Способ получения защищенного гексапептида последовательности 15-20 в-цепи инсулина человека в виде симметричного дисульфида

 

ОПИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Оп 49lbl7

Союз Советских

Социалистических

Республик r Ф I

-Ч (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 13.07.72 (21) 1810216, 23-4 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 15.11.75. Бюллетень № 42

Дата опубликования описания 17.03.76 (51) М. Кл. С 07с 103/52

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 547.964.4.07 (088.8) ло делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

М. И. Титов, Ж. Д. Беспалова и Л. И. Леонтьева (71) Заявитель

Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. А. А. Жданова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАШИШЕННОГО ГЕКСАПЕПТИДА

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 15 — 20 В-ЦЕПИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

В ВИДЕ СИММЕТРИЧНОГО ДИСУЛЬФИДА

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения защищенного гексапептида 15 — 20 последовательности В-цепи инсулина человека в виде симметричного дисульфида, который может быть использован для синтеза инсулина и аналогов.

Известен способ получения защищенного гексапептида. В 15 — 20 инсулина человека, заключающийся в том, что последовательно конденсируют метиловый эфир цистинилглицина с карбобензоксивалином, карбобензоксилейцином, дикарбобензокситирозином и о-нитрофенилсульфениллейцином.

Недостатком известного метода является длительность процесса и значительный расход ряда аминокислот, например валина. Указанные недостатки устраняются использованием другой схемы синтеза защищенного гексапептида.

Цель изобретения — усовершенствование процесса. Поставленная цель достигается тем, что последовательно конденсируют валин с карбобензоксилейцином, дикарбобензокситирозином и о-нитрофенилсульфениллейцином с получением тетрапептида о-нитрофенилсульфениллейцилтирозиллейцилвалина, удаляя защитныс группы действием бромистого водороlI3 в уксусной кислоте или каталитическим гидрогенолизом, полученный тетрапептид конденсируют карбодиимидным методом с дипептидомцистинпл-бис-глицилдпметиловым эфиром и полученный метиловый эфир гексапептида подвергают щелочному гидролизу.

Пример.

Карбобензоксилейцилвалин (1)

3,9 г и-нитрофенплового эфира карбобензоксилсйцина растворяют в 25 мл диоксана, смешивают с 1,2 г валина в 10,5 мл 0,96 н. едкого натра и оставляют а 10 — 12 ч при комнатной

1О температуре. Смесь упаривают до небольшого объема, разбавляют 1 и. соляной кислотой. экстрагируют этилацетатом. этилацетатHbl?l C 7O?I 17PO11blB3IOT ВОдой, вают досуха. После кристаллизации остатка

15 из смеси этилацетат-петролсйный эфир получают 2.8 г (78%) про,?укта с т. пл. 107--109 C.

Дикарбобензоксптирозиллейцилвалин (11)

3,4 г продукта 1 растворяют в 30 мл мета20 иола и гидрируют в присутствии палладия IIa угле до прекращения выделения СОз. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упарнвают и растворяют в 8,5 мл 1,11 н. едкого патра.

К получе??ному раствору добавляют 5,2 I.

25 и-нитрофенплового эфира дикарбобензокситирозина в 15 мл диоксана и оставляют па два дня при комнатной температуре. Смесь упаривают до небольшого объема, разбавляют

1 н. соляной кислотой, экстрагируют этилацеЗО татом, этплацетатный слой промывают водой, 491617

Формула изобретения

Сотавитель Л. Фонина

Техред 3. Тараненко Корректор М. Лейзерман

Редактор Т. Девятко

Заказ 120/8 Изд. М 1961 Тираж 529 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 0К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 сушат, упаривают до объема 15 мл. K остатку добавляют 2 мл дициклогексиламина, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают эфиром, сушат. После кристаллизации из этилацетата получают 6,1 г (78 /о) продукта.

Найдено, %. С 67, 17; Н 8,24.

C4oHoyNgOg Н20.

Вычислено, /o: С 66,94; Н 7,96.

Полученную таким образом дициклогексиламмониевую соль суспендируют в этилацетате и встряхивают с 0,5 н. серной кислотой до полного растворения. Этилацетатный слой отделяют, промывают водой, сушат. После упаривания получают 4,8 г (100о o) продукта с т. пл. 157 — 158 С. о-Нитрофенилсульфениллейцилтирозиллейцилвалин (III)

Продукт III получают из продукта II и инитрофенилового эфира о-нитрофенилсульфениллейцина по методике, аналогичной предыдущей, и выделяют и идентифицируют в виде его дициклогексиламмониевой соли. Выход

98о/о, т. пл. 152 — 154 С; (а)20 — 11ОС (с 1, ДМФА), Найдено, %. С 61,6; Н 8,13.

С44НввМвОв. 2НвО.

Вычислено, /о. С 61,31; Н 8,42.

Диметиловый эфир бис- (о-нитрофенилсульфениллейцилтирозиллейцилвалил) -цистин и лбис-глицина (IV) .

1,0 r диметилового эфира дикарбобензоксицистинил-бис-глицина обрабатывают 5 мл

25%-ного раствора бромистого водорода в уксусной кислоте, через 40 мин реакционную смесь разбавляют эфиром, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают эфиром и растворяют в 5 мл диметилформамида. К полученному раствору при размешивании добавляют безводный бикарбонат натрия, через

5 мин отфильтровывают, к фильтрату добавля1от 3,4 г дициклогексиламмониевой соли продикта III и 1,0 г оксисукципимида, смесь охлаждают до — 15 C и добавляют 0,7 г дициклогексилкарбодиимида, Смесь выдерживают 2 дня при 0 С, отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочевину, фильтрат разбавляют 0,5 н. серной кислотой, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой, 5о/о-ным бикарбонатом натрия, водой, сушат. После крисгаллпзации из смеси диметилформамид-вода получают 2,26 г (88% ) продукта с т. пл. 237 †2"С; (а)- — 50 С (с 1, ДМФА).

Найдено, % . .С 54,60; Н 6,62.

Ств H oaU >40zoS4.

Вычислено, %. С 54, 78; Н 6,53.

Бис- (о-нитрофенилсульфениллейцилтирозил10 лейцилвалил) -цистинил-бис-глицин (V) .

1,4 г продукта IV растворяют в 10 мл метанола, к полученному раствору добавляют 4,6 мл

1,0 н. едкого натра и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь отфильтровывают с активированным углем, фильтрат разбавляют 0,5 н. серной кислотой, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой, сушат.

Получают 1,0 г (75%) продукта с т. пл. 213—

215 С (а1 — 21 С (с 1, ДМФА).

Найдено, %. С 54,67; Н 6,40.

С74Н104К1404$4.

Вычислено, %. .С 54,19; Н 6,40.

25 Аминокислотный состав, г (в скобках даны теоретические величины): цистеин 0,8 (1); тирозин 0,7 (1); валин 1,2 (1); лейцин 2,2 (2).

Способ получения защищенного гексапептида последовательности 15 — 20 В-цепи инсули35 на человека в виде симметричного дисульфида, отличающийся тем, что, с целью усовершенствования процесса, последовательно конденсируют валин с карбобензоксилейцином, дикарбобензокситирозином и о-нитрофе40 нилсульфениллейцином, удаляя защитные группы действием бромистого водорода в уксусной кислоте или каталитическим гидрогенолизом, полученный тетрапептид-о-нитрофенилсульфениллейцилтирозиллейцилвалин кон45 денсируют карбодиимидным методом с дипептидом цистинил-бис-глицилдиметиловым эфиром и полученный метиловый эфир гексапептида подвергают щелочному гидролизу с последующим выделением целевого продукта

50 известным способом.