Иммуносорбент

 

(1

М. Д. Смирнов, В. М. Земсков и А.;Б,. Алексеев

i

::-;1

Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Авторы изобретения (7I) Заявитель (54) ИММУНОСОРБЕНТ

Изобретение относится к области получения иммуносорбентов для иммунологических исследований.

Иммуносорбенты представляют собой иммобилизованные антигены (или анти5 тела), способные к специфическим реакциям. Переведенные в нерастворимую форму они связывают антитела (или антигены), которые при этом также становятся нерастворимыми. Отмывая затем иммуносорбент, удаляют все возможные примеси, загрязняющ;.е препарат антител (или антигена), которые далее, после диссоциацни имму о,о комплекса, можно выделить в чистом виде.

Одной из главных характеристик иммуносорбента является его емкость, т.е. то максимальное количество антител, которое можно извлечь одним миллилитром сорбента. Емкость в основном определяется количеством антигена, иммобилиэованного на одном миллиметре носителя и стерической доступностью этого связанного антигена. Известны различные иммуносорбенты. Для их получения белок ковалентно связывают с матрицей. Сложность синтеза иммуносорбентов состоит в том, что различные антигены имеют очень широкий спектр физико-химических и иммунологических свойств, и поэтому фактически каждый антиген требует индивидуального подхода.

Известен иммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с диазотированной парааминобензилцелпюлозой (РАВ-целлюлоза (1),С33, Указанный сорбент получают следующим образом. Парааминобенэилцеллюлозу модифицируют — диазотируют смесью соляной кислоты и нитрита натрия на хо" лоде. Затем при смешивании диазотированного производного ПАВ-целлюлозы с раствором коллагена происходит иммобилиэация последнего с образованием иммуносорбента.

Недостатком сорбента является его малая емкость (0,06 мг антител/мг кол=

;хагена в сорбенте1, поскольку не уда ется иммобилизовать достаточно большое количество антигена (коллагена) на единицу объема иммуносорбента. Это происходит по многим причинам. Во-первых, коммерческий препарат ПАБ-целлюлозы имеет малое количество парааминобензильных групп и они труднодоступны для таких крупных неглобулярных белков как коллаген. Во-вторых, получа-! емое при диазотировании активное производное IIAB-целлюлозы не стабильно в физиологических условиях, при кото рых происходит иммобилизация. Кроме этого, стерические затруднения приводят также к тому, что иммобилизованные белки, имеющие малое количество антигенных детерменант, как, например, коллаген, плохо работают как иммуносорбенты. Кроме того, изготовление иммуносарбентов на основе ПАБ-целлюлозы очень трудоемка. Полученные по этому методу сорбенты мало подходят для колоночной аффинной хроматографии вследствие малой механической прочности, которая вызывает усику сорбента в колонке и затрудняет работу с ним.

Целью изобретения является новый иммуносорбент на основе коллагена 1 типа, обладающего высокой емкостью, механической прочностью и минимальной неспецифической сорбцией компонентов сывороток.

Указанная цель достигается свойствами нового иммуносорбента, представляющего собой коллаген 1 типа, связанный с модифицированным полиакриламид.— ным гелем и имеющий следующий элементарный состав .(на сухое вещество), :

С 50,7010,02

Н 7,04+0,01

0 22,53i0,01

Н 19, 7210,01

S 0,003 0,001

Соединение представляет собой бе-. .пый водонаполненный гель с содержанием воды от 75 до 97, слаборастворимо в диамине и не растворимо в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте.

Способ получения нового иммуносорбента основан на известном методе (2) иммобилизации белков на полиакриламидном геле, модифицированном тлутаровым альдегидом и осуществляется следующим образом.

Сначала проводят модификацию полиакриламидного геля, которую ведут длительно и в большом избытке глутарово3053

10 !

4 го альдегида при комнатной температуре, так как амидные группы полиакрил. амида реагируют с альдегидами не очень активно. При использовании 3-10Х глутаровоГо альдегида в реакционной смеси за 10-30 ч при комнатной температуре достигается высокая степень модификации исходного геля. После окончания активации удаляют избыток глутарового альдегида и тщательно омывают водой активированный гель. Так как получаемое на этой стадии активное производное полиакриламида.и глутарового альдегида вполне устойчиво при физиологических условиях в широком интервале температур, дальнейшую иммобилизацию коллагена с полученным ранее гелем проводят в фосфатном буфере рН 8,0-9,4 при 16-25оС в течение

20-60 ч с последующим восстановлением азометиновых связей и альдегидных групп продукта. В результате степень пришивки белка подчас превышает 90%, т.е. почти весь коллаген связывается с нерастворимой матрицей-гелем.

Предлагаемый иммуносорбент позволяет сорбировать более 0,2 мг белка антител на 1 мл сорбента, что более чем втрое превышает аналогичный показатель известного сорбента.

Полученный иммуносорбент .отличается механической прочностью и химической стабильностью. Высокая механическая прочность обеспечивается исполь— зованием в качестве матрицы гранулированного полиакриламидного геля. Химическая стабильность связана с химической стабильностью геля-носителя и .,высокой устойчивостью коллагеновых белков к различным денатурационным воздействиям, и с тем, что образовавшиеся в ходе иммобилизации относительно лабильные азометиновые связи (основания Шиффа) в конечном продукте восстановлены. Указанные свойства позволяют в хроматографических колонках, наполненных сорбентом, обеспечить высокую скорость подачи раствора. Так, нанесение сыворотки и элюция проводятся со скоростью 1-2 мп/см2, а отмывка колонки от неспецифически связавшихся белков - со скоростью 3-20 мл/см, что вдвое быстрее, чем с известным сорбентом. Сорбент выдерживает многократные обработки водными растворами буфером с рН от 2 до 11, водными растворами

8 M мочевины, 5 М гуанидина, 3,5 M роданида натрия.

883053

15

25

30 суток перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре гель отфильтровывают, промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, 1 л 1 И хлористого натрия и снова 1 л 0,15 M

10 фосфатного буфера рН 9,0. Охлаждают гель в 0,15 M фосфатном буфере рН

9,0 до 0 С и, насухо отфильтровав, вноо сят его в охлажденный до 0 С раствор

° 5 цы

Пример 3. Условия получения соединения идентичны описанным в примере 1 за исключением времени активации носителя глутаровым альдегидом, которое в данном случае составляет 9 ч.

Полученное соединение содержит 1,2 мг иммобилизованного коллагена 1 типа на 1 мл геля конечного продукта. Общий объем полу- .енного геля составляет

240 мл. Количество соединенного с ноОтмеченные химическая стабильность, и механическая прочность иредлагаемого иммуносорбента позволяют использовать его в различных иммунологических исследованиях лабораторий и клиник десятки раз без заметного изменения сорбционных свойств и не перепаковывая хроматографические колонки.

Предлагаемый иммуносорбент обладает также очень низкой неспецифической сорбцией (около 1,7 мк г неспецифических белков на мл.сорбента).

Пример I. 60 г сухого гранулированного полиакриламидного геля (р. змер гранул 35 — 75 мкм) суспендируюч в 300 мл 0,15 M фосфатного буфера рН 8,5. Набухший гель занимает объем

230 мл. В суспензию вносят 150 мл

25Х-ного глутарового альдегида, доводят рН до 8,0 и оставляют перемешиваться на магнитной мешалке при комнатной температуре на сутки. После этого полученный активированный глутаровым альдегидом гель отмывают на воронке со стеклянным фильтром раствором хлористого натрия до полного исчезновения запаха глутарового альдегида и еще 1,5 л 0,15 M фосфатного буфера рН 9,0. Отфильтрованный насухо гель вносят в 230 мл раствора с концентрацией 2,3 мг коллагена первого типа в миллилитре фосфатного буфера 0,15 М, рН 9,0. Общий объем реакционной смеси 440 мл, в ней содержится в общей сложности 529 мг коллагена. После трех

5 r боргидрида натрия в 150 мл этого же буфера. Реакционную смесь интенсивно перемешивают на солоде магнитнои мешалкой в течение 40 мин, а затем отфильтровывают. Полученный восстановленный гель промывают 1 л холодного

0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, а затем при комнатной температуре заливают гель буфером 0,2 М глицин-НС1 рН

2 2 для полного разложения остатков

1 бо гидрида натрия. После ирекращения р

55 выделения пузырьков ыодор ц а гел промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера

P Н 9 0 и затем 2 л изотонического раствора хлористого натрия. Получается 240 мл геля, пригодного для использования в качестве иммуносорбента.

Один миллилитр конечного продукта содержит 2 мг иммобилизованного коллагена I типа (т.е. 90,7Х введенного в реакционную смесь белка иимобилизуется на носителе) . Состав сухого. вещества иммуносорбента включает 50,70% углерода, 7,04% водорода, 22,53Х кислорода, 19,72Х азота, 0,003% серы.

Полученное вещество представляет собой водонаполненный гель белого цвета, содержащий 75% воды, который не растворяется в воде, водных растворах солей и ни в каких распространенных органических растворителях за исключением диамина. Хранят полученный иммуносорбент при 4 С в изотоническом растворе хлористого натрия с добавлением

0,02Х азида натрия.

Пример 2. Условия получения соединения идентичны описанным в примере 1 за исключением того, что в качестве носителя для приготовления иммуносорбента берут 5 г крупнопористого гранулированного полиакриламидного гранулированного полиакриламидного геля (с тем же размером гранул!. Общий объем полученного геля составляет

180 мл. Полученное соединение содержит 1, 1 мг иммобилизованного коллагена I типа на 1 мл геля конечного продукта. Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,70Х углерода, 7,04Х водорода, 22,53 кислорода, 19,72% азота, 0,002Х серы. Полученное вещество представляет собой водонаполненный полиакриламидный гель, содержащий 97% воды.

Как видно из примеров 1 и 2, понижение содержания сухого вещетсва в составе геля-носителя с 25% (пример 1) до 3% (пример 2) приводит к снижению содержания иммобилизованного коллагена в конечном продукте из-за уменьшения количества активных групп, возникающих в результате активации матри883053 8 ки антитела растворены I3 иэотонп (eñком растворе хлористого натрия нейтрального рН, не содержащем глицпп».

Полученные элюаты, содержащие чистые антитела, при необходимости концентрируют ультрафильтрацией и хранят замороженными при -250С.

Формула изобретения

1О сителем коллагена зависит от степени активации носителя.

Как видно из примеров 1 и 2, на свойства полученного сорбента влияет время активации носителя глутаровым альдегидом, которое должно быть не ме нее 10 ч. Активация длительнее 30 ч нецелесообразна, так как это не ведет к увеличению степени пришивки коллагена к носителю.

Сорбционная активность полученных соединений иллюстрируется следующим примером.

Пример 4. 30 мл иммуносорбента, полученного в примере 1, заполняют колонку диаметром 16 мм и длиной

160 мм. Колонку с сорбентом, предварительно обработанным нормальной сывороткой, промывают 100 мл буфера О,1 глицин-НСI рН 2, 2, а затем изотоническим раствором хлористого натрия до нейтрального рН выходящего раствора. После этого наносится 100 мл им- . мунной сыворотки с титром 1:1000 по

РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) со скоростью 20-30 мл/ч, которая смывается изотоническим раствором хло ристого натрия до нуля оптической

11лотности при 280 нм выходящего из лонки раствора. Обычно требуется 300500 мл, жидкости для полного отмывания колонки от неспецифических белков, Для элюции связавшихся с сорбентом антител используют 100 мл О,l M буфера глицин-НС! рН 2,2 при скорости протока 5-10 мл/ч. Иэ 100 мл указанной иммунной сыворотки элюируется около 6 мг чистых антител, причем основная их часть выходит из колонки в объеме

6-10 мл. При этом выходящие иэ колонИммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с модифицированным полиакриламидным гелем, имеющий следующий элементарный состав (Ha сухое вещество1, %:

С 50,70 0,02

Н 7,0410,01

0 22,5310,01

20 14 19,7210,01

S 0,003+0,001

Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 75 до 97, слаборастворим в диамине и не растворим в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте., Источники. информации, принятые во внимание при экспертизе

1. R. Timpl, Н. Furthmayr, С.Steffen, M.DoIeschel, "Isolation of pure

anti-collagen antibodies using à specific lmmunoadsorbent technigue", Z.Immup1сatsforsch, 1967, 134, 4, 35 .391-396

2, Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. Т..I, М., 1976, изд-во

МГУ, с. 184.

Составитель О. Скородумова

Редактор Т. Кугрышева Техред Н; Майорош Корректор М Пожо

Заказ 10113/31 Тираж 400 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва X-35 Раушская наб. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4