Способ определения активности общих эстераз в биологическом материале

 

!

l .I. l,";(i л1;

Гидрохимический институт Госкомйт по гидрометеорологии и контролю природной среды (72) Аз торы изобретения (73 2 Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ОБЩИХ ЭСТЕРАЗ

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения активности ферментов, и может быть использовано в микробиологии, гидробиологии, энзимологии, а

5 также при диагностике ряда заболеванйй человека и животных;.

Известен способ определения активности общих эстераз в биологическом .материале путем внесения в пробу субстрата красителя и буферного раствора с последующим инкубированием и фотометрированием полученного цветного комплекса El).

Недостатками известного способа яв.1з ляются сложность определения, невысокая точность и неустойчивость окраски полученного раствора, что ограничивает возможности способа.

Цель изобретения - ускорение спо- 2о соба и возможности осуществления его в полевых условиях.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения ак2 тивности общих эстераз в биологичес" ком материале путем внесения в пробу субстрата красителя и буферного раствора с последующим инкубированием и фотометрированвем полученного цвет" ного комплекса, в качестве субстрата используют с -нафтилацетат, а в качестве буфера - . HC1-оксиметиламинометан, предварительно нанесенные на носитель, а в .качестве красителя ис" пользуют 4-бензоиламин-2,5-диметокси" анилин, при этом окраску инкубацион ной смеси стабилизируют введением трихлоруксусной кислоты и глицерина, а перед фотометрированием в смесь добавляют ацетон.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. 30 мг с -нафтилацетата растворяют в 1. мл хлороформа и пропитывают этим раствором хроматографическую бумагу площадью

5х5 см, хорошо высушивают носитель и разрезают на квадраты 5х5 мм . В

3 972399 таком виде субстрат может хранитьcR в темной IlfloTHQ закрытой склянке несяолько месяцев. Носитель с буфером готовят следующим образом: приготавливают раствор 0,5 M Ht!l-оксиметиламинометана и пропитывают им хроматографическую бумагу площадью

5х5 см,хорошо высушивают носитель в термостате при 40-50 С и разрезают. на квадраты 5х5 мм..В таком виде и буфер может храниться несколько ме.сяцев.

В пробирку вносят 1 квадратик носителя, пропитанного йафтилацетатом и добавляют 2 капли этаяола, через 2- 1

3 мин прибавляют 2 капли дистиллиро ванной воды и хорошо перемешивают стеклянной палочкой для лучшего экстрагирования субстрата. Затем добавляют 1 квадратик носителя, пропитанного буфером, перемешивают смесь и приливают 0,2 мл исследуемой биологической жидкости, еще раз тщательно перемешивают смесь и инкубируют ее в широкогорлом термосе при условиях температурного и временного оптимумов инкубации исследуемых биологических объектов.

После инкубации капельницей приливают 3 капли (О,1 мл) 0,2Ф-ного раствора 4-6ензоиламин-2,5-диметоксианилина, интенсивно встряхивают и через 3 мин приливают при помощи капельницы б капель (0,2 мл) раствора, содержащего 403 трихлоруксусной кислоты и 603 глицерина. В таком виде проба сохраняется до 5 сут. В лабораторных условиях приливают 3 мл ацетона и спектрофотометрируют в ин тервале длин волн 0,46-0,48 MKM против контрольной пробы, ко,орая отличается от опытной тем„ что биологическая жидкость добавляется после внесения смеси трихлоруксусной кислоты и глицерина.

4$

Активность общих эстераз выражают в микромолях *-нафтола, освобожденного в результате реакции 1 r ткани в минуту и рассчитывают по формуле

С-В 56

4

С - количество образовавшегося

oL- нафто ла в ми к ромолях;

Т - время инкубации в .минутах. .Количество о -нафтола рассчитывается по калибровочной кривой.

Предлагаемый способ определения активности общих эстераз в биологи" ческом материале обладает высокой точностью определения активности фермента, облегчает выполнение работ за счет уменьшения числа приливаемых жидких реагентов с 7 до 2, стабильность субстрата увеличивается с 1-2 ч до 1-2 мес, а стабильность окрашенного комплекса повышается с 8-20 мин до 5- 10 сут, позво-. ляет количественно определять активность общих эстераз в полевых условиях.

Простота выполнения, высокая точность и отсутствие потребности в специально оборудованной стационарной лаборатории дают возможность широко использовать предлагаемый . способ определения активности общих эстераз для энзимодиагностики в токсикологии, генетике и медицине.

Формула изобретения

Способ определения активности о".щих эстераз в биологическом материале путем внесения в пробу субстрата красителя и буферного раствора с последующим инкубированием и фотометрированием полученного цветного комплекса, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и воэможности осуществления его в полевых условиях, в качестве субстрата используют о -нафтилацетат, а в ка- . честве буфера - НС1-оксиметиламинометан, предварительно нанесенные на носитель,. а в качестве красителя используют 4-6ензоиламин-2,5-диметоксианилин, при этом окраску инкубационной смеси стабилизируют введением трихлоруксусной кислоты и глицерина, .а перед фотометрированием в смесь добавляют ацетон.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Серова О. Л., Корочкина Л.И.

Исследование синтеза РНК и белка спектра.эстераз и активности аце; резах коры головличного возраста, Октогенез, ое где А - активность фермента в микро- тилхолинэстераэы в с молях на 1 r ткани в минуту; ного мозга крыс раэ

8 - величина разведения исследу" в условиях in vitro

1 71 2 5 471-478 °

ВНИИПИ Заказ 8507/35 Тираж 887 Подписн филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4