Способ получения модифицированного водорастворимого препарата целлюлозы
(ii) 709631
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 09.0877 (21) 2526576/23-04
Союз Соеетскик
Социалистическик
Республик (51) М. Кл.
07 Q 7/02//
А 61 K 37/48 с присоединением заявки Йо (23) Приоритет
Государственный комитет
СССР оо делам изобретеннй и открытнй
Опубликовано 15,0180. Бюллетень М 2 (53) УДК 547.15. .07(088.8) Дата опубликован и я описания 1 5 0 1.8 0 (72) Авторы изобретения Д IO. БалцеРе, А.к. АРен и Д. Я. ДайЯ
-(71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО
ВОДОРАСТВОРИМОГО ПРЕПАРАТА ЦЕЛЛЮЛОЗНЫ
Изобретение относится к области получения иммобилизованных ферментов.
Одним из перспективных направлений применения ферментов, в частности целлюлазы, является ферментативный гидролиз целлюлозы, в том числе целлюлозы-отходов лесной и деревообрабатывающей промышленности.
Известен способ получения иммобилизованной целлюлаэы с использованием пенополиуретана в качестве матрицы fl); по этому способу получают нерастворимый препарат целлюлвзы.
Однако процессы переработки целлюлазы, твердого и.плохорастворимого субстрата, требуют применения растворимых целлюлазных препаратбв.
Известен способ получения модифици-2О рованного водорастворимого препарата целлюлозы путем связывания целлюлаэы с полимерами (2), представляющими собой синтетические сополимеры этилена и малеинового ангидрида, винилацетата и малеинового ангидрида и др.
Растворимый препарат целлюлазы получают обработкой фермента суспензией сополимера в буфере (рН 7,48) при перемешивании в течение 24 ч при.4 С. Затем проводят центрифугирование, диализ и лиофилизацию.
В связи с тем, что применяется большая по отношению к полимеру концентрация фермента (фермент: полимер — 1:0,25), происходит поперечная сшивка молекул полимера ферментом. Это вызывает образование конечных продуктов с большой молекулярной массой и, следовательно, плохой растворимостью.
Выход растворимого препарата целлюлазы 18Ъ, активность 60Ъ от исходной активности фермента, Данный способ обеспечивает относительно низкий выход целевого продукта и сопровождается значительными потерями фермента, .Целью изобретения является увеличение выхода препарата. Поставленная цель достигается использованием при иммобилизации целлюлазы природного полимера-альбумина, предварительно активированного.
Описывается согласно изобретению, способ получения модифицированного водорастворимого препарата целлюлазы путем ковалентного связывания ее с полимером, в качестве которого используют природные полимеры—
709631 а 1 ь буми ны, акти вирова и ные глутароBRIM циальдегидом при BE.<-..оном сооТ ноIIOIIии альбумин1 глутароный диальдегид-1:8-25, а связывание целлюлаэы с полимером проводят при весовом соотно1нении целлюлаэа: полимер 1:1 — 3..
Ввиду того, что используются товарные альбумины, содержащие фракции с различным содержанием ИН2-групп и раз— личной молекулярной массой и нвиду возможных стерических затруднений, глутаровый диальдегид берется в избыточном количестве. В этом случае условия активирования альбуминон оптимальные для введения максимального количества. CHO-групп, активных по отношению к NIi -группам фермента.
Высокое содержание активных
CHQ-групп в активированном альбумине и небольшая концентрация
Ферме.та по отношению к полимеру способствует присоединению нескольких ИП -групп целлюлазы к одной молекуле альбумина и тем самым ограничивает рост молекулы целевого продукта, что обуславливает хорошую растворимость последнего, Кроме того, окружение Фермента альбумином,, электростатически заряженным природным полимером, также увеличивает гидрофильность препарата.
В11сокая концентрация альбумина полностью обеспечивает присоедине.1ие цеглюлаэы и исключает потери
Фермента.
Процесс обычно проводят следующи:.:! обра з ом.
;: льбу:лин (2Ъ-ный раствор) активируют глутароным диальдегидом,(25Ú-ный раствор) при весовом cooTHQUении
1:8-25 в течение 24 ч при 20ОС, отделяют избыток диальдегида гельфильтрацией на сефадексе Е3-25, с послецующим связыванием фермента и активированного альбумина в течение 24 ч при
Выход препарата в пересчете на целлюлазу и альбумин 10 0Ъ, активность его превышает активность исходной целлюлаэы на 30-40Ъ.
П р м е р 1. 0,20 г яичного альбумина растворяют в 10 мл воды, добавляют 2 мл (2,08 г) глутарового диальдегида. После 24 ч выдержки при 20"C отделяют избыток глутарового диальдегида гельфильтрацией на сефадоксе Ы-25. К 100 мл водного раствора активиронанного альбумина цобавляют 0,10 г целлюлазы. Через
24 ч водный раствор препарата природен для ферментативного расщепления целлюлозы. Выход в пересчете на целлюлазу и альбумин 100Ъ. Активность 132Ъ от исходной, Определение акт,1вности фермента.
Активность целлюлазы определяет49 по методу Мандельса-Вебера.
Оот в ет ст Ве!i!Io л1ет Г> i j IIE111. 1ю1; а !в ная актив! эсть o!IpEå oii IE -„. 1 я по ко— личеству редуцируюших сахаров, образуюцихся при гидролизе 50 мг (0, 5 х О, 5 см) бума ги 1," 1! а(.!пап л1 1 в течение 1 ч при 50 С в 0,05 н ацетатном буфере (pH 4,8), П р и м e p 2. 0,30 г молочного альбумина растворяют 15 мл воды, добавляют 2,4 мп (2,49 г) глутарового.диальдегида. После ?4 ч выдержки при +20 С отделяют избыток диальдегида гель-фильтрацией íà сефадексе 61-25. К 130 мл водного раствора активированногo альбумина добавляют 0,20 г целлюлаэы. Через 24 ч определяют целлюлазную активность.
Выход препарата,00Ъ. r1ктивность
130,5Ъ от акTxBI Пример 3, 0 20 r бычьего сывороточногo альбумина растворяют н 10 мп воды, добавляют 3 мл (3,12r) глутарового диальдегида. 11оследующую обработку проводят аналогично описанным примерам. К 108 мл водного раствора активиронанного альбумина добавляют 0,06 г целлюлазы. Выход препарата 100Ъ. Активность 134Ъ от активности исходной целлюгазы. Пример 4. 0,15 г яичного альбумина ра"ò.âîðÿþò в 7,5 мл воды, добавляют 3,12 г глутарового диальдегица. После 24 †часов выдержки при +20 С отделяют избыток глутауоВо;о диальдегида гельфильтрацией на сефадексе С.-25. Методом оксимирования определяют содержание альдегида н: изкомолекулярной фракции 0,08 r. Для активации альбумина израсходовано 3,04 г альдегида. К полученным после гльфильтрации 98 мл водного раствора активированного альбумина (0,15 г альбумина : 3,04г циальдегида = l;20) добавгяют 0,15 r целлюлаэы (цел";юлаза: а.:ьбулн1н = 1:1) Через 24 ч определяют целлюлазную активность модифицированного нодорастворимого целлюлазного препарата. Она равна 132Ъ от активности исходной целлюлазы„ Выход нодораcTBoðlìoãо препарата в пересчете на целлюлазу и альбумин 100Ъ. Пример 5. 0,10 г молочного альбуми 1а растворяют в 5 мл воды„ добавляют 2,6 г глутарового диальдегида. После 24-часовой выдержки, гельфильтрацией на сефадексе C-25 отделяют неприсоединенный диальдегид. К 86 мп раствора активированногo альбумина (альбумин: диальдегид 1:25) добавляют 0,05 г целлюлазы (соотношение целлюлаза: альбумин = 1:2). Через 24 ч целлюлазная активность составляет 138Ъ актив!!ости исходной целлюлазы. 709631 Формула изобретения Составитель О. Скородумова Редакто Л. Емельянова Тех е Н.Бабурка Корректор M. Пожо Заказ 8699/31 Тираж 495 ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий Подписное Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 В, хол .), lë;>; ñòâîðèìîãî целлюлазного препарата 1001. Пример 6. 0,30 r бычьего сывороточного альбумина растворяют в 15 мл воды, добавляют 2,7 г глутарового диальдегида. После 24часовой выдержки, гельфильтрацией отделяют неприсоединенный диальдегид. К полученным 118 мл водного раствора активированного альбумина (альбумин: диальдегид 1:8) добавляют 0,1 г целлюлазы (целлюлаза:альбумин=1:3). Способ получения модифицированного водорастворимого препарата целлюлазы посредством ковалентногс связывания целлюлаэы с полимером, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве полимера используют альбумины, предварительно активированные глутаровым диальдегидом при весовом соотношении альбумин: глутаровый диальдегид 1:8-25, а связывание целлюлазы а полимером проводят при весовом соотношении целлюлаза: полимер 1:1-3 соответственно. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент СШл Р 3929574, кл, 195-66, опублик. 1975. 2. Патент Великобритании 9 1290701, кл. С 3 Н, опублик. 1969 (прототип).
