Способ получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы

Авторы патента:

C07H3/06 - олигосахариды, т.е. сахариды, содержащие от трех до пяти сахаридных радикалов, связанных друг с другом гликозидными связями

A61K49 - Препараты для исследований на живом организме

Союз Советсннк

Социалистических

Ресяубпнн

OflNCAKNЕ

ИЗЬБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<»>929646 (6l ) Дополнительное к авт. санд-ву (22) Заявлено 15. 01 . 80 (21) 2878516/23» р 4 с прнсоеднненнеет заявки М(23 ) Приоритет

Опубликовано 23.05.82. тиоллетень 1т 19

Дата опубликования описания 23.05.82 (51)М. Кл.

С 07 Н 3./06

//А 61 К 49/00

Гасударственный квинтет

СССР (53) УД К 547. 4 58:

:66+547.458. .611:66(088.0) по делан нзабретеннй н атпрытнй (72) Авторы изобретения

Т.Н.Звягинцева, Л.А.Елякова и Н.И.Назарова

Тихоокеанский институт биоорганический химии

Дальневосточного научного центра АН СССР (7l) Заявитель (541 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ ЛАМИНАРИБИОЗЫ

И ЛАМИН АРИТ Р ИОЗЫ!

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения олигосахаридов из ламинарина вЂ” смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы, которая находит широкое применение в био« органическои химии, в иммунохимии. 5

Извест способ получения смеси ламинарибиозы и ламинаритрозы путем гидролиза ламинарина концентрации

8,5 мг/мл в сильнокислой среде при нагревании реакционной смеси на кипящей водяной бане, полученный гидролизат нейтрализуют смолой

АпЬег11 е 1R-4 В(ОН ) и очистку целевого продукта осуществляют на колонке

IS со смесью угля и целита. Выход смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы составляет 11,6i, продолжительность процесса 360 ч 11.

Недостатками известного способа получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы являются. низкий выход целевого продукта и длительность проведения процесса.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта и упрощение процесса.!

Цель достигается тем, что согласно рпособу получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы, гидролизуют ламинарин в концентрации 3,0-4,0 мг/мл эндо-Р-1,3 глюконазой, полученной из кристаллического стебелька моллюска

СЫавуз abbidus, в среде ацетатного буфера, содержащего 0,04. вЂ” О,1 М хлористого натрия, рН 5,3-5,5, при температуре 22-25ОС с последующей обработкой инкубационной смеси глюкозооксидазой и очистку целевого продукта осуществляют на ионообменных смолах КУ-2(Н+) и А-17(ОН ).

Выход целевого продукта 604, продолжительность процесса 96 ч.

Важную роль пр>е осуществлении ферментолиза играют условия проведения ферментативной реакции, такие

929646

Выбраны оптимальные величины температуры, рН среды, ионной силы раствора, при которых фермент эндо-Jh""1,3-глюконаэа наиболее стабилен и реакции гидролиэа ламинарина протекают до конца с образованием необходимых олигосахаридов. Так как эндо-Jb-1,3-глюконаэа лабильный фермент, то предложено добавлять к ацетатному буферу 0,04И-0,1Н раствор хлористого натрия. Определенная ионная сила необходима как для протекания ферментативной реакции, так и для увеличения стабильности фермента. В табл.1 представлены данные по определению оптимальной для действия эндо-1з-1,3-глюконаэы концентрации хлористого натрия.

Так,. при увеличении концентрации ламинарина выше 4,0 мг/мл над реакцией гидролиза начинают преобладать 1В ,реакции трансгликозилирования, при этом получается сложный набор олигосахаридов. Не рекомендуется брать концентрацию ламинарина ниже 3 мг/мл, так как это приводит к повышенному 15 расходу фермента, увеличению объемов инкубационных смесей и т.д., что значительно усложняет процесс.

Таблица 1

««««««

Активность фермента Активность (метод Нельсона, фермента,4

Концентрация

t4aC1 М

0,200

0,780

0,680

0,640

0,510

0,440

0,300

0,06

0,04

0,01

0,04

0,1

0,2

0,4 .0,6

0,8

1,0

1,2 ферментативной реакции поддерживают равной 22-25 С. Повышение температуры приводит к денатурации фермента, понижение температуры уменьшает скорость реакции.

В табл.2 показана зависимость стабильности фермента от температуры. ферментолиз ламинарина осуществляют при рН 5,3-5,5, так как в этом ин4$ тервале рН фермент эндо- -1,3-глюконаза наиболее стабилен. Температуру

Таблица 2

Активность Фермента (метод Нельсона Аи ) при температуре, С

Время, мин

-3

О, 760

0,690

О, 180

0i800

0,780

0,09

3 как температура, рН среды, ионная сила раствора, концентрация субстрата..Изменение условий процесса может вызвать изменение не только в соотношении конечных продуктов, но даже в их характере.

Из табл.1 видно, что фермент наиболее активен в растворе, содержащем 0,04И-0,1t1 NaCl.

25,6

100, О

87 0

82,0

65,4

56,4

38,5

6,7

5,1

929646

6 ,Продолжение табл, 2

Время, мин Активность фермента (метод Нельсона А „1 при температуре, С

Г ) 45

0,480

0,410

О, 360

0,05

О, 790

0,.800

0,820

0,00

120

180

0,800

0,750

0,810

240

300

Таблица 3

Глубина гидролиза аС 4

Время реакции t, ч

36,0

44,0

49,0

53,0

Все эти подобранные условия ферментативного гидролиэа ламинарина эндо-Р-1,3-глюконазой из кристаллического стебелька моллюска СЬ1ап1уэ

abbidus позволят провести ферментоПример 1. ферментативный гидролиз.

3,5 л ламинарина растворяют в

900 мл ацетатного буфера (0,05 М; рН 5,4) с добавкой иаС1 0,05 М

Затем в раствор ламинарина добавляют

75 мл эндо-. P-1 3-глюконазы из ChlaЭ

mys abbidus (1.с)=! мг)/100 мл), инкубируют смесь в течение 24 ч при

23 С. После этого добавляют еще

25 мл фермента и инкубируют смесь

24 ч. Продукты ферментолиэа анализируют с помощью жидкостного хроматог50 рафа. После окончания ферментативного гидролиэа инкубационную смесь упаривают на раторном испарителе при

50 -70 С до 180 мл, добавляют 20 мл

3 И фосфатного буфера (рН 7,0) и растворяют в полученном растворе

200 мг глюкозооксидаэы, смесь инку:бируют в течение 24 ч. После инку-: лиз до конца и получить нужный набор олигосахаридов. В этих условиях

: реакция гидролиза ламинарина практически заканчивается через 48 ч, что показано в таСп.3. бации с глюкозооксидазой раствор обрабатывают поочередно смолами .

КУ-2 (Н+) и А-47 (ОН ) до тех пор, пока"реда не станет нейтральной. Смолы промывают, промывные воды объединяют с раствором, содержащим ламинари)5иозу и ламинаритриозу, и раствор высушивают лиофильно. Получают аморфный порошок желтоватого цвета. Выход смеси ламинарибиозы и ламинаритриоэы составляет 2,4 г (60 от исходного количества ламинарина). Выходы составляют для ламинарибиоэы301 и ламинаритриозы - 303. от исходного количества ламинарина.

Пример 2. При проведении реакции с 3 мг/мл ламинарина в ацетатном буфере рН 5,3"5,5 в присутствии 0,1 М.

МаСI и при прочих указанных условиях получаются те же продукты реакции и .выход ик не ухудшается.

929646

Составитель Л Никулина

Техред М, Тепер Корректор М.Коста

Редактор О.Половка

Заказ 3408/32 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, И-35, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", r.Óæãoðîä, ул.Проектная,4

7 формула изобретения

Способ получения смеси ламинарибиозы и ламинаритриозы путем гидролиза ламинарина и очистки смеси, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и упрощения процесса, ламинарии в концентрации 3,0 - 4,0 мг/мл гидролизуют эндо- -1,3-глюконазой, полученной из кристаллического стебель- 1В ка моллюска Chamys abbidus, в среде ацетатного буфера, содержащего 0;040,1Í хлористого натрия, рН 5,3-5 5 при 22-25 С с последующей обработкой инкубационной смеси глюкозооксидазой и очистку целевого продукта осуществляют на ионообменных смолах.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Методы химии углеводов. Под ред. чл. корр. АН СССР Кочеткова H.Ê.

М., "Мир", 1967, с.243-245 (прототип).