Натриевые соли -аминофосфонил-5- аденилатов для избирательного ингибирования процессов биосинтеза белка в клетке и способ их получения

 

О П".И С А Н, И Е

ИЗОБРЕТЕН И Я

«» 67I288

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 18.07.77 (21) 2508259/23-04 (51) (L.Кл С 07 Н 19/20//

А 61 К31/00 с присоединением заявки— (23) Приоритет—

3осударственный комитет (43) Опубликовано 30.03.80. Бюллетень ¹ 12 по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.159 (088.8) (45) Дата опублыкования описания 30.03.80 (72) Авторы изобретения

Б. Х. Ишмуратов, А. И. Бирюков, И. А. Гандурина, T. И. Осипова и P. М. Хомутов

Институт молекулярной биологии АН СССР (71) 3!анэитель (54) НАТРИЕВЫЕ СОЛИ а-АМИНОФОСФОНИЛ5 -АДЕН ИЛАТОВ ДЛЯ И ЗБ И РАТЕЛ Ь НОГО

ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЦЕССОВ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА

В КЛЕТКЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к способу получения новых натриевых солей а-аминофосфониладенилатов общей формулы

О

l! l! .р- (,Н вЂ” р — Π— р — Π— гг O

l 1 l .т!гн г Ока 0%

НО ОН где R — метил; изопропил; изобутил; бензил; для избирательного ингибирования процессов биосинтеза белка в клетке. и - Аминофесфониладенилаты являются сильными и избирательными ингибиторами аминоацилирования транспортны.; рибонуклеиновых кислот (тРНК).

Известны смешанные ангидриды мстил-, хлорметил- и г,-хлорацетиламинометилфосфоровы: кислот и аденозин-5 -монофосфата (АМФ). Известные смешанные ангидриды аминофосфоновых кислот и А1ЧФ в своем составе содержат не свободну10, а защищенную аминогруппу, что является огклонением от природного строения аминокислоты, субстрата синтетаз, и не позволяет использовать известные смешанные ангидриды для эффективного инги бирова низ ферментов.

Цель изобрстения — синтез новых ааминофосфониладещ1латов в виде натриевых солей, отличающихся от извсстных смешанных анп1дридов строением фосфонат-Ibex фрагментов, содержащих сьобо:1,— ные а-аминогруппы и подобных по строению природным аминокислотам, что обеспе10 чивает изоирательность и эффектна»!ость ингибирования процессов биосинтеза бел: а в клетке — достигается путем синтеза последних.

Известен спосоо получения аденозинди15 фосфатов взаимодействием имидазолпда

АМФ с ортофосфор ой 1оислотой. Однако этим способом нельзя получить целевые продукты — а - аминофосфониладенилаты, содержащие фосфонатный фрагмент со сВободной с -аминогруппой, из-за высокой peal ц110нн011 спосо биост ll HOc.lc:IHcé и IB(lH 11ности ангидридно11 сзязи.

Постаьленная цель достигается путем использозания в качестве исходного сырья

1iа -карбобензокси-а-аминофосфоновых КНс70Т, провсдеllием резкц11и с TpH-H-актиламмониевой солью имидазочида АЧФ и гидрогенолпзом полученного пирофосфатног0 производного в безводном диметилформаЗО миде.

671288

Пример 1. Натриевая соль а-аминоизобутилфосфонил-5 -аденилата.

К раствору 0,349 г (0,5 млоль) три-и-октилам мои невой соли имидазолида аденозин-5 -фосфата в 3 лл абсолютного ди- 5 метилформамида прибавляют 0,158 г (0,55 ллоль) NÄ-карбобензокси-и-ампноизобутилфосфоновой кислоты и оставляют при

20 С .на 24 ч. Затем упаривают в вакууме при 40 С, остаток растирают с 1 лл абсолютного изопропанола, добавляют порциями абсолютный эфир до объема 5 лл, осадок быстро отфильтровывают и,после очиски тонкослойной хроматографией (силикагель УФ 254, восходящая, система — изопропанол: 25%-ный аммиак: вода=7: 1: 2, элюация поло "ы с Ry =0,0 ",-ным раствором триэтиламина в метаноле) получают

G;150 г (50%) триэтиламмонпевой соли

N„-карбобензоксипроиззодного целезого продукта.

0,150 г (0,24 ллоль) этого производного смешивают с раствором 0,085 г (0,25 ллоль) три-и-октиламина в 3 лл абсолютного диметилформамида, упзривают досуха в вакууме, остаток растворяют .в 2 лл абсолютного диметилформамида и гидрируют в течение

3 — 5 ч над 70 лг Pd- ерни, промытой абсолютным диметилформамидом. Катали затор отфильтровывают, фильтрат упаризают в вакууме при 40 С, остаток раствор-ют с абс. изопропанолом и эфиром, осадок отделяют, растворяют B 1 лл метанола и прибавляют метанольный расгвор 0,028 * (0,24 ллоль) перхлората натрия. Осадок отфильтровывают, пpомыlвают спиртом и после очистки препаративным электрофорезом (бумага ФН-18, буфер — 0,05 М ацетат натрия, рН 4,1 4,2, нагпряжение 4000 В; 40 элюция водой при +4 — 4,5 С полосы с ,подвижностью +0,76 относительно АЛ1Ф, лпофилизация; промывание остатка спиртом, эфиром, высушивание в вакуум:= над

Р О ) получают 0,02 г (20%) натрпезой 4ь соли а-аминоизобутилфосфонил-5 - аде}гилата в виде белого гигроскопического вещества, хорошо растворимого и во."се

U,,м, = 0,76 (условпя фореза см. выше) .

Проявлен Ie IIo пог IQLHcHolo в УФ, I . too f рпном, молиб;атом аммония. Продукт Ilo?t гпдролизс 1 н. соляной кислотой в т чеии

20 лпя при 100 С превращается в а-амииоизобутилфосфоновуto кислоту и АМФ, llo подтверждает наличие пирофосфатной связи. Продукт окисляется периодатом натрия; !

To доказывает наличие свободной цпсгликольной группировки, и обладает УФ-спекгром, характерным для незамещенных адезозинов. во

Таким же образом получены и ооладали аналогичными свойствами натриевые со. I,t остальных а - аминофосфопил-5 -адеинлатов.

Пример 2. Ингибирование валилтРНК-синтетазы натриевой солью и-ампноизобутилфосфонил-5 -аденилата.

Валил-тРНК-синтетазу получали и очищали известными методами. При определении активности фегмептз использовали аденозинтрифосфат натрия (АТФ вЂ” Na), С 4-L-валин (125 Кп/лоль) Рз -пирофосфат натрия (16 УГи лоль), aêò.:âèðoâàííûé лоль

;7 . л

КогИ А, 8-vãркаптоэтанол коммерческой !"HÑÒOÒÛ.

:.нгпоироз=::.;å реакцп.. ами-:oàц }пирования тРНК и аденозинтрифосфат (АМФ) и пирофосфат (ФФ,;) обмена проводят в стандартных услозиях при 37 — 37,5 С в течение 15 лип. 50 лкл (10 " — 10 "М) раствора а-аминопзобутплфосфонил-5 -аденилата вносят в инкубационную пробу непосредственно перед добавлением фермента.

Инкубационная проба содержит в пересчете на 1 лл: 40 л,а .ось -...î;ïñ НС! (рН 7,8), 5 лкло,гь ацетата магния, 72 лтлоль хлористого аммония, 6 лклоль Р-меркаптоэтанола, 2 лклоль АТФ, 4 лклоль С 4-1 -валина, 0,3 лг тРНI, "п 0,005 лг фермента. Скорость ацилировачпя тРНК определяют известными методамп. Скорость АТФ вЂ” ФФ; обмена определяют в стандартной инкубационной смеси, ooäåðÿàùåé в пересчете

»а 1 лл: 100 л<гполь трис. HCI (рН 8,0), 5 лклоль ацетата магния, 72 лклоль хлористого аммония, 6 лклоль Р-меркаптоэтанола, 2 лlèëîëь АТФ, 2 лклоль I -валина, 2 лклоль Р"-пирофосфата натрия и

0,020 лг фермента. Анализ проб проводят известным методом. Получены коэффициенты ингибпрования для реакции АТФ—

ФФ.; обмена К;(М) !,4 10 " для реакции аминоацилирозания тРНК К;(М) 2,8. 10- .

Ф ор му I à изооретения

1. Натрневые соли а-аминофосфонил-5 аденилатов общей формулы: о о

И И р — н — P — О

I I 4 }} ON зiяа и где К вЂ” метил; изопропил, изобутил; бензпл; для избирательного ннгибирования процессов биосинтеза белка в клетке.

2. Способ получения соединений по п.

1, отличающийся тем, что N- -карбобензокси-а-ампнофосфо:- овые кислоты подвергают взаимодействию с три-н-октиламмонисвой солью имидазолида аденозин-5монофосфата, полученные пирофосфатные производные подвергают каталитическому гидрогенолпзу в беззодном диметилформамиде.