Способ получения 11 ,21-диоксистероидов

 

Союэ Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлеио18.07.75 (21) 2157907/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (11) 555115 (51) М. Кл.

С07 3 5/00

//A61 К 31/57

Государстоеннь и коиитет

Сооото Ииннстроо СССР по долом изобретений н открытий (43) Опубликовано 25.03.773юллетеиь № 1 5 (53) УДК 547.689. .6.07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 02.06.77

Г. С. Гриненко, В. М, Рыжкова, Н, П. Сорокина, Е. B. Попова, Т. И. Гусарова и A. А. Шпинги(72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 11 Jb 21,11HOKCHCl ЕРОИДОВ

СН20Н

C=o

- R3

К2

20

Изобретение относится к области усовершенствования микробиологического способа получения 11 Р> 21-диоксистероидов, н-t» меняющихся в качестве лечебных препаратов в фармацевтической IlpoMbIIIIJleHHocTH, 5

Известен способ получения 11,21-диоксистероидов обшей формулы где R атОм водорода или фтора;

К вЂ” атом водорода; — гидрокчильная группа, или Я и Р вместе составляют изот пропилидендиоксигруппу, 2 путем микробиологического гидроксилирования 21-оксистероидов при помощи культуре Т ефИе майа ог сЬ Ь Ф, выращенной в аэрируемых условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азо- . та и минеральных солей, ваключаю1пийся в том, что исходный стероид вносят в культуральную жидкость однократно в растворителе, например в этаноле (1).

Известно также использование для аналогичноч цели культуры Сценаfawia Eunata при внесении стероида в культуральную жид кость в виде мелкодисперсной суспензия 12)

При этом концентрация стероида в культуральной жидкости не превышает 0,5-1 г/л.

Повышение концентрации стероида при использовании мелкодисперсной суспензни затрудняется деструкцией стероида в процессе трансформации. Кроме того, размельчение стероида требует сложного аппаратурного оформления (3). Процесс трансформации при таком способе введения стероида осложняется сильным вспеннванием.

Применение растворителей в связи с их токсичностью для микро.. рганизмов не позво555115 ляет увеличивать концентрацию стероидов в культуральной жидкости.

При обоих методах внесения стероида лишь незначительная часть находится в растворенном состоянии (1О-20%), что ограни- и чивает скорость процесса.

Целью изобретения является устранение недостатков известных способов, интенсификация процесса за счет увеличения концентрации стероидов в процессе 11 р -гидроксили- l0 рования, повышения скорости реакции и упрощение процесса.

Для этого производное 21-оксистероида вводят в культуральную жидкость в виде водного раствора натриевых солей кислых 16 эфиров 21-оксистероидов формулы 11 ! 2 +<

c=0

° R$

О

К1

30 где Я„Я и (имеют указанные значения;

R — остаток натриевой соли янтарной или фосфорной кислоты (-СОСН СН ьООКО или - (oNel) °

Предлагается способ получения 11 fh>21-диоксистероидов .формулы 1 путем микробиологического гид;.оксилирования при помощи культурьг гриба такого, как Tiegbeme_#_a

ОУСЫ48 .I ãыращенного в аэрируемых условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минераль ных солей, заключающийся в том, что исходный стероид вводят в виде водного раствора натриевых солей кислых эфиров 21-оксисте- ©

О роидов формулы П.

По предлагаемому способу для процесса трансформации используют культуру Т48 Ъ|гпеНо огеЪ|да . Можно также использовать гриб Сцтчиlgpia (ипд д.

Трансформирующую культуру выращивают в аэрируемых условиях на среде, содер>кашей углеводы, органические источники азота и неорганические соли.

К выросшему мицелию добавляют стеро- щ ид в виде водного раствора. Трансформацию осуществляют на отмытом мицелии при концентраци.i стероида в культурапьной жидкости 3-5 г/л, в пересчете на 21-оксистероид ° 60

По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отделяют от мицелия и экстрагируют несмешивающимися с водой растворителями. Растворитель упаривают и целевой продукт выделяют известным способом.

Использование для микробиологического получения 11 р 21-диоксистероидов в качестве исходных соединений натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов позволяет увеличить нагрузку стероида в 6-10 раз по сравнению с известными способами и довести ее до 3-5 г/л (в пересчете на

21-оксистероид), за счет чего достигается повышение производительности аппаратуры, упрощение и ускорение процесса производства, Воднорастворимые натриевые соли кислых эфиров формулы П получают этериАикацией соответствующих 21-оксистероидов органическими и неорганическими кислотами, например янтарной или фосфорной кислотами по методике f4).

Пример 1. К суспензии 20 г (0,058 моля) кортексолона в 240 мл тето рагидрофурана, охлажденной до -40 С прикапывают раствор 29,2 r (0,16 моля) пирофосфорилхлорида в 40 мл тетрагидрофурана в течение 15 мнн. Смесь перемешивают о при -40 С 3-3,5 часа до исчезновения кортексолона (ТСХ). Затем прикалывают 100мл о воды при температуре не выше 0 С в течение 15 мин. Тетрагидрофуран отгоняют в вакууме, к суспензии приливают 100 мл воды и охлаждают при 5 С в течение часа.

Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 5 и после сушки получают 23 1 г (94%) 21-фосфата кортексолона f3 Я,=М =Н, R — ОН; R — PO(OH) Т.пл. 1 (О С (разложение); (Xj + 1 12 (с = 1; метанол); E = 359; A +„240 нм.

Найдено, %: P 7,37%;

С Н, От Р

Вычислено, Р 7,26%.

20 г 21-фосфата кортексолона растворяо ют в 100. мл метанола поои 60 С. К охлажденному раствору при 10 С приливают 2Я спиртовой раствор едкого натра до рН 10.

Смесь охлаждают при - С в течение часа. о

Осадок отфильтровывают, промывают 20 мл сухого хлороформа и 20 мл абсолютного этанола. После сушки получают 20,5 r (92,5%) (1R) = R =Н; R =-ОН;

Р =РО(ОНИ ); ф„) + 100 (с=1; дистиллированная вода).

Таким образом, выход динатриевой соли

21-фосфата кортексолона составляет 87%, считая на кортексолон.

555115

Пример 2. Способом, описанным в примере 1, получают 21-фосфат 6- А

-фтор-16 А, 17, -изопропипидендиоксипрегнен-4-ол-21-диона-3,20 (l,R = F, R> и — изопропилидендиоксигруппа, R 4 = РО (ОН )Д с BblxogoM 71, 5%.

Я >+ 64 (с = 0,5;CHaOH); Е 321>3;

3 „, х 236 "м

Способом, описанным в примере 1, получают динатриевую соль 21-фосфата 6 а(. — В

-фтор-16 А, 1 7 -изопропилидеьдиоксипрегнен-4-ол-2 l-диона-3,20.

Пример 3 ° Суспензию 18 г кортексолона (й, R, = Кй= Н, Я, = ОН, К, =Н) и 14 г (3 моля) янтарного ангидрида в И 90 мл пиридина в токе аргона перемешивают 10 час. Затем раствор охлаждают и при ь

0-10 С в течение часа к смеси прибавляют

108 мл соляной кислоты, 90 мл воды и

90 г льда. После этого температуру повыо шают до 20 С и перемешивают в течение

3 час. Осадок отфильтровывают, промывают водой и после сушки получают 22,87 r гемисукцината кортексопона (l,R = R > = Н, R = ОН, К вЂ” СОСН СН СООН) с т. л. 1933.95 С. Выход 95%; на пластинк е Si Rufous

UV 254 в системе этилацетат/ циклогексан (4;6) при:просматривании в УФ-свете исходное не обнаружено.

После перекристалпизации из ацетона т.пл. 195-197 С, (oc)> 118,4 (1% этанопа ).

К раствору 1,36 г бикарбоната натрия в 136 мл воды прибавляют 4,52 r гемио сукционата кортексопона (т.пл. 193-195 С); перемешивают в течение 2 час н используют на стадии трансформации.

Пример 4. 11 (> -Гидроксилир>ванне динатриевой соли 21-фосфата кортексо-,р лона при помощи Tiegheme_#_a огоЪ|д@

Культуру гриба Т1е йегпеИа огсЪ|4ь выращивают на скошенном суслоогаре в пообирках в течение 2-3 недель при 26-28 С.

Споры гриба смывают с поверхности arapa 4ô

5 мл физиологического раствора и споровую суспензию в количестве 1 мп вносят в

100 мп стерильной среды следующего состава: глюкоза 30 r, кукурузный экстракт.

5 г (сухой вес), пелтон 3 г, дрожжевой 59 автопизат 3 г,КИ1РО4 5 г, вода водопроводная 1000 мп; РН 6,8-7,2. Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 л на круговой качалке

220 об/мин при 26-29 С. Через сутки Ж полученный инокупят в количестве 10 мл вносят в 1 50 мл среды названного состава и проводят вторую инокупяцию лри том же режиме, что и первую. Через 20-22 часа роста мицелий от 13 колб отфяпьтровыва- 60 ют, объединяют, промывают водой (pH 6,57 и ресуспензируют в водопроводной воде комнатной температуры. Полученную водную суспензию мицелия в количестве 1950 мл разливают по 150 мл в к нические колбы на 0,75 л, доведя предварительно рН до

7-7,2. В каждую колбу вносят 450 мг кортексолона (нагрузка 3 г/л) в виде водного раствора динатриевой соли 21-фосфата, для чего навеску соли 7,95 r (соответствующую 5,85 r кортексопона) растворяют предварительно в 65 мл воды. Трансформацию стероида ведут в тех же услови» ях, что и выращивание мицелия гриба. Контроль процесса осуществляют методом хро-, матографии на пластинках "SiPu.19 " в системе метанол /хлористый метилен/ вода (5: 9 5: О, 5 ) . Продолжительность процесса

24-36 час. По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отфильтровыо вают от мицелия, мицеплй промывают водой, трижды экстрагируют хлороформом (1:1 по объему). Отгоняют хлороформ в вакууме, остаток растирают с 30 мп гексана. Осадок отфильтровывают и сушат. Все суммы стероидов 5,3 r (87%), содержание гидрокортизона 65%.

Пример 5. 11 5 -Гидроксилирование динатриевой соли 21-фосфата кортексолона при помощи См чиРсйт)см 6иnata.

А. Культуру гриба C. Pu. <äta выращивают в пробирке на скошенной агаризованной среде следующего состава: глюкоза 4 r, дро>.жевой экстракт 4 г, солодовый экстракт 10 г, агар 30 г, водопроводная вода 100 мп. Время выращивания 7-10 суо ток, температура 26-28 С. Споры гриба смывают 5 мп дистиллированной воды и споровую суспензию в количестве 2 мп вносят в 100 мл стерильной среды следующего состава: сахароза 30 r, дрожжевой автолизат 2,5 г, NANO> 2г (NH4 НР04, 3 г, К НРО 1 г, КС(0 5 г, /й $04 вода водопроводная 1000 мл; рН 6,0-6,1.

Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 и на круговой качалке 160 об/мин при 26-28 С. Через

30 час полученный инокупят в количестве

10 мп вносят в 150 мл среды названного состава и проводят вторую инокупяцию при тех же режимах, что и первую. Через .24часа роста мицелий используют дпя трансфор» мации. Подготовку мицелия для трансформации осуществляют как в примере 4. Для трансформации берут 4,9 г динатриевой соли 2 1-фосфата кортексол>на, что соотгетствует 3,6 г кортексопона. Навеску растворяют в. 40 мп воды и распределяют в 8 колбах (нагрузка 3 г/и). Продолжительность

5551 1 5

С Н,ОН !

С=О э

"М

СН,ОН„

С=О

У процесса трансформации 24-36 час. По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отфильтровывают от мицелия, дважды промывают по 150 мл воды и

4 раза экстрагируют хлористым метиленом (1:1 по объему), Посл» отгонки хлористого метилена на роторном испарителе остаток растирают с 20 мл н-гексана и фильтруют, иа фильтре промывают 20 мл н-гексана.

Получают сумму стероидов 3,05 r (81%), lp в которой содержится 62,5% гидрокортизона.

Б, Выращивание культуры C.tunarta и процесс трансформации ведут по примеру

5 А. Для трансформации берут 8,16 г ди- 15 натриевой соли 21-фосфата кортексолона, что .соответствует 6 r кортексолона, навеску растворяют в 80 колбах (нагрузка 5 г/л).

Чер з 26 час опыт заканчивается. Обработка такая же, как в опыте 5 A. 20

Получают 3,9 r (70%, считая на трансформироваьный стероид, с учетом возвращенного 21-фосфата кортексолона) суммы стеронинов с 60%-ным содержанием гидрокортизона. 25

После экстракции кулЬтуральной жидкости . хлористым метиленом и выделения стероидов, культуральную жидкость подкисляют до рН 3 разбавленной серной кислотой и трижды экстрагируют этилацетатом по 150 мл. После отгонки этилацетата 0,8 г 21-фосфата кор» тексолона.

Пример 6. 11 Р-Гидроксилирование натриевой соли 21-гемисукцината кортексолона при помощи T%(1lqmeHa oychidig.

Выращивание культуры Т, cr cg ig : и

-процесс трансформации 136 мл водяного раствора натриевой -.оли 21-гемисукцината (соответствует 3,6 r кортексолона) распре40 деляют в 8 колбах с культурой гриба (нагрузка 3 г/л).

Продолжительность опыта 24-36 час.

После обработки (пример 4) получают

3,3 г (87%) технического гидрокортизона содержащего около 63% гидрокортизона.

Пример 7. 11 Р -Гидроксилиоование натриевой соли 2 1-гемисукцината кортексолона при помощи Т вфЬещеИа orobidis

Выращивание культуры Т. ог chid щ и процесс трансформации осуществляют по примеру 5. Для трансформации 85 мл водного раствора чатриевой соли 2 1-гемисукцината, соответствующих 2,25 г кортексолона, распределяют в 5 колбах с культурой гриба. Продолжительность трансформации

24-36 час. После соответствующей обработки получают 2,1 (89 .l ) технического продукта, содержащего 65"о гидрокортпзона. во

Пример 8. 11 Р -Гидроксилир >ванне динатриевой соли 21-фосфата 6 *—

-фтор-16 Х, 17 4 -изопропилидендиоксипрегн-4-ен-21-ол-3,20-диона при помощи Т е Ье веИа orchid È.

Процесс трансформации ведут по примеру 4. В колбу вносят 150 „мг 6 c(-фтоо-1 6 ос, 1 7 а. -изопропилщ ендиоксипрегн-4-ен-21-ол-3,20-диона (нагрузка 1 r/: в виде водного раствора динатриевой соли

21-фосфата.

Получают 6 4,-фтор-16 * 17 ot,— изопропилидендиоксипрегн-4-1 1 .Р, 2 1-диол-3,20-дион с выходом 60-70% по хроматографическому анализу культуральной жидкости.

Формула изобретения

1. Способ получения 11 Ь 21-диоксистероидов общей формулы где R< — атом водорода или фтора;

R — атом водорода; — гидроксильная группа или R и R вместе составляют изопропилидендиоксигруппу, путем микробиологического гидроксилирования при помощи культуры гриба такого, как TiegkewePfa orch idio выращенного в аэрируемых условиях на питательной cnege, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, про из водны х

21-оксистероидов в растворителе, о т л ич а ю ш и и с я тем, что, с целью интенсификации и упрощения процесса, используют водный раствор натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов обшей формулы )(555115

Составитель T. Илюхина

Редактор Н. Джарагетти Техред А. Богдан Корректор Н Бугакова

Заказ 412/12 Тираж 572 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 где и, К и R имеют указанные значения;

Р -остаток натриевой соли янтарной или фосфорной кислоты -COCH CHgCOONa иьи - РО ОИа) .

2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й5 с я тем, что в качестве гриба используют

Силам,Хана ш айа .

Источники информации, принятые во вни(10 мание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство СССР № 370229, кл. С 12 3. 13/00, 1973 г.

2. Патент США N3419470,,кл. Я60195.51, 1968 г.

3. Могильницкий Г. M., Кащеенко К. А.

Особенности трансформации 21-ацетата веil щества, $ Рейхштейна грибом Т вфИещеИа ото| 616. Прикл. биохимия и микробиология", 1973 г., вып. 3, т. 9, с. 380.

4ТNiki и др., А рЪоврЬотфаЬion of зЬето дв, Chain. and Pha rn. ВиИ. 1974 г., у. 22, № 7. с. 1439.