Способ иммобилизации ферментов

 

с

°: техник ;,к к .."т: н-. 1,кс -;

ОПИСАН И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1Щ 548 6И

Союз Советских

Социалистических

Ресаублик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.10.75 (21) 2185181/04 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 28.02.77. Бюллетень ¹ 8

Дата опубликования описания 15.08.77 (51) М Кт 2 С 07G 7/02//

А 61К 37/48

Государственный комитет

Совета Министров СССР ча денете изобретений и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Л. Дьяков и В. К. Антонов

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ.CF1 — 1т

СНС0-N сн.= сн

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могуг найти широкое применение в татищевой, хи мической, микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике.

Известно большое количество способов иммобилизации ферментов на водонерастворимых носителях. В частности, известен способ иммобилизации ферментов на сополимере этилена и малеинового ангидрида (11.

Недостатком этого способа является значительная солюбилизация иммобилизованного фермента и ограниченность типов применяемых носителей.

Предложен способ получения иммобилизованных ферментов на карбоксилсодержащих полимерах посредством образования ковалентной связи между карбоксильной группой матрицы и свободными функциональными группами белков. Отличительным признаком метода является предварительная активация карбоксильных групп носителя. Активация достигается обработкой носителя, содержащего свободные карбоксилыные пруп пы, хлористым тионилом, а затем имидазолом. Иммобилизацию фермента проводят путем контактирования раствора фермента с активированным носителем. Предложенный способ введения имидазола не пригоден для углеводсодержащих полимеров, однако, если использовать мягкие активирующие реагенты, такие, например, как карбанилдии мидазол, можно ввести имидазольный остаток и в такого типа носители. Акти5 вированный носитель содержит ацилнмидазольные группы которые могут вступать в реакцию ацилирования со свободными функциональными группами белков (H N-группы, HS — группы цистеина, НО-)группы тирозиHa и т. д.).

15 Пример 1. Получение активнрованного носителя.

К 12 г полиметакриловой смолы — Апйегlite CG-50, ти п 11 («L. P. С. Chemicals Dyes», Великобритания) в 100 мл абсолютного хло20 рофор»а (бензола) приливают 12 мл хлористого тионила и смесь кипятят в течение 3—

5 час до прекращения выделения хлористого водорода. Избыток хлористого тионпла и растворитель отгоняют, затем последовательно

25 дважды добавляют по 50 мл абсолютного хлороформа (бензола) и упаривают с»есь досуха.

К сухой смоле прибавляют 5,г имидазоla, 60 мл хлороформа и 10 мл триэтиламина. Реакционную смесь кипятят с обратным холо30 дильником в течение 4 час. Смесь переносят

548613

Формула изобретения

Составитель А. Бочаров

Техред И. Карандашова

Редактор Л. Герасимова

Корректор Е. Хмелева

Заказ 1674/1 Изд. Мз 633 Тираж 589

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Типография, пр. Сапунова, 2

3 на фильтр и тщательно отмывают от избытка реа|гентов абсолютным хлороформом, Слегка желтоватый порошок активи рован но го носителя при хранении в вакуум-эксикаторе над

РзОз по крайней мере в течение 2 месяцев сохраняет способность реагировать с ферментами. Согласно результатам микроанализа полученная смола содержит 1,76o азота, т. е. приблизительно 10% свободных карбоксильных групп вступает в реакцию с имидазолом.

Пример 2. Иммобилизация а-химотрипсина.

1 г активированното носителя тщательно промывают 3 М раствором NaC1 в ацетатном буфере (рН 5,5), а затем буфером (ацетатным

50 мм или трис-НС1, 0,1 М) до рН в промывных водах, при котором предполагают проводить иммобилизацию. К смоле, подвергнутой такой обработке, прибавляют 250 мг а-химотрипсина в 6 — 10 мл соответствующего буфера. Реакционную смесь инкубируют при перемешивании в течение 3 часов при 25 С или

18 час при 4 С. После инкубации реакционную смесь переносят на фильтр и многократно промывают 3 М раствором NaC1 в ацетатном буфере до полного удаления белка, связавшегося со смолой за счет ионообменной сорбции.

Количество иммобилизованного а-химотрипсина (мг/г носителя), определенное по скорости гидролиза и-нитрофенилацетата при трех значениях рН 5,5, 6,7, 8,5 составило соответственно 3 — 4, 22, 40 — 50.

Пример 3. Иммобилизация фосфодиэсте5 разы яда гюрзы.

К 1 г активированного носителя, обработанного, как в примере 2, приливают раствор фосфодиэстеразы с удельной активностью 25 ед/мл.

Общее количество фермента в инкубационной

10 смеси приблизительно 100 ед. После инкубации полученный препарат промывают, как в примере 2. Содержание активного фермента на носителе при проведении иммобилизации при рН 6,7 составляет приблизительно 3% от

15 взятого в реакцию количества.

Способ .иммобилизации ферментов путем

20 нанесения фермента на носитель — карбоксилсодержащий полимер, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации, носитель предварительно активируют хлористым тионилом, а затем имидазо25 лом.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3616229, кл. 195 — 63, 1971 (прототип).