Способ получения меченного тритием гуанозин-5-трифосфата

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

О П И С А Н И Е о1>4о4з4в

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 06.12.71(21) 1723820/23-4 (51) М. Кл. с присоединением заявки № (23) Приоритет

С 07 Н 19/20

С 07 В 23/00

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (43) Опубликовано 25.10.763юллЕтень № 39 (53) УДК 547.857. .7. 07 (088. 8) (45) Дата опубликования описания 14.02.77 (72) Авторы изобретения

О.В. Лавров, Н.С. Марченков, К.С. Михаилов q IJ и H.Ô, Мясоедов (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ

ГУАНОЗИН-5 -ТРИФОСФАТА

Изобретение относится к улучшенному способу получения меченного тритием био;югического соединения, которое может найти применение для биологических и биохимических исследеваний. 5

Известен способ получения меченного

С гуанозин-5.-трифосфата, заключающий14 1 ся в том, что выращивают культуру микро-44 организмов на среде, содержащей С О, выделяют из биомассы меченую РНК, гид- ð ролизуют ее до нуклеотидов, разделяют их с последующим биохимическим фосфорилиро1 ванием меченого гуанозин- 5 -монофосфа/ та до меченого гуанози -5 -трифосфата.

Однако известный способ получения меченого гуанозин-5 -трифосфата IID3BQ» ляет получить целевой продукт только низкой удельной активности (не более 50200 м кюри/г) и с очень незначительным выходом (по суммарной активности). 20

При этом метка по молекуле гуанозин—

-5 -трифосфата распределена неопределенно.

11елью изобретения является повышение удельной активности и радиохимической чистоты.

Для этого 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченного гуанозина — 8-(T) и последующей радиохимической очисткой гуанозина- 8 (Т), совмещенной со стадией фосфорилирования.

Обычно гуанозин-8(Т) выделяют на смоле Дауэкс 1х8 в формиатной форме элюаций 0,1 М растьороммуравьиной кислоты, после чего его концентрируют при помощи активированного угля.

Продукты фосфорилирования гуанозина-8(Т) обычно разделяют хроматографией на ионообменном сефадексе А-25 в бикарбонатной форме при помощи триэтиламмоний -би— карбонатного буфера.

Выход гуанозин-5 -трифосфата — 8(T) по активности составляет 50% (в расчете на промежуточный гуанозин — 8(Т) ).

Преимушеством предложенного способа является то, что основная масса посторонней радиоактивности, не связанной с гуанозином, сбрасывается при выделении гуано—

404348

3 зина- 8(Т) . Дополнительная радиохимическая очистка происходит при концентрировании гуанозина-8(T) на активированном угле, Наконец, наиболее тонкая и сложная очистка or продуктов радиационного поврен у дения гуанозина, хроматографически сходных с гуанозином, совмещена с процессом биохимического фосфорилирования.

Благодаря высокой специфичности фермента к субстрату, радиационно-поврежден-. р ные молекулы не фосфорилируются и связанная с ними активность легко сбрасывается в процессе разделения продуктов фосфорилирования.

Пример . 145 мг 8-бромгуанози- И на наносят на 600 мг катализатора (10%

Р на угле "Норит"). Тритирование проводят в стеклянной ампуле со впаянным электродом, вокруг которого помещают нанесенный на стеклянную вату катализатор с 8- ф)

-брэмгуанэзином. Прэдэлжительнэсть тритирования в атмосфере 99%-го трития в условиях высокочастотного электрического разряда составляет 20 мин. Температсура в ампуле в процессе тритирования 120-1 30 С. По окончании процесса вещество смывают с катализатора 60 мл спиртоаммиачной смеси (1 N раствор N Н в 50%-м спирте) и лабильн и тритий замещают на водород путем повторного изотопного уравновешива- 30 ния с водой, Сухой остаток после отгонки последней порции воды растворяют в 20 мл дистиллированной воды и вводят в колонку с Дауэкс 1х8 в формиатной форме (3х30 см). Колонку промывают - 250 мл дистил- N лированной воды, а затем выделяют гуанозин-8 (Т) в виде четкого пика при элюации

- 300 мл 0,1 N муравьиной кислоты, Далее выделяют 8-бромгуанозин-Т (Ч ), используя для элюации 0,2 N муравьиную кис- Ф лоту. В эксперименте получается 30 мг гуа нозика- 8 (Т) с удельной активностью

10 кюри/г (т.е. 300 мкюри), и 40 мг 8-бромгуанозина-Т (0 ) с удельной активностью 1 хюри/г (т.е. 40 мкюри).

Полученный препарат гуанозина-8(Т) концентрируют при помощи активированного угля и фосфорилируют (используя 10 мл фермвнтного раствора до гуанозин-5 -трифосфат-8(Т) ГТФ-8(Т) ), Продукты фосфори лирования разделяют на колонке (1,5х21 см), заполненной сефадексом А-25 в бикарбонат— ной форме. Для элюции применяют градиент концентрации триэтиламмоний-бикарбоната (OT 0,2М до 0,6 М). Соответствующие фракции собирают, обессоливают при помощи сефадекса

С-25 (в Н-форме) и концентрируют выпа— риванием в вакууме. В результате эксперимента получают 55 мг ГТФ-8(Т) с удельной активностью 2,8 кюри/г (т.е.

150-1 60 м кюри) .Проверка чистоты пэлученI ного препарата показала, что гуанозин-5—

-трифосфат-8(Т) хроматографически однороден и радиохимически чист. форм ула изобретения

Способ получения меченного тритием гу анозин-5 -трифосфата биохимическим фосг форилированием меченного гуанозина с пос ледующим выделением целевого продукта известным способом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения удельной активности и радиохимической чистоты,, 8-бромгуанозин, абсорбированный на палладиевом катализаторе, подвергают обработке газообразным тритием в условиях высокочастотного электрического разряда с промежуточным выделением меченэгэ гуанозина-8(Т) и последующей радиохимической очисткой гуанозина-8(Т), совмещенной со стадией фосфорилирования.

Составитель B. Жестков

Редактор С. Осганине Техред Г. Родак Корректор Н. Бабурка

Заказ 5442/171 Тираж 575 П одписн ое

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,