Олигодезокситионуклеотиды,проявляющие матричные свойства в рнк-полимеразной системе из еsснеriснid coli

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«(>899571 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 130779 (21)2798760/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 23.01.82. Бюллетень ¹ 3

Дата опубликования описания 230132 М g> з

С 07 Н 21/04

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (53) УДК 547.455. .07(088.8) В.П. Кумарев, В.С. Богачев, Л.В. Баранов и М.И. Ривкин (72) Авторы изобретения

Щ (;NU»::: и АТтц(:1 (ТЕХН(1(:2Г!

ro oggPggg%k AH СССР (71) Заявитель

Институт цитологии и генетики Сибирск (54) ОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДЫ,ПРОЯВЛЯЮЩ(!Е

МАТРИЧНЫЕ СВОЙСТВА В РНК-ПОЛИМЕРАЗНОЙ

СИСТЕМЕ ИЗ (5СНЕй(СН(А COL!

Изобретение относится к новым биологически активным олигодезокситионуклеотидам общей формулы

О.р.- .СН, (I)

0 QO -S-сн (! О О и.

Olt„ где  — тимин, цитозин, аденин, гуанин, к — H, остаток тиофосфата 5-/ -циан(или N,N-дифенилкарбомоил)зтилфосфотиоата; и

1,2,3, проявляющие матричные свойства в PHKполимераэной системе иэ ;scherichi

co!i.

Соединения формулы составляют новую группу класса тиоаналогов природных полидеэоксирибонуклеотидов, отличаясь от последних типом связи между составляющими их мононуклсотидами,а от известных соединений наличием новых структурных фрагментов остатков гуаниловой и цитидиловой кислот.

Известные 2 -дезоксигексатиотими( дилаты и олигодеэокситионуклеотиды вследствие малой длины и неполного набора составляющих их мономерных нуклеотидов не являются полноценными аналогами ДНК и не проявляют матричные свойства при транскрипции в РНК15 полимеразной системе из Escherichia со! (1) и (2). цель изобретения — получение новых олигодезокситионуклеотидов, близких по своим биологическим свойствам природным ДНК и расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм.

Поставленная цель достигается но-выми олигодезокситионуклеотидами общей формулы I, проявляющими матрич25 ные свойства í PHK-полимеразной системе иэ Escherichia coli.

Способ получения новых олигодезокситионуклеотидов основан на реакции получения 2 -деэоксигексатиотимиди 30 латов, исходя из литиевой соли тн899571 мидил(или олиготимидил)3-фосфотиоатов и 2,5-дидеэокси-5 -иод произI ( водного тимидина, и состоит во взаимодействии производных деэоксинуклеозид-3 -Фосфотиоатов общей формулы

"100Н В

5 (i i)

0 -Ьк

0= 0 Кс

I с 5 -иод-производными тионуклеотидов общей формулы (i i i) где  — тимин, и -анизоилцитозин, 4(N-изобутирилгуанин; N -бен2 зоиладенин, 20

R2 — Н; олигодезокситионуклеотид ил, катион натрия или лития;

+ йл — Н, остаток L i - или йа-соли

S-p-циан(или й,N-дифенил- 25 каобомоил)этилфосфотиоата.

Пример 1.2 -Деэокси1тимидили -3,5 -три-(5 -дезокси-5 -тиотимилилил)-3,5 †(5-деэокси-5-тиогуанилил)-3,5 -дезокси-(5 -тиоцитидин)(, трsTpsTI sGрзсо (л)(!

Стадия I 2 -Деэокси(тимидилил-3, 5-!

-три(5 -дезокси-5 -тиотими)илил)— 3 5 †(5-дезокси-5 -тио-N -изобу- 0 ( (-.èðèëãóàíoçèí)) -3 -фосфотиоат (2). 35 (г

0,066 г 2 -деэокси(тимидилил-3,5

-ди-(5-дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 (!

-(5 -дезокси-5 -тиотимидин)3 -3 -фосфотиоат (TpsTpsTpsTps) пенталитиевои соли (0,05 ммоль) и 0,041 г литиевои соли 2,5 -дидезокси-5 !

-иод-, -изобутирилгуанозин-3 -S-I((Ы

-iN,N-дифенил)карбомоилэтилфосфотиоата (0,053 ммоль), встряхивают в 2 мл

:;и:-(етилформамида в течение 4 ч. Ко- 45 нец реакции определяют иодметрическим титрованием свободных тиофосфатных групп или ионообменной хроматографией. По окончании реакции смесь обрабатывают 15 мл ацетона осадок центри 7угируют, промывают ацетоном ,5х5 мл) и сушат в вакууме. Получают

0,095 r осадка, содержащего

0,046 ммоль S-p (й,й-дифенил)карбомоилэтильного производного (2 ).Полученный осадок растворяют в 2 мл, 0,5 н. гидроокиси лития, выдерживают

1 ч, экстрагируют толуолом (Зх2 мл) и водный слои нейтрализуют катионообменной смолой дауэксом 50(Н -фор+ ма) до рН 7,5. Смолу.отфильтровыва- Я ют и фильтрат лиофильно высушивают.

Получают О, 087 г осадка, содер;;<ащего 0,046 ммоль производного (2 ) (92 по результатам микрохроматографии на аминохроме). 65

Стадия II. 0,043 r продукта стадии, содержащего 0,023 ммоль

LI +-соли и 0,0217 r 2,5 -дидезокси-5 -иод-й4-анизоилцитидин (0,046 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида в течение 4 ч,раствор выдерживают еще 1 ч и продукт осаждают 10 мл ацетона. Осадок промывают ацетоном (Зх5 мл) и высушивают в вакууме. Затем его растворяют в 5 мл 25%-ного водного раствора аммиака, выдерживают 4 ч при 50(С, упаривают в вакууме и остаток растворяют в 1 мл 0,1 N бикарбоната аммония (рН 7,5), содержащего 10% этанола. Этот раствор наносят на колонку с сефадексом 6-25 (5 х 100 см) и элюируют тем же буфером. Первый пик собирают и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси вода — спирт (1:5) и упаривают досуха.

Эту процедуру повторяют еще два раза и затем продукт лиофильно высушивают. Получают 0,04 r (90%) пентааммонийной соли соединения 1 (82,5% в расчете на исходный (Tps )4 L i<)

Пример 2. 2 -geao((,cH (тимидилил-3,5 -три-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -(5-дезокси-5 -тиогуанилил)-3,5 †(5-дезокси-5 -тио(! ( цитидилил)-3 -3-(5 -дезокси-5 -тиоаденилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 ((-тиоаденозин) 3

ТРэТРъТР ТРъ ив СРв АР в Аб(7 (3).

Стадия I.2 -Дезокси(тимидилил-3,5 -три-(5 -дезокси-5 -тиоти(лидилил)-3,5 вЂ,5-деэокси-5 -тио-й -изобу-! (1 тирилгуанилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 ! (!

-тио-й4-анизоилцитидин)-3 -фосфотиоат (4).

0,043 г продукта I стадии примера 1, содержащего 0,023 ммоль (.((б -соли соединения 2 и 0,15 r литие.+ вой соли 2,5 -дидезокси-5 -иод-й4-анизоилцитидин-3-5-р-цианэтилфосфотиоата (0,024 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида 4 ч, выдерживают еще 1 ч и продукт выделяют как в стадии примера 1. Защиту с тиофосфатной группы проводят так же, но без экстракции толуолом. Получают 0,05 r осадка, содержащего

0,0215 ммоль LI+ соли соединения 4 (94%), которую очищают хроматографией на аминохроме.

Стадия II. 2 -Дезокси(тимидилил(-3,5 -три(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 вЂ, 5 -дезокси-5 -тио-N (-изобутирилгуанилил)-3,5 -(5 -дезокси-5 -тио-й -ачизоилцитидилил)—

-3,5 †(5 -дезокси-5 -тио-N4-бензоиладенозин)) -3 -фосфотиоат (5).

Продукт 1 стадии, содержащий

0,0215 ммоль Li+-соли соединения 4

7 ( и 0,018 r литиевой соли ?,5 -дидезокси-5 -иод-й<-бензоиладе((озин-3 (899571

-S-p-(N,N-дифенил)карбомоиЛэтилфосфОтиоата (0,0227 ммоль), встряхивают в 2 мп диметилформамида, содержащего

2Ъ воды, в течение 5 ч, выдерживают еще 2 ч и продукт выделяют как в ! стадии примера 1, промывая осадок в конце смесью этанол — ацетон (1:1,3).

Защиту с тиофосфатной группы снимают как в I стадии примера 1,используя для экстракции толуол (Зх 3 мп). Получают 0,054 г неочищенного продукта 1О содержащего 0,020 ммоль соединения

5 (93Ъ), который очищают ионообменной хроматографией на аминохроме.

Стадия III. 0,027 г соединения 5, содержащего 0,01 ммоль Li+-соли соединения а и 0,01 в 2,5 -дидезокси-5 -иод-N -бензоиладенозина

6 (0,02 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего 2Ъ воды, в течение 5 ч, выдерживают еще

2 ч и продукт выделяют как в ста- 20 дии примера 1, промывая осадок этанолом — спиртом (1:1,1). Снятие защит с оснований нуклеотидов и гель-хроматографию проводят как во II стадии примера 1, используя вместо сефадекса yg

G-25 сефадекс G-50 суперфайн. Выход гептааммонийной солИ соединения 3

0,023 г (89Ъ или 72Ъ в расчете на (ТРь)4. !- сб )

Ко/сия радиоавтограммы, полученной при определении первичной структуры, приведена на фиг. 1.

„l

Пример 3. 2 -Дезокси(тимидилил-3,5 -три-(5 -дезокси-5 —

-тиотимидилил) — 3,5 †(5 -дезокси-5 / /

-тиогуанилил)-3,5 †(5 -дезокси-5

-тиоцитидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5/ -тиоаденилил)-3,5 †(5 -дезокси-5,-тиотимидилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиогуанозин), 40

ТреТрьТрэ СрвТрвТрсТрв Срв (9 ).

Стадия I. 2 .-Дезокси(тимидилил/ с /

-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 -тио имидилил)/

-3, 5 †(5 -дезокси-5 -тио-N4-анизоилс цитидин)1-3 -фосфотиоат (10)..

0,05 r тетралитиевой соли 2 -де-, зокси(тимидилил-,5 †(5 -дезокси-5

-тиотимидилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиотимидин)) -3 -фосфотиоата

TpgTprTpsTpg 6рьСрь I> psTps QoH (6).

Стадия I. 2 -Дезокси(тимидилил-3,5 -три-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 вЂ,5 -дезокси-5 -тио-N

< г/ / 2

-изобутирилгуанилил) -3, 5 — (5 -де- 45 зокси-5/ -тио-й4-ан>!зоилцитицилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тио-N -бенс с с / зоиладенилил)-3/,5 †(5/ -дезокси-5 —

-тио-N6-бензоиладенозин)3 — 3 -фосфотиоат < 7).

О, 027 r неочищенного продукта. лученного íà I I стадии примера 2,содер>кащего О, 01 ммоль L !8-ñîëè соединения 5 и 0,087 г литиевой соли 2

5 -дидезокси-5 -иод-! --бензоиладено/ зин-3 — 5-P - (й, й-дифенил -карбомоил- 55 этилфосфотиоата 0,011 ììîëü/встряхивают в 1 мл диметилформа> ида, содержа- . щего 2Ъ воды,в течение 4 ч,выдерживают еще 2 ч. Продукт выделяют как в стадии примера 1, проводя промывку gp осадка 2 мл смеси этанол — ацетон (1:1). Защиту с тиофосфата снимают так же как Ф примере 1. Получают

0,031 r неочищенного продукта,,содер>кащего 0,0091 ммоль (91Ъ) соеди- 65 ненни 7, который очищают ионообменной хроматографией. ! / с

Стадия II. 2 -Дезокси(тимидилил-3,5 -три (5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -(5 -дезокси-5 -тио-й

-изобутирилгуанилил)-3,5 †(5 -деэокси-5" -тио-N"-анизоилцитидилил)—

/ / /

-3,5 -ди(5 -дезокси-5!-тио-Ni -бенэоиладенилил)-3,5/ -(5 -дезокси-5/-тио-тимидин) -3 -фосфотиоат (8).

0,031 г соединения 7, содержащего 0,091 MMo I его Li -соли и

0,0068 г литиевой соли 2,5 -диде/ зокси-5 -иод-тимидин-3-S -)/>I- (й, й—

-дифенил)карбомоилэтилфосфотиоата (0,01 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего 2Ъ воды, б ч, раствор затем выдерживают 2 ч и продукт выделяют как в стадии примера 1, промывая осадок дополнительно этанолом (2х 2 мл). Снятие защиты с тиофосфата проводят аналогично

I стадии примера 1. Получают О, r неочищенного продукта, содержащего

0,0082 ммоль (90Ъ) соединения б,который очищают ионообменной хроматографией.

Стадия III 0 031 г соединения 8, сопержащего 0,0082 ммоль его i! -coс с, о ли и 0,0072 г 2,5 -дидезокси-5 -иод-й -изобутирилгуаноэина,0,016 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего ЗЪ воды, в течение б ч, выдерживают,еще 3 ч и продукт выделяют как в I стадии примера 1,промывая осадок в конце этанолом (2 х 2 мл).

После снятия защит с оснований аммиаком продукт выделяют гель-хроматографией как í I I стадии примера 2. Затем продукт рехроматографируют на аминохроме с-3 (колонка 2,3 х х 25 см в линейном градиенте 0-0,2 И бикарбоната аммония, рН 7,0), используя резервуар и смеситель объемом по 1 л, скорость элюции 300 мл/ч.

Продукт элюируется 0,18 М бикарбонатом аммония. Пик собирают, упаривают, удаляют бикарбонат аммония упариванием трижды с 30 мл смеси воды спирт (1:5) и продукт лиофильно высушивают. Выход соединения б в виде нонааммонийной соли 0,023 r (86Ъ) или 51Ъ в расчете на (Tps)4 Lip).

П р е р 4. 2 -Дезокси(тимидилил-3,5 -ди-(5 -деэокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -(5-дезокси-5 -тиоцитидилил) -3,5 -три-(5 -дезокси-5 -тио/ с тимидилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиоцитидин))-3 -фосфотиоат, 899571

f0,05 ммоль) и 0,033 г литиеной со- эокси-5 -тиотимидилил;)-3,5 †(5 — ли 2,5 -дидезокси-5 -иод-й -анизоил- -дезокси-5(-тиотимидин) g -3 -фосфоI I ((а» цитозин-3 -S-P-цианэтилфосфотиоата тиоат (13). (0,0525 ммоль) растворяют при нстря- 0,082 г соединения 12, содержахивании в 2 мл диметилформамида и ны- щего 0,0375 ммоль Li+-соли 0 02 r

I держивают 2 ч. Затем обрабатынают 5 литиевой соли и 2,5 -дидезокси-5

i0 мл ацетона, осадок центрифугируют, -иодтимидин-3 -5-(-цианэтилфосфопромывают ацетоном (5 х 4 мл) и нысу- тиоата (0,040 ммоль) встряхивают н

I, шинают в накууме. Получают 0,075 г 3 мл диметилфорМамида, содержащего бесцветного порошка, содержащего 1Ъ воды, 3 ч, выдерживают раствор

0,046 ммоль (92Ъ) цианэтильного про- »0 еще 2 ч и затем обрабатывают как иэводного соединения 10. Этот осадок íà I стадии, промывая осадок в конрастворяют в 2 мл 0,5 н. гидроокиси це 2 мл этанола. После снятия защиты лития, выдерживают 1 ч и нейтрализу- c Фосфотиоатной группы и- высушивают избыток щелочи катионообменной ;. ния полУчают 0,082 г.порошка, содерсмолой дауэкс-50.(H+-форма), Смолу жащего 0,034 ммоль (91Ъ) окталитие15 отфильтровывают, а фильтрат лиофиль- - ной соли соединения 13, которую очино высушивают. Получают 0,072 r не- щают ионообменной.хроматографией. очищенного продукта, содержащего Стадия V, 0,082 г соединения 13, 0,046 ммоль (92Ъ) пенталитиевой соли содержащего 0,034 ммоль его LIg -сосоединения 10, а также следы исход- ли и 0,024 г литиевой соли 2,5 ных веществ. Продукт очищают ионооб- 20 -дидезокси-5 -иод-N -анизоилцитидинменной хроматографией на аминохроме -3 -S-P-цианэтилфосфотиоата с-3. (0,038»л(лоль)» встряхивают в 3 мл

Стадия ((, 2 -Дезокси (тимидилил- диметилформамида, содержащего 2Ъ

-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 -тиотимиди- воды 3 ч, выдерживают еще 3 ч и облил)-3,5(†(5(-дезокси-5 -тио-ц4- g$ Рабатынают как íà I стадии. После

-анизоилцитидилил)-3,5 †(5 -дезокси- снЯтиЯ защиты с тиофосфата осадок

-5 -тиотимидинЦ -3 -Фосфотиоат (11) . обрабатывают аммиаком как но ! стадии

r соединения 10, содержаще- пРимеРа 1 и ныделЯют пРодУкт, как н го 0,046 ммоль его Li -соли и III стадии примера 3 при помощи

0,0245 г литиевой соли 2,5 -диде- З0 I»oHoo6MeHной хроматографии

5 зокси-5 -иодтимидин-3 -S-P-цианэтил- хРоме, использУЯ гРадиент 0-0,3 N фосфотиоата (0,0485 ммоль), встряхи- бикарбоната аммония. Выход моноамвают н 2 мл диметилформамида 1 ч, ны- монийной соли соединения 9 85Ъ держинают раствор еще 1 ч и o6pa6a-, (0,078 г или 58Ъ и расчете íà (Tps) LI ). тынают как в I стадии, дополнительно З Вещество гомогенно при ионообменной промывая осадок 2 мл смеси этанол — и гель-хроматографии. ацетон (1:1) .После аналогичного снятия П»(и м е р 5. 2 -Дезокси гуани(Г(I защиты и высушивания получают 0 082 г лил-3 5 †(5 -дезокси-5 -тиотимидиI ! ( неочищенного продукта, содержащего лил)-3,5 -ди†(5 -дезокси-5 -тиоцити0,0415 ммоль (90Ъ) гексалитиевой дилил)-3,5 †(5-дезокси-5 -тиоадени- (( соли соединения 11, которую очищают 40 лил)-3,5 -гекса-,5 -дезокси-5 -тиоионообменной хроматографией. тимидилпл)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиоСтадия III. 2 -деэокси(тимидилил- тимидин))-3 -фосфотиоат, ((-3,5 -ди-(5 -деэокси-5 -тиотимиди- GPs TP5(CPs)2AP5(TPsg И4).. лил) -3, 5 — (5 -дезокси-5 -тио-N+-анизоилцитидилил)-3,5 †(5 -деэокси- 45 Стадия I. 2 -Дезокси t. N изобу

2

-5,-тиотимидилил) -3,5 †(5 -деэокси- тирилгуанилин-Э,5 †(5 -дезокси-5

I г (I (-5 -тиотимидин )) -3 -фосфотиоат (12). -тиотимидин)) -Э -фосфотиоат (15).

0,082 г соединения 11, содержаще- 0,048 r,дигидрата дилитиеной соли

ro 0,0415 ммоль его Li+ -соли и 2 -дезокси-й2-изобутирилгуанозин-3

I 2

0,022 г литиевой соли 2,5 -диде(-фосфотиоата 2 dops (0,1 мм(ель) и н( эокси-5 -иодтимидин-3 — S-p-цианэтил- 0,0532 г литиевой соли и 2 -5 -дидефосфотиоата (0,044 ммоль), н 2 мл зокси-5(-иодтимидин-3 -S-P-цианэтилдиметилформамида, содержащего 1Ъ фосфотиоата (0,105 ммоль) растворяводы, встряхивают 2 ч, выдерживают ют в 2 мл диметилформамида и выдержиеще 2 ч и обрабатывают как Hà I ста- вают 1 ч при комнатной температуре. дии, промывая осадок 2 мл этанола. К Реакционной смеси добавляют 20 мл

После снятия защиты с тиофосфата и ацетона, осадок центрифугируют, провысушивания получают 0,082 г бесцвет- мывают ацетоном (5 х 10 мл), высушиного порошка, содержащего вают в вакууме и снимают защиту с

0,0375 ммоль (91Ъ) гепталитиеной со- тиофосфата как в I стадии примера 4. ли соединения 12, которую очищают ф0 Получают 0,08 г бесцветного порошка, ионообменной хроматографией. содержащего 0,095 ммоль (95Ъ) триСтадия IV. 2 -Дезокси(тимидилил- литиевой соли соединения 15, которую ((-3,5 -ди†(5 — дезокси-5 -тиотимиди- очищают ионообменной хроматографией. лил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тио-й ( (Стадия tl 2 -Дезокси(N -изобу.а (-анизоилцитидилил)-3,5 -ди-(5 -де- 65 тирилгуанилил-3,5 †(5 -дезоксн-5

899571

-тиотимидилил)-3,5 †;5 -дезокси-5 -тио-N -анизоилцитидин)(-3 -фосфотиоат (16).

0,08 г соединения 15, содержащего 0,095 ммоль его Li+-со.ли и 0,082 r литиевой соли 2

Ъ j

5 -дидезокси-5 -иод-И -аниэоилцити4 ( дин-3 -5-Р-цианэтилфосфотиоата (0,1 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида 0,5 ч, выдерживают раствор 1 ч и обрабатывают как на ! стадии. После снятия за(иты с тиофосфата как на стадии примера 4 получают 0,119 г неочищенного продукта, содержащего 0,089 ммоль (93,5Ъ) тетралитиевой соли соединения 16.

Стадия III. 2 -ДезоксиГ(! †изобу(2 тирилгуанилил-3,5 †(5 -дезокси-5 —

-тиотимидилил)-3,5 †(5-дезокси-5

-тио-й4-анизоилцитидилил)-3,5 †(5

-деэокси-5 -тио-N -анизоилцитидинЦ-3 -фосфотиоат (17).

О,"19 r очищенного соединения 16, содержащего 0,089 ммоль его LI4 -солч и 0,0585 r литиевой соли 2,5(—

-дидезокси-/ -иод-И -анизоилцитидинI

-3 -5-) -цианэтилфосфотиоата (0Ä0935 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида 1 ч. Раствор выдерживают еще 1 ч и обрабатывают как на стадии. Защиту с тиофосфата снимают как в I стадии примера 4.Получают 0,15 г порошка, содержа(({его

0,081 ммоль (92Ъ) тенталитиевой соли соединения 17, которую очищают ионообменной хроматографией.

Стадия IV. 2 -Деэокси(й -изобу( тирил-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиотими((! дилил)-3,5 -ди(5 -дезокси-5 -тио-И4 -анизоилцитидилил)-3,5 †(5-дезокси-5 -тио-N -бензоиладенозин)(—

-3 -фосфотиоат (18).

0,15 г соединения 17, содержащего

0,081 ммоль его Li<-соли и 0,53 г литиевой соли 2,5 -дидезокси-5 -иод(/ /

-И -бенэоиладенозин-3 -S-Р-цианэтил6 фосфотиоата (0,085 ммоль), встряхивают в 3 мл диметилформамида 1,5 ч, выдерживают раствор 2 ч и обрабатывают как на стадии. Снимают защиту с тиофосфата как в I стадии примера 4 и получают 0,17 г порошка, содержащего 0,075 ммоль (93Ъ) гексалитиевой соли соединения 18.

Стадия V. 2 -Дезокси(й. -изобу2 ( ( тирилгуанилил-3,5 †(5 -дезокси-5.—

-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -тио-И (-анизоилцитидилил) †3,5 †(5 -дез((/кси-5 -тио-N --бензоиладенилил)-3,5

6 †(5 -дезокси-5 -тиотимидин)!-3 -фосфотиоат (19).

0,017 г соединения 18, содержащего 0,075 ммоль его L("-соли и !

0,042 r литиевой соли 2,,5(-дидеэокси-5 -иодтимидин-3 -5-P-öèàíýòèëôocфотиоата (0,082 ммоль), встряхивают в 3 мн диметилформамида 2 ч, выдерживают е(це 1 ч и обрабатывают как на I стадии, промывая дважды осадок

2 мл смеси этанол — ацетон (1:1).

Защиту с фосфата снимают как в стадии примера 4. Получают 0,179 r осадка, содержащего 0,0685 ммоль (91Ъ) пепталитиевой соли соединения. 19, которую очищают ионообменной хрома тографией. ! 2

Стадия Vl. 2 -QeaoxcH(N -изобутирилгуанилил-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 —

-тио-И4-анизоилцитидилил)-3 ;5 (5 —

-дезокси-5 -тио-N -бензоиладенилил)l (-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)—

-3,,5 — {5 -дезокси-5 ° -тиотимидин)(—

15.

-3 -фосфотиоат (20).

0,179 г соединения 19, содержащего 0,0685 ммоль его !.(+-соли и ли/

-( тиевую соль 2,5 -дезокси-5 -иодтнмидин-3 -S-P-цианэтилфосфотиоата, I встряхивают в 3 мл диметилформамида, 20 содержащего 1Ъ воды, в течение 4 ч, выдерживают 2 ч и обрабатывают как на стадии, промывая осадок этанолом (2 х 2 мл). Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4 и по 5 лучают 0,188 г осадка, содержащего

0,061 ммоль (89Ъ) окталитиевой соли соединения 20.

Стадия VII. 2 -Дезокси(й -изобуI

2 тирилгуанилил-3,5(†(5 -дезокси-5

-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -деэокси-5 -тио-й -анизоилцитидилил)-3,5 — ((†(5 -дезокси-5 -тио-N -бензоиладени(( лил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 -тиотимидилил)-3,5 — {5 -дезокси-5 -тиоl (/ тимидин)(-3 -фосфотиоат (21).

0,183 г соединения 20, содержащего 0,061 ммоль его Li -соли и

0,034 r литиевой соли 2,5 -дидезок8 / си-5 -тиотимидин-3 -S-P-цианэтил( фосфотиоата (0,067 ммоль), встряхи40 вают в 3 мл диметилформамида, содержащего 2Ъ воды,в течение 4 ч, выдерживают еще 2 ч и обрабатывают как на

I стадии. Защиту с фосфата снимают как в I стадии примера 4 и получают

45 после высушивания 0,19 г осадка,содержащего 0,055 ммоль (90Ъ) ноналитиевой соли соединения 21, которую очищают ионообменной хроматографией.

Стадия VI!! . 2 -Дезоксиj N 2-иэобу5р тирилгуанилил-3,5 †(5 -дезокси-5 —

-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -деэокси(..Л

-5 -тио-И--анизоклцитидилил)-3,5 †(5-дезокси-5-тио-И -бензоиладенилин)(-3, 5 -три (5 -дезокси-5 — тиотимидилил )55

-3 5 †(5 -деэокси-5 -тиотимидин)1—

-3 -фосфотиоат (22).

0,19 r соединения 21, содержащего

0,055 ммоль его (-соли и 0,031 г литиевой соли 2,5 -дидеэокси-5

-иодтимидин-3 -5-(/-цианэтилфосфотиоата (0,061 ммоль), встряхивают в

3 мп диметилформамида, содержащего

ЗЪ воды/ в течение 5 ч, выдерживают еще 3 ч и обрабатывают как íà I стадии, промывая осадок этанолом

899571 (2 х 2 мл). .Защиту с фосфата снимают как в стадии примера 4 и получают 0,18 r осадка, содержащего

0,0485 ммоль (88%) декалитиевой соли соединения 22, которую очищают ионообменной хроматографией.

Стадия IX. 2 -Дезокси1!! -изобутирилгуанилил-3,5 -(5 -деэокси-5 -тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 —

-тио-й4 -анизоилцитидилил)-3,5 †(5 —

-деэокси-5 -тио-й -бензоиладенилил)-3,5 -тетра-(5 -деэокси-5 -тиотимиI г(f I

10 дилил)-3,5 †(5 -дезокси-5 -тиотимиt t ( дин))-3 -фосфотиоат (23).

0,18 r порошка неочищенного соединения 22, содержащего 0,0485 ммоль его !(+ -соли и 0,028 г литиевой соли

I,.i 40 (с

2, .; -дидезокси-5 -иодтимидин-3

-S-p-цианэтилфосфотиоата (0,053 ммоль) встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 4Ъ воды, в течение 6 ч, выдерживают раствор еще 4 ч и обраба- 20 тывают как описано в I стадии, промывают осадок в конце этанолом (.2 х 2мл).

Снятие защиты с фосфата проводят как в I стадии примера 4. Получают

0,178 г бесцветного порошка, содержа- )5 щего 0,0435 ммоль (90Ъ) унцекалитиевой соли соединения 23, которую очищают ионообменной хроматографией.

Стадия Х. 2 -Дезокси(М -изобутирилгуанилил-3,5 †(5 -дезокси-5

-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-5 -тио-N -аниэоилцитидилил)-3,5

4 ( — (5 — дезокси — 5 -тио;N -бензоиладени((6 лил) — 3, 5 -пента- (5 -дезокси-5 -тио(( (I I тимидилил)-3,5 †(5 -дезокеи-5 -тиотимидин)) †-фосфотиоат (24).

0,178 г порошка соединения 23, содержащего 0,0435 ммоль его !.1„ -ro° Фли и 2,5 -дидезокси-5 -иодтимидин1 ((-3 -S-ti-цианэтилфосфотиоата (0,0479 ммоль), встряхивают в диме- 40 ,тилформамиде, содержащем 4Ъ воды, в течение 7 ч, выдерживают еще 4 ч и обрабатывают как на стадии, промывая осадок в конце этанолом (2 х 2 мл), Снятие защиты с фосфата проводят как 45 в I стадии примера 4.Получают 0,182 r осадка, содержащего 0,0388 ммоль (88%) дедекалитиевой соли соединения 24, которую очищают ионообменной хроматографией. 50

Стадия XI. 0,182 r соединения 24, содержащего 0,0388 ммоль его !.1„ -соли и 0,0395 литиевой соли 2,5 -дидезокси-5 -иодтимидин-3 -S-P-цианэтилфосфотиоата (0,078 Жюль), встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 4Ъ воды, в течение 8 ч, выдерж((вают 2 ч и обрабатывают как на стадии. Защиту с фосфата снимают как в стадии примера 4, а защиты с оснований нуклеотидов — как во dO

tI стадии примера 1 и продукт выделяют при помощи ионообменной хроматографии на аминохроме как в III стадии примера 3, используя градиент 0-0,3 M бикарбоната аммония. Выход тридека- 65 аммонийной соли соединения 14 86Ъ (0,137 r или 31,6Ъ в расчете на

Gps Li+H>0).

П р и и е р 6. 2 -Дезокси(!!

I l

-изобутирилгуанилил-3,5 †(5 -дезок( си-5 -тиотимидин))-3 -фосфотиоат (25) .

0,051 г дигидрата динатриевой соли 2 -дезокси-N -изобутирилгуанозин-3 -фосфотиоата (0,1 ммоль) и 0,055r натриевой соли 2,5 -дидезокси-5 —

-иодтимидин-3 -S-tII-цианэтилфосфотиоата (0,105 ммоль) растворяют в

2 мл диметилформамида и .выдерживают

1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатывают так же как в t стадии примера 5. Получают

0,083 г бесцветного порошка, содержащего 0,094 ммоль (94Ъ) тринатриевой соли соединения 25, которую очищают ионообменной хроматографией.

Характеристики образцов соединений, полученных в примерах 1-6, привецены в таблице.

Правильность структуры полученных олигодеэокситионуклеотидов основывается на: а) количественном протекании реакции образования 3,5 -фосфотиодиэфирной связи, б) наблюдении молекулярного веса и отрицательного заряда, что следует из данных гель- и ионообменной хроматографии, в) образовании при неполном фосфодиэстеразном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономерных звеньев в исходном олигонуклеотиде, что свидетельствует о природном (3, 5 )типе связей между ними,, г) полном расщеплении окислителями фосфотиодиэфирных связей с образованием набора окисленных мономеров, д) соответствии УФ-спектров полученных олигодезокситионуклеотидов расчетным данным.

Пример 7. Определение матричной активности октануклеотида 14.

Реакционную смесь (0,5 мл), содержащую 0,16 мкмоль ГТФ;

О, 16 мкмоль 4 С-АТФ. (удельная радиоактивность 0,84 /мкмоль); ! ((с

0,01 моль меркаптоэтанола, 0,04 моль трис-НС! (рН 7,9); 0,01 моль MgCI

436 мкг/мл PHK-полимеразы Escherlchia coli; октануклеотид — 2о.е./мл и r(A-A-A) — 2,7 о.е/мл инкубируют при 20 С, отбирая аликвоты по

0,05 мл. Их помещают на ватман 3 мм, высушивают, отмывают 5В-ной -рихлоруксусной кислотой, содержащей

0,05 моль пирофосфата натрия, (3 х х 5 мл) при О С, затем этанолом, высушивают и определяют радиоактивность на счетчике ИагК !!!. По полученным данным строят график зависимости ко899571 уф-данные ) Молекулят "

1. ный вес сл) Содержание концевых тиофосфатных, групп, Г ) рН 7, рН7 .,рН7 !

РН 7

E .10

ltd )1

Соединение

C) Гк, 1

d)

Kd м

267 (38,4) 234 (9,6) 0,086 0,78

100 . 328

TpsTpsTpsTps

267 (47,6) 235 (16,8) 0,101 0,70

267 (55,8) 236 (24,2) 0,058 0,61

267 (55,8) 236 (24,2) 0,117 0,60

265 (67,6) 234 (27,3) 0,129 0,55

1749

1937

2194

2633

265 i80,2) 233 (30,1) 0,087 0,47

2627

265 (80 2) 233 (30 1) О 141 О 46

265 (88,8) 234 (33,4) 0,153 0,40

264 (95,9) 232 (36,7) 0,119 0,36

0,97

0,98

3072

3408

3335

234 (7,2) 99

0.070 0,87

Тр 5 Tp s Tp s

269 (37,2) 237 (12,8) 0,087 0,79

269 (45,9) 237 (16,0) 0,102 0,70

269 (54,8) 236 (19,1) 0,118 0,62

10

1447

1773

12

2099

«7

269 (63,4) 235 (22,5) 0,130 0,54

2425 о

2701

270 (72,1) 236 (26,8) 0,142 0,46

14 Âè

2dGps 28 0

253 (13,6) 224 (3,9) 0,046 1,06

100

257 (21,2) 236 (6,8) 0,058 0,96

807

269 (27,4) 231 (14,2) 0,071 0,88

270 (36,1) 234 (20,9) 0,087 0,79

1252

99

1697

98

0,103 0,70

264 (46,3) 231 (23,5)

265 (54,2) 232 (26,5) 2136

2462

О, 119 0,62

98

266 (60,7) 232 (28,1) 0,130 0,54

267 (68,3) 233 (30,5) 0,142 0,45

267 (75,1) 234 (31,1) 0,153 0,38

2738

3114

3440 личсства продукта транскрипции от времени (фиг. 1).

И р и и е р В. Определение матричной активности додекануклеотида

15.

Реакционную смесь, содержащую

0,16 мкмоль ГТФ; 0,48 мкмоль

С-АТФ,(удельная радиоактивность

0,84 /мкмоль); 0,84 моль трис.-НС1 (рН 7,9); 0,01 моль меркаптоэтанола;

0,01 моль М9С1, 262 глкг/мл РНК-полимеразы БьсЬег сЬ а со1 ; додеканук1002 267 (28,8) леотид — 2о.е. и статистический тририбонуклеотид — 7,2 о.е., инкубируют 60 мин при 20 С, отбирая аликвоты по 0,05 мп. Выделение продукта прос водят как в при лере 7. Данные представлены на фиг. 2.

Таким образом, испытуемые соединения 14 и 15 проявляют матричные своиства в РНК-полимеразной системе из-

Escherichia coli и, следовательчо, являются биологически активными соединениями.

899571

Продолжение таблицы

УФ-данные б) Содержание концевых тиофосфатных групп Р)

Молекулярный веса) рН 7

Е.10

max рН 7

Хп c1X > нм рН 7

1 vn(n нм рН 7 > с)

E.,10 (КН РОЗ

r»ih Л 4 м

Соединение

267 i83,4) 234 (33,7) 0,163 0,32 . 98.

267 (91,2) 234 (35,0) 0,175 0,27 97

3766

4092

267 (97,8) 234 (36,8) 0,190 0,23 97

4115

Соединения 2,5,8,14 и 15 — аммонийные соли, остальные — в виде литиевых солей, После снятия защит с аминогрупп оснований нуклеоо тидов концентрированным аммиаком при 50 С в течение 4 ч.

Ионообменная хроматография нааминохроме С-3колонка

40 мкл, градиент 0,25 М КН, РО в 7 М мочевине рН 7).

Гель-хроматография на сефадексе 6-50 в 0,1 М бикарбонате аммония в 10%-ном зтаноле. Колонка (0,49 х 30 см),Kd = - = †-" вЂ, где V е — объем выхода

Ч -Чо веяества с колонки, Чо "(свободныи объем) = 4 мл;

У„= 5 мл. дачные иодометрического титрования раствором иода в метаноле.

Примечания.а) в) с) d) 30

Формула изобретения

Олигодезокситионуклеотиды общей формулы р - СН

О 0

0x S C">Ã0 п-1

=P-08-СН, 0 0 n

0RR где  — тимин, цитозин, аленин, гуанин;

R — Н, остаток тиофосфата

S-t>-циан(или М,N-дифенилкарбомоил)этилфосфотиоата

n = 1,2,3..., проявляющие матричные свойства в

PHK-полимеразной системе из Escherichia coli.

Источники информации, принятые Во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2414492/23-04, кл. С 07 Н 19/06, 28.06.77.

4 2. Chladek S., Nagyvary

Nucleophilic reaction of some nucIeoside vhosphorothioates - "I. Am.Chem, Soc" > 1972, Я4, р. 2079.

899571 у00

tO0O

Я Ф0 00 00 t, мин бремя фиг.2

0 N И 00 120 I_#_ t, мин

Время

Риа1

Составитель В.Криворучко

Редактор Г.Кацалап Техред З.Фанта Корректор О Билак

Заказ 12054/31 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного коиитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Мосина, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

g 1000 ь

Е

", Z00O

Е 4М0 > 3000

6 с gg ь

"- fN0

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4