Способ определения скорости лизисафибринового сгустка

 

Союз Советских

Социалистических

Реслублнк

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ж

1 (б3) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 22.07.79 (21) 2798602/28-18 (53)hh Кл с присоединением заявки Йо

G 01 H 33/86

ГосударствеииыЯ комитет

СССР ио аеяам нзобретеииЯ и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 2304.81, Бюллетень ЙЯ 15 (53) УДК 615.151. 5 (088.8) Дата опубликования описания 23. 04 . 81 (72) Авторы изобретения

В.П. Торчилин, Е.В. Ильина и E Ã. Тищенко,/

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию биологических объектов.

Известен способ определения скорости лизиса фибринового сгустка путем инкубации его с раствором фибринолитического фермента с последующим измерением оптической плотности инкубационной среды (1g.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности, чтобы получить достоверные результаты .необходимо провести большую серию анализов (10-20 опытов)..

Цель изобретения — повышение точ- .15 ности способа.

Эта цель достигается тем, что фибриновый сгусток перед инкубацией помещают на проницаемую для белка подложку, затем располагают на по- 20 верхности раствора фермента и процесс инкубации ведут при постоянном равномерном перемешивании раствора.

Способ осуществляют следующим образом. 25

В гладкостенном цилиндре модельный сгусток готовят одним из известных методов. Нижний срез трубки, затянутый сеткой, к которой прилегает сгусток, опускают на незначительную 30 глубину в раствор фибринолитического фермента, находящегося в реакционном сосуде. Содержимое сосуда перемешивают со скоростью, достаточной для равномерного распределения прбдуктав деградации по всему объему раствора. По мере лизиса сгустка, который происходит только с нижней поверхности, верхние слои сгустка опускаются, прижимаются к сетке и в свою оче1 редь, претерпевают лизис. Отбор проб и определение концентрации продуктов деградации производят обычным способом.

Благодаря условиям осуществления способа белок поступает в раствор равномерно и концентрация раствора является истинным показателем скорости ливиса сгустка. достаточно одного, в крайнем случае двух опытов, чтобы получить точные данные.

Пример 1. Приготовление растворов.. Фибриноген растворяют в

0,1 н. фосфатном буфере рН 7,4, в котором содержйтся 0,02 М ЭДТА-2а.

Концентрация фибриногена 12 мг/мл.

Тромбин растворяют в 0,1 н,фосфатном буфере рН 7,4 так, чтобы кон центрация его составила 500 ед/мп.

824053

Время, прошедшее от начала лиэиса до данного измерения, мин

Оптическая плотнооть,%

Плотность растворения сгустка,Ъ изменение. (в зависимости от лизиса тромба) Контрольно- образца го образца с тромбом

0,481

0,487

0,487

0,488.0,481 0

0,012

0 i 030

0,060

0,499

0,517

0,548

12

24

Химотрипсин растворяют в 0 1 н. фосфатном буфере рВ 7,4.

Концентрация 0,25 мг/мя. Начальную оптическую плотность замеряют на спектрофотометре при длине волны

280 нм.

Получение фибринового сгустка.

Перед внесением растворов фнбриногена и тромбина в трубку, нижний срез которой затянут сеткой, последнюю с внешней стороны затягивают пленкой

0,5 мл раствора фибриногена а

0,1 мл раствора тромбина вносят последовательно на сетку при помощи дозирующих микропипеток, быстро перемешивают тонкой стеклянной палочкой и полученную массу выдерживают при 15 комнатной температуре в течение 1 ч.

Затем с сетки удаляют пленку и трубку с образовавшимся сгустком помещают в стаканчик с 20 мг раствора фермента на глубину 2-5 мм. Раствор фермента перемешивают при помощи магнитной мешалки со скоростью 150 об/мин. 3а скоростью лизиса фибринового сгустка следят по изменению (увеличению) оптической плотности при длине волны

280 нм во времени.

При проведении эксперимента берут два параллельных образца с тромбами и одну контрольную пробу.

Контрольная проба — изменение оптической плотности раствора фермента ЗО беэ фибринового сгустка, так как у раствора фермента в результате автолиза со временем происходит измене-. ние оптической плотности.

При проведении эксперимента за- 35 полняют таблицу, строят график приращения оптической плотности от времени и определяют tд сА. . В таблице приведены изменения оптической плотности в зависимости от 4р времени.

За .100% принимают оптическую плот- ность при полном растворении сгустка. Фиксируемое при этом время, это время полного растворения сгустка и оно служит величиной сравнения между .45 образцами.

По данным таблицы строят график, приведенный на чертеже.

По оси абсцисс отложено время в мин, а по оси ординат-приращение оптической плотности в Ъ при длине волны 280 нм. tg d, определяют построessex графика и уточняют методом наименьших квадратов. Примеру 1 соответствует прямая 1 на чертеже, tg угла наклона прямой равен 0,60., g p и м е р 2. Этот пример про,водят, в тех же условиях, что и пример 1, однако концентрация фибриногена h сгустке 7 мг/мл. Концеитраци ; химотрипсина та же, что и в примере

1 и составляет 0,25 мг/мл. Примеру соответствует линия 2 на чертеже, где tg угла наклона равен 0,74.

Пример 3. Условия те же, что и в примере 1. Концентрация фибриногена в сгустке 7 мг/мл. Концентрация химотрипсина 0,125 мг/мл.

Примеру соответствует прямая 3 с

tg угла наклона 0,44.

Пример 4. Условия и концентрация реагентов те же, что и в примере 1. Опыт проводят через месяц после проведения примера 1. Примеру также соответствует прямая 1 с tg угла наклона 0,61.

Иэ приведенного графика видно, kTo tg угла наклона прямой характеризует скорость растворения фибринового сгустка, причем с увеличением скорости увеличивается tg угла наклона.

С увеличением концентрации фибриногена плотность фибринового сгуста возрастает, скорость растворения уменьшается, а следовательно, уменьшается tg угла наклона прямой.

С увеличением концентрации фермента,лиэирующего сгусток, скорость лизиса увеличивается.

Предлагаемый способ быстро и с большой точностью позволяет определить скорость лиэиса фибринового сгустка, а в известном способе для получения результата необходимо

10-20 опытов.

824053 !

Продолжение таблицы

Плотность растворения сгустка,%

Время, прошед шее от начала лизиса до данного измерения, мин

Оптическая плотность, % образца с тромбом контрольного образца изменени (в завис мости от ливиса тромба) 0,491 0,592 0,101

41

90 0,495

120 0,495

150 0,500

185 0,505

200 0,508

0,627 0,131

0,693 0,198

0,730 0,230

0,754 0,249

80

100

100

0,757 0,249

Через 1 месяц

0,481

0,487

0,497

0,488

30

29

0,491

60

0,495

0,495

0,500

0,505

0,512

120

150

100

-180

100

210

Формула изобретения

Способ определения скорости лизиса фибринового сгустка путем инкубации его с раствором фибринолитического фермента с последующим измерением оптической плотности инкубационной среды, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения .точности способа, фибриновый сгусток перед инкубацией помещают на прони0,481 О

0,506 0,019

0,517 0,038

0,556 0,668

0,600 0,109

0,631 0,136

0,692 0,197

0,730 0,230

0,741 0,236

0,748 0,236 цаемую для белка подложку, затем располагают на поверхности раствора

4 фермента и процесс инкубации ведут при постоянном равномерном перемешивании раствора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. CafFney P.S. and Whitaher АМ

Thrombosis Res. 1979, vol, 14, р . 85-94.

824053

Щ7 Ф,мин б6 за

Составитель С. Малютина

Техред Н.Иайорош Корректор M. Коста

Филимон ПЙП "Патент", Г. Уигород, ул. Проектная,4

Уедакжр И ; ltaaaosa

М М(Заман :" 2099 / 64 Тирам 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

É33935, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5