Способ получения орготеина

 

О П И С А Н И Е « 5359I2

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз. Сооетслнх

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 22.05.73 (21) 1918551/13 (23) Приоритет — (32) 19.07.72 (31) 273278 (33) США

Опубликовано 15.11.76. Бюллетень № 42 (51) М. Кл С 07G 7/04

Государственный комитет

Совет» Министров СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 576.8.097 (088.8) Дата опубликования описания 13.12.76 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Вольфганг Хьюбер, Марк Гари Сейфер и Силвер Хьюнг Чоу

США

Иностранная фирма

«Диагностик Дэйта Иик»

США (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИНА

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической промышленности.

Известен способ получения орготеина из экстрактов тканей хкивотных и птиц путем хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе.

Однако известный способ не обеспечивает высокой степени чистоты целевого продукта.

С целью повышения степени чистоты целевого продукта экстракт предварительно обрабатывают протеолитическим ферментом.

Способ получения орготеина осуществляют следующим образом.

Используют исходную смесь протеинов, содержащих оргогеин, которую подвергают ферментному воздействию выбранного протеолитического фермента, при любых условиях температуры, р1-1, времени и соотношении протеинов к энзиму, которые подходящи для выбранного энзима.

Исходную смесь протеинов испольуют в любом водном растворителе, в котором орготеин растворим и устойчив. Применяю г буфер, например с рН l — 13 (предпочтительно 4 — 1О), содержащий небольшое количество одного или более двухвалентных металлов, например, Со, Cu, Fe, Ge, Mg, Zn, Mn или Са, имеющие ионную силу менее чем 0,1М.

Смесь протеинов, включающих орготеин, используют в любой подходящей концентрации, например 0,01 — 10%, в выбранном водном растворителе. Раствор имеет ионную силу

0,001 — 01M которая обеспечена солью, например iU»C1 или буфером, например, трис, трисглицином, фосфатом и содержит один или более двухвалентных металлов, например Мп, Сп, Zn Ht Mg.

10 Энзиматическое разрушение обычно проводится при температуре около 20 — 40 С, но может быть более высокая и более низкая температура, например, 0 — 60 С, причем, оптимальная температура зависит от активности

15 и устойчивости выбранного энзима.

Соотношение энзима к исходной смеси протеинов зависит от соотношения орготеина и инородных протеинов в исходной смеси. Количество энзима также зависит от активности

20 выбранного энзима.

Очищенный таким образом орготеин мохкет быть выделен и далее очищен различными путями. Протеолетически разрушенные протсины, являются ли они олигопептидазами или

25 аминокислотами, легко отделяются от очищенного орготеина, например, путем одного или более приемов ионообменной или гелевой хроматографии с помощью фракционного осажде535912

65 ния растворителем, или сульфатом аммония и/или ультрафильтрацией или мембранным диализом.

Если белковые примеси остаются, они могут быть отделены после диализа, чтобы удалить протеолитически разрушенные белки путем адсорбции и последующим элюированием и слабо кислотной или слабо основной ионообменной колонки, или гелевой фильтрацией, хроматографией, фракционное осаждение растворителем, например, ацетоном или этанолом, или сульфатом аммония и нагревание, например, при 70 — 75 С, чтобы осадить оставшиеся белковые примеси.

Пример 1. 1 кг бычьей печени смешивают с 2 л 0,025М тройного буфера, рН 7,5 в 0,3М сахарозе и 0,05М КС1. Суспензию центрифугируют в течение 1 — 2 ч. Мутный верхний слой жидкости занимает объем 2150 мл и имеет рН 6,3.100 мл порция поверхностного слоя (60 мг протеина(мл, 0 — 15 мг — 0,3 мг орготеина/мл дигерируют при температуре окружающей среды в течение 20 ч в присутствии протеолитических ферментов: проназы, панкреатина, субтилизина, пептидазы, папаина, бромелапна (ананаза).

Лнализ электрофорограммы (после диализа для удаления разрушенных протеинов и фильтрации) превращенного энзимами поверхностного слоя жидкости показывает, что при применяемых количествах 200 мг проназы и

15 мг панкреатина они удаляют большую часть белковых примесей, следующий по эффективности субтилизин после папаина и бромелаина. Самые плохие результаты получают со свиной пептидазой. Белковые примеси, оставшиеся после переваривания с панкреатином и бромелаином, наиболее легко удаляют ионообменной хроматографией на ДЕЛЕ-целлюлозе.

Пример 2. 408 r свежей печени смешивают с 816 мл 0,025М трис (тройной буфер), рН

7,5, в 0,3 сахарозы и 0,05М КС1.

Суспензию центрифугируют в течение 1 ч.

Мутный верхний слой жидкости имеет объем

800 мл и рН вЂ” 6,3.

100 мл порцию верхнего слоя жидкости, содержащую 15 — 30 мг орготеина, подвергают в течение 2 дней при 37 С дигерированию (перевариванию) с некоторым количеством протеолитического энзима, с добавлением азида натрия (0,1 /о) как предохраняющего средства с последующим диализом.

Лучший результат получают с панкреатином, прон азой и субтилиз ином, остаточный протеин легко удаляют из панкреатиновой выварки путем ионнобменной хроматотрафии с

ДЕЛЕ-целлюлозой.

Пример 3. 300 г печени смешивают с 600 мл

0025М тройного буфера 0025М глизина в

0,01М Мп++, рН 7,5.

Смесь (шлам) центрифугируют. Остаток:намного лучше уплотняется в этом буфере. Верхний слой жидкости (110 мг протеина) мл измеряется в 570 мл. Порцию подвергают фер5

50 ментному перевариванию с панкреатином или проназой и подвергают диализу с целью отделения орготечна от деградированных протеинов.

У панкреатина приблизительно одинаковая эффективность при все испытуемых концентрациях (3 — 150 мг/мл). Пропаза менее эффективна, когда разведена от 2 мг/мл до

0,02 или 0,04 мг/мл.

Пример 4. 300 г бычьей печени смешивают с 0,025М тройного буфера, 0,025 мг лицина в

0,01М Мп++, рН 7,5 в соотношении 2 мл буфера,на 1 г печени. Шлам центрифугируют в течение 1 ч (экстрагированнь1е протенны, 60 г/л поверхностного слоя жидкости; орготеин приблизительно 150 мг/л). Приготовляют раствор панкреатина (100 мг/мл) в 0,05М тройной НС1 — буфер, рН вЂ” 7,5.

Верхний слой жидкости экстракта бычьей печени (рН 6,7) титруют до 7,5 рН с помощью

1М тройного буфера. К каждым 100 мл экстракта бычьей печени добавляют 6 мл (0,6 г) раствора панкреатина и 1 мл 10 /о азида натрия. Смесь (рН вЂ” 7,5) инкубируют при 37 С в течение 2 дней, в течение которых цвет смеси меняется от красного до коричневатого (остаточный протеин, около 3 г/л, орготеин приблизительно 150 мг/л). Выдержанную смесь подвергают диализу через деионизированную воду в течение ночи и наконец в 0,005М фосфатного буфера рН 6,0.Диализатцентрифугируют в течение 1 ч и затем отфильтровывают через микрофильтр.

Фильтрат имеет рН 6,3.

Содержание орготеина в протеинах оставшееся в них, более чем 5О/о по сравнению с

0,2 /о в растворимых протеинах, экстрагированных из исходного шлама.

Чистый орготеин удаляют из фильтрата, Диэтиламиноэтилцеллюлозную ионообменную колонку наполняют до 8,5 мл объема слоя.

Уравновешивают 0,005М фосфатным буфером, рН 6,0. Скорость протока 20 мл в час.

253 мл фильтрата, эквивалентных 82 r печени, загружают в эту колонку. Колонку потом промывают 30 мл 0,005М фосфатного буфера с рН вЂ” 6,0. Орготеин подвергают элюированию с линейным градиентом от 0,005М фосфата, рН 6, до 0,005 фосфата в 0,075 рН 6,0, в общем объеме 170 мл.

Трубки, содержащие орготеин, без примесей помещают в одну фракцию, а те, которые содержат орготеин вместе с некоторыми примесями — в другую фракцию. Обе фракции, каждая диализировалась, стабилизируют давлением сахарозы, если необходимо, фильтруют и лиофилизируют.

Выход чистого орготеина 27,6 мл (0,034 /О) в расчете на исходное количество печени; 62% от теоретических. Выход чистого орготеина

10 мг, давая общий выход орготеина 84 /о от теории.

Чистый орготеин может быть рециркулирован или далее очищен путем воздействия дру535912

Составитель С. Малютина

Техред Е. Подурушина

Редактор Э. Шибаева

1(орректор Е. Хмелева

Заказ 2489, 19 Изд. № 1776 Тираж 575 Подписное

ЦИИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ио делам изобретений и открытий

113035, Москва, )K-35, Раушскан t;au., д. 4/5 з ипографии, пр. Сапунова, 2 гих протеолитических энзимов, например, про«азы, или геленой, «л«иопообме««ой хроматографией.

Г! р и м е р 5. Чтобы определить эффект проведения стадии протеолитического дигерирования на различных стадиях отделения орготонна, вся бычья печень, растворимые протеи«ы из бычьей печени и растворимые протеипы из бычьей печени, обработанные теплом, подвергают ферм ентной очистке панкреати«ом. Чтобы получить экстракт растворимых протеинов из бычьей печени, 500 г (150 г твердых веществ) бычьей печени смешивают в смесителе с одним литром буферного раствора

0,25М тройного, 0,025М глицина и 0,01М

Мп++, рН вЂ” 7,5, чтобы получить 1380 г/мл смеси, 100 мл порции полученной смеси подвергают обработке по стадиям

А. Смесь центрифугируют, в течение 1 ч, получая 78 мл поверхностного слоя жидкости, содержащей 100% растворимых протеинов и

100% орготеина в исходной печени.

Б. 78 мл поверхностного слоя жидкости из стадии А подвергают протеолитическому разруше«ию с помощью 300 мг панкреатина, рН вЂ” 7,5; 37 С; 24 — 28 час. 100% орготеина и

10% общих растворимых протеинов исход«ой печени остаются.

В. 100 мл исходной пече«очной смеси подвергают тепловой обработке при 65 С в тече««е 15 мнн, охлаждают и центрифугируют, получая 78 мл верхнего слоя жидкости и 7,6 г/ (89,5% ) осажденных нерастворимых протеи5 нов,78мл поверхностного слоя жидкости затем подвергают обработке энзимами стадии 100% орготеина и (6% общих растворимых протеинов исходной печени остаются.

Г. 78 мл поверхностного слоя жидкости ста10 дии А подвергают тепловой обработке стадии В. Выход от центрифугирования 60 мл (2,70 г твердых веществ) поверхностного слоя жидкости и 2,05 г осадка. 60 мл поверхностного слоя жидкости затем подвергают обра15 ботке протеолитическими энзимами стадии Б.

Остается 3 — 6% растворимых протеинов. Тепловая обработка перед стадиями энзимной обработки делает последнюю более эффективной, потому, что на стадиях В и Г остается

20 только 3 — 6% растворимых протеинов, тогда на стадии В остается больше чем 6%.

Формула изобретения

Способ получения орготеина из экстрактов

25 животных тканей путем хроматографического фракционирования, о тл и ч а ю щ «й с я тем, что, с целью повышения степени чистоты целевого продукта, экстракт предварительно обраба гывают протеолитическим ферментом.