Способ получения дезоксирибонуклеозидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ЛВтОВСКОМЬ СВИДЕТИЛЬСтВж

< i) 546874

Сс.аз Сееетскик

Соцналкстичссккх

Реса:т".:,ик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 03.03.75 (21) 2110178 04 (51) М. Кл.- "С 07Н 19, 00 с присоединением заявки ¹â€”

ГасУдаРственный комитет (23) Пм орнтет

Совета Министров СССР

Оп o-iii oDqi o 30 12 76 ) |о-|-|е|ень 4 (53) УДК 547.963.32.07 (088.8) и открытий

Дата опубликования оп|.сания 08.02.77 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОЗИДОВ

Изобретение относится к области получения веществ, которые находят широкое применение в медицине, а также в химической промышленности как полупродукт для синтеза реа ктивов и лечебных препаратов.

Известен способ получения дезоксирибонуKлеозидов путем выделения дезоксирибонуклеино вой кислоты (ДНК) с последующим гидролизом ее неочищенным ферментным препаратом, выделенным из почек лососевых рыб и обработанным протамином, при 37 С.

Образующуюся после гидролиза смесь очищают путем многократной фильтрации, центрифугирования, экстракции,упаривания и разделяют методом ионообменной хроматографии (1).

Недостатками известного способа являются: сложность выделения целевого продукта, дороговизна его получения, обусловленная необходимостью предварительно выделять и охарактеризовывать ДНК, а также снижение выхода целевого продукта из-за присутствия в ферментном препарате дезаминаз, разрушающих дезоксирибонуклеозиды.

Целью изобретения является упрощение процесса и удешевление себестоимости получения целевого продукта.

Указанная цель дсстигается тем, что в качестве исходного сырья, содержащего дериваты ДНК, используют о|ходы промышленного производства протамш|сульфата пз молок iOсосевых рыб, которые гидролизуют при 36—

38 С очищенным от дезаминаз ферментным препаратом нуклеаз. Образующиеся при этом

5 дезоксирибонуклеозиды н дезокспрпбонуклеотиды из р-створа извлекают кислотной экстракцией с последующим повторным п|дролизом кишечной фосфатазой. Смесь дезоксирибонуклеозидов разделяют методом ионнооб10 менной хроматографии. Для кислотной экстракции обычно используют 7с с-ную трихлору ксусную кислоту.

Используемый ферме гный препарат, полученный из почек лососевых рыб, свободен от

15 примесей дезаминаз и представляет собой смесь фракций дезоксирибонуклеаз и фосфатаз, объединенных в один ферментный препарат, называемый нуклеазой.

Сущность метода получения нуклеаз из по2;) чек лососевых рыб состоит в кислотной экстракции белков, обладающих ферментной активностью, которые затем фракционпруют сернокислым аммонпем, разделяют на сефалексе Г-100 с последующим выделением фрак25 ций дезоксирибонуклеаз и фосфатаз, например методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЕЛЕ-целлюлозой.

Пример 1. 100 г отходов производства протампнcóëüôàòà нз молок рыб гомогенизнЗз руют в 1,8 л 0,02 М раствора NgSO4.7Í O, 540874

Таблица 1

Дезокеирибонуклеозиды, выделенные из отходов производства протаминзульфата из молок лососевых пород рыб

Количественный выход дезоксирибонуклеозидон, от веса сухих отходов

Количественны и выход дезоксирибонуклеозидов, мг на 100 r cyxux отходов

0,5

0,4

0,45

0,5

0,0005

0,0004

0,00345

0,0005

d-Цитидин

d-Аденозин

d-Гуанозпн

Тимидин

Т аблица 2

Количественный выход дезоксирибонуклеозидов, мг на 100 г сухих отходов

Количественный выход дезоксирибонуклеозидов, от веса сухих отходов

Дезоксирибонуклеозиды

d-Цитидин

d-Аденин

0,0002

0,0001

0,0002

0,0008

0,2

0,1

0,2

0,3

d-Гуанззин

Тимидин доводят рН гомогената до 7,6 1 н. раствором

КОН и добавляют 50 мг ферментного препарата нуклеаз. Общий объем реакционной смеси доводят до 2 л 0,02М растворо;i MgSO4.7Н О и инкубируют при 37 С в течение 20 час. Ilo окончан:» ферментгтивного гпдролиза инкубационную смесь центрифугнруют в течение 40 мин при 5000 g. Из осадка после центрифугирования экстрагируют в течение 1 час при встряхивании кислоторастворимые компоненты дезоксирибонуклеиновой кислоты 400 мл

7% -ной трпхлоруксусной кислоты, приготовленной нл основе 0,02Мраство ра kgSO, 7Н О, гидролизат и кислотный экстракт объединяют раствором iXH4OH, рН полученной смеси доводят до 7,0 и вносят 150 мг фсрментного

1репарата кишечной фосфатазы.

Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37 С в течение 24 час.

Из упаренного до объема 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центрифугированием за 20 мин при 4500 g, экстрагиру1от дезоксирибонуклеозиды 96%ным этанолом (из расчета на одич обьем раствора — четыре объема 96%-ного гидролизного спирта). Спиртовойэкстракт дезоксирнбонуклеозидов упаривают при 25=С до сиропообразного состояния, затем растворяют в воде, доводят общий объем до 200 мл и смешивают с 85 г а ктивированного угля.

Дезo«c.iрибонуклеозиды элюируют с активированного угля на воронке Бюхнера 8 л

50%-ного этанола, содержащего 1% аммиака.

Элюат упаризают, дсзодят рН до 10,5 28%ным раствором NH401- и фильтруют полученный раствор через фильтровальну1о бьумагу (ват лап Х 1).

Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов осуществляют ионообменной хроматографией на смоле «Дауэкс» 2 8. Элюируют дезоксирибонуклеозиды 12 л 0,4 М раствора формиата аммония (рН 9,6), смешанного с 12 л воды (рН 9 — !чН4ОН). В фракциях элноата количество дезоксирибонуклеозидов определяют по

УФ-поглощению при 260 нм и при помощи цистеинсерной кислоты. Фракции, содержащие дезоксирибонуклеозиды, упаривают до небольшого объема; дезоксирибонуклеозиды выкристаллизовывают при 0 С. Выход дезоксирибонуклеозидов 1 з отходов производства протамипсульфата из молок рыб приведен з табл. 1.

П p II ii с р 2. Пол 1 чеHrie дезокс;:риc OHi ineозндов кислотной экстракц11ей.

100 г отходов производства протаминсульфата 1з молок pLio TIIl,àòûûiî измельчают, из 1ельченную массу помещают в 850 мл 7%-ной трихлору ксу сной кислоты, приготсвленнОЙ на основе 0,02М раствора 1gSO. 7H.O, -III::.Сл1.11о перемешивают в теченис 1 -1ас и цент ифугирую-, 40 мин при 5000 g. Осадок о,брасы1;а1от, à рН супернатанта доводят до 7,0 раствором ХП;OH и вносят 150 i:ã фсрментного рс:12p21 а кишечной фосф",Tàçi.i. Полученную ре;кционную смесь гидролпзуют 11ри 3i С в те:1ение 24 час.

Из упаренного до 100 мл раствора, в котором осадок предварительно удаляют центри2> фугированием в тсчение 20 мин при 4500 g, дезоксирибонуклеозиды экстрагируют 96%пым этанолом (из расчета на один объем полученного раствора — четыре объема 96%-но го гидролизного спирта).

Спиртовой экстракт дезоксирибонуклеозидов упаривают при 25 С до сиропообразного ссстояния, затем растзоряют в воде, доводят сбщий объем раствора до 200 мл и смешивают с 85 г активированного угля.

8 1 Дезоксирибонукл 03иды эл1оируют с активированного угля на воронке Бюхнера 8 л 50%ного этанола, содержащего 1р аммиака.

Элюат упарнвают, рН остатка доводят до

10,5 28%-ным раствором ХН4ОН и фильтруют

85 рас-вор через фнльтровальную бумагу (ват з1ан „ чо )

Разделение смеси дезсксирибонуклеозидов осуществляют методом ио:-1ообменной хрома,ограф11п на смоле «Дауэкс» 2Р,8. Элюируют

4 1 дезокснрибонуклеозпды 12 л 0,4 М формиата аммония (рН 8,6), смешанного с 12 л воды (рН 9, . !Н4ОН). В собранных фракциях элюаа количество дезоксирибонуклеозидов определяют спектрофотометрически и при помощи

- 15 цII TQHHcepной кислОты. Фракции, содержащие дезсксирибонуклеозиды, упарнвают до небольшого объема, дезоксприбонуклеозиды выкристаллизовывают при 0 С.

Выход дезоксирнбонуклеозидов из отходов

50 производства гротаминсульфата из молок

540874

Формула изобретения

Таблица 3

Количеств "нный ВЫХОл ле30кеиОибснуклеозидов, г в пересчете на

10 кг отходов

Количественный выход дезоксирибонуклеозидов, o„ от веса сухих отходов

Дезоксирибонуклеозиды

d-Цитидин

d-Аленозин

46,2

39,5

42

49,1

0,03046

0,00039

0,00043

0,00049

d-Гуанэзин

Тимидин

Составитель С. чернова

Техред А. Камыш ни кова

Редактор И. Астафьева

Корректор Л. Брахнина

Заказ 3010/6 Изд. ¹ 1914 Тираж 575 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Ми шстров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Рауш:к-я иаб., д. 4, 5

Типографии, 7p., Сап1нова 2 рыб, полученных путем непосредственной кислотной экстракции, пр :âåäåí в табл. 2.

Пример 3. 500 г отходов производства протаминсульфата из молок рыб тщательно измельчают, помещают в 8,6 л 0,02М раствора MgSO4 7Н20, доводят рН до 7,6 Iн. раствором КОН, после чего к полученной смеси добавляют 250 мг ферментного препарата нуклеаз и доводят общий ооъем раствора до 9 л

0,02М раствором MgSO4.7НзО. Реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 20 час.

По окончании ферментативного гидролиза инкубационную смесь центрифугируют 40 мин при 5000 g, из осадка дополнительно экстрагируют в течение 1 час при встряхивании кислоторастворимые компоненты ДНК 2 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты, приготовленной на основе 0,002М раствора MgSO4 7Н20, гидролизат и кислотный экстракт объединяют, доводят рН до 7,0 раствором KH

750 мг ферментного препарата кишечной фосфатазы. Полученную реакционную смесь гидролизуют при 37=С в течение 24 - ас.

Из упаренного до ооъема 250 мл раствора дезоксирибонуклеотиды экстра прх 1or 96%ным этанолом.

Спиртовой экстракт упаривают при 25 С до сиропообразного состояния, растворяют в воде, доводят общий объем до 600 мл и cìeøèвают с 250 г активировагп ого угля.

Дезоксирибонуклеозиды элюируют с активированного угля на воронке Бюхнера 30 л

50 р-ного этанола, содержащего 1% аммиака.

Элюат упаривают, рН остатка доводят до

10,5 28 ц-ным раствором ХН4ОН и фильтруют через фильтровальную бумагу.

Разделение смеси дезоксирибонуклеозидов

5 осуществляют методом ионообменной хроматографии на смоле «Дауэкс» 2<8. Дезоксири. бонуклеозпды элюируют 35 л 0,4М формиата аммония (рН 8,6), смешанного с 35 л воды (рН 9, XII.OH). В собранных фракциях элю10 ата определяют количество дезоксирибонуклеозидов при помощи цистеинсерной кислоты спскт1зофотометричес1

Выход дезоксирпбонуклеозидов приведен в табл. 3.

1. Способ получения дезоксирибонуклеозидов путем гидролиза дезоксирибонуклеиновых кислот (, !-IК) ni;: температуре 36 — 38 С фер2., ментпым препаратом, выделенным из почек лососевыгх рыо, с использованием разделения образующейся смеси дезоксирибонуклеозидов методом ионообменной хроматографии, отл ич а ю шийся тем, ч го, с целью упрощения

3 1 процесса и удешевления себестоимости получения целевого продукта, в качестве исходного сырья, содержащего дериваты ДНК, используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, которые гидролизуют очищен35 ным от дезаминаз ферментным препаратом пуклеаз, после чего образующиеся дезоксирибонуклеозиды и дезоксирибонуклеотиды из раствора извлекают кислотной экстракцией с последующим попзторным гидролизом кишеч40 ной фосфатазой.

2. Способ по п. 1, отличаю цийся тем, что для кислотной экстракцпи используют

7%-ную трпхлоруксусную кислоту.

Источники информации, принятые во внима45 нпе прп экспертизе изобретения:

1. ЛЬс1п1,11ацапп and Н.J.À. Tavr, Journa!

of Fisheries ге=сагс11 board of Canada, 1961

18, ¹ 3, 349 — 366.