Способ получения полидезоксинуклеотидов

 

Со!оэ Советских

Социалистические

Республик

О П И С А Н И Е 925964

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6I ) Дополнительное к авт. сеид-ву (22)Заявлено Ol.3.l.79 (2l) 2835418/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 07.05.82, бюллетень И 17

Дата опубликования описания 09.05.82 (53)M. Кл.

С 07 Н 18116

:А Gl К 49/00

Гееудереткнее!е квинтет

CCCP ее делен язебретеее6 н еткрытяв (63) 3К 547.963. .32 (088.8) В. П. Кумарев, В. С. Богачев, Л. В. Баранова н (72) Авторы изобретения

Институт цитологии и генетики Сибирского отд

АН СССР (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ

В,ОС 0 В

1

Сказ P= 0 !

OR2 ю

Изобретение относится к усовершенст-. вованному способу получения полидезоксинуклеотидов, используемых в биохимии и генетике.

Известен способ получения полидезоксннуклеотндов путем конденсации в пиридине нуклеозидного (нуклеозид-3хлорфенил-0-2-цианэтилфосфата) и нукле-! отидного (5 -0-диметокситритил-3 -0«« хлорфенилфосфата нуклеотида) компонентов в присутствии арилсульфотетразолидов (например, толуолсульфотетразолида), и обработки продукта реакции кислотой (o «голуолсульфокислотой) или триэтил-! амином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином. Выход, поли-дезоксинуклеотидов в расчете на исходный мономер составляет «3%. Выделение промежуточных и целевого продуктов осуществляют хроматографией (ll °

Недостатками известного: способа п! . лучения являются низкий выход целевого продукта и необходимость вьщеления промежуточных и целевого продуктов хроматографией, что усложняет процесс.

Цель изобретения - увеличение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения цолидезоксинуклеотидов путем конденсации в иирндине нуклеозидного и нуклеотидного компоненгов в присутствии арилсульфотетразолидов и обработки продукта коюденсацин кислотой или триэтиламином или последовательной обработки кислотой н триэтиламином с последующим выделением целевого продукта в качестве нуклеозидного и нуклеотидного компо нентов s реакции конденсации используют

2-дезоксинуклеотиды общей формулы где  — остаток тимина, йч — аниэоил« цитозина, ll — бензоиладенина, N

6 а

ИЗОбУ ГИРИЛГУаиииае

R, — Н, n„n — диметокситритил;

К вЂ” Н, 2-цианэтил, 5 до. обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином продукт конденсации выделяют экстракцией хлороформом или смесью хлороформ-метанол (7:3) с последующим снятием тиометильной за- (о шиты концентрированным аммиаком при

50-60" С в течение 4-6 ч.

Выход целевого продукта 367.

Пример 1. 8 -Диметокситритил((-иэобутирилдеэокситуанилил-(3 - (- 1

V метилтио+ 5 ) — ((— изобутирилдезокси( гуанозин-3 — 5 -метилтиафосфат (11 °

5 -Диметокситритил- Й -изобутирилг и дезоксигуанозин-3 — 8 -метилтиофосфат (153 мг, 0,2 ммоль) и g -изобутирилдеэоксйгyаноэин-3 -0-,2-цианэт@л- .метилтиофосфат (128 мг, 0,2 ммоль) растворяют и сухом пиридине {20 мл) и упаривают в вакууме на ротационно испарителе до 2 мл. Добавляют 100,8 мг 5

{0,4 ммоль) мезитиленсульфотетразилида и оставляка при 20 С на 1 ч. К реакционной сиене прибевлиют 20 нл смеси внетеиитрин-тривтилеиин (1: 1 и ) и ч иегреввют 10 иии нри 50еС. Уивривеют в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (20 мл), хлороформный раствор промывают водой (10 мл ХЗ), затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают вещество 1. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии и составе хлороформ: метанол (9: 1"/ ) (система A).

Измеренная суммарная плотность вещества 1 (XD><о ) при 260 нм 6850

46 оптических ециниц (о. ед.), количество вещества Х 1М 1 D j6O 6АЗО

1 46ЕО >«+

= 0,190 (ммоль). Количество вещества

1 цо поглощению диметокситвитильной

0,195 (ммоль|.

Отношение количества вещества (., измеренного по поглощению при 260 нм 50 и 500 нм М =, { ; = —:- - = 0,97.

0. 90

Q 5ô ..

Эта характеристика (М), определяющая количество полученного вещества двумя независимыми измерениями { KB 66 и 25О0 ) и в пределе равная 1, доказывает состав динуклеотида 3:.

Выход вещества 1 246 мг; 0,19 ммоль;.

97 70.

3 928964 4

Пример 2. Й6-gеизoиладенозил-(3 — 5- -метилтио -р- 5 ) -тимидин)3 -О-2-циакэтил- .1 -метилтиофосфат (Ц).

5 -Диметокситритил- М -бензоилдез(:р(в

1 ксиаденозин-3 - 8 -метилтиофосфат (168 мг, 0,2 ммоль) и тимидин-Ф-0-2цианэтил- Ь -метилтиофосфат (84 мг, 0,2 ммоль) растворяют в сухом пиридине (20 мл) и упаривают в вакууме до 1 мл.

Добавляют мезитилен сульфотетразолид (100, 8 мг, 0,4 ммоль) и выдерживают о при 20 С в течение 1 ч. Упаривают с толуолом (20 мл (2) досуха и растворяют в хлороформе (20 мл). К охлажденному до 0 С раствору приливают охлажденный до О С 2%-ный раствор тоауолсульфокислоты (20 мл) в смеси метанол-хлороформ (3:7). Через 2 мин нейтрализуют.5%.ным водным раствором бикарбоната натрия, водный слой отделяют, органический слой промывают водой (10 мл х 2), фкпьтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают соединение

И (3840 о.е., 222 мг, 0,191 ммольи

98%)-; ур 1960. Вашество гомогенно при тонкослойиой хроматографии в системе А. Это подтверждает состав соединения П.

Пример 3. 5 -Диметокситритил М -изобутирил-деэоксигуанилил-{ 3 -S—

Е

2. метилтио — р- д )- Я -иэобутирилдеэоксингуанилил-{3 -Ь-метилтио - 5 )- М

l I 6 бензоилдеэоксиаденоэил-{3 -5 -метилтио5 (-тимидии -М -О-2-цианэтил- Sметилтиофосфат -{ Ш).

Соединение 1 (6850 о.ед., 0,19 ммоль) и соединение (П) (3840; 0,19 ммоль) растворяют в сухом пиридине (30 мл) и упаривают в-вакууме до 2 мл. Добавляют меэитиленсульфатетраэолид (100,8 мг, 0,4 ммоль), и выдерживают 1 ч. при 20 С

Добавляют воду (0,2 мл), выдерживают

1 мин и растворяют в хлороформе {20 мл). лороформный раствор промывают водой (10 мл z 3), фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают в вакууме, затем снова упаривают с толуолом (20 мл). Сухой остаток растворяют в хлороформе (10мл) и наносят на колонку с силикагелем (V = 30 мл). Элюируют в градиенте концентрации метано,iia в хлороформе (300 мл хлороформа в резервуаре и 300 мл 5%-ного-метанола в хлороформе в смесителе) Получают соединение Ш (9350 о.ед. 380 мг, 0,18 ммоль, 907 o), 6 я = 5500. Вешество гомогенно при тоикослойной хроматографии на силикагеле в системе А.

Отношение количеств вещества И1, изме5 9259 ренных при 260 нм и 500 нм, М = 0,95.

Это подтверждает состав соединения Ш.

Пример 4. и -Бензоилдезоксиаденозил-(3 - S-метилтио- 5 )-3 -дибен3 \ зоилдеэоксиаденозин (1У).

Конденсация 5 -О-диметокситритил1

)Р -бенэоил-дезоксиаденозин-3 — S -метилтиофосфата (78,4 мг, 0,1 ммоль) с

Цб, 3 -дибенэоилдезоксиадеиоэином (44,7 мг, 0,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях примера 2 дает вещество IV (2130 î.ед., 101 мг, 0,96 ммоль, 96Ъ) Вещество 1Ч гомогенно при тоикослойной хроматографии иа силикагеле s.cèñòåìå А. 15 браво 2220 о.ед. Это доказывает состав соединения 1T..

Пример 5. 5 -О-Диметокситритилтимидилил-(3 - g-метилтио - 5 )-Й изобутирилдезоксягуанозии- 3 - -метилтиофосфат (Ж.

Конденсация 5 -О-диметокситритилтимидин-3" -5-метилтиафосфата (66, 1 мг, О, 1 ммоль) с М -изобутирилдезоксигуанозин-3-0,2-цианэтил- 3-метилтиофоа- 25 фатом (63,8 мг, 0,1 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях при мера 2 дает вещество 7 (2560 о.ед„ . 104 мг,, 0,94 ммоль, 94%). Веществом

r oMàãeHío при тонкослойной хромато- 5В графин на силикагеле в car теме А. ОЬношение количеств вещества Ч, измеренных при 260 нм и 500 нм, М 0,97. 2вц 2720. Это подтверждает состав соединения М.

Пример 6. 5 -О-Диметокситри- тил-тимидилил-(3 — Ь -метилтио-Ф5 )р и . изобутирилдзэоксигуанилил-(3" - й: метилтио — 5 )- I -бензоилдезоксиаде нозил-(3 — S-метилтно — «5 )- Й, 3\ в дибензоилдезоксиаденозин (Vl).

Конденсация соединения 17 (2130 о. ед., 0,096 ммоль) и соединения (V) (2560 о.ед., 0,094 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях прнмера

3 дает соединение Vl (4550-о.ед., 0,086 ммоль, 92%). Соединение Vl ro» могенно при тоикослойной хроматографии на силикагеле в системе А. Огношение количеств вещества 1Г1, найденных при

260 нм и 500 нм, М 0,95. 2вв = 4940. Это подтверждает состав соединения Vl.

Пример 7. 5 -@нметокситрнтил-. и i иэобутирилдезоксигужщлилф -3 - .

55 метилтио — «- 5 )- Я2-изобутирилдезоксиъ в гуанилил-(3 - S-метилтио - 5 )- И

1 бензоилдезсксиаденозил-(3 — S -метилтио ф5 )-тимидпл-(3 — ф-метялтио-ю.5 )-Й

1 гД \ Ъ.

4 6 изобутирилдезоксигуанилил-(Зф - g M тио - "5 )- и . -изобутирилдезоксигу

I 2. лил-(3 8-метилтио- » 5 ) Й6- бензоилдеэоксиаденозил-(3 — Ь-метилтио 5< ) тим идин1-3 -О-2цианэтил- Й-метилтиофосфат (V11).

Вещество Ш (4675 о.ед., 0,09 ммоль) обрабатывают 10 мл смеси ацетонитрилтриэтиламин (1: Р/ч ) и нагревают

10 мин при 50РС. Упирают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 мл), хлороформный раствор промывают водой (5 мл З) затем фильм руют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают 56 циметокситритил- (и -изобутнрилдезскси2 гуанилил-(3 - 3-метиотио-«5 )- И изобутирилдезоксигуанилил-(3 — S -ìåòèëтио-ь- 5 ) Я -бензоилдезоксиаденозип- l (3 — З«метилтио — 5 )-тимидин -3 - Ьметилтиофосфат (ИИ).

Вещество (g) (4675 о.ед., 0,09 ммоль) растворяют в хлороформе (10 мл). К охлаждеиному.до О С хлороформному р«твору приливают охлажденный до 0 С 2%иый раствор тоауолсульфокислоты (10 мл) в смеси метанол-хлороформ (3:7 /у ).

Через 2 мин нейтрализуют 5% -ным водным раствором бикарбоната натрии, водный слой отделяют, органический слой промывают водой {5 мл к2), фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают досуха. Получают и -изобутирилдезI ".Г. г. оксигуанилил-(3 - 8-метилтио->5 )- Й изобутирилдезоксигуанилил-(3 — S -метилтио- -5 )- й:-бензоилдезоксиаденозилв (3 — $ -метилтио- .5 )-тимиции-31 -0-2циаиэтил- Ь-метилтиофосфат (Х). Кондеисация вещества УЦ1 с веществом 1Х и обработка реакционной смеси в условиях примера 3 дает соединение . Ц (7560 а ед., 0,063 ммоль, 70%).(а60 10800.

Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе

А. Отношение количеств вещества Qll, найденных при 260 им и 500 нм, И

= 0,95. Это подтверждает состав соединения V1I.

Пример 8. 5 -ДиметокситритилМ -изобутирилдезоксигуаиилкл-(3 - S2. ! метилтио «5 )- И -изобутирилдезокси! 2, гуанилил-(3 — -метилтио- .5 )-М -бенс 1 В

1 зоилдезоксиаденоэил-(3 — S -метилтио« .

5 )-тимидил-(З вЂ” 3-метилтио-«5 )- Йиэобутирилцезокс игуанилил-(3 — S -метилтио- 5 )- И -иэобутирилдезоксигуаиилил-(3 -$ -метилтио -«5 )- М --беизоилI I 1 дезоксиаденозял-(3 — 8-метилтио-s S )1 8

5 )-аденозил-(3 «5 )-тимидил-(3 i ) гуанилил-(3 -+ 5 )-гуанилил-(3 - 5 )

t I аденоэил (3 - 5 ) тимидилил-(3 -+5 ) тимидилил-(3 5 )-тимидилил (3 - 5 ) гуанилил-(3 - 5 )-адеиозил-(3 - 5 )дезоксиаденооин (ХШ). Аммиак упаривают на ротационном испарителе, до.бавляют к остатку 80%-ную уксусную кислоту (10 мл) и сразу же упаривают, затем к остатку добавляют воду (10 мл) и опять упаривают, получают соединение

ХТ7. Соединение X1V хроматографируют на. колонке с аминохромом (Y = 200 мл).

Элюцию проводят в градиенте К НРО (pH = 7) в 7М мочевине при 40ОС. Обессоливание проводят на колонке с сефадексом (3 10 (V = 500 мл).

Применение предложенного способа позволяет увеличить выход целевого продукта до 36% и исключить из процесса трудоемкую стадию хроматографической очистки.

Щ Щ ОВ

О

СН З вЂ” Р=О

I /

ОЭ

) где  — остаток тимина, Й" -анизоилцитозина, N -бензоиладенина, М -иэобутирил6 2. гу анина;

К вЂ” Н, п, и-диметокситритил;

Я - Н, 2-цианэтил, до обработки продукта конденсации кислотой или триэтиламином продукт конденсации выделяют экстракцией хлороформом или смесью хлороформ-метанол (7:3) с последующим снятием тиометильной заши7 92596 тимидилил-(3 — 8-метилтио-+5 )-изобути« рилдезоксигуанилил-(3 — $ метилтио-+ 5 )тимидилил-(3 - S-метилтио- 5 )- H

1 6

6енэоилд езокс иад нозил-(3 — Ь -м ет илти

-5 )- Я -бензоилдеэоксиаденозил-(36

S-метилтио- -5 )- И, 3 -дибензоилдеэ6 ) оксиаденоэин (Х).

Соединение YQ (259 мг, 0,063 ммоль), обрабатывают 10 мл смеси ацетонитрилтриэтиламин (1: 1"() и нагревают 10

10 мин при 50 С. Упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в хлороформе (10 мл), хлороформный раствор промывают водой (5 мл х 3), затем фильтруют через безводный сульфат натрия и упа- 1S ривают досуха. Получают 5 -диметоксиz. тритил- N -изобутирилдезоксигуанилил(g — S -метилтио- 5 )-М <-иэобутирилдж ., 1 оксигуанилил-(3 — $ - метилтио- 51 )-ф— бензоилдезоксиаденозил-(3 - S -метилтио 20

Ж )-тимидилил-(3 — 5-метилтио - 5 )-! I l

g -изобутирилдезоксигуанипил-(3 -  —метилтио- 5 )- N .-изобутирилдеэоксигуа пилил-(3 — $ -метилтио- 5 )- М6 -бенэоипдезоксиаденозил-(3 — 3 -метиптио- .5 )тим идин-3 — S -метилтиофосфач (Xl ) (249 мг, 0,063 ммоль).

Соединение 7 Х (172 мг, 0,086 ммопь) растворяют в хлороформе (10 мл). К ох30 лажденному до СР С хлороформному раствору приливают 10 мл охлажденного до 0 С 270-ного раствора толуолсульфокислоты в смеси метанол-хлороформ (3:7 /„). Через 2 мин нейтрализуют

2Ж-ным раствором бикарбоната натрия, 3S водный слой отделяют, органи уеский слой промывают водой (5 мл 2), фильтруют через безводный сульфат натрия, упаривают досуха. Получают тимндипип«, (3 - -метилтио-+5 )- М -изобутирипдеэа 40 . оксигуанил ил-(3 — S -M e Tmnr Ho 5 ) - Й

1 б бенэоилдезоксиаденозил-(3 -Ь»метнлтио- чб )- и, 3 -дибенэоилдезоксиаденозил (XII) (154 мг, 0,086 ммоль).

Конденсация соединения Х1 (259 мг, 0,063 ммоль) и соединения ХП (172 мг, 0,086 ммоль) и обработка реакционной смеси в условиях /прймера 2 дает вещество

Х (220 мг, 0,038 ммоль, 60%). 5 o 15540. Вещество гомогенно при тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе А. Отношение количеств вещества Х, найденных при260 нм и 500 им, М = 0,96.

Соединение Х нагревают в концентриро- о ванном аммиаке (20 мл) 6 ч при 50 С. -!

Получают 5 -диметокситритил-дезоксигуанилил-(3 — 5 )-дезоксигуанилил-(3

Фор мула изобретения

Способ получения полидеэоксинуклеотндов путем конденсации в пиридине нукпеоэидного и нуклеотидного компонентов в присутствии арипсульфотетразолидов и обработки продукта конденсации кислотой ипи триэтиламином или последовательной обработки кислотой и триэтиламином с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве нуклеозидного и нуклеотидного компонентов в реакции конденсации используют 2-деэоксинуклеотиды обшей формулы

4 10

1- й. Саве е at„,lhernieot aqntheiуу., о фепев ter i ьйюал мамам щс. Hatt.;

"АСМ.$ь. 081, 1978, 75, М 12

5765-5769 (прототип).

S Е259В ты конпентрированным аммиаком при 5060оC в течение 4-6 ч..

ИсФочники ияформапии, принятые во внимайие при экспертиэе

Составитель Л. Никулина редактор Jl. Веселовская Техред З.Фанта орректер У. Пономарен! о

3 ФйЮ ЭЬ

О ЮЙЪЪ °

Заказ 2882/7 Тираж 390 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытия

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4