Способ определения " @ @ " пороговой концентрации мембранотоксического действия химических веществ

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ IN. IVITRO ПОРОГОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕМБРАНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ с регистрацией биолюминесценции , отличающийся тем, что, с целью повышения точнойти и упрощения способа, эритроциты человека инкубируют in vitro с химическими веществами концентраций от М до 1 М и регистрируют выход АТФ из клеток хемилюминесцентным методом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И)

3659 1 66 С К 3 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ /

:ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИП"»

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВЪ (21) 3499 924/28-13

l22) 14. 10. 82 сФ (46) 07.05.84. Бюл. Р 17 (72) A.C.Øïèãåëü, И.П.Королюк, В.A.Äàíèëèí и A.É.Êëèìèíà (71) Куйбышевский медицинский инсти-. тут им. Д.И.Ульянова (53) 615-092 (088.8) (56) 1. Методы установления допустимых уровней воздействия профессиональных вредностей. Доклад Комитета экспертов Всемирной Организации

Здравоохранения с участием МОТ, Серия технических докладов 601, Женева, 1978.

2. Патент США Р 4246340, кл. С 12 Q 1/66, 20.01.81 (прототип) ..(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ "IN VITRO ПОРОГОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕМБРАНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ с регистрацией биолюминесценции, отличающийся тем, что, с цЕлью повышения точности и упрощения способа, эритроциты человека инкубируют "in vitro" с химическими веществами концентраций от 1x10 М до 1 М и регистрируют выход АТФ из клеток хемилюминесцент:ным методом.

1090719

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Заказ 3015/23

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4

Изобретение относится к медицине а именно, к методам исследования и количественной оценке потенциальной опасности химических веществ, может быть использовано в токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия химических соединений, а также в промышленной гигиене с .целью определения допустимого уровня токсичес° ких химических агентов в воздухе.

Известен способ прогнозирования воздействия химических веществ с помощью экспресс-тестов "1п ч1 г0 для выяснения возможных канцерогенных свойств химических соединений (1(15

Недостатком этого способа является его невысокая точно Рть.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ 20 измерения биолюминесценции, заключаю. щийся в реакции АТФ с ферментом люциферазой и Д-люциферином в присутствии ацетата магния, бычьего сывороточного альбумина, ЗДТА в трис-буфере рН 7,75, в результате которой выделяется фотон.

Недостатком известного способа является то, что он не позволяет определять пороговые значения мембранотоксического действия химических соединений на эритроциты человека в опытах "in vitro".

Целью изобретения является повышение точности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения

"in vi.tro" пороговой концентрации

:мембранотоксического действия химических веществ с регистрацией биолюминесценции, эритроциты человека 40

ИнкубМруют "iu vitro с химическими л веществами концентрации от 1,0к10 N до 1,0 М и регистрируют выход АТФ из клеток хемилюминесцентным методом.

Способ осуществляют следующим 45 образом.

В ряд пробирок, содержащих изотонический раствор хлористого натрия, вносят растворы исследуемых химических веществ, приготовленные с учетом их молекулярного веса, плотности и коэффициента. растворимости с концентрациями от 1,0 10 М до 1,0 М.

В другой ряд пробирок приливают по 0,1 мл эритроцитной массы, предварительно очищенной от лейкоцитов и тромбоцитов, крови, взятой у человека, и 0,8 мл физиологического раствора. Затем из первого ряда пробирок во второй ряд последовательно прибавляют 0,1 мл растворенного в 60

Физрастворе исследуемого химического вещества в указанных концентрациях.

Контролем служат пробирки с раствором, содержащим 0,1 мл эритроцитной массы и 0,9 мл изотонического физраствора.

Пробирки с опытными и контрольными образцами термостатируют 30 мин при

37 С, затем центрифугируют при

3000 об/мин 10 мин и в надосадочной жидкости определяют уровень АТФ хемилюминесцентным методом с помощью набора реактива фирмы LKB Mallac

Количество добавляемого реагента к опытной пробе должно составлять

20% от объема образца. Исследования проводили на люминометре-1250, снабженным фотоэлектронным умножителем.

При соотношении сигнал/шум темнового тока, равном единице, достигается чувствительность выше, чем 4к10 М

АТФ.

Порог повреждающего действия исследуемого химического вещества определяют по усилению хемилюминесценции. За пороговые значения повреждающего действия химических веществ на мембраны эритроцитов человека принимают увеличение светового потока по сравнению с контролем в 1,5 раза выше.

Пример. Приготавливают растворы бензола в изотоническом растворе хлористого натрия в следующих концентрациях, м: 1,02 10 ; 0,51»

>10 ; 0,128к10 ; 0,63 10; 1,02

"10; 1,02к10 -; 1,0х10

В другой ряд пробирок прибавляют по 0,1 мл эритроцитной массы человека, очищенной от лейкоцитов и тромбоцитов крови, и 0,8 мл физраствора, затем прибавляют по 0,1 мл изотонического раствора хлористого натрия, содержащего приведенные концентрации бензола, Конечные концентрации в реагирующем объеме следующие: 1,02к10

0,51" 10; 0,128к10; 0,63к10 4; и т,д.

В качестве контроля служат пробирки, содержащие 0,1 мл эритроцитной массы и 0,9 мл изотонического физраствора. Инкубируют содержимое в пробирках 30 мин при 37, центрифугируют и в насадке определяют уровень АТФ.

-М

При концентрации бензола 1,0 10 M в контрольных образцах уровень АТФ составляет 1,3 ед, а концентрация

1,0к10 М дает 4,7 ед, т.е. превышает уровень АТФ в контроле более, чем в 3 раза.