Способ получения инсулина

 

Сеоз Советских

Социалистиыеских

Республик (6l) Дополнительный к патенту(22) Заявлено 26.04.72(21) 1778186/28-13 (23) Приоритет (32) 30.04.71 (31) 1 39120 (ЗЗ) США (51) М. Кл. A 61 К 37/26 (бз) УДК 615.45:615.

,361.37 (088.8) Гаоуааротееииый иоиитет

Совета Миниотрое СССР ио лелю изооратеиий и открытий (43) Опубликовано 25.03.765юллетень № 11 (45) Дата опубликования описания 15.04.76 .

Иностранец

Ричард Ли Джексон (США) (72) Автор изобретения

Иностранная фирма

"Злтт Лилли энд Компани" (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНСУЛИНА

Изобретение относится к фармацевтичес кой промышленности.

Известен способ получения комплекса цинковая соль инсулина - протамин путем прибавления к раствору кристаллического инсулина цинка хлорида,и протамин-сульфа0 та, Для псъышения быстрсгы и длительности действия вещества смешивают натриевую соль инсулина в соотношении на каждые нт

100 ео. инсулина 0,2 — 1,5 мг протамина и растворяют в воде при рН 6,5-8,0.

Соль инсулина приготавливают путем шелочной кристаллизации инсулина, применяя едкий натр, гH!1pooKHcb шелочного металла та или гидроокись аммония. После кристаллизации кристаллы промывают и сушат до тех пор, пока ссдержание влаги будет менее

107. Соль инсулина мгновенно растворяет-. ся в воде при нейтральном рН и может хра- оа виться в растворе до 3 есяцев без сушественногс ухудшения, Соль инсулина и протамин соединяют в водной среде так, чтобы образовался КоМплекс соль инсулина-прстамин, рН водной о5

2 среды 6,5-8,0. Комплекс соль инсулина-протамин может быть легко отделен от жидкой среды фильтрованием и высушен. Комплекс в сухой форме может храниться год и более. Если применяют ксиплекс соль инсулина-протамин, то его:растворяют в водной среде, предпочтительно в изотоническом разбавителе при рН 6,5-8,0. После растворения комплекс готов для инъекции„ Комплекс характеризуется быстро наступаюшим и длительно продолжаюшимся действием.

Изготовление комплекса соль инсулина-протамин состоит в приготовлении натриевой соли инсулина, почти не содержашей цинка, т.е, менее 0,05% (натриевая соль в кристаллическом виде, но растворима в воде или в изотоническом разбавителе). Затем натриевую соль растворяют в жидкой среде в таком количестве, чтобы на 100 млжидкой среды приходилось 90-115 ед, Затем к жидкой среде добавляют требуемое коли чество протамин-сульфата. Образуется н растворимый комплекс в виде очень тонкого осадка. Тонко распределенный осадок хорошо суспендируется в жидкой среде,.так бО8162 т аблица1 что иньекпия производится легко. Если комплекс хранится s ж иaд коcй сcрpеeд е, то ои остается стабильным и ие теряеч айтивиость в течение года.

Натриевую соль инсулина получасов пу |ем

: обработки неочишенного инсулина едким и&тром и водном растворе, причем едкий . натр присутс гвует в количестве, необходи- мом для получения рН 8-8,5. Натриевая соль инсулина осаждается в растворе и легко отделяется декантированием, центри» : фугированием „фильтрованием, Натриеваг

cga может быть очищена последуюшим, растворением и нерекристаллизацией. Анализ показывает, что при применении нат. риевой соли инсулина на 1 моль натрия присутствует 1 моль инсулина. Кристаллы натриевого инсулина могут содержать обычный или свиной инсулин и легко растворимы в воде:и изотонических растворах при рН около 7.

Протамин обычно присутствует в виде протамин-сульфата или в другой водорастворимой форме.

Если применяют изотонический оаэбавитель в качестве среды для протамин-суль- фата и соли инсулина, необходимо чтобы разбавитель содержал консервируюшее средство. Консервирующим средством является фенол и метил«п -гидрооксибензоат.

М ф

Биологическую активность комплекса о протамин-инсулин определяют B& кроликах

36 кроликов (2 равные группы) выдер живают голоднымн 24 часа перед испыте вием. 8 течение всего испытания им не де

an нн воды, ни пищи. Для определения перво начального . содержания сахара в крови пробу крови берут из концевой ушной вены. Контрольной группе кроликов впрыскивакаг назначенную дозу нейтрального роъамин-инсулина Хагедорн (g РН), испытываемой группе ииьецируют комплекс протамнинач риевый инсулин (Р33), Первую пробу крови у каждого кролика берут через ЗО мин.

Последующие пробы берут через 1,5, 3, 5, 7 и 9 час после инъекции. Каждую про бу анализируют на содержание сахара в крови, результаты выражают в миллиграмм/

/процентах глюкозы; Зля обеих групп вычиочя ляют среднее содержание сахара для каждого отбора проб.

Если применяют перекрестное испытание, кроликов., которые цолучают контрольную пробу, иньецируют комплексом протаминнатриевый инсулйн .й наоборот. Эти яспытьнич проводят через неделю по окончании первоначальных испытаний.

Полученные результаты„выраженные как среднее содержание сахара в крови в мил30 лиграмм/процентах, представлены в табл.1.

Комплекс протамин-натриевый инсулин действует более быст ю, более продолжи- 55 тельно, чем продукт HPH.

Комплекс Р5 3 (протамин- натриевый ин сулин) сравнивают со смесью Ag 3 (кисло л. ный обычный инсулин) н ЯРН и" соотноше- вв нии 1:1 (на базе активности). Концентрация протамин-сульфата О,B мгlмл.

При этом перекрестном испытании и< » пользуют 36 кроликов, Каждому впрыскивают О,1 мл инсулинового продукта, т.е.

1 ед. инсулина на иньекцию.

Результаты представлены в табл.2.

5081 62

Та блиц а 2 действия не наблюдается, Сравниваюг три продукта: свиной и бы чий инсулины, а также смесь, содержащую д .75% бычьего и 25% свиного инсулина.

Испытание проводя г над 6 кроликами, каждому впрыскивают 0,01 мл, т.е. дозу в 1 ед. инсулина.

Содержание сахара в крови (мг/%)после введения

Время, Проводят сравнение трех. типсе иейтральщих продуктов протамин-натриевый инсулин в комбинации с О, 02 м г цинка ща 1 00 ед, инсулина. Каждый инсулиновый продукт содержит 0,02 мг цинка. на 100 ед. инсулина..

При добавлении цинка определяют его влияние на быстро наступающее и долго продолжающееся действие комплекса прота-..миинатриевый инсулин. Неблагоприятного

Свиной инсулин дейс-.вует быстро, хотя продолжительность его действия не такая длительная, как других инсулиновых продуктов. Бычий и смешанный продукты действуют быстро и долго.

Пример.1. Приготовление комнлек- 35 са протамин-инсулин в дозированной форме.

Кристаллический бычий натриевый инсулин приготавливают следующим образом.

Инсулин экстрагируют из бычьей поджелудочной железы, подкисленной водной спир- 60

Результаты представлены в табл. 3, ТаблицаЗ товой средой; концентрируют под вакуумом и частично очищают дробным осаждением," с хлористым натрием и изоэлектрическим .I осаждением. Затем инсулин очищают:щелоч« ной. кристаллизацией при рН 8, Полученные кристаллы растворяют в разбавленной уксусной кислоте (0,5 н) и далее фракционируют фильтрованием на С=фадексе Г-50.

Элюат, сос гоявший из 0,5 и. уксусной кислоты и инсулина, нейтрализуют 1 н.ед5081 6

7. ким натром и перемешивают 1 час при ком натной температуре. Затем кристаллы натри :евого инсулина отделяют фильтрованием и промывают 2%-ным хлористым натрием.

После чего промытые кристаллы вносят и избыток ф олютного, спирта ItpH сильнОм перемешивании, отфильтровывают и собирают. После второй промывки абсолютным : спиртом кристаллы прожывают эфиром и высушивают в вакууме. Ю

Пример 2. Нейтральный комплекс приготавливают, аналогично примеру 1,. за исключением того, что нзотонический разбавитель содержит 1,2 мг протамина/мл.

Каждое испытание проводят над 9 кроликами.

Между испытаниями комплекс, суспендированный в нзотоническом разбавнтеле,, хранится при 25оС. Кроликам впрыскивают по 0,01. мл ннсулинового продукта.

Результаты приведены в табл,. 4.

Получают кристаллический бычий натриевый инсулий со следующей характеристикой:активнос гь -25,8 ед./мг> азот — 15,82%;

à 8,0%; цв,тной,индекс 0,005 д !15

1%-ного раствора при 340 ммкм, Порцию сухого натриевого инсулина в количестве 8,98 r растворяют в 990 мл свободно от пирогена воды,, содержащей

2,27 г фенола и 1,5 мл 10 Ь-ной НС6 .

Затем с помощью 1,7 мл 109ногофаОН доводят до 7,4. Испытания показали, что активность инсулина 101,3 ед./мл. Этот раствор подвергают стерильной фильтрадии

35 и разливают в флаконы по 1 мл, высушивам ют при температуре ниже ОоС в асептичеоких условиях и получают 6 каждом флаконе . сухой. натриевый инсулин, который и сохра 50 няется в таком виде до испытаний.

2i

8!

В каждый флакон добавляют иэотоничеокий раэоавитель в таком количестве, чтобы жидкая среда содержала 101,3 ед, инсулина /мл. Этот изотонический раэбавитель.содержит :0,4 мг протамин-сульфата/

/мл, 1,6% глицерчча и 0,25 вес.Ъ фенола, рН иэотоннческого -acvsopa 7;4 После добавления.иэотонического раствора к сухому натриевому инсулину происходит мгно венное образование комплекса протамин-нат риевый инсулин. Эт зт комплекс находится в флаконе в виде тонко распределенного осадка. Осадок остается достаточно равномерно суспендированным в водном разбавителе, так что при взятии",инъекционным шприцем каждый раз отбирают одинаковое количество инсулина.

Данные таблицы показывают, что даже после, хранения комплекса, суспендированного в изотоническом разбавителе, при

25 С сохраняется активность инсулина; он о действует быстро и длительно.

Пример 3. Образование и применение комплекса протамнна с аммонийным, литиевым и калиевым инсулином, а также натриевым инсулином примера 1.

Каждую из эти;: инсулиновых солей получают цо методике примера 1, смешивают с иэотоническим раствором, содержа55 шим 0,4 мг протам лн-сульфата/мл, и впрыскивают так, как описано в примере 1, 18 кроликам.

Результаты приведены а табл, 5,.. 508162

Таблица 5

Натриевый инсулин действует длительно, другие же составы вызывают значительное снижение содержания сахара в крови.

П р н м е.р 4. Стабильность комплекса протамин-натриевый инсулин, Таблица 6

Врем час

0,5

Каждый из высушенных иисулиновых сос Ф о р м у л а л э о б р е т е н и я тавов растворяют и инъецируют, что вызы- Способ получения препарата инсулина вает значительное снижение содержания са- . путем смешивания соли инсулина с протахара в крови, мин-сульфатом, о т л и ч а ю ш и и с я

Комплекс приготавливают аналогично примеру 1, применяя О,4 мг/мл протамин-суль фата в изотоническом раэбавителе. Г1осле - приготовления комплекс помещают в проби ки центрифуги, центрифугируют и выделившуюся жидкость декантируют, Отделенный осадок промывают 15 мл абсолютного спирта и затем 15 мл абсолютного эфира. Ilpoмытый осадок затем высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Высушенный материал снова суспендйру- ют в нейтральном раэбавителе, не содержащем протамин-сульфата, Суспенднрованный материал анализируют на активность . Активность 88-95 ед./мл, что показывает легкую потерю инсулина при промывке перед сушкой.

Испытания проводят на 9 кроликах.

Данные приведены в табл. 6. Испытания с высушенным при низкой температуре материалом проводят с материалом, cíîâà суспеидированным в воде и затем высушенным при низкой температуре.

SO81 62

Составитель П. Малютина

Редактор Т. Загребельная Техред О. Луговая Корректор А Г .(сева

Заказ Q5 Тираж ЯЯ Подписное

llHHHHH Государствеяяого комитета Совета Министров CCCP по делам, изобретений неоъярытяй

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Гагарина, 101 тем,«.чтс с целью повышения быстроты и длительности действия вашества, смешивают натриевую соль инсулина в соотношении на

12 каждые $00 ед. инсулина 0,2-1,5 мг протамина и растворяют в воде при рН 6,58,0.