Способ получения -сульфоната в-цепи инсулина человека

 

О П И С "А -Н-И?=Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

«»696011 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 220777 (21) 2502756/23-04 с присоединением заявки Ио (23) Приоритет (51)М. Кл.

С 07 С 103/52

Государственный комитет

СССР по делан нзобретеннй н отнрытнй (53) УДК 547.964. .4.07 {088,8) Опубликовано 05,11.79. Бюллетень Ио 41. Дата опубликования описания 0811.79

Ж.Д.Беспалова и М,И.Титов (71) заявитель Всесоюзный кардиологический научный центр Академии

Медицинских Наук СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Б, S -СУЛЬфОНАТА

В-ЦЕПИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к способу получения S,S -сульфоната В-цепи инсулина человека, биологически активного соединения, применяемого

5 в медицине.

В литературе известен способ получения B-цепи инсулина человека (1) с использованием твердофазного метода синтеза пептидов, не гарантирующего чистоту конечного продукта, Кроме того, удаление, защитных групп на последних стадиях синтеза, проходящее в жестких условиях, приводйт

15 к деструкции синтезированного продукВ другом известном способе получения В-цеди инсулина человека {2) используют на последней стадии для удаления защитных групп обработку натрием в жидком аммиаке. При этом идет деструкция молекулы с полным отщеплением однoгb остатка треонина.

Таким образол, в обоих описываемь1х способах получаемый продукт по свое" му строению отличается от В-цепи инсулина человека, Наиболее близок к описываемому спос?б попучения S,S — сульфоната В-и 11» инсулина человека путем voH—

) 1.. 11(:.1 1ll11, 1111зшнх защищенных пеllтидов

2 последовательности 1-8: (карбобензоксифенилаланил-валил-аспарагинил-глутамил гистидил-лейцил)-цистинил-бис-глицин с 9-14: карбобензокси-о-трет-бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валил-f-трет-бутиловый эфир-глутамил-аланил-трет-бутил-оксикарбонил-.гидраэидом, и 15 -20: бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцнл-тирозил-лейцил- валил)-цистннил-бнс-глицин с 21-30: карбобенэокси- —

-трет-бутиловый эфир-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-F-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонином, Полученные фрагменты 1-14 и 15-30 конденсируют аэидным методом, защитные группы удаляют обработкой продукта конденсации HBr в трифторуксусной кислоте, затем проводят окислительный сульфитолиз и выделяют целевой продукт {.32.

Основным недостатком известного способа является низкий выход на стадии конденсации пептидных фрагментов. Так, конденсация фрагментов последовательности 1-14 и 15-30 дает целевой продукт с выходом не более

13%.

6960)1

Целью изобретения являет ся повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается

/ описываемым способом получения S, S

-сульфоната В-цепи инсулина человека путем конденс ации ни зших з ащищенных пептидов, частичного удаления защитных групп, заключительной конденсации полученных пептидных фрагментов, полного удаления защитных групп и окислительного сульфитолиза, заключающегося в том, что в качестве низших защищенных фрагментов используют пептиды последовательности 9-15: трет-бутилоксикарбонил-гидразид карбобензокси-серил-гистидил-лейцил-валил- f-трет †бут-глутамил †аланил15

-лейцина и 16-20: о-нитрофенилсульфенил-0-бензил-тирозил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цис теи нил-глици н; заключительную стадию конденсации проводят с пептидом последовательности 1-15: бис-трет- бутилоксикарбонил-гидразид бис- (карбобен зокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутаминилгистидил-лейцил) -цистеинил-бис- (глицил-серил-гистидил-лейцил-валил- 25

-трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина) и пептидом последовательности 16-30: о-нитрофенилсульфенил -0-бензил-тирозил-лейцил-валил-S-ацетамидоме тил-цистеинил-глицил-Д -трет-бутил- 30

-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-.

-6-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонином

Использование описываемого способа 35 конденсации фрагментов последовательности 1-15 и 16-30 позволяет получить целевой продукт с выходом 40%;

Пример 1. а. бис-(Карбобензокси-фенилаланил- 40

-валил-аспаргил-глутамил-гистидил-лейцил) -цистинил-бис-(глицил-0-трет-бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валил) -$ -трет-бутиловый эфир-глутамил-аланил-трет-бутилоксикарбонил-гидразид, 45

0,120 г карбобензокси-о-трет-бутиловый эфир-серил-гистидил-лейцил-валил-Я-трет-бутиловый эфир-глутамил-аланил-трет-бутил-оксикарбонил-гидразида суспендируют в 5 мл метанола и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение двух дней.

Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре водой и метанолом, фильтрат упаривают досуха, растворяют остаток в 2 мл гексаметанола,добавляют к раствору 0,120 г бис-(карбобензокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутамил-гистидил-лейцил)— .-цистеинил-бис-глицина и 0,031 г дициклогексилкарбодиимила, выдерживают два дня при 0 С и два дня при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, разбавляют фильтра эфиром, отфильтровывают выпавший оса док, промын ают е ro на фильтре смесью метанол — эцио, сушат и полу тают 0,125 r продукта, со держащего 1,2 (1) цистеина, 1,8 (2) гистидина, . О, 7 (1) аспарагиновой кислоты, 0,4 (1) серина, 1,0 (1) глицин а, 1, 5 (2 ) глутами нов ой кислоты, 1,7 (2) валина, 0,6 (1) .фенилаланина, 1,8 (2) лейцина, 0,7 (1) аланина.

Здесь и далее в скобках указано теоретическое количество аминокислот. б. бис- (о-Нитрофенилсульфенил) -бис-{глицил- =трет-бутиловый эфир-

-глутамил-аргинил -глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-Я-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонин.

К раствору 1,0 г бис-(о-нитрофенилсульфенил-лейцил-тирозил-лейцил-валил)-цистеинил-бис-глицина и

0,2 г и-нитрофенола в 15 мл диметилформамида при -10 С добавляют 0,3 г дициклогексилмочевины, разбавляют фильтрат водой, экстрагируют этилацетатом, сушат и упаринают экстракт досуха. После кристаллизации остатка из смеси изопропилоный спирт-гексан получают 0,6 r (50%) продукта, т.пл.

270 С (разл); 1с(..) . -22 (c=I, диметилформамид).

Найдено, Ъ: С 54,39; Н 6,73;

С st Н ио И1ь 024 84 °

Вычислено,%: С 54 39; Р брОО.

0,9 г карбобензокси-1-трет-бути-. ловый эфир-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-Я-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонина растворяют в 10 мл метанола, добавляют 5,36 мл 0,10 н,сер ной кислоты и гидрируют в присутствии палладия на угле в течение трех дней °

Катализатор отфильтронывают, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в 50%-ном метаноле и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит

ИРА-410 (ОН-форма) . Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре 50%ным метанолом, упаривают фильтрат досуха, сушат остаток в вакууме над пятиокисью фосфора и растворяют в 4 мл диметилформамида, K полученному раствору добавляют. 0,4 г продукта, полученного выше, ныдерживают один день при комнатной температуре, разбавляют эфиром,.отделяют осадок центрифугиронанием, кристаллизуют из метанола и получают 0,7 r (77%) продукта, т.пл. 174-178 С;(с(.3 -26 (caI, диметилформамид).

Найдено, Ъ: С 56,89; Н 7 33, Вычислено,Ь: С 56,92; Н 6,85. в . S Б -Дисульфонат В-цепи.

50 мг продукта, полученного на стадии а, растноряют н 10 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 ч при комнатной температуре, упаривают досуха, разбавляют остаток водой и снова упаринают досуха. Эту опера696011 цию повторяют еще три раза. Остаток после упаривания растворяют в. 10 мл диметилформамида, добавляют 0,07 мл

2,00 н.раствора HCI в тетрагидрофура». не, при -20 С добавляют 0,1 мл раствора, содержащего 1,9 мг нитрита натрия, выдерживают 30 мин при -20 С, охлаждают полученный аэид до -40 C и нейтрализуют триэтиламином.

62 мг продукта, полученного на стадии б, растворяют в 5 мл метанола, охлаждают до О C и добавляют

0.,1 мл уксусной кислоты и 0,1-мл

0,3 н.раствора НС1 в метаноле.. Через

10 мин смесь упаривают досуха, растворяют остаток в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит HPA-.410 15 (OB-форма) . Смолу отфильтровывают, промывают на Фильтре. водой, упаривают фильтрат досуха, растворяют остаток в минимальном количестве диметилформамида и при -40 С добав- 20 ляют к раствору, содержащему азид.

Полученную смесь выдерживают три дня при -5 С и два дня при комнатной температуре, уп арив ают досуха, ост аток растворяют в 30 мл трифторуксус- Q5 ной кислоты и в течение 2 ч пропускают через раствор сухой бромистый . водород. Раствор упаривают досуха при комнатной температуре, сушат остаток в вакууме над твердой щелочью Зр и пятиокисью фосфора, растворяют в

10 мл диоксана и 6 мл 0,2 н.трис-

-буфера (рН 8,1). К полученному раствору добавляют 110 мг сульфита натрия и 60 мг тетратионата натрия, выдерживают 12 ч при комнатной тем- пературе и 2 ч при 37 С, диализируют б ч против нескольких смен дистиллированной воды, раствор после диалиэа упаривают до наибольшего объема и лиофилизуют. Получают 12 мг (13а) 40 продукта, (d.1 > -95 + 5 (c=0,1, 0,5 н,уксусная кислота) .

Аминокислотный анализ . лизин 1,15 (1), гистидин 1,92 (2), аргинин 0,92 (1), аспарагиновая кислота 1,05 (1), треонин 1,94 (2), серин 0,97 (1),глутаминовая кислота 3,18 (3), пролин

1,10 (1.), глицин 3,0 (3),.аланин

1.,0 (1), цистеин 1,59 (2)., валин

2,85 (3)., лейцин 3,77 (4), тирозин, 50

1,85 (2), фенилаланин 2,72 (3).

Электрофорез проводят на бумаге при напряжении 1000-1200 В и экспозиции 50-60 мин в 2Ъ-ной уксусной кислоте, проявляя бенэидином и хло- 55 ром, и в буферном растворе, содержащем 4 М мочевину, муравьиную кислоту (13:2), проявляя реактивом Паули.

Во всех случаях продукт был индивидуальным, его подвижность сов- 6р йадала с подвижностью бис-сульфоната

В-цепи инсулина быка, выделенного из природного инсулина и использованного в качестве свидетеля.

Пример 2. 65 бис-трет- Бутилоксикарбонил-гидразид бис-(карбобензокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутаминил-гистидил-лейцил)-цистеинил-бис-(глицил-серил-гистидил-лейцил-валил-Д -трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина) (E).

1,6 г бис-(карбобензокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутаминил-гистидил-лейцнл) -цистеинил-бис-глицина растворяют в 15 мл диметилформамида и добавляют продукт, полученны1: после гидрирования 1,65 г трет-бутилоксикарбонил-гидраэида карбобензокси-сеоил-гис идил-лейцил-валил- )) -трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина. Раствор охлаждают до О С и при перемешивании добавляют 2,1 г и-нитрофенола и 0,45 г дициклогексилкарбодиимида. Смесь выдерживают в течение трех дней при комнатной температуре, выпавшие кристаллы отфильтровывают, фильтрат разбавляют 0,5н, серной кислотой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают 2,5 г (88%) продукта. Аминокислотный состав: гистидин

2,16 (2), аспарагиновая кислота 1,09 (1), серин 0,67 (1), глутаминовая кислота 2,00 (2), глицин 1,17 (1), алании 0,89 (1), цистеин 1,08 (1), валин 1,68 (2), лейцин 3,10 (3), фенилаланин 0,85 (1). о-Нитрофенилсульфенил-О-бензилтирозил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цистеинил-глицил- -трет-бутилглутамил-глицил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-F-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонин (П) .

2,02 г о-нитрофенилсульфенил-О-бенэил-тироэил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цистеинил-глицина растворяют в 30 мл диметилформамида, добавляют 0,325 мл триэтиламина, о смесь охлаждают до -10 C и добавляют продукт, полученный после гидрирования 3,58 r карбобензокси-)-трет-бутил-глутамил-аргинил-фенилаланил-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил—.с-трет-бутилоксикарбонил-лизил-треонина, Смесь выдерживают в течение 30 мин при -10 С и затем еще в течение суток при О С, разбавляют

0,5 н.серной кислотой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат и получают 4, 38 г (82:) продукта (с -19 (с=2, диметилформамид) . Аминокислотный состав: лизин 0,96 (1), аргинин 0,89 (1) треонин 1,73 (?), глутаминовая кислота 1, 00 (1), пролин 1, 04 (1), глицин 2,08 (2), валин 1,17 (1), лейкин

1,03 (1), тироэин 1,89 (2), фенилаланин 1,84 (2) .

S, S -сульфонат В-цепи инсулина челов ек а. а. 0,260 r продукта II растворяют в 5 мл диметилформамида и добавляют

О, 60 мл уксус юой кислоты и несколь кэ капель метанола, К полу - е,«и му,,..т696011 (2), аргинин ая кислота 0 (2 ), серин 0 ислота 3, 00 глицин 2,96 валин 2,83 фенилаланин

3 (2),,1,05 (1), ас— ,97 (1), трео,99 (1), глута(3), пр олин (3), аланин (3), лейцин

3,00 (3), тидин ),90 парагинон нин 1,96 миноная к

0,97 (1), 5 1,00 (1), 3,96 (4), розин 2,0 формула изобретения цНИИПИ 6700/25, тираж 513

Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вору при перемешивании добавляют

0,125 r тиомочевины, выдерживают в течение 2 ч при комнатной темпера,туре, разбавляют эфиром, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром сушат и растворяют в 5 мл диметйлформамида. б, 0,200 r продукта I растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты и вы держивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают, остаток растворяют в 2 мл диметилформамида и добавляют 0,2 мл 3,6 н, Раствора хлористого водорода в тетрагидрофуране. Полученную смесь оха лаждают до -30 C и при перемешивании добавляют О, 02 мл бутилнитрита.

Смесь перемешивают в течение 20 мин при -30 С, с помощью триэтиламина доводят рН раствора до 8,5 и добавляют раствор, полученный по методике а, Смесь выдерживают при

-5 С в течение 48 ч, нагревают до комнатной температуры и добавляют

0,6 мл уксусной кислоты, 0,6 r фенола и 0,075 r иода в 1,мл метанола.

Выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч, добавляют несколько капель 1 М раствора тиосуль-. фата натрия, разбавляют водой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат, Полученный про- 30 дукат растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты и в течение 1 ч пропуе кают ток бромистого водорода, упаривают, остаток обрабатывают эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Полученный продукт растворяют в 10 мл воды, с помощью 1 н. едкого натра доводят рН раствора до 7,0 и добавляют 0,380 r сульфита натрия и 0,380 г тетратионата натрия. Смесь выдерживают в течение су ток при комнатной температуре, диализуют против дистиллированной воды, упаривают до небольшого объема, оста- ток лиофилизуют, полученный продукт растворяют в 45 мл 5%-ной уксусной

;кисЛоты и добавляют 45 мл насыщенного .Раствора пикриновой. кислоты. Смесь вывора пикриновой кислоты. Смесь выдержив ают в течение суток при 0 С, выпавшие кристаллы отфильтровывают, растворяют в небольшом количестве ,муравьйной кислоты и фильтруют через колонку (2 х 70 cM) с сефадексом

Г-25 М/1 н. CHsCO0ri). Получают

0,15 r (40%) продукта с (с(,.) > -100 С. (c=0,1, 0,5 н. СН СООТГ). Аминокислотный состав: лизин 1,02 {1). гисти-, /

Способ получения S,S -сульфоната

В-цепи инсулина человека путем конденсации низших защищенных пептидов, частичного удаления защитных групп, заключительной конденсации полученных псптидных фрагментов, полного удаления защитных групп и окислительного сульфитолиэа, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве низших защлщенных пептидов используют пептиды последовательности

9-1 5: трет-бутилоксик арбснил-гидра зид карбоб ен зокси-серил- гистидил-лейцил-валил-))=трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина и 16-20:о-нитрофенилсульфенил-О-бензил-тирозил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цистеинил-глицин, а заключительную стадию конденсации ведут с пептидом последовательности

1-15: бис-третбутилоксикарбонил-гидраэид бис-{карбобенэокси-фенилаланил-валил-аспарагинил-глутаминил-гистидил-лейцил)-цистеинил-бисвЂ(глицил-серил- гистидил лейцил-валил-трет-бутил-глутамил-аланил-лейцина) и пептидом последовательности 16-30; о-нитрофенилсульфенил-О-бензил-тирозил-лейцил-валил-S-ацетамидометил-цистеинил-глицил-Д—

-трет-бутил-глутамил-аргинил-глицил-фенилаланлл-фенилаланил-тирозил-треонил-пролил-Я-трет-бутилокслкарбонил-лизил-треонином.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

j.öâà÷êHH )О.П и др, Лаборатор1 ный синтез инсулина человека. ЖОХ, 1973, 43, Ф 1, 216

2. КсАэо сюМв P.G,7ometsV,o А.М е» oe.ansu&n pept des.Х1.ТЪе synthesis о1 the В ch(,ann оК Ъовоп insulin and its сотт Ыьс Мо,. аН,h the

naturals cha1n о% Во Ье ввЮюto g ånenatå и ы Ы act1witw." 1. Àtnen. С е1 1 soc., (966,85,164.

3. Авторское свидетельство ".CCP

Р 487066, кл. С 07 С 103/>2, 1972.