Способ выделения лейцинаминопептидазы из aspergillus oryzae

 

(22) Авторы взвбретени я

N.П. Путере и И.A. Вина (7l ) Заввятедь (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙЦИНАИИНОПЕПТИДАЗЦ

ИЗ ASPERGILLUS ORYZAE

Изобретение относится к способам получения фермента лейцинаминопепти:. даэы (Н.Ф.3.4.11.1.), применяемой в молекулярной биологии для исследования аминокислотной последовательнос" ти в белковых молекулах, для получения аминокислот и в медицине.

1!звестны способы получения лейцинаминопептиэады из животного и расти" тельного сырья, например, из почки . о свиньи (1 ) и иэ семян гороха t 2 ).

Однако эти способы основаны на использовании дефицитного или пищевого сырья и не имеют промышленного значения.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения лей ци нами нопептидазы с помощью ми кроf организмов, в частности из плесневого гриба. Asperql 11а" огугаФ (3).

Способ заключается в том, что неочищенный йерментний раствор предварительно очищают rpynnosoA обработкой амберлитом, фракционируют сульфатом аммония, осаждают риванолом. Получейный осадок двухкратно экстрагируют

0,5 И ацетатным бункером с рН 5,0. В охлажденном экстракте осаждают белки, добавляя охлажденный ацетон до 673ной концентрации. Осадок растворяют в воде. Последующую ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят при линейном гриденте 0-0,4 И йаСф в 0,01 И оосФатном 6yhepe с рН 7,0.

После концентрирования на ультрафильт ре лейцинаминопептидазную оракцию наносят на колонку с сеФадексом 0-100 и повторно гельйильтруют на колонке с сешадексом 0-200 в 0,1 И ацетатном бункере с рН 6,5. Потом проводят хроматографию на диэтиламиноэтил"сефадексе А-50 с Фосйатным буйером (рН

7,0) при линейном градиенте 0-0,4 И

NaCg. Очистку завершают повторной гельфильтрацией на себадексе G"200 в 0.„1 М ацетатном бупере с рН 6,5.

975797

Полученный препарат замораживают до

-15 0 °

Общая активность лейцинаминопептидаэы (в экстракте - 2090 ед., в полученном препарате " 262 ед.) - 131.

Удельная активность лейцинаминопептидазы в экстракте - О, t81 ед./мг белка, в полученном препарате4,54 ед./мг белка (субстрат трипептид Ней-Гли-Гли). Вычисленная сте- 0 пень очистки - 25.

Наряду с обеспечением высокой удельной активности известный способ имеет недостатки - сравнительно ниэ" кий выход по общей активности, вызван ls ,ный длительным и многоступенчатым процессом выделения, в котором возни кают потери, и недостаточно высокую степень очистки, 20

Цель изобретения - повишение выхода и степени очистки, упрощение процесса выделения.

Поставленная цель достигается способом получения лейцинаминопептидаэы из Лэрегп111us nryzae,включающим экстракцию Фермента буфером, осаждение его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией буфером, содержащим йаС1, причем в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-673, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят дважды, при этом сорбцию Фермента проводят в статических условиях при объемном соотношении фермент:сорбент 1:(1,3-1,5), элюцию Фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентоИ йаС! от 0,2 до 0,5 И в буфере, а между хро"

46 матографическими стадиями Ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62 С в течение 1012 мин.

Обычно используют 0,005 И веро-. нальный буйер с рН 7,9-8,0.

Этим достигается повышение качества сорбции фермента на ионообменной целлюлозе, которую осуществляют смешиванием Ферментного раствора с сорбентом в статических условиях. Проведением десорбции фермента в динамических условиях при ступенчатом градиенте достигается четкость разделе" ния белков. Отличия в условиях сорбции и десорбции сокращают время проведения стадий ионообменной хроматогра- фии и рехроматографии. Увеличение б степени очистки на этих стадиях по-, зволяет отказаться от гельфильтрации на сефадексе и упростить процесс.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Амилориэин П 10 Х экстрагируют 3 ч

0,005 M верональным буфером с рН 7,9$:1 при комнатной температуре. Центрифугируют 25-35 мин при 5500-6000 o6/

/мин. Центрифугат охлаждают и добавляют охлажденный до -20 С этиловый спирт до конечной концентрации 60-673.

Через 20 мин .осадок отделяют центрифугированием, которое осуществляют

20-?5 мин при 5500-6000 об/мин и

0-4"С, и растворяют в двоййом объеме

0,005 М веронального буфера с рН 7,98,1. Нерастворенный осадок отделяют центрифугированием при тех же услови" ях, Полученный центрифугат смешивают с уравновешенной буйером ДЭАЭ-цел" люлозой в объемных соотношениях

1:(1,3- 1,5) и заполняют колонку. Неорбированные белки и лейцинаминопеп идазнонеактивные белки отмывают

0,2 И раствором МаГ1 в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют 0,5 И раствором ЦаС1 в том же бупере, диализируют и нагревают до 60-62 Г, выдерживают

„0 ! при этой температуре 10-12 мин, быстро охлаждают до 0-4 С, смешивают с

C? уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3-1,5) и заполняют в колонку. Отмывание колонки и десорбцию фермента проводят как и первую хроматографию. Полученный препарат концентрируют с сухим сефадексом Г1-75.

Выход по активности - 253 (активность в экстракте - 8,68 ед., в полученном препарате - 2,17 ед.).

Степень очистки " 38 (удельная активность экстракта - 0,00815, полученного препарата - 0,31 ед/мг белка по субстрату Лей-H-нитроанилид).

Пример 1. 50 г амилориэина

П 10 X экстрагируют в 250 мп 0,005 M верональном буфере с рН 7,9-8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре.

Центрифугируют 25-35 мин при 5;56,0 тыс.об/MHH

Экстракт (215 мл) охлаждают до

0-4 С и добавляют 502 мл 963-ного этилового спирта, охлажденного до

-20 С, до конечной концентрации 67 ;.<

Через 20 мин осадок отделяют центри97

Общий выход по активности полученного препарата - 254 (активность экстракта - 8,84 еда> полученного препарата -,2,21 ед.), Степень очистки32 (удельная активность экстракта0,0079, полученного препарата0,25 ед./мг белка по субстрату Лей"

-ю -нитроанилид).

Пример 2. 50 г амилоризинв

П 10 Х экстрагируют в 250 мл 0,005 И верональном 6yhepe с рН 7,9-8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре.

Центрифугируют, осаждают белки спиртом, центрифугируют, растворяют осадок и вновь центрифугируют, как в при.мере 1.

Полученные 130 мл центрифугата смешивает в течение часа с 195 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлелозой (в объемных соотношениях 1:1,5) и эапол" няет хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки от" мыяает двумя литрами 0>2 Н раствора

НаС1 в 0,005 И верональном 6yhepe с рН 7,9-8,1. Активную ферментную фракцию десорбируйт, пропуская через колонку 1 л 0,4 Н раствора ЙаС! в том же буфере. Первые 30 мл элеата выбрасывает (не имеют лейцинаминопептидаэной активности, следуюе!ие 340 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и тепловую обработку проводят аналогично первому примеру.

При рехроматографии диализирован" ный юерментный раствор смешивают в те" чение часа с уравновешенной буфером

ДЭЛЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,5) и заполняют хроматограФическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя лит" рами 0,2 Н раствора flaCl в 0,005 М верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром 0,4 M раствором НаС1 в том we бу.Фере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл, содержащие максимально активный фермент> собирают. Диализ и концентрирование конечного продукта проводят аналогично первому примеру.

9757

Фугированием при 5,5-6,0 тыс.об/мин при("21 -(2) Ñ и растворяет в 10Ð мл

0 >005 M веронального буфера с рН 7,98,1. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при тех we условиях.

Полученные 135 мл центрифугата смешивает в течение часа с 175 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,3) и за" >0 полняет в хроматографическуе колонку.

Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 Н раствора ИаС1 в 0,005 Н верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию 15 десорбируют, пропуская через колонку 1 л 0,5 раствора МаС1 в том же буфере. Первые 20 мл элеата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содер- зе жащие максимально активный фермент, собирают и диалиэируют против 5 л

0,0005 Н неронального буфера с рН 7,98,1 в течение 24 ч. Ro время диализа буферный раствор меняют 4 раза . И

Диализированный раствор нагревают до 60"62 С и выдерживают при этой температуре 10 мин, потом быстро охлаждают до 2-6оС.

Инактивированные протеиназы отде- за ляют с помощью рехроматографии на ! ионообменной целлюлозе. Диализированный рармантный раствор смвюнвают в т>чение часа с уравновешенной буфером

ДЭАЭ-целлелозой в съемных соотношениях 1:1,3 и заполняют в хроматогра"

Фическую колонку. Несорбированые белки отмывают двунл литрами 0,2 раствора tlaCl в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром 0,5 И раствора ИаС1 в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывает (не имеет лейцинаминопептидазной активности), следую" щие 320 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 М верональн9го, буфера с рН 7,9-8,1 в течение 24 ч.

1 Во время диализа буферный раствор меняют 4 раза.

С целью концентрирования в 350 мл диализированного ферментного раствора помещает целлофановый мешочек с 40 г сухого сефадекса 0-75. Через 24 ч к 5 мл концентрированного ферментного раствора прибавляют 2,36 г сухого сульфата аммония (до 3Я от 0>7 насыщения) и 0,0012 хлористого магния.

Общий выход по активности полученного продукта — 253.(активность экстракта - 8,91 еда> полученного препарата " 2,23 ед.). Степень очистки - 34 (удельная активность экстракта0,0093, полученного препарата "

975797

0,30 ед./мг белка по субстрату Лей-1 !- нитроанилид) .

Пример 3. Экстракцию и осаж" дение белков этанолом проводят аналогично первому примеру. При ионообмен- S ной хроматографии 130 мп фврментного раствора смешивают в течение часа с 180 мл уравновешенной буфером ДЭАЭцеллюлозой (в объемных соотношениях

1:l,h) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,3 tl раствора йаС1 в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9-8,1, ферментную фракцию десорбируют, пропуская через колонку л 0,4 И раствора NaCI, в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают {не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие

330 мл элюата, содержащие максималь- 30 но активный фериент, собирают. Диализ и термоинактивацию балластных белков проводят аналогично первому примеру.

При рехроматографии диалиэированный ферментный раствор смешивают в тече" ние часа с уравновешенной буфером

ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,4), заполняют колонку, отмывают 0,3 И раствором МаС! в 0,005 И верональном буфере с рН 7,9"8,! и де- эв сорбируют 0,4 Н раствором WaC1 в том же буфере. Собирают 330 мл (c 31-ro по 360-ый мл) элюата, содержащих мак" симально активный Фермент. Конечный продукт получают после диализа и кон" ЗЗ центрирования, Общий выход по активности конечного про)1укта - 253 (активность экстракта — 8,77 ед., полученного препарата - 2,79 ед;). Степень очистки - 4о

38 (удельная активность экстракта0,00815, полученного препарата 0,31 ед./мг белка по субстрату Лей;е -нитроанилид).

Определение активности фермента.

За единицу активности лейцинамино пептидазы принимают такое количество фермента, которое гидролизует l,0 мкмоль лейцин-И-нитроанилида в минуту при 37ОС и рН 8,5.

Удельную активность лейцинаминопептидаэц. вычисляют по формуле д т †--а — — — — ед,/мг белка, 4063 5 . 55 9 ° и 0,1 ° х где 3,5 -. объем реакционной смеси

s кювете, си ;

3,9 - коэффициент экстинкции

1 мкмоль т1-нитроанилина в условиях опыта;

t - время инкубации Фермента с субстратом;

0,1"" объем раствора препарата, взятый на анализ, см- з;

x " концентрация белка в исход" ном растворе, мг/смЗ {определяется по Лоури).

Активность лейцииаминопептидаэы определена на субстрата Лей-И-нитроанилид отечественного производства.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в обеспечении производства фермента лейцинаминопептидаэы, используемого в молекулярной биологии и медицине иэ дешевого микробиального сырья;. повышение общего выхода по активности, который по известному способу составляет 133, а по предлагаемому " 253. Кроме того, степень очистки увеличивается с 25 (по известному способу) до 38 (по предлагаемому). В процессе выделения исключаются также стадии гельфильтрации на свфадексе 6- l00 и сефадексе 0"200. формула изобретения

1. Способ выделения лейцинаминопептидазы иэ hsperqillus oryzae путем экстракции фермента буфером, осаждения его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцивй буфером, содержащим NeC1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода, по активности и степени очистки фермента, а также упрощения процесса, в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-673, хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюло:зе проводят дважды, причем сорбцию фермента проводят в статических условиях при объемном соотношении hepмент : сорбент 1:(1,3-1 ")) элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом ПаС1 от 0,2 до 0,5 И в 6yhepe, а между хроматографическими стадиями ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62 Ñ в течение 1012 мин.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что используют

О 005 5И верональный буфер с рП 7 Ч-8 !

975797

Н сто чни ки и нйормации, принятые во внимание при вкспертизе

1. Spacknan О.П., Smith Е.L,, Prawn 0.0. Leucine amlnopeptidase IV.

Osolat ion and properties of the engy;me from swine Rl ne!, .l. Biol, rhen., 1955, vol 212, йг. 1, р. 255.;

t0

2. F) leman Y,Ñ. Armnopeptidase of реа. Aiochen. J., 1974, Уоl. 141, Nr. 1, р. 113-1!8.

ttakadal Т, ties«no 5 °, tguehf tt, у Purification of leucine amonopeptida se I l from hsp, oryzae. 4фг. В1о1.

CheA,,1973, Vo1 37у tlr. 4, р. 767774.

Составитель О. Скородумова

Редактор П Егорова Texpeg И. Гергель Корректор1 А. Гриценко

Заказ 5934/43 Тираж 505 Подписное

ВНИИП11 Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11)ОЯ Носква И- Б Ра лйская наб. g. 4Д

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4