыто в показаны на фиг. 2 (Asp. oryzae) и фиг. 3 (Аэр. awamori), на которых номера кривых и их названия соответст вую т о боз начениям на фиг. 1.

Из графиков видно, что практически вся активность ферментов концентрируется в высокомолекуляр ной фракции препарата, находящейся в переделах пустого объема геля (первый IIHIK) в то время, как пигменты концентр ируются в низ комолекуля рной фракции препарата, фракц ио нирова ни е которых происходит во внутреннем объеме геля (второй и третий пики). Таким образсзм, в этих опытах происходит полное отделение ферментов от пигментов и друпих примесей, молекулярный вес которых не nipeIBBrrnaeT 10000 — 17000.

Пр имер 3. Для очистки используют ферментный препарат М 49, получен ный из повероноспной культуры Asp. terriicola. 10 /о -ные

palcTIBlopBr .препарата (рН 5,1),получают с помощью 0,1 М СНзСООН, Предварительную очистку о т балластных веществ проводят с использованием paEIHbrõ объемов 20%-lrroro раствора ацетата кальция. Дальнейшую очистку от ьзигменpoiB и других примесей проводят (согласно методике, изложенной в описакии) на биогеле П-10, урав новеше н н ом 0,007 М

СНзСООН °

Хр оматограмма опыта показана на фиг. 4, где номера,кривых и их названий соответствуют обовначения м на фит. l. Из графика видно, что вся протеолитическая aiKTHIBность сосредоточенна в фракциях, соответствующих пустому объему геля. Отбирают,по объему

70О/о фракций (на фиг. 4 указано стрел кой), в

368364

Протеолитическая активность ед./r

Степень повышения активности

Количество пигментов после очистки, рН действия протеиназ

Выход после очистки, % исходного препарата очищенного препарата

2,5

3,0

3,3

7,5

2688

2577

„290

32,0

33,0

33,6

30,0

8640

59

62

62

0,85 которых находится 80 — 90% активности ферментов. Остававшуюся часть фра кций отбрасываю т, не уменьшая удельную актив ность ферме нтов (на 1 г сухого вещества). На графике

Как видно из таблицы, активность протеиназ в 30 — 34 раза, выход ферментов, в среднем, составил 60%, а количество пигментов уменьшилось более, чем в 100 раз.

Для сравнения приводим опыт,по очистке этого же исходного препарата на:биогеле

П-10, слой которого ура>вновешен не уксусной кислотой, а дистилл>и рован ной водой (фиг. 5).

TIpeIIaрат перед очисткой растворяли в 0,1 М ацетат — НС1 буфере с до>бав.чением %

NaCl для создания большей ионной силы (рН

5,1). Элю иво вание образна прово пили дистичлированной водой. Хроматогра мма состоит практически из одного большого пика. Конце нтрация бе.чковых вещее в на ней совпадает с концентрацией пигментов (кривые I и 2).

Поэтому в ф>ракции, составляющие пустой объем геля, где находилась вся акт и вность ферментов, переходит свыше 40% всего количества пи.гмвнтов.

Ппедмет изобпетения

l. Способ очистки ферме ннов от пигментов путем растворения фермента и нанесения полмчеиного ра створа на колонку с молекуlBп ным ситом с последующим элюировапчсм видно, что пигменты отделяются от высокомолекулярной фракции и выходят в составе следующих пиков. Результаты очистки приведены в таблице. ферментов, отличаюи!ийся тем, что, с IIe,чью более полной очистки ферментов, перед нанесен;ием ферментного раствора колонку уравновеш и вают ко>мплексообразующим вещество.м.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве ком>пле ксообразующего вещества испо чьзтют 0,001 — 0,009 М уксусную, кислоту.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве элюента используют дистиллированную водч>.

4. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что растворение фермента ос ществчяют в укгаствор нейтрального электролита, например ,пова ре,н>ную соль.

20 5. Способ по пп. 1 — 4, отличающийся тем, что растворение фермента с чцествчяют в уксусной кислоте, при этом рН раствора устанавли вают оптимальным для стабильности очищаемого фермента, напримев при очистке

25 протео.читических ферментов рН раствора устанавливают равным 4,5 — 5,1.

6. Способ по пп. 1 — 5, отличающийся тем, что очистку ферментов ведут через молектлярHîå сито с нейтпальной матрицей, неDаз30 рушающейся под действием очищае>мого фепмента и неадсороирующей его.

/О /5 20 25 50 35 Ф0 I5 50 55 бб 55 70

Риг, Ф

<0 /5 20 2$ 50

Риг, 5

Составитель Т. Полянская

Редактор Г. Ивченкова

Техред T. Ускова

Корректор О. Усова

Типография, пр. Сапунова, 2

Заказ 748/11 Изд. № 195 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4(5