Способ определения структуры триглицеридов природных и модифицированных жиров

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3@а а01Н 33 00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

А0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPHTHA

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1, Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ д:„,,:„„::.-,,(д

Ю (21) 3363314/28-13 (22) 26 ° 11. 81 (46) 23. 06 ° S3. Бюл. Р 23 (72) О.В.Озеринина, B.B.×óïèí, A.Ï.Нечаев, Н.С.Гейко, Г.A.Ñåðåáðåíникова И P.Ï.Åâñòèãíååâà (71) Московский. ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт пишевой промышленности и

МосКовский ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой химическбй технологии им. M.В.Ломоносова (53) 665.014 (088.8) (56) 1. Физиология и биохимия культурных растений. 1977, 9 4, с. 346-351 °

2. Физиология и биохимия культурных растений. 1978, 1 ), с. 48-53.,SU„„1024833 А (54) (57 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С. УРУКТУРЫ ТРИГЛИЦЕРИДОВ ПРИРОДНЫХ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЖИРОВ, включающий гидролиэ тригЛицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов и гидролиз фосфолипазой Л, о т л и ч а ю ц и и с я тем,что, с целью сокрацения времени анализа, фосфорилирование диглицеридов осуществляют

2-хлор-2-оксо-1;3,2-диоксафосфоланом в количестве" 3-4 молей на моль диглицеридов пои 40-45ОC в течение

30-60 мин.

1024833

СНОСОК

eHoC oR г

СН О-р, i

П О вЂ” ОИ

СЦOCO

СЯОСИ.си осок

: схоаоа 0

СН О -Р— ОВН ЛХд ОН

О. CH20R

H o

Изобретение относится к способам определения состава и, строения триглицеридов и может быть использовано пля установления триглицерилной структуры природных и модифицированных жиров, применяемых в пищевой промыш- 5 ленности.

Известен способ. определения структуры триглицеридов, включающий гидролиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицери- )0 дов и гидролиз фосфоглицеридов фосфолипазой А, в котором гидролиз триглицеридов осуществляют в среде аммонийного буфера в присутствии хлористого кальция и дезоксихолевой кислоты при 37 С в течение 30-40 мин;

Фосфорилирование диглицеридов проводят фенилдихлорфосфатом при 20 С в течение 3 ч и для более полного протекания реакции фосфорилирования выдерживают реакционную массу 36-40 ч при комнатной температуре. Синтезированные фосфоглицериды гидролизуют .фосфолипазой А< при 30 С в течение

4 ч f1).

Недостатком этого способа является, прежде всего, необходимость отделения симметричных диглицеридов, образующихся при гидролизе, от несимметричных, используемых далее на второй стадии анализа. Основным недос- 30 татком данного способа является длительность реакции фосфорилирования диглицеридов.

Наиболее близким к изобретению является способ определения структу-. 35 ры триглицеридов, включающий гидрошиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов -фталимидоэтилфосфатом в присутствии триизопропилфенилсульфо- 40 хлорида (ТР ) и гидролиз синтезиО п,О Со

Ck - Р

О-СЯ2

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят гидролиз жиров панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов 2-хлор-2-оксо-1,3,2диоксофоланом и гидролиз фосфогли" церидов фосфолипазой Ag.

Пример 1. Определяют структуру триглицеридов природных жиров.

В круглодонную трехгорлую колбу на

100 мп помешают 0,4 r исследуемого жира туда же добавляют предвариf тельно выдержанные при 40 С 5 мл

0,11 М раствора хлористого кальция,,65 ров анных фосфоглицеридов фосфолипазой А . Гидролиз триглицеридов панкреатической липазой проводят в среде фи-с -НСЕ буфера в присутствии хлористого натрия и хлористого кальция при 39 С в течение 15 мин. Фосфорилирование диглицеридов осуществляют Pr-фталимидоэтилфосфатом в присутствии ТР5 при 65 С в течение 3 ч.

Гидролиз синтезированных фосфоглице" ридов производят в течение 10 ч при

30 С j2).

Однако в данных условиях фосфорилирования не исключено перекисное окисление липидов и ацильная миграция. Снижение времени фосфорилирования и температуры реакции уменьшает вероятность того и другого про" цесса. Кроме того, недостатком известного способа является более длительный гидролиз фосфоглицеридов фосфолипазой A

Целью изобретения является сокращение времени анализа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения . структуры триглицеридов природных и модифицированных жиров, включающему гидролиз триглицеридов панкреатической липазой, фосфорилирование диглицеридов и гидролиз фосфоглицеридов фосфолипазой А>, фосфорилирование диглицеридов осуществляют 2-хлор2-оксо-1,3,2-диоксафосфоланом в количестве 3-4 молей на моль диглицеридов при 40-45 С в течение 30-60 мин.

В предложенном способе получаемые фосфоглицериды по своей структуре близки к природным фосфолипидам и поэтому являются лучшим субстратом е для фосфолипазы А, за счет чего и снижена продолжительность их гидролиза.

30 мл 1 н. раствора хлористого натрия, 20 мл 1М..трцс -HCE буфера (рН 8,0) и 0,08 г панкреатической липазы (активность 47,3, марка А), растворенной в 3 мл 0,01 МЬ-гистидина. Гидролиз триглицеридов проводят при .интенсивном механическом перемешивании в токе азота в течение 2,5 мин при 40ОС и останавливают добавлением 15 мл 4> соляной кислоты."

Экстракцию проводят диэтиловым эфиром. Полученный эфирный экстракт промывают водой до нейтральной реакции и сушат над прокаленным сульфа1024833 том натрия. Эфирный экстракт декан= тируют, растворитель удаляют под вакуумом. Продукты гидролиэа выделяют препаративной тонкослойной хроматографией (TXC) на силикагеле ЛС .

5/40 6. Проявление ведут в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота(50:50:1). Фракции обнаруживают парами иода и фиксируют. Полученные. моноглицериды и диглицериды экстрагируют с силикагелем диэтиловым эфиром. Растворитель отгоняют под вакуумом. Состав жирных кислот исходных триглицеридов и моноглицеридов определяют методом гаэожидкостной хроматографии (ГЖХ). 15

Навеску диглицеридов 0,09 (0,000145 моля) растворяют в 2 мл безводного бензала, добавляют 0,4 мл сухого триэтиламина и вводят по каплям при 20 С раствор 0,065 г (0,000438 моль) 2-хлор-2-оксо-1,3,2-диоксафосфолана в 4 мл .бенэола.

Реакционную массу перемешивают при

45 С в течение 30 мин. Выпавший осадок хлоргидрата триэтиламина отфильтровывают, к фильтрату добавляют водный бензол и удаляют растворитель под вакуумом. Фосфоглицериды выделяют препаративной ТСХ, используя в качестве проявителя систему хлороформ-метанол-ацетон-аммиак (15:?:5:1). Фосфо- 30 глицериды обнаруживают при опрыскивании краев пластин модифицированных реактивом Васьковского (Ру=.0,48) и экстрагируют с силикагеля смесью хлороформ-метанол (2:1). Растворитель З5 удаляют под вакуумом. Выход фосфоглицеридов 0,07 (65%).

Навеску фосфоглицеридов 0,07 г растворяют в 5 мл диэтилового эфира.

К полученному раствору добавляют

0,014 г лиофилиэированного яда гюрзы, . растворенного в смеси,.содержащей

1 мл,0,1 М боратного буфера (рН 7,2) и 0,1 мл 0,11 N хлористого кальция.

Реакционную массу перемешивают при

30с C в течение 5 ч. Растворитель 45 удаляют под вакуумом, лизофосфоглицериды выделяют препаративной ТСХ в системе хлороформ-метанол-вода при соотношении 65:25г4 (9 0,29), обнаруживают модицифированным реактивом 50

Васьковского. Экстракцию проводят метанолом, растворитель удаляют под вакуумом. Состав жировых кислот лизофосфоглицеридов определяют методом

ГЖХ. 55

Пример 2. Определяют структуру триглицеридов модифицированных жиров.

В круглодонную трехгорлую колбу на 100 мл помещают 0,4 г расплавлен-, ного гидрогениэированного жира, туда же добавляют предварительно выдержан, ные при 40 C 5 мл 0,11 M раствора хлористого кальция; 30 мл 1н .раствора хлористого натрия, 20 мл 1 М 65 трцс -HC1 буфера (рН 8,0) и 0,08 r панкреатической липазы (активность

47,3,, марка A), растворенной в 3 мл

0,01 М Ъ-гистидина. Гидролиз триглицеридов проводят при интенсивном механическом перемешивании в токе азота в течение 2,5 мин при 40 С и останавливают добавлением 15 мл 4н. соляной кислоты-. Экстракцию проводят диэтиловым эфиром. Полученный эфирный экстракт про ывают водой до нейтральной реакции и сушат над прокаленным сульфатом натрия. Эфирный экстракт декантируют, растворитель удаляют под вакуумом. Продукты гидролиэа выделяют препаративной TCX на силикагеле лс 5/40р. Проявление ведут в системе гексан-.диэтиловый эфир-уксусная кислота (50:50:1). Фракции обнаруживают в парах иода и фиксируют.

Полученные моноглицериды и диглицериды экстрагируют с силикагеля диэтиловым эфиром. Растворитель отгоняют под вакуумом. Состав жирных кислот исходных триглицеридов и моноглицеридов определяют методом ГЖХ.

Навеску диглицеридов 0,087 r (0,00014 моль) растворяют в 2 мл безводного бензола, добавляют 0,4 мл сухого триэтиламина и вводят по каплям при 20 С раствор 0,084 г (0,.00056 моль) 2-хлор-2-оксо-1,3,2-диоксафосфолана в 4 мл бенэола.

Реакционную. массу перемешивают при

40 С в течение 1 ч. Выпавший осадок хлоргидрата триэтиламина отфильтровывают. К фильтрату добавляют водный бензол и удаляют растворитель под вакуумом. Фосфоглицериды выделяют препаративной ТХС, используя в качестве проявителя систему хлороформ-метанол- ацетон-аммиак (15:7:5:1).

Фосфоглицериды обнаруживают при опрыскивании краев пластин модифицированным реактивом Васьковского (к,g 0,48) и экстрагируют смесью хлороформ-метанол (2:1). Растворитель удаляют под вакуумом. Выход фосфоглицеридов 0,08(753).

Навеску фосфоглицеридов 0,08 r растворяют в 5 мл диэтилового эфира.

К полученному раствору добавляют

0,016 г лиофилиэированного яда гюрзы, растворенного в смеси, содер-, жащей 1 мл 0,01 М боратного буфера (рН 7,2) и 0,1 мл 0,11 М хлористого кальция. Реакционную массу перемешивают при 30 С в течение 5 ч. Растворитель отгоняют под вакуумом, лизофосфоглицериды выделяют црепаратинной ТСХ 8 системе хлороформ-метанол-вода при соотношении компонентов

65:25:4 ((0,29). Экстракцию проводят метанолом. Растворитель удаляют под вакуумом. Состав жирных кислот лизофосфоглицеридов определяют методом

ГЖХ.

Использование предлагаемого способа. определения структуры тригли-..

1024833

Составитель Н. Афанасьева

Редактор В. Иванова Техред A,Âàáèââö. Корректор Г Qx аР

Заказ 4386/41 Тираж 873 . . Подписное

BHHHGH Государственного комитета сСсР по делам изобретенИй и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;; д. 4/5

Филиал ППП "Патент ", r. ужгород, ул. Проектная церидов природных и моДифицированнкй жиров обеспечивает по сравнению с известным следующие преимущества: синтезированные фосфоглицериды по своей структуре близки к природным фосфолипидам и являются по этому лучшим субстратом для фосфолипазы А за счет чего достигается снижение с

10 до 5 ч времени их гидролиза ; исключаетдя использование на стадии фосфорилирования дорогостоящего конденсирующего агента - триизопропилфенилсульфохлорида (TPS); снижение продолжительйости фосфорилирования с 3 до 1 ч и температуры реакции с 65 до 40«45 С уменьшает вероятность перекисного окисления и ацильной миграции в ходе анализа, длительность анализа составляет 20 вместо

27 ч,