Способ получения над-зависимой формиатдегидрогеназы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ , предусматривающий культивирование продуцирующих ее дрожжей рода Candida при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и. спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и эффективности процесса , в качестве продуцента используют штамм дрожжей Candida methylica ИБ4Ф1 У-670, культивирование ведут в проточных условиях, а в качестве источ ника углерода используют этиловый 8 спирт и формиат натрия в концентрации 0,01-0,1 и 0,03-0,07% соответственно от объема питательной сре:ды , при этом фоЕмиат натрия вносят при достижении i культурой, экспонен циальной фазы роста. ро 1 О1 KD СЛ

(191 (И}

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

И С

РЕСПУБЛИК

3(59 С 12 N 9 04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

tl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТСРСИСФЕУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,(21 ) 2946164/28-13 (22) 23.04.80 (46) 23.02.84. Бюл. 9 7 (72) А.M. Егоров, Т.B. Авилова, О.A. Егорова, Л.Сд Платоненкова, Н.С. Егоров и И.В. Березин (71.) МГУ им. М.В. Ломоносова (53) 577.15(088.8) (56) 1 ° Kato И °, Капо M. Tani J °, 0gata R» "Furif ication and Characterisation of Formate Dehydrogenase in Metha nolutilising Yeast ° Kloekera вр. а 220Х" Agr. Biol. СЬев, 38,1974, 111-116.

2В Egorov АВМС, Avilovs T.UP.,, Dikov M.M., Ророч V.Î., Rodionov Т,Ч.

Bereain I.V. "MAD-dependent Formste.

Dehydrogensse from Methy1otrophic

Bacterium. Strain I. Purification sqd

chaiscterisation". Eur. J.Biochem, 99у 1979, 569-576.

3 ° Schutte Н. ° Flossdorf J., .Sahm H. ° Ku1s M.-R. "Purification

snd properties of Гогвв1йеЬуйе deЬудто8еааве аай formate dehydi ogenase

fram Candida boidinii" ° Eur.J.B&ochem 62, У I, 1976р 151-160 ° .(54 ) (57 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЗАВИСИМОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАВЫ, предусматривающий культивирование продуцирующих ее дрожжей рода Csndida npu аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и.спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента, отличающийся тем, что, с целью повнаения активности целевого продукта и эффективности процес. .са, в качестве продуцента используют штамм дрожжей Candida methylics ИБФМ

У-670, культивирование ведут в проточных условиях, а в качестве источ-! ника углерода используют этиловый спирт и формиат натрия в концентрации оу01-оу1 и Обоз-оу07а соответ« ственно от объема питательной среды, при этом формиат натрия вносят при достижении,,культурой .эксцонен;циальной фазы роста.

871525

Изобретение относится к микробиологической промьпаленности, а именно к способам получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы из дрожжей, и может найти применение в фармацевтической, медицинской про- 5 мышленности, а также для научных исследований.

НАД-зависимая формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до двуокиси углерода при сопря- 10 женном восстановлении НАД+ до НАДН °

В связи с этим формиатдегидрогеназа может найти применение в окислительно-восстановительных процессах, связанных с регенерацией кофактора, 15 например при модификации стероидов, получейии аминокислот, а также в биоэлектрохимических системах окисления органических соединений для создания топливных элементов, в которых .НАДН выполнял бы функцию переносчика. электронов с органических соединений на электрод.

Известны высокоочищенные препараты формиатдегидрогеназы, выделенные из метанолиспользующих дрожжей Kloeckera sy. 2201 (1 ) и метанолиспользующих грамотрицательных бактерий штамма Р 1 (2 ). Однако указанные высокоочищенные ферментные препараты обладают недостаточно высокой каталитической активностью.

Кроме того, в качестве источника углерода в питательной среде для культивирования микроорганизмов-продуцентов используют метиловый спирт, З5 что усложняет процесс наращивания биомассы и снижает его эффективность так как возникает необходимость очистки сточных вод.

Наиболее близким по технической 4р сущности и достигаемому результату к предлагаемому способу является способ получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, предусматривающий. культивирование продуцирующих ее дрож- 45 жей рода Candida при аэрации на синте тической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2%-ный метиловый спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента Е31;

Недостатками способа являются периодические условия культивирования, которые не позволяют поддержи. вать культуру в одном и том же физио- логическом состоянии с высокой ферментативной активностью, а также недостаточно высокая активность фермента, составляющая 0,13 мкМ/мин.мг белка для бесклеточного экстракта 60 и 2,4 мкИ/мин мг белка для очищенного фермента.

Кроме того, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в производственных условиях, так как

on летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола.

Цель изобретения — повышение активности целевого продукта и эффективности процесса.

Цель достигается тегл, что в способе получения НАД-зависимой формиатдегидрогеназы, предусматривающем культивирование продуцирующих ее дрожжей рода Candida при аэрации на синтетической питательной среде, содержащий источники азота, фосфора, минеральные соли и спирт в качестве источника углерода, с последующим выделением фермента, в качестве продуцента используют штамм дрожжей

Candida me+hylicà ИБФИ У-670, культивирование ведут в проточных условиях, в качестве источника углерода используют этиловый спирт и формиат натрия в концентрации 0,01-0,1 и

0,03-0,07% соответственно от объема питательной среды, при этом формиат натрия вносят в среду при достижении культурой экспоненциальной фазы роста.

Повышение эффективности процесса происходит в результате культивирования в условиях протока, при которых культура поддерживается в одной и той же фазе рбста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения высокой формиатдегидрогеназной активности.

Проточное культивирование позволяет получать большие количества биомассы, чем периодическое, а использование в качестве источника углерода этилового спирта вместо метилового значительно упрощает технологию, что также приводит к увеличению эффективности процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Дрожжи Candida methylica ИБФМ

У-670 культивируют на синтетической питательной среде следующего состава, г/л: (NHg)g НРО4 0,5; (ИН4) Н РО, 15; КИО 4 ; МяБО4 025 дрожжевой автолизат 0,01) этиловый спирт 0,01-0,1Ъ по объему. Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1 ч ", при рН 6,0. Формиат натрия в концентрации 0,03-0,07% вносят в среду через 6-8 ч от начала культивирования при достижении культурой экспоненциальной фазы роста.

Для выделения фермента биомассу разрушают иа Ср-дезинтеграте путем растирания со стеклянными бусами центрифугируют при 4 000 g в течение 1 ч, Надосадочную жидкость используют для выделения и очистки

871525

ВНИИПИ Заказ 1138/5 . Тираж 522 Подписное

Ю

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4 формиатдегидрогеназы. Гомогенный фермент получают ионообменной хроматографией на ЛЭАЭ-целлюлозе с последующей гельфильтрацней на сефадексе 0-200. Активность полученного гомогенного препарата формиатдегидрогеназы составляет 16 мкм/мин.мг белка.

Пример 1..В качестве продуцента используют штамм метилотрофных дрожжей Candida methylica ИБФМ

У-670, который хранится в коллекции института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР в r. Пущино-на-Оке. Штамм защищен авторским свидетельством 9 449933, кл. С 12 С 11/18.

Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава, r/л: (НН4.)2 НРЙ4 0,5Р NH4 Н2РО4 1,5;

КЯО 4,0; MgS04 0,25; дрожжевой автолизат 0,01 . Вода дистиллированная. Значение рН среды доводят до

6,0 соляной кислотой. Стерилизация среды проводится 20 мин при 1 атм.

Этиловый спирт, используемый в качестве источника углерода, добавляют в среду после стерилизации в количестве 0,05% по объему.

Формиат натрия в концентрации

0,04% вносят в среду через 6 ч от начала культивирования при достиже нии культурой экспоненциальной фазы роста.

Культивирование проводят в ферментерах фирмы ЛКВ (Швеция) или .Braun Melsungen (ФРГ) в непрерывнопроточном режиме по хемостатному принципу.

Для предотвращения вспенивания в среду добавляют силиконовое масло (0,01%). Среду подают регулируемыми перистальтическими насосами, коэффициент разбавления Д 0,1 ч " .

Аэреацию проводят воздухом .из расчета 1 об. в мин/1 об. среды. Ско» рость вращения мешалки 400 об/мин, температура 28 С. Значение рН среды поддерживают постоянным (6,0) путем автоматической подачи щелочи (0,5%-ной NaOH). За ростом культуры следят, измеряя плотность суспензии. Выходящую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2 С и подвергают сепарированию на супер центрифуге при 2800 об/мин. Отсепарированные клетки (20 г) суспендируют в 40 мл 0,05 М фосфатного бУфеРа (КН2РО4-наок, РН 7,5), содержащего 1 мМ дитиотреитола, и разрушают íà CP-дезинтеграте (Швеция) при скорости вращения мешалки

3000 об/мин в течение 25 мин. Дез интеграт центрифугируют в течение

1 ч при 4000g. Надосадочную жидкость используют в качестве бескле5 точного экстракта. Полученный бес клеточный экстракт обладает формиатдегидрогеназной активностью, равной

0,54 мкМ/мин тамг белка. Выделение и очистку фермента до гомогенного состояния проводят согласно следую(ц щей методике: бесклеточный экстракт разводят в 2,5 раза дистиллированной водой и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную

0,02 М фосфатным буфером, содержа15 щим 1мМ дитиотреитола, Формиатдегидрогенаэу элюируют 0,1 М раствором ИаC1 в этом буфере.

Гомогенные препараты формиатдегидрогеназы получают гельхроматографией в колонке с сефадексом С-200 образцов, полученных в результате ионообменной хроматографии на

ДЭАЭ-целлюлозе. Активуость гомогенного препарата формиатдегидрогена зы, полученного гельфильтрацией, составляет 16 мкМ/мин ° мг белка.

Пример 2. Дрожжи Candida

methylica ИБФМ У-670 выращивают со;гласно примеру 1. В качестве источ.ика углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,050% и формиат натрия в концентрации. 0,01%.

Формиатдегидрогеназная активность бесклеточного экстракта составляет0,26 мкМ/мин тамг белка. Активность гомогенного препарата равна

7 мкМ/мин-мг белка.

Пример 3. Дрожжи Candida

methylica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источ40 ника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1Ъ и формиат натрия в концентрации 0,07%.

Формиатдегидрогеназная активность бесклеточного экстракта составляет

45 0,30 MK(1/Mèí ° ìã белка. Активность гомогенного препарата формиата равна 8 мкМ/мин мг белка.

Предлагаемый способ позволяет

«получить НАД-зависимую формиатдегид50 рогеназу с высокой ферментативной активностью (в 6-7 раз выае, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса путем применения проточных условий куль55 тиви сичного этилового спирта и.формиата в качестве источника углерода.

Кроме того, выделение гомогенного фермента осуществляют в три стадии в отличие от пяти стадий, используемых в известном способе.